KR101620153B1 - Composition for preventing or treating ostarthritis comprising Glehnia littoralis - Google Patents

Abstract

본 발명은 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갯방풍 추출물은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6 또는 TNF-의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 파골세포 분화를 감소시키는 효과가 우수하여 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis or osteoporosis comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient. The present invention relates to a method for preventing or treating osteoarthritis or osteoporosis, which is excellent in reducing or inhibiting the activity of the inflammatory cytokines IL-17, IL-6 or TNF-, In addition, there is no cytotoxicity, there is no toxicity to the drug, and no side effects, so that it can be safely used even when taken for a long time, and it has a stable effect in the body.

Description

갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating ostarthritis comprising Glehnia littoralis}[0001] The present invention relates to a composition for preventing or treating arthritis,

본 발명은 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoarthritis or osteoporosis comprising an extract of Aspergillus oryzae as an active ingredient.

인체는 약 200 여개의 관절로 이루어져 있다. 관절이란 뼈와 뼈가 만나는 부위이다. 관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록, 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다.The human body consists of about 200 joints. Joints are the sites where bones and bones meet. The joints are made up of cartilage, joint capsule, synovial membrane, ligament, tendon, and muscle to smoothly move between the bones and the bones, and absorb the impact caused by the movement.

이러한 관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균 감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염, 결합조직의 퇴행성 변화로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.Inflammatory diseases in these joints are caused by chronic rheumatoid arthritis, which is understood to be caused by autoimmunity, infectious arthritis caused by bacterial infection, deformed arthritis caused by degeneration or destruction of articular cartilage or bone due to various causes, And crystalline arthritis in which soluble metabolites are deposited as crystals in the connective tissue around the joints.

퇴행성 관절염, 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포(chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여, 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형II 콜라겐(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨-1(interleukin-1) 및 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라, 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.Degenerative arthritis, i.e., osteoarthritis, is caused by degeneration of aging and the like in chondrocytes constituting joints, thereby inhibiting the synthesis of type II collagen (type II collagen) and proteoglycan, which are matrix materials of joints in chondrocytes, The production of inflammatory cytokines, such as interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha, has led to the synthesis of matrix metalloproteinases (MMPs) It is a disease caused by destruction of joint tissue due to increase in activity in articular cells.

또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과, 생성된 일산화질소에 의한 자가 증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에서의 염증반응을 유발시킨다. In addition, arthritis is further exacerbated by the production of nitric oxide by inflammatory cytokines and the production of self-amplifying cytokines by the produced nitric oxide, which leads to the synthesis of more MMPs and accelerates the degradation of joint matrix. At the same time, inflammatory cytokines increase the production of prostaglandin E2, a lipid metabolite, leading to an inflammatory response in arthritis.

류마티스성 관절염은 만성 전신성 염증 질환으로 대칭성, 다발성의 관절염과 이에 따른 관절의 손상 및 변형이 생기는 질환이다. 류마티스성 관절염에 대한 치료를 받지 않을 경우에는 경과가 불량하여 관절 기능의 장애를 나타내며, 더 지속되면 관절 기능의 장애로 인하여 일상생활에 지장을 받는다. 국내에서는 전인구의 약 1%가 류마티스성 관절염으로 고생하고 있을 것으로 추정되는데, 류마티스성 관절염의 발생률은 남성보다 여성이 3배 정도 높으며 주로 20 ~ 40대에서 발생하는 것으로 알려져 있다. Rheumatoid arthritis is a chronic systemic inflammatory disease characterized by symmetrical, multiple arthritis and subsequent joint damage and deformation. In the absence of treatment for rheumatoid arthritis, the course is poor and indicates a disability of the joint function, and if persistent, disability of the joint function interferes with daily life. In Korea, it is estimated that about 1% of the whole population is suffering from rheumatoid arthritis. The incidence of rheumatoid arthritis is three times higher in women than in men, and it is known to occur mainly in the 20s and 40s.

류마티스성 관절염의 주요 원인이 점차 밝혀지고 있으며, 유전적인 요인과 감염, 호르몬의 이상 등이 원인 인자로 생각되고 있다. 이러한 원인 인자로 인하여 '자가면역' 현상이 생기는데, 자가면역이란, 우리 몸의 면역조절 기능 이상으로 인해 만성 염증이 몸의 여러 부위에서 다발적, 지속적으로 일어나는 현상이다.The main causes of rheumatoid arthritis are becoming increasingly evident, and genetic factors, infections, and hormonal abnormalities are thought to be causative factors. Because of these causative factors, 'autoimmune' phenomenon occurs. Autoimmune is a phenomenon that chronic inflammation occurs in many parts of the body due to abnormality of immunity control of our body.

한편, 상기 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 신경관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발작, 경직을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.On the other hand, the drugs used in the treatment of arthritis can be classified based on the main mechanism of action such as reduction of inflammation, delay of disease progression, and decrease of uric acid concentration, and many neuroarthritis treating drugs act to reduce inflammation. Inflammation is a pathological process that causes pain, swelling, warmth, seizures, and stiffness. Drugs that rapidly relieve inflammation include steroidal anti-inflammatory drugs, including aspirin, non-steroidal anti-inflammatory drugs and cortisone.

비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증을 완화시키는 효과가 있으나, 위장장애가 나타나거나 복통을 유발하는 경우도 있기 때문에, 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해 체중 증가나 고혈압 등의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs have the effect of reducing pain and relaxing nerve joints and relieving inflammation. However, because of gastrointestinal disturbances or abdominal pain, it is recommended that non-steroidal anti-inflammatory drugs be given to people with active peptic ulcer or gastrointestinal bleeding Use prohibited. Steroidal anti-inflammatory drugs are not used for degenerative arthritis due to serious side effects such as weight gain and hypertension compared with their effects.

특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고, 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며, 이는 신경관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.In particular, steroidal anti-inflammatory drugs have nothing to do with the causative treatment of the disease, and may simply induce excessive use of the joints by temporarily reducing the pain, which causes destruction of the nerve joints and deterioration of the disorder. It requires attention.

따라서, 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 동안 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.Therefore, conventional therapies used for joint damage such as arthritis have limited effectiveness, involve obvious toxic side effects, can not be used continuously for a long period of time, and their effectiveness is limited. Therefore, New therapies or therapeutic agents are in desperate need.

한국등록특허 제656571호Korean Patent No. 656571 한국등록특허 제585562호Korean Patent No. 585562

이에 본 발명자들은 갯방풍(Glehnia littoralis)이 염증성 사이토카인을 억제하고 파골세포를 감소시킨다는 것을 규명함으로써 관절염 또는 골다공증의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention confirmed that Glehnia littoralis inhibits inflammatory cytokines and reduces osteoclasts and thus can be used as a therapeutic agent for arthritis or osteoporosis, thus completing the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, which contains Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다 .Another object of the present invention is to provide a health functional food for preventing or ameliorating arthritis or osteoporosis, which comprises Glehnia littoralis as an active ingredient.

나아가 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 파골세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공하는 것이다.It is a further object of the present invention to provide a method for inhibiting osteoclast differentiation, which comprises treating osteoclasts in vitro with Glehnia littoralis extract.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, which comprises Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 메탄올을 이용하여 수득한 메탄올 추출물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the Glehnia littoralis extract may be a methanol extract obtained by using methanol.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6, 인터페론-감마 또는 TNF-α의 활성 및 생성을 감소 또는 억제할 수 있다.In one embodiment of the invention, the Glehnia littoralis extract may reduce or inhibit the activity and production of the inflammatory cytokines IL-17, IL-6, interferon-gamma or TNF-a.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 연골파괴 인자인 MMP1(metalloproteinase 1), MMP3(metalloproteinase 3), MMP13(metalloproteinase 13)의 발현을 억제하여 연골파괴를 감소시키고, 연골재생 인자인 Timp1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 및 Timp3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현은 촉진시켜 연골재생 활성을 가질 수 있다. In one embodiment of the present invention, the Glehnia littoralis inhibits cartilage destruction by inhibiting expression of MMP1 (metalloproteinase 1), MMP3 (metalloproteinase 3), and MMP13 (metalloproteinase 13) (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) and Timp3 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3), which are cartilage regeneration factors.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)은 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함되어 있을 수 있다. In one embodiment of the present invention, the Glehnia littoralis extract may be contained at a concentration of 0.1 ug / ml to 500 ug / ml.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관절염은 노인성 관절염, 퇴행성 관절염, 자가면역관절염, 골관절염, 류마티스관절염 및 비만이나 고지혈증을 동반한 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the arthritis may be selected from the group consisting of geriatric arthritis, degenerative arthritis, autoimmune arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, and arthritis associated with obesity or hyperlipemia.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may further comprise coenzyme Q10.

본 발명의 일실시예에 있어서, 코엔자임 Q10을 더 포함하는 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, coenzyme Q10 may be contained at a concentration of 3 to 6 uM and cochineal extract may be contained at a concentration of 200 to 300 ug / ml.

또한, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis, which comprises Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에 코엔자임 Q10을 더 포함할 수 있다.In one embodiment of the present invention, the composition may further comprise coenzyme Q10.

