KR101617319B1 - 조직 비특이적인 알카리 포스파타제에 의한 다분화성 성체 세포의 분리 - Google Patents

조직 비특이적인 알카리 포스파타제에 의한 다분화성 성체 세포의 분리 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다분화성 성체 세포를 동정 및/또는 분리함에 있어 마커로서의 조직 비특이적인 알카리 포스파타제(TNAP)의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 농화된 세포 집단 및 이들 세포의 치료학적 용도에 관한 것이다.

Description

조직 비특이적인 알카리 포스파타제에 의한 다분화성 성체 세포의 분리{ISOLATION OF ADULT MULTIPOTENTIAL CELLS BY TISSUE NON-SPECIFIC ALKALINE PHOSPHATASE}
본 발명은 다분화성 성체 세포를 동정 및/또는 분리함에 있어 마커로서의 조직 비특이적인 알카리 포스파타제(TNAP)의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 농화된 세포 집단 및 이들 세포의 치료학적 용도에 관한 것이다.
다분화성 성체 세포의 농화( enrichment )
섬유아세포, 지방세포, 연골모세포, 평활근 세포, 조골세포 및 그외 골 세포성 요소를 포함하는 골수(BM)의 비-조혈모세포가, 골수강(bone marrow space)과 주변 결합 조직 도처에 있는 다분화성 골수 간엽 전구 세포(MPC) 집단으로부터 파생된다는 개념을 뒷받침하는 많은 연구들이 있다(Bianco et al., 2001; Gronthos and Simmons, 1996; Owen and Friedenstein, 1988; Prockop, 1997). 이러한 MPC는 표현형이나 기능적으로 동일한 더 많은 수의 세포(자기-재생 과정) 뿐만 아니라 분화된, 계통-예정된 간엽 전구체(lineage-committed mesenchymal progeny)를 산출하는 것으로 생각된다. 명확한 마커가 부족하여, 인간 MPC가 계통-예정된 전구체로 분화 및 성숙하는 동안에 이루어지는, 발생에 따라 정확하게 조절되는 표현형 변화와 유전자 발현에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 골형성 과정을 조사한 연구를 통해, 이러한 초기 마커 1개, 즉 골형성 세포 계통으로 예정된 MPC를 동정할 수 있는 전사인자 CBFA1가 동정되었다(Ducy et al., 1997). 그러나, CBFA1와 같은 마커는 이질적인 세포 집단내에서 살아있는 세포를 분리하고 조작하는데에는 사용할 수 없다. 이러한 점은 주된 한계점으로, MPC 컴파트먼트에 고유한 또는 이에 한정되는 세포 표면 항체를 동정할 수 있는 단일클론 항체(mAb)의 결핍에 의해 더욱 심화된다.
지금까지, STRO-1 단일클론 항체는 인간 골수 천자액(bone marrow aspirate) 유래의 모든 콜로니 형성 MPC(CFU-F: 콜로리 형성 단위-섬유아세포)와 면역반응성을 보이지만 조혈 줄기 세포와의 반응성은 결여된 단순 시약에 불과하다(Dennis et al., 2002; Gronthos et al., 2003; Simmons and Torok-Storb, 1991).
본 연구를 통해, 생체외에서 증폭시킨 인간 MPC가 혈청 존재하에서 신속하게 분화하며, 골형성 및 그외 세포 계통 결정과 관련있는 다수의 마커(Gronthos et al., 2003)를 발현하기 시작한다는 것을 확인하였다. 생체내에서 모든 MPC(CFU-F)를 식별하는 mAb STRO-1은 MPC의 생체외 배양 이후에는 하향 조절된다. 중요한 점은, 배양된 세포의 적은 비율은 생체외 증폭 이후에도 계속적으로 STRO-1을 발현하며, 이러한 세포는 미분화된 MPC의 특징이다(Gronthos et al., 1999; Stewart et al., 1999).
알카리 포스파타제
알카리 포스파타제(AP, EC 3.1.3.1)는 무기 포스페이트가 방출되는 알카리 조건하에서 포스포모노에스테르의 가수분해를 촉매하는 흔한 이량성 금속 함유 효소(metalloenzyme) 패밀리이다(McComb et al., 1979). 인간에서는, 이를 동질 효소 4종(isoenzyme)으로 구분할 수 있다: i) 태반 특이적인 AP, ii) 생식세포 특이적인 (태반) AP, iii) 장의 AP 및 iv) 조직 특이적인 AP(TNAP)(Harris, 1990). TNAP는 간(LAP), 신장(KAP) 및 뼈(BAP)에서 가장 많이 생성되며(Moss, 1992), AP 이성형(soform)은 혈청에 가장 풍부하다(Mulivor, et al., 1985). LAP, KAP 및 BAP간의 차이는 번역후 다양한 O-당화 패턴으로 인한 것으로(Miura, et al., 1994), 그것들의 아미노산 서열은 본질적으로 동일하지만 상이한 특이적인 활성을 나타낸다(Weiss et al., 1988). 또한, Nosjean et al.(1997)은 tns-AP의 N-당화가 효소 활성에 필수적이라는 것을 입증하였다. 따라서, 조직 비특이적인 AP는 당화된 여러 AP들의 혼합이다.
인간 TNAP 유전자는 1986년에 클로닝되었다(Weiss, et al., 1986). 이것은 524개의 아미노산과, 17개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 신호 서열 및 그 단백질을 생체내에서 원형질막의 바깥측에 고정시키는 C-말단 GPI 고정 서열(anchor sequence)로 구성된, 단백질을 코딩한다(Hooper, 1997). COS-1(Fukushi, et al., 1998) 및 베큘로바이러스가 감염된 곤충 세포(Oda, et al., 1999)와 같은 진핵 세포에서, 생물학적으로 활성인 재조합 TNAP 효소의 발현이 보고되었다.
골 및 골수 조직에서 TNAP의 정확한 분자 기능은 TNAP가 발견된지 70년이 지났음에도 불구하고 명확하지 않다. 포유류에서 TNAP의 생물학적 기능이 몇가지 제안되어 있는데, 그 기능으로는 포스페이트 에스테르를 가수분해하여 비-포스페이트 모이어티(nonphosphate moiety) 제공, 포스페이트 에스테르 합성에 있어 트랜스퍼라제 기능, 무기 포스페이트 대사 조절, 포스포릴-대사산물의 농도를 정상 상태로 유지 및 포스포단백질 포스파타제로서의 작용을 포함한다(Whyte, 1994). 또한, B/L/K-TNAP는 무기 피로포스페이트와 같은 석회화(calcification) 저해자의 가수분해에 의한 골격 미네랄화(mineralization)에 있어 특이적인 기능을 가지고 있을 수 있으며, 고농도에서는 수산화인회석 결정(hydroxyapatite crystal)의 성장을 저해할 수도 있다(De Broe and Moss, 1992; Moss, 1992; Whyte, 1994). 대안적으로, TNAP는 칼슘 포스페이트의 침전을 자극하고 오스테오이드에 미네랄 침착으로 이르는, 무기 포스페이트, 세포외 칼슘 이온 결합성 단백질의 원형질막 수송체일 수 있는 것으로 시사되었다.
TNAP는 조골세포 분화 마커로도 알려져 있다. 그러나, 본 발명자가 알기에는 미성숙 다분화성 세포에 의한 TNAP의 세포 표면 발현에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명은 다분화성 성체 세포를 동정 및/또는 분리함에 있어 마커로서의 조직 비특이적인 알카리 포스파타제(TNAP)의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 농화된 세포 집단 및 이들 세포의 치료학적 용도를 제공한다.
발명의 개요
본 발명자들은 최근에 미분획한 골수로부터 다분화성 성체 세포를 동정 및 분리하여, 생체내 및 시험관내에서 STRO-1 집단을 세분하는 능력을 가진, 신규한 mAb(STRO-3)을 제조하였다. 본 발명자들은 조직 비특이적인 알카리 포스파타제(TNAP)에 STRO-3이 결합함을 확인하였다. 또한, STRO-3은 성체 골수 천자액에 포함된 일부 세포와만 반응하며, 인간 성체 골수 천자액내 CD34 양성인 조혈 줄기세포와는 반응하지 않는다는 것을 확인하였다. 이는, TNAP가 다양한 조직 기원으로부터 다분화성 성체 세포를 단일 시약으로 농화하는데 이용가능한 마커임을 최초로 입증한다.
따라서, 본 발명은 다분화성 성체 세포의 동정 및/또는 농화용 마커로서의 TNAP의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 조직 유래의 세포 샘플을 준비하는 단계 및 TNAP 마커를 발현하는 세포를 농화하는 단계를 포함하는 다분화성 성체 세포의 농화 방법을 제공한다.
일 예로, 다분화성 성체 세포의 농화 방법은 TNAP가 TNAP 결합제에 결합가능한 조건하에서 상기 세포 샘플을 TNAP 결합제와 접촉시키는 단계 및 상기 TNAP 결합제에 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 TNAP 마커를 발현하는 샘플에서 세포를 동정하는 단계를 포함하는 세포 샘플내에서 다분화성 성체 세포의 존재를 동정하는 방법을 제공한다.
