KR101620163B1

KR101620163B1 - 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 우울증 또는 인지장애의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101620163B1
Application number: KR1020140062111A
Authority: KR
Inventors: 홍정화; 강성구; 이상현; 송우태; 김지영; 백승은
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2014-05-23
Publication date: 2016-05-12
Also published as: KR20150134824A

Abstract

본 발명은 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안 또는 우울증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미강 추출물, 특히 미강 발효 추출물은 우울증, 불안장애 및 인지장애로 인해 나타나는 이상 행동을 유의적으로 감소하며, 신경조절물질의 발현 정도를 증가시키고, 뇌의 해마의 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 부위의 세포사멸을 억제하여 우울증, 불안장애 및 인지장애의 예방 및 치료를 위한 약학적 용도 및 기능성 식품학적 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 우울증 또는 인지장애의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising rice bran extract for prevention or treatment of depressive disorder or cognitive disorder}

본 발명은 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 우울증 또는 인지장애의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에 관한 것이다.

우울증은 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 뜻하고, 평생 유병률 중 약 15-20%가 우울장애라고 보고된 바 있고, 불안장애는 다양한 형태의 비정상적, 병적인 불안과 공포로 인하여 일상생활에 장애를 일으키는 질병을 통칭한다. 발병 원인에 대해서는 아직 명확하지 않으나 다른 정신 질환과 같이 다양한 생화학적, 유전적 그리고 환경적 요인이 질병을 야기 시킬 수 있다. 급성 또는 만성 스트레스는 분노, 불안장애와 우울증과 같은 정서적 상태를 유발시킨다.

그러나 이러한 우울증은 오늘날 손꼽히는 고빈도 질환의 하나로 자리매김되고 있는데, 이러한 질환은 심신을 동시에 악화시키는 광범위한 질환으로 치료받지 않으면 몇 개월에서 몇 년 동안 지속될 수 있으며 관계의 와해나 직업적인 생산성의 상실, 무능이나 죽음에 이를 수도 있어 개인뿐 아니라 가족, 사회에 큰 부담을 주는 질환이다. 주요 우울증성 장애의 평생 유병률은 여자의 경우 10-25%, 남자의 경우 5-12% 정도로, 여자가 남성에 비해 약 2배 이상 많다.

현재 임상에 사용되는 항우울제는 대부분이 모노아민계 신경전달물질의 작용을 강화하는 약물들인데, 신경세포의 세로토닌 재흡수, 노르에피네프린의 재흡수 등을 억제하는 물질 (SSRI, SNRI, TCAs 계열 등), 모노아민 산화효소 억제제(monoamine oxidase inhibitors)와 같이 세로토닌이나 도파민 등의 분해를 억제하는 물질이다. 하지만, 현재 우리나라의 우울증 환자 중 약 10-25%만이 항우울제 치료를 받고 있으며, 이중 40% 가량은 부작용 등으로 인해 순응도가 떨어져 치료를 중단하는 것으로 알려져 있고, 나아가 항우울제를 복용하더라도 반응이 없는 비반응군(non-responder)이 33%에 달하는 것으로 보고되고 있어 보다 효과적인 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

또한, 인지장애는 정상적으로 행해지던 생활이 다양한 원인에 인해 뇌기능이 손상되면서 이전에 비해 인지 기능이 지속적이고 전반적으로 저하되어 일상생활에 상당한 지장이 나타나고 있는 증상이다. 이러한 인지장애는 점진적으로 최중증 정신 황폐를 야기하고 결국 죽음을 초래하는 기억, 인지, 추론, 판단 및 감정 안정의 진행성 손실을 임상적인 특징으로 한다. 그러한 장애의 하나의 예로서 알츠하이머병(AD)은 노인들의 진행성 정신적 기능상실(치매)의 통상적인 원인이고 미국에서 의학적 사망 원인 중 4번째로 간주된다. 특히, AD는 기억을 포함한 인지 작용에서 기본적인 역할을 하는 전뇌 기저부에서 콜린성 뉴런의 퇴행과 연계되어 있다(문헌[Becker et al., Drug Development Research, 1988, 12, 163-195]). 또한, 인지 장애 및 퇴행성 뇌 장애는 다양한 인종 및 종족에서 세계적으로 발견되었고, 주요한 공공의 건강 문제가 되었다. 현재 이들 질병은 미국에서만 약 2백만 내지 3백만명에 영향을 미치고 있는 것으로 추정되고 있으나, 현재 사용되는 약물처치로는 치료가 불가능하고 인간 수명이 증가함에 따라 전 세계적으로 증가하고 있어, 초기에 예방할 수 있도록 주의를 기울이는 것이 중요하다고 할 수 있으며, 효과적인 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 등록특허 10-0941527

