KR101617434B1

KR101617434B1 - 생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골지지체 제조방법

Info

Publication number: KR101617434B1
Application number: KR1020140078805A
Authority: KR
Inventors: 마이클조; 정도선; 조민경; 김동수; 김재원
Original assignee: 주식회사 티이바이오스
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2016-05-02
Also published as: KR20160001071A

Abstract

본 발명은 고기능 생분해성 생체고분자를 이용하여 다층구조의 연골 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 특히 생체고분자인 폴리카프롤락톤(PCL)을 염류용탈작용의 공정의 기공형성제로 쓰이는 염화나트륨을 사용하여 조성비를 조절하여 구배를 줌으로써 물성이 뛰어난 이중층(단단한 면 및 부드러운 면)을 가진 연골 지지체를 제조할 수 있다. 또한 상기의 염류용탈작용 공정에 있어서, 기공형성제인 염류계의 크기 및 모양 및 성형틀의 형상을 조절함으로써, 연골 지지체의 멤브레인 타입의 형상을 제조가 가능하며 재료적·기계적 특징을 쉽게 제어할 수 있다.

Description

생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골지지체 제조방법 {Method for manufacturing multilayered scaffold for cartilage using biodegradable biopolymers}

본 발명은 고기능 생분해성 생체고분자를 이용한 다층구조의 연골 지지체 제조방법에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 생명과학과 공학의 기본 개념과 기술을 통합 응용하여 생체조직의 구조와 기능사이의 상관관계를 이해하고, 나아가서 생체조직의 대용품을 만들어 다시 체내에 이식함으로써 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 하는 응용학문이다. 이러한 조직공학은 사람이나 동물의 조직을 채취하여 그 조직으로부터 세포를 분리시킨 후 지지체(스캐폴드)에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체나 동물 내에 이식하는 것을 기본으로 한다.

조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관 및 인공근육 등 인체에 거의 모든 장기에 적용되고 있는데, 이러한 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 지지체가 제공되어야 한다. 일반적으로 척추동물의 관절을 이루는 연골 조직은 한번 손상되면 정상적으로 생체 내에서 재생되지 않는다.

기본적으로 연골 지지체는 무독성이어야 하고, 기계적 물성이 뛰어나야 하며, 다공성이어야 한다. 이때, 무독성은 세포-지지체 복합체 및 단독으로 지지체를 생체조직 내 이식후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 것을 말하고, 지지체의 기계적 물성은 세포의 성장을 충분히 지지할 수 있는 강도 등을 말하며, 지지체의 다공성은 지지체에 세포의 접착이 잘 일어날 뿐만 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의한 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고, 또 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조를 말한다.

세포는 2차원적 배양이 이루어지는데, 이를 조직이나 장기의 형태로 배양하기 위해서는 3차원의 지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 수많은 기공을 가지고 있어 세포들이 내 외부에 부착할 수 있어야 하며 세포의 성장에 필요한 양분을 공급받고 노폐물을 배출하기 위해 열린 구조를 가져야 한다. 즉 다공성의 3차원 지지체가 필요한 것이다.

따라서 상기 기본적 요건을 만족하는 지지체로는 동물 체내의 세포외 기질과 유사한 것이 적합하고, 상기 세포외 기질과 같은 다공성을 가진 지지체를 제조하는 방법이 활발히 연구되고 있다. 대표적인 방법으로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.

상기 입자 침출법은 생체 적합한 고분자를 유기용매에 용해시킨 용액에 녹지 않는 염 입자를 혼합하여 주물을 제조한 후 용매를 제거하고 물을 이용하여 염 입자를 제거함으로써 공극을 형성하는 방법이다. 그러나 입자 침출법은 사용하는 염의 양이 대량이어야 하며, 염의 사이즈를 제어하여 기공을 제어하는 방법을 취하고 있어서 잔존하는 소금염이나 거친 형상으로 인해 세포가 손상되는 문제가 있다.