또한, 본 발명은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 파골세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inhibiting osteoclast differentiation, comprising treating osteoclasts with Glehnia littoralis extract in vitro.

또한, 본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. Further, the present invention provides a health functional food for preventing or ameliorating arthritis or osteoporosis comprising Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명은 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 갯방풍 추출물은 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6 또는 TNF-α의 활성을 감소 또는 억제시키는 활성이 우수하고, 파골세포 분화를 감소시키는 효과가 우수하여 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료할 수 있는 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.The present invention relates to a composition for preventing or treating osteoarthritis or osteoporosis, which comprises Glehnia littoralis as an active ingredient. The present invention relates to a method for preventing or treating osteoarthritis or osteoporosis, which is excellent in the activity of reducing or inhibiting the activity of the inflammatory cytokines IL-17, IL-6 or TNF-a and osteoclast differentiation, The composition can be used as a composition which can be treated.

또한, 세포독성이 일어나지 않으며, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에서도 안정한 효과가 있다.In addition, there is no cytotoxicity, toxicity to the drug, and side effects are avoided, so that they can be used safely even when taken for a long period of time and have a stable effect in the body.

도 1은 마우스로부터 비장세포를 수득하여 갯방풍 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 인간 전혈에서 분리한 PMBC 세포에 갯방풍 추출물을 농도별로 처리한 뒤 세포독성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 마우스 비장세포에 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 농도별로 처리하여 배양 후 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정한 결과이다.
도 4는 인간 전혈에서 분리한 PMBC 세포를 anti-CD3 0.5 g/mL로 배양한 뒤 IL-17과 IL-6의 양을 ELISA 로 측정한 결과이다.
도 5는 갯방풍 추출물에 의한 관절염 억제 효과를 알아보기 위하여 마우스의 골수세포를 MCSF 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화하도록 유도한 뒤 파골세포 분화 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 파골세포 억제 효과를 관찰하기 위하여 파골세포와 관련된 분자를 Real time PCR로 관찰 한 결과이다.
도 7은 6주령 마우스와 35주령 마우스 비장세포에 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양 후 IL-17, IFN-r의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 8은 마우스 비강세포에 anti-CD 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 250 g/mL 농도로 처리하여 배양 후 IL-17, IFN-r와 TNF-α의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 9는 인간 전혈세포에서 분리한 PMBC 세포를 anti-CD3 0.5 g/mL에서 배양한 뒤 갯방풍 추출물을 250 g/mL 농도로 처리하여 48시간 배양 후 IL-17, IL-6, IFN-r의 양을 ELISA로 측정한 결과이다.
도 10은 갯방풍 추출물에 의한 골관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 골관절염 유도 마우스를 대상으로 통증측정을 한 결과이다.
도 11은 연골파괴 Catabolic pathway 관련 분자와 Anabolic pathway 관련 분자의 발현을 Realtime PCR로 조사한 결과이다.
도 12는 갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물 모델 치료 효과 및 항체 조절 효과를 확인한 결과이다.
도 13은 갯방풍 추출물에 의한 류마티스 관절염 치료 효과를 알아보기 위하여 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)의 관절에 H&E 염색으로 염증세포의 침윤정도 및 Safranin O로 연골의 파괴정도를 관찰한 결과이다.
도 14는 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)에서 얻은 비장세포의 CD-4 세포에서 IL-17 발현양을 FACS로 조사한 결과이다.
도 15는 5주간 갯방풍을 투여한 류마티스 관절염 마우스(IL-1Rako)에서 얻은 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 TRAP 양성 세포를 조사한 결과이다.
도 16은 마우스의 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 처리하여 세포를 자극한 후, 코엔자임 Q10 단독처리, 갯방풍 추출물 단독 처리 및 코엔자임 Q10과 갯방풍 추출물 병용처리에 따른 TRAP 양성 세포를 조사한 결과이다.FIG. 1 shows the result of obtaining spleen cells from a mouse, treating the extracts of Ganoderma lucidum with concentration, and confirming cytotoxicity.
FIG. 2 is a result of examining the cytotoxicity of PMBC cells isolated from human whole blood by treating the Pseudomonas sp.
FIG. 3 shows the results of measurement of IL-17 and TNF alpha by ELISA after incubation with anti-CD3 0.5 ug / ml or LPS 100 ng / ml on mouse spleen cells and cultured by treatment with various concentrations of Ganoderma lucidum extract.
FIG. 4 shows the results of measuring the amounts of IL-17 and IL-6 by ELISA after culturing PMBC cells isolated from human whole blood with anti-CD3 0.5 g / mL.
FIG. 5 shows the results of confirming the degree of osteoclast differentiation after inducing the differentiation of bone marrow cells of the mouse in the presence of MCSF and soluble RANKL in order to examine arthritis inhibition effect by the extract of Guanxia fusiformes.
FIG. 6 shows the results of real-time PCR observation of osteoclast-related molecules in order to observe the osteoclast inhibitory effect.
FIG. 7 shows the results of measurement of the amounts of IL-17 and IFN-r by ELISA after incubation with anti-CD3 0.5 g / mL or LPS 100 ng / ml in 6-week-old mice and 35-week-old mouse splenocytes.
FIG. 8 shows the effect of IL-17, IFN-r, and TNF-α on the activity of anti-CD 0.5 g / mL or LPS 100 ng / The amount was measured by ELISA.
FIG. 9 shows that PMBC cells isolated from human whole blood cells were cultured at a concentration of 0.5 g / mL of anti-CD3 and then cultured for 48 hours at a concentration of 250 g / mL. The IL-17, IL-6 and IFN- Was measured by ELISA.
FIG. 10 shows the result of measuring the pain of osteoarthritis-induced mice in order to examine the therapeutic effect of osteoarthritis caused by the extracts of Ganoderma lucidum.
FIG. 11 shows the results of Realtime PCR for the expression of molecules related to cartilage destruction catabolic pathway and anabolic pathway-related molecules.
FIG. 12 shows the results of confirming the therapeutic effect and antibody-modulating effect of an animal model of rheumatoid arthritis using a rhizomes.
FIG. 13 shows the effect of the extract of R. japonicus on the treatment of rheumatoid arthritis. The degree of infiltration of inflammatory cells by H & E staining on the joints of rheumatoid arthritis mice (IL-1Rako) .
FIG. 14 shows the results of FACS analysis of the amount of IL-17 expressed in CD-4 cells of spleen cells obtained from a rheumatoid arthritis mouse (IL-1Rako) administered with a 5-week shimadzu.
FIG. 15 shows the results of stimulation of RANKL and M-CSF with TRAP-positive cells in bone marrow cells obtained from a rheumatoid arthritis mouse (IL-1Rako) administered with 5-week shrimp.
FIG. 16 shows results of TRAP-positive cells treated with coenzyme Q10 alone, cochineal extracts, and coenzyme Q10 and cochineal extracts in combination with RANKL and M-CSF to treat bone marrow cells of mice, .

본 발명은 갯방풍(Glehnia littoralis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis comprising an extract of Glehnia littoralis as an active ingredient.

본 발명자들은 관절염 치료를 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 갯방풍에 주목하였는데 갯방풍은 바닷가 모래땅에서 잘 자라는 산형과의 풀로 바닷가의 모래땅에서 자란다. 전체에 흰색 털이 나고 뿌리는 모래 속에 묻히며 높이는 20cm 정도이다. 잎자루는 길고 잎은 깃꼴겹잎으로 삼각형이나 달걀 모양 삼각형이다. 작은 잎은 타원형 또는 달걀 모양 원형으로 두껍고 윤이 나며 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 흰색으로 6 ~ 7월에 피는 것으로 알려져 있다. While studying to develop a new therapeutic agent for treating arthritis, the present inventors have paid attention to the nematocysts, which grow well in the sandy beaches and grow in the sandy beaches. The whole is covered with white hairs and the roots are about 20cm high. The petiole is long and the leaf is a double-leaf type with triangular or oval triangle. Leaves are oval or egg-shaped, thick and shiny, with sawtooth on edge. Flowers are known to bloom in June to July in white.

생약으로 쓰이는 해방풍은 뿌리를 말린 것이며 한방에서는 발한해열진통약으로 쓰이고, 유주성 다발성 신경통, 건위 강장의 특효약이기도 하며 매일 먹으면 중풍에 걸리지 않는다. 또한, 어지럼증, 두통, 눈에서 괜히 눈물이 줄줄 흘러내릴 때, 사지관절이 아프고 경련이 날 때도 효과가 있다. 나아가 여성의 냉증, 대하증, 부정기적 자궁 출혈에도 좋고 발한 작용이 강해서 감기에도 효과가 있다고 알려져 있다. It is used as a herbal medicine for fever, and it is a special medicine for multiple neuropathic pain and dry bowel syndrome. It is not affected by paralysis every day. It also works when dizziness, headache, tears run down from your eyes, and your limbs are aching and seizures. It is also known that it is effective for colds because it is good for sweating of women, great depression, irregular uterine bleeding and strong sweating.

그러나, 종래에는 갯방풍을 관절염의 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 내용에 대해서는 전혀 언급된 바가 없다. However, in the past, there has been no mention at all about the fact that the nasal sprays can be used for prevention or treatment of arthritis.