이에 본 발명자들은 우울증, 불안증 및 인지장애를 개선, 예방 및 치료하기 위한 치료제로서 미강 추출물을 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 미강 열수 추출물 또는 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안 또는 우울증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미강 열수 추출물 또는 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안, 우울증 또는 인지장애의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 불안, 우울증 또는 인지장애의 개선 및 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 미강 열수 추출물 또는 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안 또는 우울증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미강 발효 추출물은 미강 열수 추출물 100 중량% 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 스트레스 호르몬의 발현을 억제시키고, 뉴런 세포 및 세로토닌의 발현은 증가시키고, BDNF, NGF 및 GDNF의 신경조절물질의 발현은 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 미강 열수 추출물 또는 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지장애 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 미강 열수 추출물 100 중량% 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 30 중량%로 상기 미강 열수 추출물에 접종하여 제조한 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안, 우울증 또는 인지장애의 예방 또는 개선용 건강 기능성 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은, (a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도에서 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양하는 단계; (c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계를 통해 수득한 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 여과하여 수득한 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결 건조하는 단계를 포함하는, 불안, 우울증 또는 인지장애의 개선 및 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)은 미강 열수 추출물 100 중량% 대비 1 내지 30 중량%의 양으로 접종하여 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 미강 발효 추출물은 우울증/불안장애 및 인지장애로 인해 나타나는 이상 행동을 유의적으로 감소하며, 신경조절물질의 발현 정도를 증가시키고, 뇌의 해마의 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 부위의 세포사멸을 억제하여 우울증/불안장애 및 인지장애에 대한 예방 및 치료효과를 나타내므로 뇌 보호제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 우울증/불안장애가 유발된 흰 쥐에서 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 몸무게 변화(a)와 스트레스 호르몬 측정결과(b)를 나타낸 것이다.
도 2는 우울증/불안장애가 유발된 흰 쥐에서 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 행동평가 결과로 강제 수영(a)과 십자형 높은 미로(b)를 측정 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 세포사멸 정도(a)와 뉴런 증가 효과(b)가 있는지를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과이다.
도 4는 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 신경영양인자(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 확인한 결과로서, a는 RT-PCR 결과를 나타낸 것이고 b는 발현 정도를 그래프로 수치화 하여 나타낸 결과이다.
도 5는 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 뉴런과 세로토닌의 증가 효과를 면역조직화학 분석을 통해 수행한 결과이다.
도 6은 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 베타 튜불린과 시냅토파이신의 증가 효과가 있는지를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 수행한 결과이다.
도 7은 인지장애가 유발된 흰 쥐에서 미강 추출물 처리에 따른 행동평가 결과로 모리스 수중 미로 검사 도피 잠재기(a)와 도피대가 있던 위치에 머무르는 시간(b)을 측정 분석한 결과이다.
도 8은 인지장애가 유발된 흰 쥐에서 미강 발효 추출물 처리에 따른 행동평가 결과로 신 물체 탐색 검사로 새로운 물체를 탐색하는 시간을 측정 분석한 결과이다.

본 발명은 불안, 우울증 또는 인지장애를 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 미강 추출물의 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 본 발명은 불안, 우울증 또는 인지장애를 치료할 수 있는 새로운 치료제로서 미강에 주목하였는데, 미강(米糠, rice bran)은 벼의 도정과정 중 발생하는 부산물로서 12 ~ 16%의 단백질과 20 ~ 25%의 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스 (hemicellulose) 등의 식이섬유와 16 ~ 22%의 지방을 함유하고 있고 그 밖에 비타민, 미네랄 등의 미량영양소가 풍부하게 함유되어 있으며, 이 외에도 인체에 유효한 폴리페놀(polyphenol) 등의 성분이 풍부하게 함유되어 영양적으로 가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다.