일 예로, 다분화성 성체 세포의 존재를 동정하는 방법은 TNAP가 TNAP 결합제에 결합가능한 조건하에서 상기 세포 샘플을 TNAP 결합제와 접촉시키는 단계 및 샘플에서 세포에 결합된 상기 TNAP 결합제의 존재를 검출하여, 다분화성 성체 세포의 존재가 TNAP 결합제에 결합하는 세포에 의해 표시되는 단계를 포함한다.
본 발명에서, 세포 샘플은 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 장, 폐, 지라, 림프절, 흉선, 난소, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄 및 골격근일 수 있다. 바람직하기로는, 상기 조직은 골수이다.
바람직한 세포 기원은 인간이지만, 소, 양, 돼지 등과 같은 농경 동물, 개 및 고양이와 같은 가축, 마우스, 랫, 햄스터 및 토끼와 같은 실험 동물, 말과 같이 스포츠에 이용되는 동물을 포함한 다른 동물에도 본 발명을 적용가능한 것으로 예상된다.
또한, 본 발명은 1차 농화 단계를 수행하기 전에 다분화성 세포의 기원을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 예컨대, 이는 대상자로부터 조직을 외과적으로 적출하는 단계 및 조직의 세포를 분리하여 단일 세포 현탁물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 분리는 물리적 또는 효소적 수단에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 일 예에서, 이러한 단계는 공지된 기술을 이용하여 골수 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 TNAP 결합제는 TNAP에 대한 결합 친화성을 가지는 것으로 동정된 모든 폴리펩티드 또는 화합물일 수 있다. 예컨대, TNAP 결합제는 항원 또는 콜라겐, 바람직하기로는 제1형 콜라겐일 수 있다.
TNAP 결합제는 TNAP의 LAP, KAP 또는 BAP 이소형 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 바람직한 일 예로, TNAP 결합제는 BAP에 결합한다. 다른 바람직한 예로, TNAP 결합제는 BAP에 특이적으로 결합한다.
"BAP에 특이적으로 결합한다"는 TNAP 결합제가 KAP 및 LAP와 같은 다른 물질이 과량으로 존재하는 조건에서 선택적인 양상으로, BAP를 발현하는 세포의 선택적인 농화에 유용한 툴을 제공하도록 충분히 강하게(즉, 매우 충분한 친화성을 가짐), BAP에 결합할 수 있음을 의미한다.
바람직한 예로, TNAP 결합제는 항-TNAP 항체(임의 기원으로부터 자연적으로 형성되거나 또는 재조합됨)이다. 항-TNAP 항체는 다클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 바람직한 예로, 항-TNAP 항체는 단일클론 항체이다.
본 발명의 사용에 적합한 항-TNAP 단일클론 항체의 예로 B4-78, 50 및 B4-50(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa); ab17973 및 ab17989(Abcam Ltd, Cambridge, UK); 및 Magnusson et al. (2002)에 언급된 항-TNAP mAb가 있다.
본 발명의 특히 바람직한 예로, 항-TNAP 단일클론 항체는 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체 또는 STRO-3 항체와 동일한 TNAP 에피토프에 결합하는 mAb이다.
본 발명에 따른 다분화성 성체 세포의 농화 방법은 TNAP 마커의 단독 존재를 토대로 수행할 수 있다. 즉, 상기 농화 방법에는 단일 시약(즉, TNAP 결합제)이 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명은 TNAP 단독 발현에 의한 세포 농화로만 한정되지 않으며, 일부의 경우에서는 2, 3 또는 그 이상의 부가적인 마커와 조합하여 TNAP 발현을 토대로 다분화성 성체 세포를 농화하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 다분화성 성체 세포의 농화 방법은 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = 렙틴-R), RANKL STRO-1(바람직하게는 STRO-1bri), 및 CD146 또는 이들 마커의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 마커의 추가적인 존재를 근간으로 할 수 있다.
예컨대, 상기 방법은 다분화성 성체 세포에 특이적인 제1 마커의 발현 농화에 의해 부분적으로 농화된 1차 세포 풀(pool)을 제조하는 단계, 및 상기 부분적으로 농화된 세포 풀로부터 TNAP 발현을 농화하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 방법은 TNAP를 발현하는 세포 선별을 기본으로 하는 첫번째 농화 단계 및 여러가지 다분화성 성체 세포의 마커를 농화시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 예로, 상기 방법은 TNAP를 발현하는 세포와 하나 이상의 부가적인 다분화성 성체 세포에 특이적인 마커를 발현하는 세포를 동시에 선별하는 단계를 포함한다.
분리의 근거를 제공하는 TNAP를 갖는 세포의 인지는 다수의 여러가지 방법에 의해 수행할 수 있지만, 이러한 방법들 모두 어떤 시점에서의 세포와 TNAP 결합제간의 결합과, 결합 정도가 높거나 낮은 결합성을 보는 세포의 분리를 토대로 한다. 대부분의 통상적인 결합제는 이들의 특이성으로 인해 항체 또는 항체성 분자, 바람직하기로는 단일클론 항체 또는 단일클론 항체성 분자이다.
TNAP 결합제를 고형 지지체에 부착하여, 조 분리(crude separation) 할 수 있다. 이러한 분리 기법은 바람직하기로는 수득되는 분획의 생존성을 최대로 유지시킨다. 여러가지 효과가 있는 다양한 기법을 사용하여 비교적 조 분리물을 수득할 수 있다. 사용되는 특정 기법은 분리력, 관련 세포독성, 실시 용이성 및 속도, 정교한 장치 및/또는 기술력의 필요성에 따라 결정될 것이다. 분리 공정은 항체에 코팅된 자기 비드를 이용한 자기 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고형 매트릭스에 부착된 항체를 이용한 "패닝(panning)"을 포함할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 정확한 분리를 제공하는 기법으로는 MACS, Dynal 자기 비드 선별 및 FACS가 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예에서, TNAP 결합제는 표지된 것이다. 다른 예로, TNAP 결합제에 결합된 세포의 분리는 기계적인 세포 분리기에 의해 수행된다.
본 발명의 다른 예로, TNAP 결합제는 형광 표지 화합물과 커플링된다. 이 경우, TNAP 결합제에 결합된 세포의 분리는 FACS(fluorescence-activated cell sorter)를 이용하여 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예로, TNAP 결합제는 고형 입자에 연결된다. 바람직하기로는, 상기 고형 입자는 자기 입자이다. 본 발명의 이러한 예에 있어서, TNAP 결합제에 결합된 세포의 분리는 바람직하기로는 액체 상으로부터 입자 상을 분리함으로써 수행된다. 본 발명의 다른 예로, 분리 단계를 수행하기 전에, 세포 샘플은 고형 입자가 연결된 TNAP 결합제에 대한 항체와 접촉되며, TNAP 결합제에 결합된 세포의 분리는 액체 상으로부터 입자 상을 분리함으로써 수행된다.
본 발명의 다른 예로, 세포 샘플의 세포는 고형 지지체상에서 배양한 유착성 세포이며, 비결합성 TNAP 결합제는 세정에 의해 제거된다.
본 발명의 다른 예로, 세포 샘플의 세포는 현탁액으로 배양되며, 비결합성 TNAP 결합제는 세포 샘플의 원심분리와 형성된 상층물의 분리 제거에 의해 제거된다.
다른 예로, 세포 샘플은 하나 이상의 다른 다분화성 세포 마커를 발현하는 세포로부터 세포 집단을 농화 또는 줄이기 위한 추가적인 세포 분리 공정에 투입된다. 상기 다분화성 세포 마커는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-1(바람직하게는 STRO-1bri), 및 CD146 또는 이들 마커의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득되는 농화된 다분화성 성체 세포 집단을 제공한다.
또한, 본 발명은 농화된 TNAP+ 다분화성 성체 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 예로, 농화된 세포 집단 전체의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 TNAP+의 표현형을 가진 다분화성 성체 세포이다.
일 예로, 본 발명의 농화 집단을 배양하면 마커 STRO-1을 이용하여 선별한 동일 조건에서 배양한 세포에 비해, STRO+인 세포의 비율이 더욱 많아진다. 바람직하기로는, 이러한 배양은 약 4 또는 약 6회의 계대배양이다. 바람직하기로는, 세포는 골수로부터 수득된다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 CD45+인 세포를 약 79% 내지 약 99%로, 더 바람직하기로는 약 84% 내지 약 94%로, 및 더더 바람직하기로는 약 89%로 포함한다.
바람직하기로는, 농화된 다분화성 성체 세포 집단은 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된다.
또한, 본 발명의 방법은 본 발명에 따른 농화된 다분화성 성체 세포를 배양함으로써 수득되는 증폭된 세포 집단을 제공한다.
일 예로, 본 발명의 농화된 세포 집단 또는 본 발명의 증폭된 세포 집단은 유전적으로 변형된 세포를 적어도 일부분 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다분화성 성체 세포 집단을 하나 이상의 자극 인자의 존재하에 배양하는 단계, 및
상기 배양한 집단을 상기 다분화성 성체 세포를 특이적인 조직 타입으로 분화시키도록 편향된 조건에 두는 단계를 포함하는, 조직 특이적인 예정된 세포 집단의 제조 방법을 제공한다.