미국 등록특허공보 US5,681,873(1997.10.28)

본 발명의 목적은 고기능성 생분해성 생체 고분자를 이용하여 연골지지체를 제공하는데 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체의 제조방법을 제공한다:

a) 생체고분자를 디클로로메탄(Dicholomethane)에 용해시켜 생체고분자 용액을 제조하는 단계;

b) 상기 a) 단계에서 제조된 생체고분자 용액에 기공형성제를 혼합하는 단계;

c) 상기 b) 단계에서 기공형성제가 혼합된 생체고분자 용액을 성형틀에 넣어 성형제를 얻는 단계; 및

d) 상기 성형제를 0℃ 내지 40℃에서 건조시키는 단계.

본 발명의 일구현예로, 상기 d) 단계에서 건조된 성형제를 수세한 후, 0℃ 내지 40℃에서 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 a) 단계의 생체고분자는 생분해성 고분자(biodegradable polymer) 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 생체고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스터(polyorthoesters), 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 기공형성제는 결정성 염류, 결정성 수산화물, 및 수용성 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 결정성 염류는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화마그네슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 결정성 수산화물은 수산화나트륨, 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 수용성 다당류는 설탕 및 녹말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또다른 구현예로, 상기 기공형성제는 생체고분자의 0.1 내지 10배의 용량으로 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 지지체는 다공 크기가 100 ~ 500㎛이고, 80 ~ 95%의 다공성을 가진 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 다공성 생분해성 중합 지지체는 10 Mpa 내지 100 Mpa의 압축강도를 가지고 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면 생체고분자인 폴리카프로락톤(PCL)을 염류 용탈작용 공정의 기공형성제로 쓰이는 염류계 염화나트륨을 사용하여 조성비를 조절을 통해 농도 구배에 따른 다층구조의 연골 지지체를 제조할 수 있다.

또한, 상기의 염류용탈작용 공정에 있어서, 기공형성제인 염류계의 크기, 모양 및 성형틀의 형상을 조절함으로써 연골지지체의 멤브레인 타입(sheet)형상 및 재료적·기계적 특징을 쉽게 제어할 수 있다.

본 발명은 간단한 제조 과정을 통하여 목적하는 기공 크기와 기공률을 가지면서 기공간의 상호 연결성이 우수하며 목적하는 다양한 형상을 갖는 연골 지지체를 수득할 수 있다. 뿐만 아니라 본 발명은 연골 지지체 제조 시간을 대폭 감푹시키고 손쉬운 대량생산을 가능하게 하므로 지지체 제조산업 분야의 생산성 및 경제성을 향상시킬 수 있다. 또한 세포의 증식, 분화, 점착을 유도하는 효과가 우수한 연골 지지체 제조할 수 있다.

도 1은 실시예 1의 제조 방법에 의해 제조된 지지체의 육안 및 구조체의 전자현미경 사진이다.
도 2는 실시예 1의 제조 방법에 대하여 모식한 사진이다.
도 3은 멤브레인 형태로 제조된 연골 지지체이다.
도 4는 제조된 지지체 구조를 전자현미경 사진이다.
도 5는 세포가 지지체 내로 이동 및 내부에 자라는 세포를 전자현미경 사진이다.
도 6은 지지체의 압축강도 및 인장강도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 제조된 지지체의 용출물 및 지지체 단독으로 세포와 배양하였을 때 세포 독성을 나타낸 사진이다.

본 발명은 생분해성 생체고분자를 이용하여 다층구조를 가지는 연골지지체의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 기술에서, 인공 피부, 인공 뼈, 인공 연골 등의 인공 조직이 생체내에 이식되기 위해서는, 상기 인공 조직들이 지지체에 잘 부착되어야 하며, 지지체 자체의 물리적 물성이 뛰어나야만 하고, 또한 지지체의 다공성이 뛰어나야만 한다.