최근 미강에 함유되어 있는 다양한 종류의 폴리페놀 (polyphenol) 성분과 헤미셀룰로스(hemicellulose), 베타글루칸(β -glucan), 아라비녹실란 (arabinoxylan) 및 펙틴(pectin) 등의 다당체 성분이 면역기능을 활성화 시켜주고 항암작용 등의 기능을 갖는다는 연구들이 발표되면서 미강의 가치가 새로이 조명되고 있으나 아직까지 미강을 불안, 우울증 또는 인지장애 치료를 위한 용도로 사용된 예에 대해서는 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 미강의 추출물을 불안, 우울증 또는 인지장애의 예방 및 치료를 위한 용도로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면 미강 열수 추출물 및 미강 발효 추출물을 우울증 및 불안장애가 유발된 마우스 모델을 대상으로 섭취하게 한 후, 스트레스 호르몬 발현 변화, 행동이상 개선변화, 뇌 세포 사멸정도 변화 및 뉴런 변화를 관찰하였는데, 분석 결과 질환이 유도된 마우스 군(미강 추출물 미처리군)에 비해 미강 추출물을 처리한 군의 경우, 스트레스 호르몬의 발현이 감소되는 것으로 나타났고, 행동이상도 개선되는 것으로 나타났으며, 뇌 세포 사멸억제 및 뉴런증식이 증가되는 것으로 나타났다.

이 뿐만 아니라, 세로토닌이 증가되고 시냅토파이신 발현 세포가 증가되며 신경영양인자인 BDGF, NGF, GDNF의 발현도 증가되어 궁극적으로 우울증 및 불안증, 인지장애 이상이 모두 개선 및 치료될 수 있다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 미강 추출물은 우울증, 불안증 또는 인지장애 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 상기 미강 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 미강 발효 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 성인의 경우, 본 발명의 약제학적 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시 1 내지 250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 이 투여량은 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감(增減)하는 것이 바람직하다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 뇌졸중 예방 또는 치료용 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다.

본 발명의 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 및 유제품 등이 있다.

이때, 식품에 첨가되는 미강 추출물의 양은 전체 식품 중량을 기준으로 0.01 내지 10 중량부가 바람직하다. 특히 식품이 음료류인 경우, 전체 음료 조성물 100㎖를 기준으로 0.001 내지 1g, 바람직하게는 0.1 내지 1g의 비율로 첨가할 수 있다. 첨가하는 양이 0.001g 미만인 경우 질환에 대한 뚜렷한 예방 또는 치료효과를 기대할 수 없으며, 첨가하는 양이 1g을 초과하는 경우 미강 추출물의 맛이 강하여 식품 자체의 맛을 방해하게 된다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 미강 추출물 이외에 통상의 보조제를 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기보조제로는 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 있다.

본 발명은 또한 미강 추출물을 유효성분으로 포함하는 우울증, 불안증 또는 인지장애의 예방 또는 개선용 기능성 건강 식품을 제공한다.

상기 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 및 유제품 등이 있다.

본 발명은 또한,

(a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도로 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양 하는 단계; (c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계의 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 여과된 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결건조하는 단계를 포함하는, 불안, 우울증 또는 인지장애의 개선 및 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 (b) 단계에서는 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P) 균주를 미강 열수 추출물 100 중량 대비 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조하는 것이 바람직하다.

나아가 본 발명은 신규한 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG) KFCC11556P 균주를 제공하며, 이 균주에 대한 균주 기탁증은 본원 출원서와 함께 첨부하였다.

또한, 본 발명의 유효성분인 상기 미강 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된‘추출물’은 적절한 용매를 이용하여 미강으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 미강의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다.

상기 미강으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 열수 추출법을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 미강 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이며, 또한 상기 미강 추출물은 미강을 발효시켜 수득한 발효 추출물을 포함할 수 있다.

바람직하게 상기 미강 발효 추출물은 미강의 열수 추출물을 발효시킬 수 있는 미생물을 이용하여 발효하여 수득할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 기술된 방법으로 수득한 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양하고, 고압멸균기(autoclave)에서 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균한 다음, 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하여 미강 발효물을 수득할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

미강 추출물 제조방법

<1-1> 미강 열수 추출물 제조

미강 열수 추출물의 제조를 위해 먼저 쌀을 도정한 후, 어떠한 가공처리도 수행하지 않은 남은 껍질 부분(미강)에 물을 첨가하는데, 이때 미강과 물의 혼합비는 1: 9의 중량비가 되도록 0.1kg:0.9kg으로 혼합한 후, 121℃에서 15분간 추출하여 열수 추출물을 수득하였다.