따라서 본 발명에서는 갯방풍 추출물이 관절염의 예방 또는 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였으며, 특히 갯방풍 추출물이 염증성 사이토카인 IL-17, IL-6, 인터페론 감마 또는 TNF-α를 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 파골세포 분화를 감소시키는 작용도 가지고 있음을 확인할 수 있었다. Therefore, the present invention was firstly applied to the present invention, and it was confirmed that the extract of Ganoderma camphorata can be used for the prophylactic or therapeutic treatment of arthritis. In particular, the extract of Ganoderma camphorata inhibits the inflammatory cytokines IL-17, IL-6, interferon gamma or TNF- And osteoclast differentiation was also observed.

보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에 의하면, 마우스 비장세포와 인간 PBMC 세포를 대상으로 MTT분석을 한 결과 세포독성이 관찰되지 않았다(도 1 및 도 2 참조).More specifically, according to one embodiment of the present invention, MTT analysis of mouse spleen cells and human PBMC cells revealed no cytotoxicity (see FIGS. 1 and 2).

또한 본 발명자들은 다른 일실시예를 통해 마우스 비장세포를 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였고, 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 Th17과 Th1 타입의 사이토카인인 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정한 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17과 TNF alpha 2가지 사이토카인 모두 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었으며(도 3 참조), 인간 전혈에서 분리한 PBMC 세포에서도 IL-17과 IL-6 생성이 감소된다는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).In addition, the present inventors cultured the mouse spleen cells with 0.5 μg / ml of anti-CD3 or 100 ng / ml of LPS through another embodiment, wherein the cells were treated with 25 μg / ml, 100 μg / ml, IL-17 and TNF alpha, which are typical Th17 and Th1 type cytokines, were measured by ELISA in supernatants after culturing at a concentration of 250 ug / ml. As a result, compared with the control group, IL-17 and TNF alpha were significantly decreased (see FIG. 3), and that IL-17 and IL-6 production was also decreased in PBMC cells isolated from human whole blood 4).

나아가 본 발명자들은 골수 마크로파지의 파골세포로의 분화에 대한 갯방풍의 영향을 확인 한 결과, M-CSF 및 RANKL에 의해 유도된 TRAP 양성인 다핵 파골세포의 형성은 갯방풍 추출물을 10 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비하여 절반정도까지 감소되었으며, 100 ug/ml 및 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 참조).Further, the inventors of the present invention have confirmed that the effect of the nematodes on the differentiation of bone marrow macrophages into osteoclasts results in the formation of TRAP-positive multinuclear osteoclasts induced by M-CSF and RANKL, , It was reduced to about half of that of the control group, and it was completely inhibited by the extracts of 100 .mu.g / ml and 500 .mu.g / ml of the bark extract (see FIG. 5).

또한 파골세포 억제 실험을 진행 한 세포에서 얻은 RNA에서 파골세포와 관련된 분자인 TRAP, MMP9, CTR 및 NFATc1 을 Real time PCR 로 분석 한 결과 갯방풍 추출물의 농도별로 감소됨을 확인 하였고, 특히 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 관찰 할 수 있었으며(도 6 참조), 연골파괴와 관련된 인자들에 대한 발현에도 갯방풍 추출물이 영향을 미치는지 조사한 결과, 연골파괴와 관련이 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13의 발현은 갯방풍에 의해 억제되는 것으로 나타나나 반면, 연골재생에 관련된 Anabolic pathway 관련 분자인 TIMP1, TIMP3의 발현은 갯방풍에 의해 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 11 참조). In addition, TRAP, MMP9, CTR, and NFATc1, which are related to osteoclast, were reduced by the concentration of the extract of R. japonicus by real time PCR, (Fig. 6). As a result of investigating the effect of the extract of Chrysanthemum morifolium extract on the expression of the factors related to the cartilage destruction, it was found that the catabolic-related molecule The expression of MMP1, MMP3, and MMP13 was suppressed by the nematocysts, whereas the expression of TIMP1 and TIMP3, anabolic pathway related molecules related to cartilage regeneration, was increased by the nematodes (see FIG. 11).

또한, 본 발명자들은 어린 마우스와 노령 마우스를 대상으로 마우스의 비장 세포를 분리하여 anti-CD3 또는 LPS로 세포를 자극시켜 염증성 사이토카인의 생성을 촉진시킨 후, 이들 세포에 갯방풍 추출물을 처리한 다음 염증성 사이토카인의 생성 정도를 분석하였는데, 그 결과, 갯방풍 추출물을 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것으로 나타났다.In addition, the present inventors isolated spleen cells from a mouse in a young mouse and an old mouse, stimulated the cells with anti-CD3 or LPS to stimulate the production of inflammatory cytokines, And the production of inflammatory cytokines was analyzed. As a result, the production of inflammatory cytokines was significantly inhibited in the group treated with the extracts of P. vivax, compared to the group without treatment.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 갯방풍 추출물이 노인성 관절염의 치료에도 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다(도 7 및 도 8 참조). Therefore, the inventors of the present invention have found that the extract of Ganoderma lucidum can be effectively used for the treatment of geriatric arthritis (see FIGS. 7 and 8).

나아가 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물이 파골세포 이상으로 유발되는 골다공증도 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었는데, 특히 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스로부터 골수세포를 얻은 후, 골수세포에 RANKL 또는 M-CSF를 처리하고 이후 갯방풍 추출물을 투여한 경우, 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 군에 비해 파골세포 인자인 TRAP 양성 세포수가 현저히 감소되어 있는 것으로 나타났다(도 15 참조). Furthermore, the inventors of the present invention found that the present invention can prevent or treat osteoporosis induced by osteoclastogenesis. In particular, according to one embodiment of the present invention, bone marrow cells are obtained from a mouse, When treated with RANKL or M-CSF and then administered with the extract of Rhododendron japonicus, the number of TRAP-positive cells, which are an osteoclast factor, was significantly reduced as compared to the group without Rhodobendil extract (see FIG. 15).

그러므로 본 발명자들은 하기 본 발명의 실시예에서 입증된 실험 결과를 토대로 본 발명의 갯방풍 추출물이 관절염을 치료하기 위한 약학적 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, the inventors of the present invention have found that the present invention can be used for pharmaceutical use for treating arthritis based on the experimental results obtained in the following examples of the present invention.

구체적으로 본 발명의 갯방풍 추출물이 적용될 수 있는 상기 관절염으로는 이에 제한되지는 않으나, 노인성 관절염, 퇴행성 관절염, 자가면역관절염, 골관절염, 류마티스관절염 및 비만이나 고지혈증을 동반한 관절염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.Specifically, the arthritic condition to which the extract of the present invention can be applied is selected from the group consisting of geriatric arthritis, degenerative arthritis, autoimmune arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis and arthritis accompanied by obesity or hyperlipemia .

나아가 이 외에도 본 발명의 갯방풍 추출물은 면역과 관련된 염증제어 기능이 있고, 미토콘드리아의 기능을 회복하는 작용을 하여 미토콘드리아 관련 증후군을 치료할 수 있고, 자가면역질환을 예방 및 치료할 수 있으며, 골다공증을 예방 및 치료할 수 있다.In addition, the present invention relates to a method for preventing or treating osteoporosis, which comprises administering an effective amount of a compound of formula (I) Can be treated.

참고로 골다공증은 골대사 질환 중 하나로서, 골 대사는 골 형성을 담당하는 조골세포와 골 흡수를 담당하는 파골세포의 작용으로 이루어져 있으며, 이들 세포의 기능이 균형을 이루어 항상성을 유지한다. 그러나 조골세포 활성이 저하되거나 파골세포 활성이 증가되면 골밀도가 감소하여 골다공증이 유발될 수 있다. 골다공증의 유발 요인으로는 여성의 폐경, 갑상선 기능항진, 당뇨병, 스트레스, 흡연 및 운동 부족, 신체적 노화와 glucocorticoid 계열 약물의 복용 등이 알려져 있다. 또한, 파골세포는 대식세포 계열의 전구세포에서 다양한 분화유발인자들에 의해 분화되는데, 특히, 조골세포로부터 분비되는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골전구세포 및 파골세포 표면에 존재하는 RANK(receptor activator of nuclear factor kappa B)와 결합하여 파골전구세포가 파골세포로의 분화와 활성화를 유발한다. 분화한 파골세포는 NF-B, c-Fos, c-jun, AP-1, NFATc1의 활성화와 MAPK, ERK, JNK, p38 활성화 과정, Src, Akt MITF 활성화등을 통하여 TRAP (tartarate resistant acid phosphatase) cathepsin K, calcitonin receptor 등 파골세포 특이 단백질 발현을 촉진하게 된다.As a reference, osteoporosis is one of the bone metabolic diseases. Bone metabolism consists of osteoblasts responsible for osteogenesis and osteoclasts responsible for bone resorption. These cells balance their functions to maintain homeostasis. However, when osteoclast activity is decreased or osteoclast activity is increased, osteoporosis may be induced by decreasing bone density. The causes of osteoporosis are known as women's menopause, hyperthyroidism, diabetes, stress, smoking, lack of exercise, physical aging and taking glucocorticoid-based drugs. In addition, osteoclasts are differentiated by various differentiation factors in macrophage-like precursor cells, and in particular, RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) secreted from osteoblasts is present on osteoclast precursor cells and osteoclast surface (RANK), which induces the differentiation and activation of osteoclast precursor cells into osteoclasts. The differentiated osteoclasts were treated with TRAP (tartarate resistant acid phosphatase) through activation of NF-B, c-Fos, c-jun, AP-1 and NFATc1 and activation of MAPK, ERK, JNK, p38, Src, cathepsin K, and calcitonin receptor.