이러한 지지체의 종래 지지체 제조에 사용되었던 입자 침출법의 경우, 염의 양이 대량이어야 하고, 기공의 형태 및 크기를 제어하기 힘들며, 이로 인해 세포가 손상되는 문제가 있었다.

따라서 본 발명자들은 염류용탈과정에 주목하여, 생체고분자와 기공형성제인 염류의 조성비를 조절하는 방법으로 지지체의 기공의 크기 및 형태를 조절할 수 있고, 상기 지지체의 물리적 성질 또한 뛰어난 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체의 제조방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명의 연골지지체 제조방법에 있어서, a) 단계는 고상의 생체 고분자를 디클로로메탄에 용해시켜 생체고분자 용액을 얻는 단계이다.

상기 생체고분자는 생분해성 고분자를 사용할 수 있다. 상기 생분해성 고분자로는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리트리메틸렌카보이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(poly-hydroxy-butyrates), 폴리히드록실발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(polyorthocarbonate), 옥살산염 폴리알킬렌(polyalkylene oxalates), 숙신산염 폴리알킬렌(polyalkylene succinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic- anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinlylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylate), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acid)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성단백질(modified proteins), 이들의 중합체 혼합물등을 사용하는 것이 바람직하고, 이중에서도 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(L-락티드폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone), 이들의 공중합체, 이들의 3 원 중합체, 또는 이들의 중합체 혼합물(polymer blends) 등을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 본 발명의 실시예와 같이 폴리카프롤락톤(polycaprolactones)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 a) 단계에 따른 생체고분자 용액 중 고분자 함량은 5~40 중량%인 것이 바람직하고, 10~20 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 이는 지지체로 이용되는 생체고분자의 함량이 증가할수록 지지체의 페이스트상이 증가된다. 이는 생체고분자 함량 변화를 통하여 재료적, 기계적 특성을 현저히 변화시킬 수 있다.

상기 생체고분자를 디클로로메탄에 10~50 중량% 용해시키는데, 이는 염류용탈작용 공정 후 생체 고분자의 재료적, 기계적 특성을 변화시킨다. 또한 고상의 생체고분자와 액상의 디클로로메탄을 10~50 중량%에 용해하여, 용매의 오염도를 줄일 수 있고, 기공형성제인 염류와의 혼합이 생체고분자의 유동성과 혼합물의 회전을 부여하여 전체적인 혼합이 가능하다.

본 발명의 연골 지지체 제조방법에 있어서, b) 단계는 상기 a) 단계에서 제조된 생체고분자 용액에 기공형성제를 첨가하여 고르게 분산시켜 혼합하는 단계이다.

염류용탈작용은 염류(salt)가 용매에 의해 운반되는 과정으로, 본 발명에서는 기공형성제로 이용되는 염류를 생체고분자 용액상에 균일하게 용해시켜 생체고분자 혼합물에 공급함으로써 인체의 골 구조물과 유사한 기공률을 갖는 연골 지지체를 얻기 위하여 이 방법을 이용한다.

또한 염류의 크기를 조절하는 것이 가능하기 때문에 다양한 크기의 기공을 가진 지지체를 제조하는 것이 가능하며 특정 부위에서 필요로 하는 물리적 및 기계적 힘을 보완할 수 있는 장점이 있다.

상기 기공형성제로는 염류계 염화나트륨 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 사용할 수 있다.

상기 기공형성제는 생체고분자에 대하여 1~5배로 첨가되는 것이 바람직하다. 여기서 염류 농도에 따라 구조나 물성이 다른 지지체의 제조도 가능하다. salt가 적게 들어가면 단단해지는 구조가 형성되고 또한 층이 3중층을 가진 지지체가 제조가 되며 salt가 많이 들어가면 2중층을 가진 지지체가 제조된다. 또한 염류(salt)에 의하여 기공률을 조절하는 것이 가능하다. 적게 들어가면 50% 미만, 2배, 5배첨가시 70~80%, 및 5배 첨가시 90%이상의 기공률을 가진 지지체의 제조가 가능하다.