<1-2> 미강 발효 추출물 제조

미강 발효 추출물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 미강 열수 추출물에 자체 분리 동정한 신균주인 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 열수추출물 100중량% 대비 5, 10, 20%를 각각 첨가하고 35℃ 진탕배양기(Shaking incubator)에서 120rpm의 속도로 24시간 교반배양 한 다음, 유산균주 불활성화를 위해 오토클레이브(Autoclave)를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균처리 하였다. 멸균 처리된 미강발효 샘플을 원심분리(10,000×g, 15min)하고 상층액을 취한 다음 여과지(Whatman No. 40)를 이용하여 감압여과 한 후 54 Brix로 농축하고, 동결건조 하여 미강 발효 추출물을 제조하였다.

< 실시예 2>

미강 추출물의 스트레스 호르몬 생성 억제 효과 분석

본 발명의 방법으로 제조한 미강의 발효 추출물을 대상으로 스트레스 억제 효과가 있는지 확인하기 위해 우울증 및 불안장애가 유발된 마우스 모델을 제조하였다. 이를 위해 평균 체중 250± 20g의 Sprague Dawley을 사용하였으며, 실험동물 마취 후 사지를 고정시킨 뒤 속목동맥과 바깥목동맥의 분지지점까지 노출시켰다. 바깥목동맥를 묶고 절단한 뒤, 절단된 바깥목동맥으로부터 나일론사를 이용해 속목동맥를 폐쇄하고 1시간 동안 중대뇌동맥(MCA)의 혈관폐쇄를 통한 혈액공급의 중단을 유지켰다. 1시간 동안 혈액공급이 중단된 상태에서 혈액을 재관류(reperfusion)시키는 방법으로 중대뇌동맥 결찰(middle cerebral artery occlusion; MCAO)을 시켜 중대뇌동맥 결찰에 의한 뇌손상 유도 실험동물을 제조하였다.

이후, 질병 마우스를 대상으로 본 발명의 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물을 각각 섭취하게 하였고 각 마우스 군을 대상으로 몸무게 변화 및 스트레스 호르몬 변화를 측정하였다. 이때 대조군(control)은 정상상태의 마우스 군을 사용하였고, stress 군은 질병이 유발된 아무것도 처리하지 않은 마우스 군을 사용하였으며, 질병이 유발된 마우스군에 대해서 각각 미강 열수 추출물을 처리한 군(Rb) 및 미강 발효 추출물(Lw)을 처리한 군을 사용하였다. 각 시험군은 하기 표에 기재된 바와 같다.

시험군	처리 사항
대조군(control)	아무것도 처리하지 않은 정상 마우스군
스트레스 유발군(stress)	우울증 및 불안장애가 유발된 마우스 군
미강 열수 추출물 처리군(Rb)	우울증 및 불안장애가 유발된 마우스 군에 미강 열수 추출물을 섭취하기 한 군(마우스 체중 kg 당 115mg 의 추출물을 처리)
미강 발효 추출물 처리군(Lw)	우울증 및 불안장애가 유발된 마우스 군에 미강 발효 추출물을 섭취하기 한 군(마우스 체중 kg 당 123mg 의 추출물을 처리)
FLX 처리군	Fluoxetine 처리군(Selective Serotonine Reuptake Inhibitor)

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, Stress 군은 몸무게의 변화가 없었고 스트레스 호르몬은 증가한 것으로 나타났다. 한편, 미강의 열수 추출물 및 발효 추출물을 처리한 군은 스트레스 호르몬의 수준이 스트레스 유발 군에 비해 낮게 측정된 것으로 나타났고, 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 스트레스 호르몬 억제 효과가 더 우수한 것으로 나타났다.

< 실시예 3>

미강 추출물 섭취에 따른 행동평가 분석

미강 추출물 처리에 따른 우울증/불안장애의 행동평가를 확인하기 위해 상기 실시예 2의 시험군 마우스군을 대상으로 강제 수영과 십자형 높은 미로 테스트를 실시하였다. 우울증/불안장애가 유도되면 강제 수영 테스트에서 행동은 부동성이 증가하고 수영시간이 감소되며, 높은 미로 테스트에서 행동은 닫힌 공간에 머무는 시간이 열린 공간에서 머무는 시간보다 증가하게 된다. 이러한 평가 기준을 기초로 본 발명의 미강 추출물이 우울증 및 불안장애로 유발되는 행동을 개선하는 효과가 있는지 분석하였다.