따라서 골다공증과 같은 골질환의 치료를 위해서는 파골세포의 분화를 억제하거나 파골세포 특이 단백질의 발현을 억제하는 물질이 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 점에서 본원의 갯방풍 추출물은 파골세포의 분화를 억제할 수 있고 TRAP 양성 세포수를 감소시킬 수 있어 골다공증의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.Therefore, in order to treat osteoporosis such as osteoporosis, a substance that inhibits osteoclast differentiation or inhibits the expression of osteoclast-specific protein can be used as a therapeutic agent. From this point of view, the present guinea fowl extract can inhibit the differentiation of osteoclasts and reduce the number of TRAP-positive cells, thus being useful as a therapeutic agent for osteoporosis.

뿐만 아니라, 본 발명에서는 보다 효과적인 골다공증 치료를 위해 갯방풍 추출물과 함께 병용할 수 있는 물질로서 코엔자임 Q10을 함께 사용할 수 있다는 것 규명하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면 마우스의 골수세포를 대상으로 M-CSF와 RANKL을 이용하여 세포를 자극시킨 후, 갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10을 함께 처리한 결과, 이들을 각각 처리한 군에 비해 함께 처리한 군이 매우 효과적으로 TRAP 양성 세포수가 감소되는 것으로 나타났다.In addition, according to the present invention, coenzyme Q10 can be used as a substance that can be used together with a guinea fowl extract for more effective treatment of osteoporosis. According to one embodiment of the present invention, After stimulation of cells with CSF and RANKL, co-treatment of cochineal extracts with coenzyme Q10 showed that the number of TRAP-positive cells was significantly reduced in the co-treated group compared to the treated group.

또한 코엔자임 Q10을 갯방풍 추출물과 함께 사용할 경우, 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 사용하고 갯방풍 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 함께 사용하는 것이 치료에 효과적임을 알 수 있었다.Also, when coenzyme Q10 was used in combination with the extract of Guanxi guinea pigs, coenzyme Q10 was used at a concentration of 3 ~ 6 uM and guinea fowl extract at a concentration of 200 ~ 300 ug / ml.

이 외에도 본 발명은 시험관 내에서 갯방풍 추출물(Glehnia littoralis)을 골수세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inhibiting osteoclast differentiation, comprising treating bone marrow cells with Glehnia littoralis extract in vitro.

한편, 본 발명에 따른 갯방풍(Glehnia littoralis)은 당업계에 공지된 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된추출물은 적절한 용매를 이용하여 갯방풍으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 갯방풍의 열수추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다.Meanwhile, the Glehnia littoralis according to the present invention can be obtained by extracting and isolating from nature using extraction and isolation methods known in the art, and the extract defined in the present invention can be obtained by using an appropriate solvent For example, a hot-water extract, a polar-solvent-soluble extract or a non-polar-solvent-extractable extract of P. vivax.

갯방풍으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 당업계에서 허용되는 용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. As the solvent suitable for extracting the extract from the sea breeze, any solvent acceptable in the art may be used, and water or an organic solvent may be used. Examples of the solvent include alcohols having 1 to 4 carbon atoms, acetone, ether, and the like, including purified water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, Various solvents such as benzene, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination. But is not limited to.

추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 본 발명의 갯방풍 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다.As the extraction method, any one of the methods such as hot water extraction method, cold extraction method, reflux cooling extraction method, solvent extraction method, steam distillation method, ultrasonic extraction method, elution method and compression method can be selected and used. In addition, the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process or may be purified using a conventional purification method. There is no limitation on the production method of the present invention, and any known method can be used.

예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 갯방풍 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.For example, the ginseng extract of the present invention can be prepared in powder form by an additional process such as vacuum distillation, freeze-drying, spray-drying, or the like, with the primary extract extracted by the hot water extraction or solvent extraction method described above have. Further, the primary extract can be further purified by using various chromatographies such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and the like, You can get it.

따라서 본 발명에 있어서 갯방풍 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.Therefore, the present invention is a concept that includes all the extracts, fractions and tablets obtained in each step of extraction, fractionation or purification, their diluted solutions, concentrates or dried products.

이러한 갯방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.The composition of the present invention comprising such an extract as an active ingredient may be a pharmaceutical composition.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the above-mentioned active ingredients. Examples of the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, A lubricant or a flavoring agent can be used.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described active ingredients for administration.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.The pharmaceutical composition may be in the form of granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, liquids, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions. For example, for formulation into tablets or capsules, the active ingredient may be combined with an oral, non-toxic pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like. Also, if desired or necessary, suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included as a mixture. Suitable binders include, but are not limited to, natural sugars such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, natural and synthetic gums such as corn sweeteners, acacia, tracker candles or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium Benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like. Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum and the like. Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile water and sterile water suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 갯방풍 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ug/ml 내지 500 ug/ml의 농도로 포함될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the peanut-shell extract of the present invention may be contained at a concentration of 0.1 ug / ml to 500 ug / ml based on the total weight of the composition.

또한, 본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 갯방풍 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. In addition, the composition of the present invention may also be a food composition. In addition to containing an effective component, the composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates such as an ordinary food composition as an additional ingredient have.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. The above-described flavors can be advantageously used as natural flavorings (tau martin), stevia extracts (e.g., rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.).

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.The food composition of the present invention can be formulated in the same manner as the above pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods. Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolates, foods, confectionery, pizza, ram noodles, other noodles, gums, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes, .

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 갯방풍 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. In addition, the food composition may contain various additives such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and flavors such as natural flavors, colorants and aging agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid, Salts of alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickening agents, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like. In addition, the food composition of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice drinks and vegetable drinks.

본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물은 천연물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료를 위한 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.The active ingredient of the present invention is a natural substance, which has little toxicity and side effects. Therefore, it can be safely used for long-term use for the prevention and treatment of arthritis and osteoporosis.

본 발명의 건강기능식품은 관절염 및 골다공증의 예방 및 치료를 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.The health functional food of the present invention can be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, and circles for the purpose of prevention and treatment of arthritis and osteoporosis.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.In the present invention, the term "health functional food" refers to a food prepared and processed by using raw materials or ingredients having useful functions in accordance with Law No. 6727 on Health Functional Foods, and the nutritional control on the structure and function of the human body Or for the purpose of obtaining a beneficial effect for health use such as physiological action.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.The health functional foods of the present invention may contain conventional food additives and, unless otherwise specified, whether or not they are suitable as food additives are classified according to the General Rules for Food Additives approved by the Food and Drug Administration, Standards and standards.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.Examples of the food items included in the above food additives include chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; Natural additives such as persimmon extract, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigment and guar gum; L-glutamic acid sodium preparations, noodle-added alkalis, preservative preparations, tar coloring preparations and the like.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.For example, the health functional food in the form of tablets can be prepared by granulating a mixture obtained by mixing the active ingredients of the present invention with excipients, binders, disintegrants and other additives in a usual manner, Or the mixture can be directly compression molded. In addition, the health functional food of the tablet form may contain a mating agent or the like if necessary.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 갯방풍 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.The hard capsule of the capsule-type health functional food can be prepared by filling a normal hard capsule with a mixture of an effective ingredient of the present invention and a mixture of an additive such as an excipient and an additive such as an excipient. And filling the mixture with a capsule base such as gelatin. The soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a coloring agent, a preservative and the like, if necessary.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.The ring-shaped health functional food can be prepared by molding a mixture of the active ingredients of the present invention, a mixture of an extract of Gucci windbreaker, an excipient, a binder and a disintegrant by a known method, and if necessary, Or it may be coated with a material such as starch, talc.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 갯방풍 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.The granular health functional food may be prepared by granulating a mixture of the active ingredients of the present invention with the extract of the present invention, excipient, binder, disintegrant and the like by a conventional method, and if necessary, And the like.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.The health functional food may be a beverage, a meat, a chocolate, a food, a confectionery, a pizza, a ramen, a noodle, a gum, a candy, an ice cream, an alcoholic beverage, a vitamin complex and a health supplement food.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 추가적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be further described by way of examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

통계처리Statistical processing

실험결과는 평균 표준편차로 표기하였고, 그 결과들은 차이를 분석하기 위하여 Tokey's test를 이용한 variance(ANOVA)로 분석하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
Experimental results were expressed as mean standard deviation. The results were analyzed by variance (ANOVA) using Tokey's test to analyze the differences. A p-value <0.05 was considered statistically significant.

<실시예 1> &Lt; Example 1 >

갯방풍 추출물의 제조Manufacture of Rhizoctonia sp.