또한 입자크기가 100㎛이하, 200㎛, 300㎛의 구형의 염화나트륨을 사용하여 인체의 뼈 구조물이 가지는 기공크기 및 골 유착능에 적합한 형상을 띄고 오염물질이 없는 최종성형제를 얻을 수 있다.

본 발명의 연골지지체 제조방법에 있어서, c) 단계는 b) 단계에서 기공형성제가 혼합된 생체고분자 용액을 성형틀에 넣어 성형하여 성형제를 얻는 단계이다.

상기 성형틀은 테프론 몰드가 이용될 수 있으며, 상기 몰드는 가로 세로 12mm, 높이 10mm로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 성형틀(몰드)의 크기 및 모양에 따라 골 이식재, 뼈 플레이트 및 각종 임플란트에 대한 구조적용이 가능하다.

본 발명의 연골지지체 제조방법에 있어서, d) 단계는 상기 성형제를 건조시키는 단계이다.

상기 건조는 실온 및 저온에서 수행될 수 있는데, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있고, 가장 바람직하게는 4℃ 내지 20℃에서 수행될 수 있다.

상기 d)단계에서 건조된 성형제를 수세한 후, 또다시 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 건조 역시 실온 및 저온에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 0℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 4℃ 내지 20℃에서 수행될 수 있다. 이 단계에서 수세를 통하여, 지지체에 존재하는 염류 및 불순물들이 제거될 수 있다.

상기 수세 및 건조 단계를 통하여 생분해성 생체고분자 성형체에 첨가한 염류를 제거하여 기공을 형성하고 불순물을 제거할 수 있다. 이때 수세를 위한 용매로는 3차 증류수가 바람직하게 사용될 수 있고 여기에 70% 에탄올 수세를 할 경우 지지체의 불순물 제거가 더 용이할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 방법으로 제조된 연골지지체에는 인간간엽줄기세포 또는 인간간엽줄기세포로부터 분화된 연골세포 또는 골세포, 콜라겐, 알지네이트, 또는 펩타이드 등을 결합시켜, 세포 부착이나 약물 전달능을 가진 지지체를 제조할 수 있다. 상기 콜라겐은 콜라겐 타입 Ⅰ인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것이 아니다.

아울러, 본 발명의 지지체는 다공크기가 100 내지 500μm이고, 80% 내지 95%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고, 10 Mpa 내지 100 Mpa의 압축강도를 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

따라서 본 발명은 생체고분자 PCL과 염류를 중량비를 조절하여 혼합하고 염류용탈작용 공정 , 실온 및 저온으로 건조하는 것으로 다층 구조의 기공을 가진 연골 지지체를 제조 할 수 있으며, 재료적·기계적 성질 및 생분해성도 제어된 고기능 생분해성 생체 고분자 연골 지지체를 얻을 수 있다.

이하 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 몰드를 이용한 둥근 형태의 PCL / Salt 농도별 연골지지체 제조( sample 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)

지지체 제조에 사용된 생분해성 생체고분자는 폴리카프로락톤(PCL, 0.5 g, 1 g, 2 g)을 디클로로메탄(10ml)에 균일하게 용해시키고 분산시킨다. 이 용액상태의 고분자 물질에 기공형성제인 NaCl(1 g, 2.5 g, 5 g, 분말상)을 첨가하여 균일하게 분산시켰다. 혼합물을 성형틀에 사출하여 실온 및 저온(4 ℃ ~ -20 ℃)에서 건조하여 3차 증류수에 수세하고 난 뒤 37 ℃ 드라이오븐에서 건조시켜 다층구조의 지지체 제조물을 얻었다. 각각의 폴리카프로락톤, 기공형성제의 조성에 따른 구분은 하기 표 1에 나타내었다.