분석 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 미강 추출물을 처리한 군은 스트레스 유발군에 비해 부동성이 감소하고, 수영시간이 증가하였으며, 열린 공간에 머무는 시간이 증가하는 것으로 나타났고, 이러한 효과는 미강 열수 추출물에 비해 미강 발효 추출물이 더 효과적인 결과를 도출하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 미강 추출물이 우울증 및 불안장애로 유발되는 행동이상 증상을 유의적으로 개선시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

미강 추출물 섭취에 따른 뇌 세포에 미치는 영향 분석

<4-1> 뇌세포 사멸 억제효과

불안감 및 우울증 증상이 초래되면 뇌의 세포사멸이 유발되는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 미강 추출물 처리 시 뇌의 세포사멸을 억제하는 효과가 있는지 분석하기 위해, 상기 실시예 2에서 사용한 각 시험군의 마우스를 대상으로 우울증/불안장애 및 인지장애를 유도시킨 다음, 2주 후에 각 실험동물을 치사 시킨 뒤 세포사멸을 확인할 뇌에 있는 해마의 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 부위를 몰딩(molding)한 후 크라이오스태트(Cryostat)으로 고정한 뇌 조직을 동결절편하였으며, 절편된 조직을 고정시키고 TUNEL reagent를 처리하여 세포사멸이 일어난 세포를 관찰하였다.

그 결과, 스트레스가 유발된 군의 Dentate Gyrus에서는 사멸된 세포의 수가 약 150개인 것으로 분석되었고, 미강 열수 추출물을 주입한 군은 120개로 나타났으며, 미강 발효 추출물을 주입한 군은 38개인 것으로 측정되었다. 또한 스트레스 군의 CA1에서는 사멸된 세포의 수가 약 99개, 미강 열수 추출물 처리군은 약 70개, 미강 발효 추출물 처리군은 약 27개로 측정되었고, CA3에서는 사멸된 세포의 수는 스트레스군의 경우 약 75개, 미강 열수 추출물 처리군의 경우 약 50개, 미강 발효 추출물 처리군의 경우 약 28개로 측정되었다(도 3a 및 3b 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 미강 추출물이 스트레스로 인한 우울증, 불안증 및 인지장애로 유발되는 뇌 세포의 세포사멸을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었고 특히 미강 열수 추출물에 비해 미강의 발효 추출물이 더욱 효과적으로 세포 사멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

<4-2> 뉴런 증가 효과

나아가 본 발명자들은 미강 추출물 처리에 따른 뉴런의 증가 효과가 있는지를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 하였다. 먼저, 해마의 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 뇌조직에 1차 항체(Primary antibody) 처리와 2차 항체(Secondary antibody) 처리를 하였으며, 여기에 사용되는 항체는 NeuN을 사용하였다. 상기와 같이 면역조직화학분석을 통해 해마의 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 부위에 존재하는 뉴런(Neuron)의 세포수를 확인하였다.

분석 결과, 스트레스 유발군에서는 Dentate Gyrus, CA1 및 CA3 부위에서의 뉴런 세포 수가 각각 약 196개, 58개, 85개인 것으로 측정되었으며, 미강 열수 추출물을 처리한 군에서는 각각 약 220개, 70개, 102개인 것으로 나타났고, 미강 발효 추출물을 처리한 군에서는 각각 246개, 70개, 102개인 것으로 나타났다(도 3c 및 3d 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 미강 추출물이 스트레스로 인한 우울증, 불안증 및 인지장애로 유발되는 뇌의 증상에서 뉴런 세포수를 증가시켜

증상을 개선시킬 수 있을 것으로 예상할 수 있었다.

< 실시예 5>

미강 추출물의 신경영양인자 발현에 미치는 영향분석

본 발명자들은 미강 열수 추출물 및 미강 발효 추출물 처리에 따른 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였는데, 즉, 실험동물을 치사 시킨 뒤 뇌 조직을 마쇄한 후, TRI reagent, chloroform 및 isopropanol을 이용하여 RNA를 추출하였다. cDNA로 합성하여 신경영양인자 (BDNF, NGF 및 GDNF) primer를 이용하여 유전자를 증폭시킨 뒤 해당 유전자의 발현을 전기영동으로 확인하였다.

분석 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 스트레스가 유발되어 불안감 및 우울증이 유발된 마우스 군에서는 BDNF, NGF 및 GDNF 모두가 정상 군에 비해 발현이 억제되어 있는 것으로 나타났다. 반면, 미강 추출물 특히 미강 발효 추출물이 처리된 군에서는 이들 물질의 발현 억제가 감소되어 스트레스 유발군에 비해 발현 정도가 증가된 것으로 나타났다(도 4 참조).