본 실시예에 사용한 갯방풍 (Glehnia littoralis)은 2012년 9월 강릉에서 직접 채집하였으며 응달에서 건조한 후 추출하기 전까지 -25 에서 보관하였다가 해빙 후, 잘게 잘랐으며 80% 메탄올(MeOH)로 실온에서 24시간 동안 3회 추출한 뒤 여과하여 회전농축기로 감압 농축함으로써 갯방풍의 메탄올 가용성 분획(즉, 추출물)을 수득하였다.
The Glehnia littoralis used in this example was collected directly from Gangneung in September, 2012. After drying in the shade, it was stored at -25 until extraction, and then it was chopped and then cut into 80% methanol (MeOH) After three times of extraction, the mixture was filtered and concentrated under reduced pressure with a rotary evaporator to obtain a methanol-soluble fraction (i.e.

<실험예 1><Experimental Example 1>

MTT 분석MTT analysis

<1-1> 마우스 비장세포<1-1> Mouse splenocytes

갯방풍 추출물의 관절염 치료 효과 여부를 알아보기 위하여 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였으며, 37, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 그리고 100 g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 마우스의 비장세포를 anti-dinitrophenyl(DNP) IgE(0.1 g/mL)로 22시간 동안 반응시키고 HSA(1 g/mL)로 반응시키기 15분 전에 37에서 갯방풍 추출물을 처리하였다. 또한, 갯방풍 추출물의 세포독성 능력을 관찰하기 위해, Mosmann의 방법에 따라 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 확인하였다. 간략하게 말하면, 마우스의 비장세포에 갯방풍 추출물을 24시간 동안 반응시킨 후 MTT stock solution(5 mg/mL)을 더해 37, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 96 well multi plates에 acidic isopropanol을 더해 SpectraCount(Packard Instrument Co. Downers, III., Meriden, CT, USA)을 사용하여 560 nm에서 읽었다.Afforded the spleen (spleen) cells from the mice to investigate whether or arthritis treatment of Conger windproof extract, 10% _{37, 5% CO 2 incubator FBS} , 100 U / mL penicillin, and 100 g / mL streptomycin (streptomycin ). &Lt; / RTI &gt; The mouse spleen cells were treated with anti-dinitrophenyl (DNP) IgE (0.1 g / mL) for 22 hours and treated with anti-dandruff extract at 37 for 15 minutes before the reaction with HSA (1 g / mL). In addition, to observe the cytotoxic ability of the extracts of P. japonicus, it was confirmed by 3- (4,5 dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay according to Mosmann's method. Briefly, the mouse spleen cells were incubated for 24 hours with MTT stock solution (5 mg / mL) and reacted for 4 hours in a 37% 5% CO ₂ incubator. After the reaction, acidic isopropanol was added to 96-well multiplates and read at 560 nm using SpectraCount (Packard Instrument Co. Downers, Inc., Meriden, CT, USA).

그 결과, 갯방풍 추출물의 가장 높은 농도인 500 g/mL를 처리하였을 때에도 세포독성이 관찰되지 않았다(도 1 참조).
As a result, cytotoxicity was not observed even when 500 g / mL of the highest concentration of P. vivax extract was treated (see FIG. 1).

<1-2> 인간 PBMC 세포&Lt; 1-2 > Human PBMC cells

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)에 37, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 그리고 100 g/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM에서 배양하였다. 마우스의 비장세포를 anti-dinitrophenyl(DNP) IgE(0.1 g/mL)로 22시간 동안 반응시키고 HSA(1 g/mL)로 반응시키기 15분 전에 37에서 갯방풍 추출물을 처리하였다. 또한, 갯방풍 추출물의 세포독성 능력을 관찰하기 위해, Mosmann의 방법에 따라 3-(4,5 dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay로 확인하였다. 간략하게 말하면, 마우스의 비장세포에 갯방풍 추출물을 24시간 동안 반응시킨 후 MTT stock solution(5 mg/mL)을 더해 37, 5% CO₂ incubator에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 96 well multi plates에 acidic isopropanol을 더해 SpectraCount(Packard Instrument Co. Downers, III., Meriden, CT, USA)을 사용하여 560 nm에서 읽었다.Human whole blood (human peripheral blood) separating the PBMC (Peripheral blood mononuclear cell) 10 % at 37, 5% CO ₂ incubator for FBS, 100 U / mL penicillin, and 100 g / mL streptomycin DMEM with neomycin (streptomycin) is included in the Lt; / RTI &gt; The mouse spleen cells were treated with anti-dinitrophenyl (DNP) IgE (0.1 g / mL) for 22 hours and treated with anti-dandruff extract at 37 for 15 minutes before the reaction with HSA (1 g / mL). In addition, to observe the cytotoxic ability of the extracts of P. japonicus, it was confirmed by 3- (4,5 dimethyl-thiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay according to Mosmann's method. Briefly, the mouse spleen cells were incubated for 24 hours with MTT stock solution (5 mg / mL) and reacted for 4 hours in a 37% 5% CO ₂ incubator. After the reaction, acidic isopropanol was added to 96-well multiplates and read at 560 nm using SpectraCount (Packard Instrument Co. Downers, Inc., Meriden, CT, USA).

그 결과, 갯방풍 추출물의 가장 높은 농도인 500 g/mL를 처리하였을 때에도 세포독성이 관찰되지 않았다(도 2 참조).
As a result, cytotoxicity was not observed even when 500 g / mL, which is the highest concentration of Ganoderma lucidum extract, was treated (see FIG. 2).

<실험예 2><Experimental Example 2>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 IL-17 생성억제 활성 분석The inhibitory activity of IL-17 production by the extract of the present invention

본 발명자들은 갯방풍 메탄올 추출물이 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 다음과 같은 방법으로 조사하였다.
The inventors of the present invention investigated whether the methanol extract of P. aeruginosa inhibits the production of IL-17, an inflammatory cytokine, by the following method.

<2-1> 마우스 비장세포<2-1> Mouse splenocytes

먼저, 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였는데, 즉, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심 분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다. First, spleen cells were obtained from the mouse, that is, the spleen extracted from the mouse was teased by slicing the spleen tissue using a glass slide, and then erythrocytes in the spleen were removed with a red blood cell hemolysis solution. After that, PBS Splenocytes were obtained by adding a buffer solution and washing by centrifugation.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 ug/ml 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 Th17과 Th1 타입의 사이토카인인 IL-17과 TNF alpha 의 양을 ELISA 로 측정하였다.Then, 1x10 &lt; ⁶ &gt; of single cells isolated from the spleen was cultured with 0.5 [mu] g / ml of anti-CD3 or 100 ng / ml of LPS. At this time, the cells were cultured at a concentration of 25 μg / ml, 100 μg / ml and 250 μg / ml, and then cultured in a supernatant to express typical Th17 and Th1 cytokines IL-17 and TNF alpha Was measured by ELISA.

그 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17과 TNF alpha 2가지 사이토카인 모두 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었으며, 갯방풍 추출물을 25 ug/ml 처리하였을 때에도 염증성 사이토카인 억제 활성이 커 적은 용량을 처리하였을 때에도 효과가 큼을 알 수 있었다(도 3 참조).
As a result, the IL-17 and TNF alpha cytokines were significantly decreased in the shark's skin extract-treated group compared with the control group, and the inflammatory cytokine inhibitory activity It was found that the effect was remarkable even when a small capacity was processed (see FIG. 3).

<2-2> 인간 PBMC 세포&Lt; 2-2 > Human PBMC cells

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell) 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 0.5 g/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 사이토카인인 IL-17과 IL-6의 양을 ELISA 로 측정하였다.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (1 × 10 ⁶ ) isolated from human peripheral blood were cultured in a 24-well plate coated with 0.5 g / mL of anti-CD3 antibody. At this time, the cells were cultured at a concentration of 25 μg / ml, 100 μg / ml and 250 μg / ml, and the amount of cytokines IL-17 and IL-6 in the supernatant was measured by ELISA Respectively.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 갯방풍 추출물에 의해 확연히 억제되는 것으로 나타났으며, 염증성 사이토카인인 IL-6의 경우는 갯방풍 추출물의 농도에 의존적으로 IL-6의 생성이 감소되는 것으로 나타났다(도 4 참조).
As a result, it was shown that IL-17, which is an inflammatory cytokine, was significantly inhibited by the extract of the present invention. In the case of IL-6, which is an inflammatory cytokine, production of IL-6 (See Fig. 4).