일 예로, 조직 타입은 심근, 혈관 조직, 뼈 조직, 연골 조직, 지방 조직, 신경 조직, 평활근 및 내피 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 농화된 다분화성 성체 세포 및/또는 본 발명의 증폭된 세포 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로 이해될 것이다.
바람직한 예로, 상기 조성물은 자극 인자를 더 포함한다. 이러한 조성물은 치료학적으로 유리할 것이므로, 따라서 약학적으로 허용가능한 형태로 제조될 것이다.
상기 조성물에 존재되는 자극 인자(들)의 함량은 경험에 의해 결정될 수 있지만, 대부분의 경우에는 대략 수 ng 또는 10 ng/ml일 것이다.
본 발명의 방법에 사용되고/사용되거나 본 발명의 조성물에 존재되는 자극 인자는 세포 분열 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 적절한 모든 인자일 수 있다. 이러한 인자들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 1α,25-디하이드록시비타민 D3 (1,25D), 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 기질 유래 인자 1α(SDF-1α)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
다른 예로, 상기 조성물은 본 발명의 다분화성 성체 세포의 분화를 하나의 특이적인 조직 타입으로 편향시키는 인자를 더 포함한다. 바람직하기로는, 조직 타입은 심근, 혈관 조직, 골 조질, 연골 조직, 지방 조직, 신경 조직, 평활근 및 내피 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다분화성 성체 세포를 골 전구 세포 또는 골로 분화시키는 조건은, 예컨대, 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 포스페이트가 보충된 α-MEM에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 조건이 시험관내에서 인간 골수 기질 세포를 미네랄화된(mineralized) 골 매트릭스로 발생 유도하는 것으로 확인되었다(Gronthos et al., 1994).
본 발명의 다분화성 성체 세포를 조골세포로 분화시키는데 적합한 조건은, 제1형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 오스테오칼신 또는 오스테오넥틴의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 특정 일 예에서, 세포는 제1형 콜라겐, 피브리노겐 및 피브린의 존재하에 배양된다. 다른 예로, 세포는 제1형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 오스테오칼신 및 오스테오넥틴의 존재하에 배양된다. 이러한 방법에 있어서, 제1형 콜라겐, 피브리노겐, 피브린, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 오스테오칼신 또는 오스테오넥틴은 단독으로 또는 성장 인자의 존재하에 사용될 수 있다. 본 단락의 전술한 화합물의 임의 조합도 본 발명에 포함되는 것으로 이해될 것이다.
다른 예로, 본 발명의 조성물은 피브린 글루를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 농화된 또는 증폭된(expanded) 세포 집단을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 대상자에서의 조직 생성 또는 복구 방법을 제공하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 대상자에게 투여하는 단계를 포함하는 대상자에서의 조직 생성 또는 복구 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 수득되는 농화된 또는 증폭된 다분화성 세포 집단은, 예컨대 골 형성 및 복구에 사용될 수 있으며, 이를 위해 다분화성 세포 조합 뿐만 아니라 적합한 지지체를 골 형성이 필요한 부위에 도입할 수 있다. 따라서, 예컨대, 골 손상이나 또는 종양이 있는 골 부위 제거로 인해 초래된 골격 결함은, 결함 부위에 배양 또는 증폭된 다분화성 성체 세포가 함유된 칼슘 포스페이트 세라믹 비히클을 이식함으로써 복구할 수 있다. 적정 방법과 기법은 Caplan 등의 미국 특허 5,226,914 및 5,837,539를 참조하며, 이들은 본 발명에 비해 보다 덜 정제된 줄기 세포 조제물을 이용한다.
또한, 농화된 세포 집단 또는 조성물은 인공기구의 고정 보조용으로 사용할 수 있다. 따라서, 엉덩이, 무릎 및 어깨 치환에 사용되는 것과 같은 인공기구의 표면을 이식하기 전에 농화된 다분화성 세포로 피복할 수 있다. 이후, 다분화성 세포는 골형성 세포로 분화되어, 인공기구의 체내 내부 성장 및 통합 과정을 가속화할 수 있다(Caplan 등의 미국 특허 5,226,914 및 5,837,539).
또한, 농화 세포 집단 또는 조성물은 유전자 치료에 사용될 수 있으며, 따라서 예컨대 농화 집단은 이에 형질전환된 외인성 핵산을 가질 수 있으며, 이후 상기 집단은 환자의 체내에 도입하여 질환 또는 증상을 치료할 수 있다. 대안적으로, 치료제 방출에 사용할 수도 있다. 적절한 기법으로, Gerson 등의 미국 특허 5,591,625를 참조하며, 이는 본 발명에 비해 덜 정제된 줄기 세포 조제물을 이용한다.
대안적으로, 농화 집단 또는 조성물을 사용하여 골수 이식을 증대시킬 수 있으며, 농화된 다분화성 성체 세포를 포함하는 조성물은 전 골수의 도입전에 골수 이식을 받는 환자에 주입할 수 있다. 이러한 방식으로, 특히 방사선요법 또는 화학요법 이전에 조혈생성율을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 조성물은 다분화성 세포와 방사선요법이나 화학 요법에 유용할 수 있는 조혈 세포의 혼합물을 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명은 대상자의 조직을 생성 또는 복구하는 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 농화 또는 증폭시킨 세포 집단의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 대상자의 조직을 생성 또는 복구하는 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득되는 유전적으로 변형된 분리된 세포 또는 그의 후대를 제공한다.
바람직한 예로, 세포는 유전적으로 변형되어 이종 단백질을 발현한다. 이종 단백질은 목적한 모든 단백질일 수 있다. 예컨대, 이종 단백질은 1α,25-디하이드록시비타민 D3 (1,25D), 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 기질 유래 인자 1α(SDF-1α)와 같은 자극 인자일 수 있다.
다른 예로, 이종 단백질은 다분화성 성체 세포의 특이적인 조직 타입으로의 분화를 가속화하는 생체활성 인자이다. 생체활성 인자는 예컨대 덱사메타손과 같은 합성 글루코코르티코이드 또는 BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-6 또는 BMP-7과 같은 골 형태형성 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명은 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 [STRO-3]하이브리도마 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체와 동일한 다분화성 세포의 에피토프에 결합하는 STRO-3 분리된 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하기로는, 조성물은 하나 이상의 적합한 담체를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 농화된 세포 집단, 본 발명의 증폭시킨 세포 집단, 본 발명의 조성물, 본 발명의 분리된 세포, 본 발명의 하이브리도마 및/또는 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다.
명세서 전반에 걸쳐서, 용어 "포함한다(comrise)" 또는 "포함한다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형된 형태는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 요소, 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 내포하며, 다른 요소, 정수, 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
상기 각 섹션에 언급된 본 발명의 다양한 특징 및 구현예는 적절히 준용하여 다른 섹션에 적용된다. 따라서, 하나의 섹션에 명시된 특징은 다른 섹션에 명시된 특징과 적절히 조합될 수 있다.
발명의 상세한 설명
미생물 기탁 사항
STRO-3로 명명된 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 2005년 12월 19일자로 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁번호 PTA-7282로 기탁하였다.
이러한 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 하위 규정의 조항에 의거하여 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년간 살아있는 배양물로 유지됨을 보장한다. 유기체는 해당 특허가 공개되었을때 대중의 배양물 후대의 영구적이고 무제한적인 이용가능성을 보장하는 부다페스트 조약에 의거하여 ATCC로부터 입수가능하다.
본 발명의 양수인은 적합한 조건하에서 배양하였을때 기탁한 배양물이 죽거나 없어지거나 또는 파괴된다면 동일한 배양물의 살아있는 표본으로 신속하게 교체하는 것에 동의하였다. 기탁된 균주의 입수가능성은 특허법에 따라 모든 정부 권력기관으로부터 부여받은 권리에 위반하여 본 발명을 실시하기 위한 라이센스로서 해석되는 것은 아니다.
일반적인 기법
특별히 언급되어 있지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해분야(예, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가지는 것으로 취급되어야 한다
달리 언급되어 있지 않는 한, 본 발명에 사용되는 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기법은 당업자에게 잘 알려져 있는 표준적인 과정이다. 이러한 기법들은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (including all updates until present)와 같은 문헌에 전반적으로 언급 및 설명되어 있다.
다분화성 성체 세포
"다분화성 성체 세포"는 임의의 수종의 성숙형 세포 타입으로 생장할 수 성체 조직으로부터 유래된 세포를 의미한다. 본원에서, 이러한 표현은 간엽 전구체 세포(MPC) 및 상기 세포의 다분화성 후대와 같은 성체 줄기 세포 및 전구체 세포를 포함한다.
간엽 전구체 세포(MPC)는 골수, 혈액, 진피 및 골막에서 발견되는 세포로, 지방세포, 골성, 연골성, 엘라스틱, 근육 및 섬유성 결합 조직을 포함하는 특정 타입의 간엽 또는 결합 조직으로 분화할 수 있다. 이들 세포가 착수하는 특정 계통-예정된 및 분화 경로는 기계적 작용 및/또는 성장 인자, 사이토카인 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국소 미세환경 조건과 같은 내인성 생체활성 인자의 다양한 영향에 의존된다. 간엽 전구 세포는 분화가 종결되지 않았으며; 무제한적으로 분열할 수 있으며; 분열되어, 적당한때에 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 만드는 줄기 세포 또는 전구 세포인 딸 세포를 형성하는 세포로 정의된다. MPC는 많은 수의 다분화성 세포를 형성할 수 있는 비-조혈성 전구 세포이다.