< 실시예 6>

미강 추출물 처리에 따른 뉴런 및 세로토닌 증가 효과 분석

미강 추출물 처리에 따른 뉴런과 세로토닌의 발현정도를 알아보기 위하여 면역조직화학법을 수행하였는데, 이를 위해 실험동물을 치사 시킨 뒤 뉴런 및 세로토닌을 확인할 뇌에 있는 해마의 CA1 부위를 몰딩(molding)한 후 크라이오스태트(Cryostat)로 고정한 뇌조직을 동결절편하였으며, 절편된 조직에 1차 항체(Primary antibody)와 2차 항체(Secondary antibody) 처리를 하였으며, 여기에 사용된 항체는 NeuN (neuronal marker)과 5-HT (serotonin marker)이다.

분석결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 스트레스 군에서의 CA1 부위의 세로토닌의 수는 약 10개로 정상 마우스 군에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났으나, 미강 발효 추출물이 주입된 군에서 CA1 부위의 세로토닌의 수는 약 31개로 현저하게 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 미강 발효 추출물을 처리한 군의 해마 CA1 부위에서 뉴런과 세로토닌의 발현이 월등히 증가하였음을 알 수 있었다(도 5 참조).

< 실시예 7>

미강 추출물 처리에 따른 시냅토파이신의 발현증가 분석

미강 추출물 처리에 따른 시냅토파이신(신경 시냅스의 표지 단백질)의 발현정도를 알아보기 위하여 면역조직화학법을 수행하였는데, 이를 위해 실험동물을 치사 시킨 뒤 뉴런 및 세로토닌을 확인할 뇌에 있는 해마의 CA1 부위를 몰딩(molding)한 후 크라이오스태트(Cryostat)로 고정한 뇌조직을 동결절편하였으며, 절편된 조직에 1차 항체(Primary antibody)와 2차 항체(Secondary antibody) 처리를 하였으며, 여기에 사용된 항체는 SYP (synaptophysin; synaptic vesicle marker) 이다.

분석 결과, 스트레스 군에서의 CA1 부위의 시냅토파이신 발현 세포수는 약 35개로 정상군 105개에 비해 33%로 현저하게 감소된 것으로 나타났으며, 반면 미강 추출물을 처리한 군에서는 시냅토파이신 발현 세포수가 증가한 것으로 나타났는데, 미강 열수 추출물 처리군에서는 약 58개로, 미강 발효 추출물 처리군에서는 약 73개로 유의적으로 증가한 것으로 나타났다(도 6 참조).

< 실시예 8>

미강 추출물 처리에 따른 인지장애 개선 효과분석

미강 추출물 처리에 따른 인지장애의 개선 정도를 확인하기 위해 모리스 수중 미로 테스트를 실시하였다.

분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 미강 발효 추출물을 처리한 군의 도피 잠재기가 처리하지 않은 군에 비해 감소된 것으로 나타났고, 도피대가 있던 위치에 머무르는 시간은 미강 발효 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 월등히 높게 나타났음을 알 수 있었다. 즉 이러한 결과를 통해 미강 발효 추출물은 인지장애를 회복시키는 효과가 우수하다는 것을 알 수 있었다. 참고로 도 7에서 sham은 MCAO를 수행하지 않고, saline을 주입한 그룹인 정상 실험동물을 나타낸 것이고 vehicle은 MCAO를 수행하고, saline을 주입한 그룹인 대조군을 나타낸 것이며, donepezil은 MCAO를 수행하고, donepezil을 주입한 그룹인 양성대조군을 나타낸 것이다.

< 실시예 9>

미강 추출물 처리에 따른 인지장애 유발 마우스의 행동테스트 분석

미강 발효 추출물 처리에 따른 인지장애 개선 정도를 행동테스트로 분석하기 위해, 신 물체 탐색 검사를 실시하였다. 즉, 각 시험군 마우스를 대상으로 신 물체를 탐색하는 시간을 측정하였다.

분석 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 미강 발효 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 미강 발효 추출물을 처리한 군에서 신 물체를 탐색하는 시간이 월등히 높은 것으로 나타났고, 인지장애 회복이 향상되었음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11556P

20130524

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(a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도에서 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양하는 단계;
(c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계를 통해 수득한 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계에서 여과하여 수득한 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결 건조하는 단계를 포함하는, 불안, 우울증 또는 인지장애의 개선 및 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 (b) 단계의 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)은 미강 열수 추출물 100 중량% 대비 1 내지 30 중량%의 양으로 접종하여 제조한 것을 특징으로 하는 방법.