<실험예 3><Experimental Example 3>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 관절염 억제 효과 분석Analysis of inhibition effect of arthritis by the present invention

파골세포 형성에 대한 갯방풍 추출물의 영향은 이미 공지된 방법을 약간 수정하여 마우스 골수 세포를 MCSF(macrophage colony-stimulating factor) 및 용해성 RANKL의 존재 하에서 분화하도록 유도하여 확인되었다(Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem. 90, 59-67). 골수세포는 6주령의 DBA/1J 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 준비하였고, 37에서 8구 챔버 슬라이드(3×10⁵세포/구; Nalge Nunc International, Naperville, IL)에 M-CSF(30 ng/ml:R&D Systems, Minneapolis, MN)의 존재하에서 정치되었다. 3일 후에 림프구를 포함한 비접착성 세포를 제거하고, 접착성 파골세포 전구세포를 M-CSF(30 ng/ml) 및 RANKL(30 ng/ml; Strathmann, Hamburg, Germany)의 존재하에서 추가로 4일 동안 배양하여 파골세포를 생산하였다. 배지는 M-CSF 및 RANKL로의 정치 동안에 1차례 교환하였다. 세포를 고정하고 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)에 대하여 염색 키트(sigma)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 실시하였다. 각 챔버에서 현미경으로 (40배율)관찰한 결과 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP 양성 다핵세포는 파골세포로서 계수되었다(Sugatani. et al. 2003,J. Cell. biochem. 90, 59-67).The effect of the extracts of P. vivax on osteoclast formation was confirmed by slightly modifying the known method to induce differentiation of mouse bone marrow cells in the presence of MCSF (macrophage colony-stimulating factor) and soluble RANKL (Sugatani et al. 2003, J. Cell. Biochem., 90, 59-67). Bone marrow cells were prepared from the femur and tibia of DBA / 1J mice at 6 weeks of age, and M-CSF (30 ng / ml) was added to the 37-8 chamber slides (3 × 10 ⁵ cells / well; Nalge Nunc International, Naperville, IL) : R & D Systems, Minneapolis, MN). After 3 days, non-adherent cells including lymphocytes were removed and adherent osteoclast precursor cells were further stained with M-CSF (30 ng / ml) and RANKL (30 ng / ml; Strathmann, Hamburg, Germany) Lt; RTI ID = 0.0 &gt; cells / day. &Lt; / RTI &gt; The medium was exchanged once during the incubation with M-CSF and RANKL. Cells were fixed and TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase) was stained using a staining kit (sigma) according to the manufacturer's protocol. Microscopic examination of each chamber (40 magnification) showed that TRAP-positive polynuclear cells containing more than 3 nuclei were counted as osteoclasts (Sugatani et al., 2003, J. Cell. Biochem., 90, 59-67).

갯방풍 추출물의 세포독성이 골수세포와 분화된 파골세포에서 측정되었다. 골수세포(1×10⁵ 세포/구)를 9구판에 접종하였고 24시간 동안 정치하였다. 다양한 농도의 갯방풍 추출물을 첨가한 후 48시간 동안 정치하고, 생존한 세포를 수용성 테트라졸리움 염 WST-8(Cell Counting Kit-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan)로 제조업자의 프로토콜에 따라 염색하였다. 분화된 파골세포에서 갯방풍 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여 앞서 설명된 바와 같이 골수세포를 파골세포로 분화하고, M-CSF 및 RANKL의 존재하에서 다양한 농도의 갯방풍 추출물과 48시간 동안 정치하였다. 세포를 TRAP에 대하여 염색하고 TRAP 양성인 다핵 세포를 계수하였다.The cytotoxicity of the extracts of P. japonicus was measured in bone marrow cells and differentiated osteoclasts. Bone marrow cells (1 × 10 ⁵ cells / well) were inoculated into 9 plates and allowed to stand for 24 hours. The cells were allowed to stand for 48 hours after the addition of various concentrations of Ganoderma lucidum extract and the surviving cells were stained with water-soluble tetrazolium salt WST-8 (Cell Counting Kit-8, Donjindo Laboratories, Kumamoto, Japan) according to the manufacturer's protocol. Bone marrow cells were differentiated into osteoclasts and allowed to stand for 48 hours in the presence of M-CSF and RANKL at various concentrations of the extracts of Ganoderma lucidum in order to measure the cytotoxicity of the extracts from the differentiated osteoclasts. Cells were stained for TRAP and counted for TRAP positive polynuclear cells.

파골세포가 관절염 관절의 뼈 파괴에서 상당한 역할을 하는 것으로 알려져 있으므로 골수 마크로파지의 파골세포로의 분화에 대한 갯방풍 추출물의 영향을 확인하였다. M-CSF 및 RANKL에 의해 유도된 TRAP 양성인 다핵 파골세포의 형성은 갯방풍 추출물을 10 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 대조군에 비하여 절반정도까지 감소되었으며, 100 ug/ml 및 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 알 수 있었다(도 5 참조).Since osteoclasts are known to play a significant role in bone destruction of arthritic joints, the effect of gingival extract on the differentiation of bone marrow macrophages into osteoclasts was confirmed. M-CSF and RANKL-induced TRAP-positive multinuclear osteoclasts were reduced to about half of that of the control group at the concentration of 10 ug / ml, and 100 ug / ml and 500 ug / ml (Fig. 5). The results are shown in Fig.

또한 파골세포 억제 실험을 진행 한 세포에서 얻은 RNA에서 파골세포와 관련된 분자인 TRAP, MMP9, CTR, NFATc1 을 Real time PCR 로 분석 한 결과 갯방풍 추출물의 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였고, 특히 500 ug/ml 용량의 갯방풍 추출물에 의해 완전히 억제되었음을 관찰 할 수 있었다.(도 6 참조).
In addition, TRAP, MMP9, CTR and NFATc1, which are related to osteoclast, were analyzed by real time PCR in RNA obtained from osteoclast inhibition experiments. As a result, ml, respectively (Fig. 6).

<실험예 4><Experimental Example 4>

본 발명의 갯방풍 추출물에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 분석Inhibitory effect of inflammatory cytokine inhibition by the present invention

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 염증성 사이토카인 억제 효과가 있는지를 다음과 같은 실험을 통해 조사하였다.
The inventors of the present invention investigated whether or not the extract of Rhododendron japonicus extract has an inflammatory cytokine inhibitory effect through the following experiment.

<4-1> young 마우스와 old 마우스의 비장세포를 대상으로 한 염증성 사이토카인 억제 분석<4-1> Inflammatory cytokine inhibition assay on spleen cells of young and old mice

먼저, 6주령의 young 마우스와 35주령의 old 마우스로부터 비장(spleen) 세포를 수득하였는데, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드(teasing slide)를 이용하여 비장조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장 내의 적혈구를 제거하였다. First, spleen cells were obtained from 6-week-old young mice and 35-week-old old mice. The spleens extracted from the mouse were obtained by finely dividing spleen tissue using a teasing slide, Lt; / RTI &gt;

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 48시간 배양하였고, 배양한 세포에 갯방풍 추출물을 25 ug/ml, 100 ug/ml, 250 ug/ml의 각 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 Th1 타입의 사이토카인인 IFN-r와 IL-6의 양을 ELISA로 측정하였다.Then, 1 × 10 ⁶ of single cells isolated from the spleen was cultured for 48 hours with 0.5 g / mL of anti-CD3 or 100 ng / mL of LPS. The cells were incubated with 25 μg / ml, 100 μg / ml and 250 ug / ml, respectively, and the amounts of IFN-r and IL-6, which are representative cytokines IL-17 and Th1 type cytokines, in the supernatant were measured by ELISA.

그 결과, 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 갯방풍 추출물을 처리한 군의 경우, IL-17, IFN-r와 IL-6 3가지 모두 유의성 있게 old 와 young 마우스에서 감소하는 것으로 나타났다(도 7 참조). 따라서 본 발명의 갯방풍 추출물은 young 마우스 뿐만 아니라 old 마우스에서도 염증성 사이토카인 억제효과가 뛰어나므로 노인성 관절염의 치료에도 효과적으로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
As a result, IL-17, IFN-r, and IL-6 were significantly reduced in old and young mice compared with the control group without shrimp extract 7). Therefore, it was found that the extract of the present invention of the present invention has an excellent inhibitory effect on inflammatory cytokines not only in young mice but also in old mice, and thus can be effectively used for the treatment of geriatric arthritis.

또한, 본 발명자들은 질병 마우스(관절염 유발 마우스)로부터 비장(spleen)세포를 수득하였으며, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드(teasing slide)를 이용하여 비장조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장 내의 적혈구를 제거하였다. 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다.The present inventors also obtained spleen cells from disease mice (arthritis-inducing mice), and the spleens extracted from the mice were chopped into spleen tissues using a teasing slide, Red blood cells were removed. Splenocytes were then obtained by adding PBS buffer solution and washing by centrifugation.

그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1×10⁶을 anti-CD3 0.5 g/mL 또는 LPS 100 ng/ml로 배양하였다. 상기 세포에 갯방풍 추출물을 250 ug/ml의 농도로 처리하여 배양 후 상등액(supernatant)에서 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 Th1 타입의 사이토카인인 IFN-r와 TNF alpha의 양을 ELISA로 측정하였다.Then, 1 × 10 ⁶ of single cells isolated from the spleen was cultured with anti-CD3 0.5 g / mL or LPS 100 ng / ml. After culturing the cells in a concentration of 250 μg / ml, IL-17 and Th1-type cytokines IFN-r and TNF alpha were measured by supernatant by ELISA Respectively.

그 결과, 대조군에 비하여 갯방풍 추출물 처리군의 경우 IL-17, IFN-r와 TNF alpha 3가지 모두 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다(도 8 참조).
As a result, it was found that the IL-17, IFN-r, and TNF alpha were significantly decreased in the group treated with the shark's pan extract, as compared with the control group (see FIG. 8).