용어 '농화된', '농화' 또는 변형 형태는 본원에서 특정 세포 타입의 비율 또는 특정 세포 타입의 수 비율이 무처리한 집단에 비해 증가된 세포 집단을 설명하기 위해 사용된다.
본 발명의 바람직한 예에서, 전체 농화 세포 집단의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상은 표현형 TNAP+을 가지는 다분화성 성체 세포이다.
특히 바람직한 예로, 본 발명의 TNAP+ 세포는 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 농화 집단은 CD45+인 세포를 약 79% 내지 약 99%, 더 바람직하기로는 약 84% 내지 약 94%, 및 더더 바람직하기로는 약 89.2%로 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 CD34+인 세포를 약 2% 이하, 더 바람직하기로는 약 1% 이하로 포함한다. 다른 예로, 농화 집단은 CD34+인 세포는 포함하지 않는다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 CC9+인 세포를 약 6% 이하로, 더 바람직하기로는 약 3.5% 이하로 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 3G5+인 세포를 약 23% 내지 약 3%, 더 바람직하기로는 약 8% 내지 약 18%, 및 더더 바람직하기로는 약 13.2%로 포함한다.
또다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 STRO-1+인 세포를 약 12% 내지 약 3%로, 더 바람직하기로는 약 10% 내지 약 6%로, 및 더더 바람직하기로는 약 7.8%로 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단은 시험관내에서 배양하지 않은 것이다.
또한, 바람직한 예로, 본 발명의 농화 집단은 클론 형성성 CFU-F로 자랄 수 있다.
일 예로, 본 발명의 농화 집단을 배양하면 STRO-1을 마커로 이용하여 선별하고 동일한 조건하에서 배양한 세포에 비해 STRO+인 세포의 비율이 보다 많아진다. 바람직하기로는, 이러한 배양은 약 4 내지 약 6회의 계대배양이다. 바람직하기로는, 세포는 골수로부터 수득된 것이다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단을 배양하면 2, 4 또는 6세대 계대 배양한 이후에 출발 세포 집단에 비해 STRO+인 자손 세포의 수적 증가를 발생시킨다. 이에 비해, STRO-1 농화 세포를 배양하면 4 또는 6세대 계대 이후에 출발(STRO-1 선별한) 세포 집단에 비해 STRO+인 자손 세포 수가 감소한다.
다른 예로, 농화된 세포 집단은 TNAP+ 세포와 동질적이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 다분화성 성체 세포의 시험관내 배양물로부터 제조되는 자손 세포(증폭시킨(expanded) 세포라고도 함)에 관한 것이다. 본 발명의 증폭시킨 세포는 배양 조건(배양 배지내 자극 인자의 개수 및/또는 타입을 포함함), 계대 횟수 등에 따라 매우 다양한 표현형을 가질 수 있다.
일 예로, 이러한 증폭된 세포(적어도 5회 계대 후)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 본원에 개시된 여러가지 배양 조건하에서 여러가지 마커 발현이 변경될 수 있다. 또한, 이러한 표현형의 세포는 증폭된 세포 집단에서 두드러질 수 있지만, 이러한 표현형(들)을 가지고 있지 않은 세포의 비율이 낮다는 것을 의미하는 것은 아니다(예, 증폭된 세포의 낮은 비율은 CC9-일 수 있음). 바람직한 일 예에서, 본 발명의 증폭된 세포는 여전히 여러가지 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가진다.
일 예로, 본 발명의 증폭된 세포 집단은 세포의 25% 이상이, 더 바람직하기로는 세포의 50% 이상이 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 증폭된 세포 집단은 세포의 40% 이상이, 더 바람직하기로는 45% 이상이 STRO-1+인 세포를 포함한다.
다른 예로, 본 발명의 농화 집단을 배양하면 LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2 = 렙틴-R), RANKL, STRO-1bright, CD146 또는 이들 마커의 임의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 마커도 발현할 수 있는 다분화성 성체 세포가 된다.
바람직하기로는, 유의한 비율의 다분화성 성체 세포가 2종 이상의 예정된 세포 타입으로 분화할 수 있다. 다분화성 성체 세포가 예정될 수 있는 계통의 비제한적인 예로는, 골 전구 세포; 담관 상피 세포와 간세포로 다능성인 간세포 전구체; 희소돌기아교세포 및 성상세포가 되는 아교세포 전구체를 생성할 수 있는 신경 한정 세포; 신경이 되는 신경 전구체; 심근(cardiac muscle) 및 심근세포(cardiomyocyte)의 전구체, 글루코스-반응성 인슐린 분비성 췌장 베타 세포주에 대한 전구체를 포함한다. 그외 계통으로는 상아질모포(odontoblast), 상아질-생산 세포 및 연골세포와 하기의 전구 세포가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다: 망막 색소 상피 세포, 섬유아세포, 각질세포와 같은 피부 세포, 수지상 세포, 모낭 세포, 신관 상피 세포, 평활근 및 골격근 세포, 고환 전구세포, 혈관내피 세포, 힘줄, 인대, 연골, 지방 세포, 섬유아세포, 골수 기질(marrow stroma), 심장 근육, 평활근, 골격근, 혈관주위 세포(pericyte), 혈관, 상피, 아교, 신경, 성상 세포 및 희소돌기아교 세포. 바람직한 예로, 다분화성 성체 세포는 적어도 시험관내 또는 생체내에서 지방 세포, 골세포 및/또는 연골세포를 생산할 수 있는 능력을 가진다.
다른 예로, 본 발명의 "다분화성 성체 세포"는 배양시 조혈세포가 되는 능력이 없다.
용어 "성체"는 광의의 의미로 출생 이후의 대상자를 포함한다. 바람직한 예로, 용어 "성체"는 사춘기가 지난 개체를 의미한다. 용어 "성체"는 본원에서 암컷의 제대혈을 포함할 수 있다. 용어 "성체"는 배아 및/또는 태아로부터 수득되는 세포는 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 "다분화성 성체 세포"는 "비-배아성 다분화성 세포"로 간주될 수 있다.
세포를 소정의 마커에 대해 "양성"이라고 언급할 때에는, 이는 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 마커의 저발현(lo 또는 dim)이나 고발현(bright, bri) 중 어느 하나일 수 있으며, 상기 용어는 세포의 색 분류 과정에서 사용되는 형광 또는 다른 색의 강도와 관련있다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 특정 세포 집단을 분류할때 사용되는 마커 측면에서 이해될 것이다. 소정의 마커에 대해 세포를 "음성"이라고 언급할때는, 상기 마커가 상기 세포에서 전혀 발현되지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 이는 상기 마커가 세포에서 비교적 매우 낮은 수준으로 발현되며, 마커를 검출가능하게 표지하였을때 매우 낮은 시그널을 형성함을 의미한다.
본원에서, 용어 "bright"는 검출가능하게 표지하였을 때 비교적 강한 신호를 형성하는 세포 표면상의 마커를 의미한다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니나, "bright" 세포는 샘플에서 다른 세포보다 표적 마커 단백질(예, STRO-1에 의해 인식된 항원)을 더 많이 발현하는 것으로 제시한다. 예컨대, STRO-1bri 세포는 FACS 분석으로 결정된 바와 따라, FITC-접합된 STRO-1 항체로 표지하였을때, 비-bright 세포(STRO- ldull / dim) 보다 형광 신호를 더 강하게 형성한다. 바람직하게는, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 강하게(brightly) 표지된 골수 단핵구 세포 약 0.1% 이상으로 구성된다. 다른 예에서, "bright" 세포는 출발 샘플에 함유된 가장 강하게 표지된 골수 단핵구 세포를 약 0.1% 이상, 약 0.5% 이상, 약 1% 이상, 약 1.5% 이상 또는 약 2% 이상으로 포함한다. 바람직한 예로, STRO-1bright 세포는 STRO-1 표면 발현이 2 log 크기로 더 강하게 발현한다. 이는 "백그라운드", 즉 SRTO-1- 세포에 상대적으로 계산된다. 비교하면, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현이 2 log 크기 미만으로, 전형적으로 약 1 log 또는 "백그라운드" 보다 낮은 수준의 발현을 갖는다.
조직 비특이적인 알칼리 포스파타제( TNAP )
본원에서 용어 "TNAP"는 단백질의 모든 이소형을 포함하는 것으로 의도된다. 예컨대, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 바람직한 예로, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직한 예에서, 본원에서 TNAP는 부다페스트 조약의 조항에 따라 2005년 12월 19일자로 ATCC에 기탁번호 PTA-7282로 기탁된 하이브리도마 세포주에서 생산되는 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 의미한다.
본 발명에서, TNAP는 바람직하기로는 인간 TNAP이다. 예컨대, TNAP는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNAP일 수 있다.