비교예 . 몰드를 이용한 둥근 형태의 PCL / Salt 농도별 연골지지체 제조( 비교예 1, 2, 3)

지지체 제조에 사용된 생분해성 생체고분자는 폴리카프로락톤(PCL, 0.5, 1, 2 g)을 디클로로메탄(10 ml)에 균일하게 용해시키고 분산시켰다. 그리고 분산된 용액을 기공형성제를 첨가하지 않고, 바로 성형틀에 사출하여 실온 및 저온(4 내지 20 ℃)에서 건조하여 3차 증류수에 수세하고 난 뒤 37 ℃ 드라이오븐에서 건조시켜 다층구조의 지지체 제조물을 얻었다.

상기 실시예 1 및 비교예의 제조공정도는 도 2에 나타내었고, 각각의 얻은 다층구조의 연골지지체의 주사전자현미경 사진은 도 3에서 나타내었으며, 실시예 1 및 비교예에 사용한 초기물질의 성상, 정량비 및 최종 지지체 조성비를 표 1, 표 2 및 표 3에서 나타내었다. 이에 따라 농도에 따라 강도의 차이가 발생하여 병증에 따라 지지체를 만들 때 선택하여 사용이 가능한 것으로 생각된다.

	용도	구성	형상	입도크기
PCL	템플레이트	C₆H₁₀O₂	고상	-
Salt (NaCl)	기공형성제	NaCl	분말상	≤200 um
디클로로메탄	용매	CH₂Cl₂	액상	-

	PCL:NaCl (%)	PCL (g)	NaCl (g)	Dichloromethane
비교예 1	5:0	0.5	0	10 mL
Sample 1	5:10	0.5	1
Sample 2	5:25	0.5	2.5
Sample 3	5:50	0.5	5
비교예 2	10:0	1	0
Sample 4	10:10	1	1
Sample 5	10:25	1	2.5
Sample 6	10:50	1	5
비교예 3	20:0	2	0
Sample 7	20:10	2	1
Sample 8	20:25	2	2.5
Sample 9	20:50	2	5

PCL 농도	5% PCL		10% PCL		20% PCL
	Salt	PCL	Salt	PCL	Salt	PCL
0	0.1	3.9	0.05	8.7	0.3	11.8
1	2.25	4.75	8.3	8.2	7.8	14.55
2.5	2.05	4.05	22.4	8.05	21.95	11.4
5	16.1	4.55	44.65	6.65	47.2	13.35

실시예 2. 몰드를 이용한 멤브레인 형태의 지지체 제조

지지체 제조에 사용된 생분해성 생체고분자는 폴리카프로락톤(PCL 2 g)을 디클로로메탄(10 ml)에 균일하게 용해시키고 분산시킨 후, 이 용액상태의 고분자 물질에 기공형성제인 NaCl(5 g, 분말상)을 첨가하여 균일하게 분산시켰다. 그리고 혼합물을 테프론 성형틀에 붓고 실온에서 1일간 방치하게 되면 이중층의 지지체를 얻게 된다. 이 지지체는 도 1과 같이 아래쪽은 부드러운 면을 가진 스폰지 타입이고, 위쪽은 단단한 면을 가진 타입을 가지는 것을 특징으로 한다.

실시예 3. 제조된 연골지지체의 단면 확인

본 발명의 실시예 1 내지 실시예 2, 및 비교예의 골 지지체의 시료 표면 정보를 얻기 위하여 주사전자 현미경(FE-SEM, JMS-6335F, JEOL, Japan)을 이용하여 분석을 실시 하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 제조된 생분해성 지지체의 횡단면을 분석한 결과로서, 기공이 형성된 것을 관찰하였다. 또한 기공을 형성하기 위하여 세수과정을 통한 염류용탈작용이 완벽하게 된 것을 확인하였다.

또한, 도 4를 확인해볼 때, 비교예(좌측)의 경우 닫힌 기공이 형성된 반면 실시예의 경우 닫힌 기공(closed pore)이 아닌 열린 기공(open pore, interconnected pore)의 형성이 관찰되었으며 이를 통해 연골 세포들의 행동 거동 및 친수성과 관련하여 본 발명의 연골지지체 안에서 활발한 증착 및 부착능이 효과적일 것이라는 것을 확인하였다.