<4-2> 인간 PBMC 세포에서의 염증성 사이토카인 생성 억제효과&Lt; 4-2 > Inhibitory effect on inflammatory cytokine production in human PBMC cells

인간 전혈(human peripheral blood)에서 분리한 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell) 1×10⁶을 anti-CD3 항체가 0.5 g/mL로 코팅(coating) 처리된 48 웰 플레이트에 분주하여 배양하였다. 이때, 상기 세포에 갯방풍 추출물을 250 ug/ml, 농도로 처리하여 48시간 배양 후 상등액(supernatant)에서 사이토카인인 IL-17과 IL-6, IFN-r의 양을 ELISA 로 측정하였다.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (1 × 10 ⁶ ) isolated from human peripheral blood were cultured in a 48-well plate coated with 0.5 g / mL of anti-CD3 antibody. At this time, the cells were cultured for 48 hours at a concentration of 250 ug / ml, and the amounts of cytokines IL-17, IL-6 and IFN-r in the supernatant were measured by ELISA.

그 결과, 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 갯방풍 추출물의 처리에 의해 확연히 생성량이 억제되는 것으로 나타났으며(약 10배 이상), 염증성 사이토카인인 IL-6과 IFN-r의 경우도 갯방풍 추출물 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다(도 9 참조).
As a result, it was shown that IL-17, which is an inflammatory cytokine, was significantly inhibited (about 10 times or more) by the treatment with the extract of the present invention and IL-6 and IFN-r which are inflammatory cytokines (Fig. 9). &Lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt;

<실험예 5><Experimental Example 5>

본 발명 갯방풍 추출물에 의한 골관절염 치료 효과 분석Analysis of the effect of osteoarthritis treatment by the present invention

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 골관절염 치료에 효과가 있는지를 알아보기 위하여 퇴행성 골관절염 유도 모델 마우스를 이용하여 갯방풍 추출물의 골관절염 개선도를 조사하였다.The inventors of the present invention investigated the degree of improvement of osteoarthritis of Ganoderma lucidum extract by using a degenerative osteoarthritis-inducing model mouse in order to find out whether the extract of Ganoderma sp.

퇴행성 골관절염 유도 모델 마우스에 갯방풍 추출물(GLE) 100 mg/kg을 투여하였으며, 양성대조군으로는 골관절염의 치료 약물로 사용되고 있는 Celecoxib를 5 mg/kg를 경구 투여한 군을 사용하였고 음성대조군으로는 GLE를 녹일때 사용한 Saline을 경구투여한 군을 사용하였다. 퇴행성 골관절염의 정도를 파악하기 위한 방법으로 Dynamic plantat aesthsiometer(Ugo Basile, Comerio, Italy)를 이용하여 통증측정을 진행하였고, 기계의 통증측정 방법은 측정 기계위에 그물로 된 판을 얹고 그 위에 아크릴로 된 동물고정틀 안에 측정할 실험동물을 넣은 후 측정기계로 약물이 주입된 오른발에 찔러 주었다. 찌른 후에 기계가 자동적으로 발을 떼는데 걸리는 시간(초)과 얼마만큼의 무게를 주었을 때 발을 떼는지(g)를 측정하여 그때 나오는 시간과 무게를 기입하여 통증 측정 그래프를 그렸다. In the degenerative osteoarthritis-induction model mice, 100 mg / kg of Gleevec extract (GLE) was administered. As a positive control, Celecoxib, which is used as a treatment for osteoarthritis, was orally administered at a dose of 5 mg / Was used to dissolve saline. To measure the degree of degenerative osteoarthritis, pain was measured using a dynamic plantar aesthsiometer (Ugo Basile, Comerio, Italy). Machine pain was measured by placing a net plate on the measuring machine, The animals were placed in an animal fixture and then stabbed in the right foot with the drug. After the stabbing, the time (in seconds) it takes the machine to automatically release the foot, and how much weight it takes to release the foot (g).

그 결과, 본 발명의 갯방풍 추출물을 주입한 군이 다른 군에 비해 골관절염 개선 정도가 가장 우수한 것으로 나타났고 이러한 개선 및 치료 정도는 종래 골관절염 치료제로 사용되고 있는 Celecoxib보다 더 우수한 효과임을 알 수 있었고, 특히 본 발명의 갯방풍 추출물은 투여 후 빠른 시간 안에(5일 만에) 통증의 정도가 50% 이상으로 현저하게 감소하는 것을 알 수 있었다(도 10 참조).
As a result, it was found that the group to which the present invention of the present invention was injected had the best improvement in osteoarthritis compared to the other groups, and the degree of improvement and treatment was superior to that of Celecoxib, which is conventionally used as a therapeutic agent for osteoarthritis. It was also found that the degree of pain was remarkably reduced to 50% or more within 5 days after the administration of the extract of the present invention (see FIG. 10).

<실험예 6><Experimental Example 6>

THP-1 세포에서 갯방풍에 의한 동화(catabolic) 및 이화(catabolic) 경로분석Analysis of catabolic and catabolic pathways in THP-1 cells

본 발명자들은 연골파괴와 관련 있는 Catabolic 관련 분자인 MMP1, MMP3, MMP13와 Anabolic pathway 관련 분자인 TIMP1, TIMP3의 발현에 본 발명의 갯방풍 추출물이 영향을 주는지 Realtime PCR로 조사하였다. The present inventors investigated the effect of the present invention on the expression of MMP1, MMP3, and MMP13, which are related to cartilage destruction, and TIMP1 and TIMP3, which are anabolic pathway related molecules, by Realtime PCR.

시험관내 실험으로 인간 유래 chondrocyte를 24시간 동안 전처리하여 세포 안정화를 시킨 후 IL-1b를 자극하여 세포의 활성을 촉진시킴과 동시에 갯방풍을 단독 처리한 후 24시간 배양한 다음 세포로부터 RNA를 수득하고 MMP1, MMP3, MMP13, TIMP1, TIMP3의 발현을 real time PCR로 관찰하였다. 이때 대조군으로는 갯방풍 추출물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.In vitro, human-derived chondrocyte was pretreated for 24 hours to stabilize the cells. IL-1b was stimulated to stimulate the activity of the cells. The cells were cultured for 24 hours, and RNA was obtained from the cells. Expression of MMP1, MMP3, MMP13, TIMP1 and TIMP3 was observed by real time PCR. At this time, the control group was a group not treated with the bark extract.

그 결과, 갯방풍 추출물을 처리한 군의 경우, MMP1, MMP3, MMP13의 발현이 현저하게 감소되어 있었고 반면 연골 재상과 관련된 인자인 Timp1, Timp3의 발현은 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 11 참조).
As a result, the expression of MMP1, MMP3, and MMP13 was markedly decreased in the group treated with shark's skin extract, whereas the expression of Timp1 and Timp3 associated with cartilage remodeling was significantly increased (see FIG. 11) ).

<실험예 7><Experimental Example 7>

본 발명의 갯방풍 추출물의 류마티스 관절염 치료 효과Effect of the present invention on the treatment of rheumatoid arthritis

본 발명자들은 갯방풍 추출물이 류마티스 관절염 치료 효과를 확인하기 위해 IL-Ra가 결여되어 자연 발생적으로 관절염이 생기는 류마티스 관절염 지수가 6점인 12주령의 IL-1Rako 마우스를 사용하여 주 3회 갯방풍 추출물을 경구 섭취하여 관절염 치료효과를 다음과 같은 방법으로 조사하였다.
The present inventors used a 12-week-old IL-1Rako mouse, which has a rheumatoid arthritis index of 6, which is spontaneously arthritis caused by lack of IL-Ra in order to confirm the therapeutic effect of rheumatoid arthritis. The effects of oral ingestion on arthritis were investigated by the following methods.

<7-1> 갯방풍에 의한 자가면역성 관절염 치료 효과 확인<7-1> Effectiveness of treatment of autoimmune arthritis by shade wind

상기 준비한 류마티스 관절염 동물 모델에 갯방풍을 투여하고 5주간 자가면역성 관절염 증상을 관찰하였다. The animal model of rheumatoid arthritis prepared above was administered with a rhizome and the symptoms of autoimmune arthritis were observed for 5 weeks.

일반적인 관절염 유도 모델이 아닌 자연 발생적으로 관절염이 이미 생겨있는 관절염 모델이기 때문에 관절염의 갯방풍에 의한 치료활성이 큰 것으로 볼 수 있다(도 12 참조).
Since the arthritis model is naturally occurring arthritis rather than a general arthritis-inducing model, it can be seen that the treatment activity of the arthritis gangs is great (see FIG. 12).

<7-2> 갯방풍에 의한 체액성 면역반응(Humoral response) 분석<7-2> Analysis of Humoral Response by Humoral Wind

갯방풍에 의한 류마티스관절염 동물 모델에서 체액성 면역반응(humoral respone)을 관찰하기 위해서 갯방풍 투여 후 5주가 되었을 때 마우스를 치사시켜 혈청에서 Total IgG, IgG2a의 발현양을 ELISA를 통해 분석하였다. Total IgG와 Th1 response에 관여하는 IgG2a 모두 갯방풍 투여군에서 모두 감소되어 있는 것으로 확인 되었다(도 12 참조).
In order to observe the humoral respone in rheumatoid arthritis animal model, the mice were sacrificed at 5 weeks after the administration, and the amount of total IgG and IgG2a expressed in the serum was analyzed by ELISA. Both total IgG and IgG2a involved in the Th1 response were found to be reduced in all of the group of rhizomes (FIG. 12).