그러나, 용어 "TNAP"는 인간 서열에 한정되지 않으며, 임의 기원, 예컨대 상동한 특히 상동 유전자(orthologue)(즉, 인간이 아닌 다른 종으로부터 수득한 동질체), 대립유전자 변이체, 단편 및 후술된 바와 같은 합성 펩티드 또는 그것의 유도체로부터 수득되는 상동 서열을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
다수의 TNAP 상동 유전자가 이미 알려져 있으며, 마우스 TNAP(서열번호: 2) 및 랫 TNAP(서열번호: 3)가 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, 상동 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 3에 기재된 서열과, 적어도 20개, 바람직하기로는 50 내지 100개의 아미노산에서 아미노산이 적어도 70, 80 또는 90% 동일한, 바람직하기로는 적어도 95% 또는 98% 동일한 아미노산 서열이다.
상동성은 또한 당업계에서 유사성(similarity)(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 가지는 아미노산 잔기) 측면에서도 고려될 수 있지만, 본 발명에서는 서열 동일성 측면에서 당업계에서도 상동성을 나타내는 것이 바람직하다. 폴리펩티드의 동일성%는 디폴트 세팅 및 질의 서열(query sequence) 50개 이상의 아미노산을 이용하여 FASTA(Pearson and Lipman, 1988) 분석(GCG program)으로 결정되며, FASTA 분석은 50개 이상의 아미노산으로 이루어진 영역으로 2개의 서열을 정렬한다. 더 바람직하기로는, FASTA 분석은 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 영역으로 2개의 서열을 정렬한다. 더 바람직하기로는, FASTA 분석은 2개의 서열을 250개 이상의 아미노산에 대해 정렬한다. 더더 바람직하기로는, FASTA 분석은 2개의 서열을 350개 이상의 아미노산에 대해 정렬한다.
본 발명의 아미노산 서열과 관련되고/관련되거나 본 발명에서 이용함에 있어 용어 "변이체" 또는 "유사체"는, 제조되는 아미노산 서열이 바람직하기로는 천연 TNAP에 25 내지 50% 이상의, 더 바람직하기로는 적어도 실질적으로는 동일한 생물 활성을 갖는, 서열로부터 또는 서열에 대해 하나(또는 그 이상)의 아미노산 대체, 변이, 변형, 치환, 결손 또는 부가를 포함한다. 해당 생물 활성은 천연 TNAP 리간드에 결합하는 변이체 또는 유사체 능력을 포함한다.
일반적으로, 변이체 또는 유사체의 적어도 20%, 10% 또는 5%의 아미노산 잔기들은 천연 TNAP의 해당 부위에 비해 변이되어 있는 것이 바람직하며, %는 전형적으로 더 짧은 아미노산 서열보다 더 낮으며, 예컨대 20개 또는 그 미만의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열의 경우 5% 미만이다.
또한, 용어 "TNAP"는 본원의 서열목록에 기재된 서열의 단편들을 포함하는, 전술한 전장 폴리펩티드 및 변이체의 단편을 포함한다. 바람직한 단편은 에피토프를 포함하는 것이다. 적정 단편의 길이는 적어도 약 6 또는 7개의 아미노산일 수 있으며, 예컨대 적어도 10, 12, 15 또는 20개의 아미노산 길이이다. 이의 길이는 200, 100 또는 50개의 아미노산 길이보다 적을 수 있다. 서열목록에 기재된 폴리펩티드의 폴리펩티드 단편들과 그것의 대립유전자 및 종 변이체는 보존적인 치환을 포함하여, 하나 이상의(예, 2, 3, 5, 또는 10) 치환, 결손 또는 삽입을 포함할 수 있다. 예컨대, 재조합 기술에 의해 치환, 결손 및/또는 삽입이 이루어지는 경우, 서열목록에 기재된 아미노산 잔기들이 20%, 10% 또는 5% 미만으로 변이되는 것이 바람직하다.
일 예로, 용어 TNAP는 태반의 AP는 포함하진 않는다.
TNAP 결합제
본원에서, 표현 "TNAP 결합제"는 TNAP를 인지하거나/인지하고 결합하는 모이어티를 의미한다.
바람직한 TNAP 결합제는 TNAP에 결합 친화성을 가지는 것으로 확인된 폴리펩티드 또는 화합물이다. 예컨대, TNAP는 콜라겐 결합성 루프를 가지는 것으로 특정화되었다(Mornet et al., 2001). 따라서, TNAP 제제는 콜라겐, 바람직하기로는 제1형 콜라겐일 수 있다.
특히 바람직한 TNAP 결합제는 (임의 기원의 천연 또는 재조합) 항-TNAP 항체이다.
용어 "항체"는 본원에서 완전한 분자(intact molecule) 뿐만 아니라 에피토프 결정원에 결합할 수 있는 Fab, F(ab')2, 및 Fv와 같은 그것의 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 그것의 항원이나 리셉터에 선택적으로 결합하는 능력을 일부 유지하고 있으며, 하기와 같이 설명된다:
(1) 효소 파파인으로 전체 항체를 분해하여 완전한 경쇄와 하나의 중쇄의 일부분을 갖도록 제조할 수 있는, 항체 분자의 일가 항원-결합성 단편을 포함하는 단편인 Fab;
(2) 전체 항체를 펩신으로 처리한 다음 환원시켜 완전한 경쇄와 중쇄 일부분을 갖는 항체 분자의 단편인 Fab', 항체 분자 1개에서 2개의 Fab' 단편이 수득됨;
(3) 전체 항체를 효소 펩신으로 처리하고 이후 환원시키지 않고 수득할 수 있는 항체의 단편인 (Fab')2; F(ab)2는 2개의 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편의 이량체임;
(4) 2개의 체인으로 발현되는 경쇄의 가변부와 중쇄의 가변부를 포함하는 유전적으로 조작된 단편인 Fv; 및
(5) 유전적으로 융합된 단일 쇄 분자로서 적정 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변부 및 중쇄의 가변부를 포함하는, 유전적으로 조작된 분자인 단쇄 항체("SCA").
이들 단편의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다(예, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, New York (1988)를 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
본 발명의 항체는 TNAP, 전장 TNAP 또는 그 단편을 발현하는 세포를 면역성 항원으로 이용하여 제조할 수 있다. 동물을 면역화하는데 사용되는 펩티드는 cDNA 번역 또는 화학합성에 의해 파생될 수 있으며, 적절한 경우에 담체 단백질에 접합될 수 있다. 펩티드를 화학적으로 커플링시키는 일반적으로 사용되는 상기 담체로는 KLH(keyhole limpet hemocyanin), 타이로글로불린, 소 혈청 알부민(BSA), 및 파상풍 톡소이드가 있다. 커플링된 펩티드를 사용하여 동물(예, 마우스 또는 토끼)을 면역화시킬 수 있다.
적절하게는, 다클론 항체는 예컨대 항체를 만드는 펩티드에 결합된 매트릭스에 결합시키고 용출시킴으로써 더욱 정제할 수 있다. 당업자는 다클론 항체 뿐만 아니라 단일클론 항체의 정제 및/또는 농축에 관한 면역학 분야에서 일반적으로 다양한 기술을 알고 있을 것이다(예, Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991을 참조하며, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
단일클론 항체는 예컨대 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술과 같이, 세포주의 연속 배양에 의해 항체 분자를 생산하는 모든 기술을 이용하여 제조할 수 있다(Kohler et al., 1975; Kozbor et al., 1985; Cote et al., 1983; Cole et al., 1984).
또한, 당해분야에 공지된 방법에 의해 항체 발현 라이브러리에서 동정 및 분리되는 항체는 TNAP에 대해 결합성을 보인다.
mAb STRO-3의 에피토프 특이성과 동일하거나 또는 유사한 항체는 TNAP(예, MPC와 같이 TNAP를 가지고 있는 세포, 또는 분리된 TNAP 단백질이나 그것의 단편)에 결합하는 특정 mAb와 경쟁하는 그것의 능력에 의해 동정할 수 있다. 리셉터 키메라(Rucker et al., 1996) 또는 그외 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, STRO-3 mAb의 결합 부위를 맵핑할 수 있다.
또한, 과도한 실험을 수행하지 않고도 전자가 후자를 TNAP에 결합하지 못하게 하는지를 확인함으로써, 단일클론 항체가 STRO-3 mAb와 동일한 특이성을 가지는 지를 결정할 수 있다. 만일, 테스트한 단일클론 항체가 STRO-3 mAb에 의한 결합성 감소로 나타나는 바와 같이 STRO-3 mAb과 경쟁한다면, 2종의 단일클론 항체는 동일하거나 또는 밀접하게 에피토프에 결합한다.
단일클론 항체가 STRO-3 mAb의 특이성을 가지는 지를 결정할 수 있는 또다른 방법은, TNAP로 테스트하는 단일클론 항체를 전-배양한 다음 STRO-3 mAb를 첨가하여 STRO-3 mAb의 TNAP 결합 능력이 저해되는지를 결정하는 것이다. 만일, STRO-3 mAb의 결합이 저해된다면, 테스트 중인 단일클론 항체는 STRO-3 mAb와 동일하거나 또는 기능적으로 동등한 에피토프 특이성을 가지고 있다.
본 발명에 사용가능한 단일항체를 조작하여 항체의 이소타입을 변화시킬 수 있다. 예컨대, IgG2A 이소타입은 IgG1, IgG2B 또는 그외 이소타입으로 조작할 수 있다.