실시예 4. 제조된 연골지지체의 세포 부착능 확인

또한 본 발명의 지지체에 세포들이 잘 부착되는 것을 확인하기 위해서 실험한 결과를 도 5에 나타내었다. 본 실시예에 사용된 세포는 NIH3T3를 사용하여 부착능을 확인하였다. 24well plate에 NIH3T3를 1x10⁵ /ml로 깔고 하루 37℃에서 배양한 뒤, 70% 알코올로 소독된 지지체를 첨가하여 7일간 배양하였다. 2일 간격으로 배지를 교체하였고 7일째 4% 포르말린으로 고정한 뒤 SRB(sulforhodamin B)염색을 통해 지지체에 세포 부착능을 확인하였다. 도 5를 볼 때, 본 발명의 지지체의 구조가 세포들이 부착하기에 우수하다는 것을 확인할 수가 있었다. 지지체에 세포들이 이동해 가거나(a), 또한 아님 세포가 자라는 것(b)을 나타난 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 5. 제조된 지지체의 물성 확인

또한, FITI시험연구원에 의뢰하여 제조된 지지체의 물성을 분석하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 비교예 1 및 실시예 1, 2의 연골 지지체의 압축강도(Instron Mechanical Tester) 및 인장강도를 분석한 결과 압출강도의 경우 50 Mpa 이상의 강도를 나타내었고 인장강도의 경우 1.3 Mpa 의 인장강도를 나타내었다.

실시예 6. 제조된 지지체의 세포독성 확인

본 실시예 1, 2에서 만들어진 지지체를 NIH3T3 세포 1x10⁴ /ml로 24 well plate에 깔고 1일간 배양한 뒤 용출물 8, 16%로 농도로 첨가하고, 지지체의 경우 앞 실시예 1에서 만들어진 지지체를 첨가한 뒤 3일간 배양하여 세포독성을 관찰하였다. 관찰을 용이하게 하기 위하여 SRB염색을 사용하였다. 도 7과 같이, 용출물(a) 및 지지체 자체(b)를 첨가하였을 때 세포의 성장에 영향을 주지 않는 것으로 관찰되었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims

a) 생체고분자를 디클로로메탄(Dicholomethane)에 용해시켜 생체고분자 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 제조된 생체고분자 용액에 기공형성제를 혼합하는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 기공형성제가 혼합된 생체고분자 용액을 성형틀에 넣어 성형제를 얻는 단계; 및
d) 상기 성형제를 0℃ 내지 40℃에서 건조시키는 단계를 포함하고,
상기 기공형성제는 상기 생체고분자 대비 중량비로 1배 내지 5배 혼합되는
다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 d) 단계에서 건조된 성형제를 수세한 후, 0℃ 내지 40℃에서 건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 a) 단계의 생체고분자는 생분해성 고분자(biodegradable polymer) 인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 3항에 있어서,
상기 생체고분자는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리-ε-카프로락톤(PCL), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스터(polyorthoesters), 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드)공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 기공형성제는 결정성 염류, 결정성 수산화물, 및 수용성 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 5항에 있어서,
상기 결정성 염류는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화마그네슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 5항에 있어서,
상기 결정성 수산화물은 수산화나트륨, 및 수산화칼륨으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 5항에 있어서,
상기 수용성 다당류는 설탕 및 녹말로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
삭제
제 1항에서 제조된 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체.
제 10항에 있어서,
상기 지지체는 다공 크기가 100 ㎛ ~ 500 ㎛이고, 80% ~ 95%의 다공성을 가진 것을 특징으로 하는 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체.
제 10항에 있어서,
상기 다공성 생분해성 중합 지지체는 10 Mpa 내지 100 Mpa의 압축강도를 가지고 있는 것을 특징으로 하는 다층구조의 생분해성 생체고분자 연골지지체.