<7-3> 갯방풍에 의한 류마티스 관절염 치료 효과 조사<7-3> Effectiveness of treatment of rheumatoid arthritis

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 조직학적 소견으로 관찰하고자 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여 한 후 마우스를 치사 시켜 관절을 얻은 후, H&E 염색으로 염증세포의 침윤정도를 관찰하였다.In order to observe the treatment effect of the rheumatoid arthritis animal model using the rhizome of the rhizome, the mice were sacrificed after 12 weeks of IL-1Rako mouse administration for 5 weeks and the joints were obtained. The infiltration of the inflammatory cells by H & E staining Respectively.

그 결과, 갯방풍 투여군에서 염증세포가 감소된 것을 확인하였다(도 13 참조).As a result, it was confirmed that the inflammatory cells were decreased in the group treated with the nasal spray (see Fig. 13).

또한, Safranin O로 연골의 파괴정도를 관찰하였고, 그 결과 갯방풍 투여군에서는 연골이 유지되어 있어 염색이 되었지만 대조군의 관절에서는 연골이 다 파괴되어 염색이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 13 참조).
In addition, the degree of destruction of cartilage was observed with Safranin O. As a result, it was confirmed that cartilage was retained in the brachyury group, but the cartilage was destroyed in the joints of the control group, so that it was not stained.

<7-4> 갯방풍에 의한 IL-1Rako 마우스의 splenocyte에서 Th17 세포의 억제효과 확인<7-4> Confirmation of the inhibitory effect of Th17 cells on IL-1Rako mouse splenocyte induced by shading

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 확인하기 위해 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여한 후 마우스를 치사시켜 비장세포를 얻었다. 획득한 비장세포의 CD4 세포에서 IL-17의 발현양을 FACS로 조사한 결과, 갯방풍을 투여한 마우스에서 병인 세포인 Th17 세포의 발현이 유의하게 감소된 것을 관찰 할 수 있었다(도 14 참조).
In order to confirm the therapeutic effect of the rheumatoid arthritis animal model using the rhizome windbreak, 12-week-old IL-1Rako mice were administered with 5 days rhythm of windshield and mice were sacrificed to obtain splenocytes. The expression of IL-17 in CD4 cells of the spleen cells obtained was examined by FACS. As a result, it was observed that the expression of Th17 cells, which is a pathologic cell, was significantly decreased in the mice treated with the Fusarium spp. (FIG. 14).

<7-5> 갯방풍에 의한 파골세포 분화 조절능 관찰<7-5> Observation of osteoclast differentiation regulation ability

갯방풍을 이용한 류마티스 관절염 동물모델 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하기 위해 12주령의 IL-1Rako 마우스에 5주간 갯방풍을 투여 한 후 마우스를 치사 시켜 마우스의 골수세포를 얻었다. 각 군의 골수세포에 RANKL과 M-CSF를 자극하고 TRAP 양성 세포를 조사한 결과, TRAP 양성 세포가 갯방풍 투여군에서 감소되어 있음을 관찰 할 수 있었다(도 15 참조).
In order to confirm the therapeutic effect of the animal model of rheumatoid arthritis using the rhizome, the 12-week-old IL-1Rako mouse was administered to the mice for 5 weeks, and the mouse bone marrow cells were obtained. RANKL and M-CSF were stimulated in bone marrow cells of each group, and TRAP-positive cells were examined. As a result, it was observed that TRAP-positive cells were decreased in the group of rhizomes (FIG. 15).

<실험예 8><Experimental Example 8>

갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10 복합처리에 따른 파골세포 분화 억제Inhibition of osteoclast differentiation by the combination of coleoptera extract and coenzyme Q10

나아가 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물에 의한 파골세포 분화 억제효과를 더욱 향상시키고자 복합처리할 수 있는 물질을 찾던 중, 갯방풍 추출물과 코엔자임 Q10을 함께 처리하였을 때 파골세포 인자인 TRAP의 양성 표지 세포수의 정도를 측정하였다. Furthermore, the present inventors searched for a substance that can be compounded to further improve osteoclast differentiation inhibition effect of the present invention. In addition, the inventors of the present invention found that osteoblast extract and coenzyme Q10, And the degree of the number of labeled cells was measured.

즉 이를 위해 상기 실험예 7에서 사용한 세포인 골수세포에 M-CSF와 RANKL를 처리하여 세포를 자극시킨 후, 각 세포를 대상으로 코엔자임 Q10을 단독처리하고(5 uM), 다른 세포에는 갯방풍 추출물을 단독처리하고(250 ug/ml), 다른 군에는 코엔자임 Q10(5 uM)과 갯방풍 추출물(250 ug/ml)을 병용 처리한 다음, TRAP의 양성 표지된 세포의 수를 측정하였다.For this purpose, M-CSF and RANKL were treated with bone marrow cells used in Experimental Example 7 to stimulate the cells, and coenzyme Q10 alone was treated (5 uM) for each cell, (250 ug / ml), and coenzyme Q10 (5 uM) and bark extract (250 ug / ml) were used in the other groups. Then, the number of TRAP positive cells was measured.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 코엔자임 Q10(5 uM)과 갯방풍 추출물(250 ug/ml)을 단독 처리한 군의 경우, 이들을 처리하지 않은 군에 비해 TRAP의 양성 표지세포수가 감소한 것으로 나타났지만, 이들을 병용 처리한 군의 경우에서는 TRAP의 양성 표지된 세포수가 거의 관찰되지 않았다.As a result, as shown in Fig. 16, in the group treated alone with coenzyme Q10 (5 uM) and bark extract (250 ug / ml), the number of positive labeled cells of TRAP decreased compared to the group treated with no coenzyme Q10 However, in the case of the combination treatment group, there was almost no positive number of TRAP-labeled cells.

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 갯방풍 추출물을 코엔자임 Q10과 함께 사용할 경우, 매우 효과적으로 파골세포 분화를 억제할 수 있으며 따라서 파골세포 분화로 인한 골질환인 골다공증과 같은 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, the inventors of the present invention have found that when the extract of the present invention is used together with coenzyme Q10, it can effectively inhibit osteoclast differentiation and effectively treat diseases such as osteoporosis, which is a bone disease caused by osteoclast differentiation And it was found.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (13)

갯방풍 메탄올 추출물(Glehnia littoralis) 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 갯방풍 메탄올 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함하고 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating arthritis, which comprises methanol extract of Ganoderma lucidum (Glehnia littoralis) and coenzyme Q10 as an active ingredient,
The pharmaceutical composition for the prevention or treatment of arthritis according to claim 1, wherein the extract comprises a concentration of 200 ~ 300 ug / ml of coenzyme Q10 and 3 ~ 6 uM of coenzyme Q10. 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 갯방풍 메탄올 추출물(Glehnia littoralis)은 연골파괴 인자인 MMP1(metalloproteinase 1), MMP3(metalloproteinase 3), MMP13(metalloproteinase 13)의 발현을 억제하여 연골파괴를 감소시키고, 연골재생 인자인 Timp1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1) 및 Timp3(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3)의 발현은 촉진시켜 연골재생 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.The method according to claim 1,
The methanol extract of Ganoderma lucidum suppresses cartilage destruction by inhibiting the expression of MMP1 (metalloproteinase 1), MMP3 (metalloproteinase 3), and MMP13 (metalloproteinase 13), which are cartilage destruction factors, of matrix metalloproteinase 1) and Timp3 (Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 3) to promote cartilage regeneration activity. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 갯방풍 메탄올 추출물(Glehnia littoralis) 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 갯방풍 메탄올 추출물은 200 ~ 300 ug/ml의 농도로 포함하고 코엔자임 Q10은 3 ~ 6 uM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis comprising methanol extract of Ganoderma lucidum (Glehnia littoralis) and coenzyme Q10 as an active ingredient,
The pharmaceutical composition for preventing or treating osteoporosis according to claim 1, wherein the extract comprises a concentration of 200 ~ 300 ug / ml of coenzyme Q10 and 3 ~ 6 uM of coenzyme Q10. 삭제delete 삭제delete 시험관 내에서 갯방풍 메탄올 추출물(Glehnia littoralis) 및 코엔자임 Q10을 골수세포에 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 억제 방법.A method for inhibiting differentiation of osteoclasts, comprising the step of treating a bone marrow cell with an extract of Ganoderma lucidum methanol extract (Glehnia littoralis) and Coenzyme Q10 in vitro. 갯방풍 메탄올 추출물(Glehnia littoralis) 및 코엔자임 Q10을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품.A health functional food for preventing or ameliorating arthritis or osteoporosis comprising methanol extract of Ganoderma lucidum (Glehnia littoralis) and coenzyme Q10 as an active ingredient.

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