본 발명의 항체와 같은 TNAP 결합제는 예컨대 세포 분리, 치료적 또는 진단적인 활용에 유용한 화합물에 접합시킬 수 있음을 인지할 것이다. 일 예로, 본 발명의 항체는 표지물에 접합된다. 표지물은 쉽게 검출할 수 있는 모든 존재일 수 있다. 예컨대, 표지물은 May 등의 미국 특허 5,656,503에 구체적으로 기재된 것과 같은 직접 표지물일 수 있다. 직접 표지물은, 자연적인 상태에서 육안으로 또는 광학 필터 또는 형광 발광을 촉진시키기 위한 자극 적용, 예컨대 UV 광의 도움하에 쉽게 볼 수 있는 실체이다. 그 예로는, 방사성 화합물, 화학발광 화합물, 전기활성 화합물(예, 레독스 표지물)이 있다. 염료 졸, 금속성 졸(예, 금) 및 유색 라텍스 입자와 같은 구체적인 직접 표지물이 매우 적합하며, 형광성 화합물과 더불어 바람직하다. 이러한 선택사항 중에서, 유색 라텍스 입자 및 형광성 화합물이 가장 바람직하다. 소형 존이나 부피로 표지물을 집중시키면, 쉽게 검출가능한 신호, 예컨대 강하게 색을 띄는 부위가 나타나야 한다. 효소와 같은 간접 표지물, 예컨대 알카리 포스파타제 및 포르세라디시 페록시다제는 기시적인 신호를 검출하기 전에 기질과 같은 하나 이상의 현색 시약의 첨가가 통상적으로 필요하지만, 이들을 또한 사용할 수 있다.
표지물과 본 발명의 항체와 같은 결합제와의 접합은 공유 또는 비공유(소수성 포함) 결합 또는 흡착에 의한 것일 수 있다. 이러한 접합 기법은 당업계에 통용되는 것으로 사용하는 특정 시약에 쉽게 개작할 수 있다.
본 발명의 항체와 같이 본 발명의 방법에 사용하기 위한 결합제는, 또한 고형 지지체에 코팅될 수도 있다. 예컨대, 항체는 합성 플라스틱 물질, 자기 입자, 마이크로타이터 분석 플레이트, 마이크로어레이 칩, 라텍스 비드, 셀룰로스 또는 합성 폴리머 물질로 구성된 필터, 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 딥스틱(dipstick), 캐필러리 필 장치(capillary fill device) 등에 코팅될 수 있다.
본 발명의 항체와 같이 본 발명에 사용되는 결합제는 또한 세포 분리용 장치에 통합될 수 있다. 예컨대, 상기 장치는 MACS 기술을 토대로하는 자동화된 세포 선별기일 수 있다. 이러한 장치는 밀폐된 멸균 시스템에서 대규모 자기 세포 선별을 행할 수 있다. 예컨대, 상기 장치는 내장된 컴퓨터, 자기 분리 단위, 연동식 펌프 및 다양한 핀치 밸브를 포함할 수 있다. 상기 내장된 컴퓨터는 바람직하기로는 장치의 모든 구성을 조절하고 표준적인 순서로 과정을 수행하도록 시스템을 관리한다. 자기 분리 단위는 바람직하기로는 이동성 연구 자석과 분리 컬럼용 홀더를 포함한다. 상기 연동식 펌프는 바람직하기로는 튜빙 세트를 통해 유속을 조절한다. 핀치 밸브를 사용하여 완충액과 세포 현탁물의 흐름을 조절할 수 있다. 선별하기 전에, 세포는 본 발명의 항체를 이용하여 자기적으로 표지한다. 이후, 분리 컬럼을 포함하여 일회용 튜빙 세트를 장치에 접촉시키고, 표지된 세포가 함유된 세포 준비 백을 상기 튜빙 세트에 연결시킬 수 있다. 선별 프로그램을 시작한 후, 시스템은 세포 샘플을 분리 컬럼에 인가하여 선택한 프로그램에 따라 일련의 세정 단계를 수행하고, 최종적으로 정제된 표적 세포를 용출한다.
세포 분리 기술
항-TNAP 항체와 같은 TNAP 결합제를 이용하여 다분화성 성체 세포를 인지하는 능력은 조직 샘플에서 이들 세포의 동정 및 정량화를 가능하게 할 뿐만 아니라 이들의 분리 및 현탁액 중의 농화를 가능하게 한다. 이는 세포-항체 복합체 또는 항체에 접촉된 표지물과 관련된 특성을 참조하여 세포를 물리적으로 분리하는 다수의 세포 분리 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 표지물은 자기 입자 또는 형광성 분자일 수 있다. 항체는 복수개의 세포 집단을 형성할 수 있도록 가교될 수 있으며, 이들은 밀도에 따라 분리가능하다. 대안적으로, 항체는 원하는 세포가 부착된 고정된 매트릭스에 부착될 수 있다.
비결합 세포로부터 항체-결합된 세포를 분리하는 여러가지 방법이 알려져 있다. 예컨대, 세포에 결합된 항체(또는 항-이소타입 항체)를 표지하고, 표지물의 존재를 검출하는 기계적인 세포 분리기로 세포를 분리할 수 있다. 형광-활성화된 세포 분리기가 당업계에 잘 알려져 있다. 일 예로, 항-TNAP 항체는 고형 지지체에 부착된다. 다양한 고형 지지체가 당업자들에게 알려져 있으며, 그 예로는 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공사막(hollow fiber membrane), 폴리머 및 플라스틱 페트리 디쉬가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 항체에 의해 결합된 세포는 세포 현탁물에서 고형 지지체를 간단하게 물리적으로 분리함으로써 세포 현탁물로부터 제거할 수 있다.
초상자성 미세입자를 세포 분리에 사용할 수 있다. 예로, 미세입자를 항-TNAP 항체로 코팅할 수 있다. 이후 항체-테깅(tagged)된 초상자성 미세입자는 원하는 세포가 함유된 용액과 인큐베이션할 수 있다. 미세입자는 원하는 다분화성 성체 세포의 표면에 결합하여, 이들 세포는 자기장하에서 채집할 수 있다.
다른 예로, 세포 샘플은 물리적인 접촉, 예컨대 고상-연결된 항-TNAP 단일클론 항체와의 물리적인 접촉이 가능하다. 고상 연결은 예컨대 플라스틱, 니트로셀룰로스 또는 그외 표면에 항체 흡착시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 항체는 중공사막의 큰 구멍(세포의 플로우 쓰루(flow-through)를 허용할 정도로 충분히 큰)에 흡착될 수 있다. 대안적으로, 항체는 표면이나 Pharmacia Sepharose 6 MB 마이크로비드와 같은 비드에 공유 연결될 수 있다. 고상-연결된 항체와 다분화성 성체 세포 함유성 현탁물의 실제 인큐베이션 조건 및 기간은 사용하는 시스템에 특이적인 여러가지 인자에 따라 결정될 것이다. 그러나 적절한 조건 선택은 당업계의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
결합되지 않은 세포는 이후 다분화성 성체 세포가 결합되기에 충분한 시간이 경과한 후 생리 완충액으로 용출시키거나 또는 세정하여 제거한다. 결합되지 않은 세포는 회수할 수 있으며, 원하는 분리가 이루어졌는지 확인하기 위해 적절한 테스트를 수행한 후 다른 목적으로 사용하거나 또는 폐기할 수 있다. 결합된 세포는 주로 고상 및 항체의 성질에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고상으로부터 분리한다. 예컨대, 결합된 세포는 왕성한 교반에 의해 플라스틱 페트리 디쉬로부터 용출시킬 수 있다. 대안적으로, 결합된 세포는 고상과 항체 사이의 효소-반응성 "스페이서" 서열을 효소적으로 "닉킹(nicking)" 또는 분해함으로써 용리시킬 수 있다. 아가로스 비드에 결합된 스페이서는 예컨대 Pharmacia로부터 구입가능하다.
세포의 용리된 농화 분획은 이후 원심분리에 의해 완충액으로 세정하고, 농화 분획 또는 비결합 분획 중 어느 하나는 기존 기술에 따라 나중에 사용하기 위해 살아있는 상태로 동결보존하거나 또는 이식 수여체에 도입할 수 있다.
유전적으로 변형된 세포의 제조
일 예로, 본 발명은 유전적으로 변형된 세포, 특히 본 발명의 유전적으로 변형된 다분화성 성체 세포에 관한 것이다. 바람직하기로는, 상기 세포는 이종의 단백질을 생산하도록 유전적으로 변형된다. 전형적으로, 세포는 이종 단백질이 세포로부터 방출되도록 유전적으로 변형될 것이다. 그러나, 일 예로, 세포는 dsRNA(전형적으로 RNA 침묵), 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 촉매성 핵산(예, 리보자임 또는 DNAzyme)과 같은 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 기능적인 비-단백질을 발현하도록 변형될 수 있다.
유전적으로 변형된 세포는 상기 변형된 세포의 생육을 뒷받침하는 충분한 양의 한가지 이상의 사이토카인의 존재하에 배양할 수 있다. 이렇게 수득되는 유전적으로 변형된 세포는 바로 이용(예, 이식에)하여 배양 및 시험관내에서 증폭시키거나, 또는 나중에 이용하기 위해 보관할 수 있다. 변형된 세포는 예컨대 액체 질소에서 동결과 같이 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 저장할 수 있다.
본원에서 유전적 변형은 외인성 또는 외래 폴리뉴클레오티드의 다분화성 성체 세포로의 도입, 또는 다분화성 성체 세포내 내인성 유전자의 변형을 포함하는, 모든 유전적 변형 방법을 포함한다. 유전적 변형은 형질전이(바이러스 매개의 숙주 또는 공여체 유래의 숙주 DNA의 수용체로의 시험관내 또는 생체내 전달), 형질감염(분리된 바이러스 DNA 게놈으로 세포 형질전환), 리포좀 매개의 전이, 전기천공(electroporation), 칼슘 포스페이트 형질감염 또는 공침전 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형질전이 방법으로는 세포와 생산자 세포의 직접적인 공배양(Bregni et al., 1992) 또는 바이러스 상층물과 단독으로 또는 적절한 성장 인자 및 폴리양이온과의 배양(Xu et al., 1994)이 있다.
외인성 폴리뉴클레오티드는 바람직하기로는 벡터 형태로 숙주 세포에 도입된다. 벡터는 바람직하기로는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필수적인 요소를 포함한다. 이러한 벡터 구축에 사용되는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 적절한 발현 벡터를 구축하는 기법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3rd Ed., 2000); and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)에 구체적으로 기재되어 있다.
벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스와 같은 바이러스 벡터; 코스미드; 플라스미드 벡터; 합성 벡터; 및 당업계에서 전형적으로 사용되는 그외 재조합 비히클이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 프로모터 및 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결될 수 있는 클로닝 사이트 둘다를 포함하고 있는 벡터는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA를 전사할 수 있으며, Stratagene (La Jolla, Calif.) 및 Promega Biotech (Madison, Wis.)과 같은 업체로부터 구입가능하다. 구체적인 예로는 Stratagene 사의 pSG, pSV2CAT, pXtl; 및 Pharmacia 사의 pMSG, pSVL, pBPV 및 pSVK3가 있다.
바람직한 벡터로는 레트로바이러스 벡터가 있다(참조, Coffin et al., "Retroviruses", Chapter 9 pp; 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997). 본 발명에 사용가능한 벡터는 당업계에 잘 알려져 있는 과정에 의해 재조합으로 제조할 수 있다. 예로, WO94/29438, WO97/21824 및 WO97/21825에는 레트로 패키징 플라스미드 및 패킹 세포주의 구축이 언급되어 있다. 예시적인 벡터로는 pCMV6b 및 pCMV6c(Chiron Corp.)와 같은 pCMV 포유류 발현 벡터, pSFFV-Neo 및 pBluescript-Sk+가 있다. 이용가능한 레트로바이러스 벡터의 비제한적인 예는, 설치류, 조류 또는 영장류 레트로바이러스 유래의 것이다. 일반적인 레트로바이러스 벡터로는, 몰루니 설치류 백혈병 바이러스를 근간으로 한 벡터(MoMLV-vector)가 있다. 그외 MoMLV 유래 벡터로는 Lmily, LINGFER, MINGFR 및 MINT가 있다. 추가적인 벡터로는 GALV(Gibbon ape leukemia virus), MOMSV(Moloney murine sarcoma virus) 및 SFFV(spleen focus forming virus) 유래 벡터가 있다. MESV(murine stem cell virus)로부터 유래된 벡터로는 MESV-MiLy가 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스를 근간으로한 벡터를 포함하며, 비제한적인 예로 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1 및 HIV-2)를 근간으로한 벡터가 있다.
레트로바이러스 벡터 구조체 제조에 있어, 바이러스의 gag, pol 및 env 서열을 바이러스에서 제거하여 외래 DNA 서열을 삽입하기 위한 공간을 만들 수 있다. 외래 DNA에 의해 코딩되는 유전자는 일반적으로 LTR(long terminal repeat)에서 강력한 바이러스 프로모터의 통제하에 발현된다. 적절한 조절 서열의 선택은 사용되는 숙주 세포에 의존적이며, 선택은 당업자의 능력내이다. LTR의 프로모터 뿐만 아니라 수많은 프로모터들이 알려져 있다. 비제한적인 예로, 파지 람다 PL 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 조기 프로모터(immediate early promoter); 몰로니 설치류 사코마 바이러스(MMSV), 루이스 사코마 바이러스(RSV) 또는 비장 집중 형성 바이러스(SFFV)의 U3 영역 프로모터; Granzyme A 프로모터; 및 Granzyme B 프로모터가 있다. 부가적으로, 유도성 및 다수개의 조절 요소가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터의 선택은 당업자들에게 명백할 것이다.
이러한 구조체는 gag, pol 및 env 기능이 충진(packing) 세포주에 의해 트랜스로 제공된다면 효율적으로 바이러스 입자로 충진될 수 있다. 따라서, 벡터 구조체가 충진 세포로 도입되었을때, 세포에서 생산된 gag-pol 및 env 단백질이 벡터 RNA와 조합하여 배양 배지로 분비되는 감염성 바이런(viron)을 생산한다. 이렇게 제조된 바이러스는 감염되어 표적 세포의 DNA에 삽입될 수 있지만, 필수적인 충진 서열이 없어 감염성 바이러스 입자를 형성하진 못한다. 현재 사용되는 대부분의 충진 세포주는 각각이 필수 코딩 서열들 중 하나를 포함하고 있는 개별 플라스미드로 형질감염되므로, 여러번의 재조합이 필수적으로 이루어진 후, 복제 가능한(replication competent) 바이러스를 제조할 수 있다. 대안적으로, 충진 세포주는 프로바이러스를 가지고 있다. 프로바이러스는 결함이 있어, 감염성 바이러스 조합에 필요한 단백질을 모두 생산할 수 있지만 자신의 RNA는 바이러스로 충진시킬 수 없다. 대신 재조합 바이러스에서 생산된 RNA가 충진된다. 그러므로, 충진된 세포로부터 나온 바이러스 스톡은 오직 재조합 바이러스만 포함한다. 레트로바이러스 충진 주의 비제한적인 예로는 PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6), 및 PT67가 있다. Miller et al., 1986; Miller et al., 1989; Danos et al., 1988; Pear et al., 1993; and Finer et al., 1994를 참조한다.
그외 적합한 벡터는 아데노바이러스 벡터(참조, Frey et al., 1998; and WO 95/27071) 및 아데노-부속 바이러스 벡터가 있다. 이들 벡터는 당업계, 예컨대 Chatterjee et al., 1996; and Stem Cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998; 및 미국 특허 제 5,693,531호 및 제 5,691,176호에서와 같이, 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 유래 벡터의 사용은 이들이 비분열성 세포에는 감염할 수 없기 때문에 특정 조건에서는 유용할 수 있다. 레트로바이러스 DNA와는 달리, 아데노바이러스 DNA는 표적 세포의 게놈으로 삽입되지 않는다. 게다가, 외래 DNA를 수송하는 능력은 레트로바이러스 벡터 보다 아데노바이러스 벡터가 더 좋다. 아데노-부속 바이러스 벡터는 다른 유용한 전달 시스템이다. 이러한 바이러스의 DNA는 비분열성 세포에 삽입될 수 있으며, 아데노-부속 바이러스 벡터를 이용하여 다양한 세포 타입으로 다수의 폴리뉴클레오티드가 성공적으로 도입되었다.
일부 예들에 있어서, 구조체 또는 벡터는 2 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 것이다. 바람직하기로는, 추가적인 핵산 서열은 선별 마커, 구조 유전자, 치료 유전자 또는 사이토카인/케모카인 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
선별 마커는 성공적인 유전적 변형을 모니터링하기 위해, 그리고 DNA가 삽입된 세포 선별을 위해 구조체 또는 벡터에 포함될 수 있다. 비제한적인 예로는 G148 또는 히그로마이신과 같은 약물 내성 마커가 있다. 부가적으로, 예컨대 마커가 HSV-tk 유전자인 경우에 음성 선별을 이용할 수 있다. 이 유전자는 세포가 아시클로버 및 간시클로버와 같은 제제에 민감하게 만든다. NeoR(네오마이신/G148 내성) 유전자가 통상적으로 사용되지만, 그 유전자 서열이 사용가능한 표적 세포에 기존재하지 않는 모든 기존의 마커 유전자를 사용할 수 있다. 다른 비제한적인 예로는, 저-친화성 신경 성장 인자(NGFR), 보강된 형광 그린 단백질(EFGP), 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자(DHFR), 박테리아 hisD 유전자, 설치류 CD24(HSA), 설치류 CD8a(lyt), 푸로마이신 또는 플레오마이신에 대해 내성을 부여하는 박테리아 유전자 및 베타-갈락토시다제가 있다.
추가적인 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 동일한 벡터상에서 숙주 세포로 도입될 수 있으며, 또는 제2의 벡터상에서 숙주 세포로 도입될 수 있다. 바람직한 예에서, 선별 마커는 폴리뉴클레오티드로서 동일한 벡터상에 포함될 것이다.
또한, 본 발명은 내인성 유전자의 발현이 천연형 다분화성 성체 세포에 비해 코딩 단백질 생산을 증가시키는 상향-조절되도록, 내인성 유전자의 프로모터 영역을 유전적으로 변형시키는 것을 포함한다.
자극 인자의 투여
본 발명의 방법은 하나 이상의 자극 인자의 사용을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 자극 인자를 포함할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 방법은 1α,25-디하이드록시비타민 D3 (1,25D), 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 종양 괴사 인자 α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 및 기질 유래 인자 1α(SDF-1α)와 같은 하나 이상의 자극 인자를 국부, 전신 또는 임플란트 또는 기기내와 같이 국소로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 예에서, 자극 인자의 바람직한 범위는 0.1 nM-0.1 M, 0.1 nM-0.05 M, 0.05 nM-15 μM 또는 0.01 nM-10 μM이다. 투여량은 완화되는 증상의 중증도에 따라 변경될 수 있음을 주지하여야 한다. 임의의 특정 대상자의 경우, 조성물의 투여를 관리하고 감독하는 사람의 전문적인 판단과 개개인의 요구에 따라 구체적인 투약 요법이 시간 경과에 따라 조절될 것이다. 본원애 언급된 투여량 범위는 단지 예에 불과하며 의료 종사자에 의해 선정될 수 있는 투여량 범위로 한정되지 않는다.
조성물내 자극 인자의 양은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자들에 따라 변경될 수 있다. 투약 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조절될 수 있다. 예컨대, 하나의 볼루스(bolus)가 투여될 수 있으며, 수개로 나눈 투여량을 시간에 따라 투여할 수 있으며, 또는 치료 상태의 절박성에 비례하여 투여량을 낮추거나 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 투약 균일성에 있어 투약 단위 형태로 비경구 조성물을 제형화하는 것이 이로울 수 있다. "투약 단위 형태"는 본원에서 치료되는 대상체에게 단일 투약으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 약학적 담체와 조합하여 원하는 치료 효과를 형성하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 함량을 포함한다.
자극 인자는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서, "약학적으로 허용가능한 담체" 또는 "부형제"는 생리적으로 혼용가능한, 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 일 예로, 상기 담체는 비경구 투여에 적합하다. 대안적으로, 담체는 정맥내, 복막내, 근육내, 설하 또는 경구 투여에 적합할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액이나 분산물, 및 멸균성 주사용 용액 또는 분산물의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적으로 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 물질이 활성 화합물과 혼용가능하지 않는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학 조성물내 이들의 사용이 포함된다. 또한, 보충적인 활성 화합물도 상기 조성물에 혼입할 수 있다.
비경구 투여용 약학 제형은 리포좀을 포함할 수 있다. 리포좀 및 에멀젼은 소수성 약물에 특히 이용가능한 전달 비히클 또는 담체로 잘 알려진 예이다. 치료 반응제의 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가적인 전략을 채택할 수 있다. 또한, 표적화된 약물 전달 시스템, 예컨대 표적 특이적인 항체로 코팅된 리포좀 형태로 약물을 투여할 수 있다. 리포좀은 표적 단백질에 결합할 것이며, 표적 단백질을 발현하는 세포에 의해 선택적으로 흡수될 것이다.
치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건에서 멸균 상태이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 약물 고농도에 적합한 그외 고도화된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적정 혼합물을 함유하고 있는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예컨대 렉시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산의 경우에 필수 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장성 물질, 예컨대, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 소르비톨 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 지연은, 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이룰 수 있다. 또한, 자극 인자는 시간 방출 제형, 예컨대 서방형 폴리머를 포함하는 조성물로 투여할 수 있다. 활성 화합물은 방출 조절성 제형과 같이 화합물이 신속하게 방출되지 않도록 보호하는 담체와 제조될 수 있으며, 임플란트 및 미세캡슐 전달 시스템을 포함한다. 생분해성, 생체적합한 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르, 폴리락트산 및 폴리락틱, 폴리글리콜릭 공중합체(PLG)를 사용할 수 있다. 이러한 제형의 제조하기 위한 다수의 방법들이 특허되어 있으며, 당업자들에게 일반적으로 공지되어 있다.
또한, 자극 인자의 현탁물은 주사에 적합한 오일성 현탁물로서 제조할 수 있다. 적합한 친지질성 용매 또는 비히클로는 참기름과 같은 지방 오일, 에틸 올레이트 또는 트리글리세라이드와 같은 합성 지방산 에스테르, 또는 리포좀을 포함한다. 또한, 주사로 사용되는 현탁물은 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁물의 점성을 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁물은 또한 고도로 농축화된 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해성을 증가시키는 물질이나 적합한 안정화제를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적정 용매중에 필수량의 활성 화합물을 필요에 따라 상기 수많은 성분들 중 하나 또는 그 조합과 혼합하고, 이후 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산물은 활성 화합물을, 기본 분산 매질과 상기 다수 성분들 이외의 다른 필수 성분을 함유하는 멸균 비히클과 혼합함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 이미 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 원하는 부가적인 성분의 분말을 도출하는, 진공 건조 및 동결 건조이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 자극 인자는 그것의 용해도를 증가시키는 하나 이상의 부가적인 화합물과 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물을 흡입에 의해 투여하는 경우, 이는 적합한 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 그외 적정 가스를 함께 사용하여, 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 프리젠테이션(spray presentation) 형태로 일반적으로 전달할 수 있다. 가압 에어로졸제의ㅇ 경우, 투약 단위는 측정된 양을 전달하기 위한 밸브를 장착함으로써 결정할 수 있다. 흡입기에 사용하기 위한, 전분 또는 락토스와 같은 적정 분말 베이스와 화합물의 분말 믹스를 포함하는 젤라틴 캡슐 및 카트리지를 제형화할 수 있다.
세포 조성물
다분화성 성체 세포를 포함하는 본 발명의 세포 조성물은 골, 연골, 힘줄, 인대, 근육, 피부 및 그외 연결 조직 뿐만 아니라, 신경, 심장, 간, 폐, 신장, 췌장, 뇌 및 그외 다른 기관 조직을 포함하여, 다양한 종류의 조직 재생에 유용할 수 있다.
일부 예에서, 본 발명의 조성물은 예컨대 세포를 지지하고, 골, 연골, 근육, 신경, 상피 및/또는 그외 결한 조직 성장을 위한 표면을 제공하기 위하여, 적절한 매트릭스와 조합하여 투여할 수 있다. 상기 매트릭스는 전통적인 매트릭스 생체물질의 형태일 수 있다. 매트릭스는 세포의 느린 방출 및/또는 그것의 존재를 위한 적합한 환경을 제공할 수 있다. 일부 예에서, 다양한 콜라겐성 및 비-콜라겐성 단백질은 상향 조절되어 세포로부터 방출되는 것으로 예상된다. 이러한 현상은 매트릭스 침착(deposition)을 증강함으로써 조직 재생을 가속화시킨다. 또한, 매트릭스 단백질은 유전적으로 조작된 세포에서 발현시킬 수 있으며, 이식 부위로 형질전환된 세포의 생착 및 부착을 증강시킬 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용적 외양(cosmetic appearance) 및 인터페이스 특징을 기초로 한다. 세포성 조성물의 특정한 적용은 적합한 제형을 한정할 것이다. 조성물에 대해 사용가능한 매트릭스는 생분해성이며, 화학적으로 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드로 규정될 수 있다. 그외 가능성 있는 물질은 생분해성이며, 골 또는 진피 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 규정된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성되어 있다. 그외 가능성 있는 매트릭스는 비-생분해성이며, 소결된 하이드록시아파티트, 바이오글라스, 알루미네이트 또는 다른 세라믹류와 같이 화학적으로 규정된다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파티트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술한 타입의 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹류는 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물중에서 변형될 수 있으며, 이를 가공하여 기공 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 세포 조성물을 사용하여 질병이나 외상, 또는 조직의 정상적인 발생 부전으로 유발되는 연골 또는 골조직의 복구 또는 치환이 필요한 환자를 치료할 수 있으며, 또는 안면이나 신체의 다른 부분을 늘리기 위한 미용 기능을 제공할 수 있다. 치료는 본 발명의 세포를 새로운 연골 조직이나 골 조직을 형성하는 용도를 수반할 수 있다. 예로, 미분화된 또는 연골형성 분화-유발된 전구세포를 포함하는 조성물을 사용하여 연골 질환, 예컨대 류마티스 관절염 또는 골관절염이나, 외상성 또는 수술로 인한 연골 상처를 치료할 수 있다. 다른 예로서, 골 전구세포를 포함하는 조성물을 사용하여, 대사성 및 비-대사성 골 질환을 포함한 골 질환들을 치료할 수 있다. 골 증상의 예로는 반월상 연골 손상(meniscal tear), 척추골 유합, 척추 디스크 제거, 척추 재건, 골절, 골/척추 변형, 골육종, 골수종, 골 형성장애(bone dysplasia), 척추 만곡(scoliosis), 골다공증, 치주질환, 치아 골 감소(dental bone loss), 골연화증, 구루병, 섬유성 골염(fibrous osteitis), 신장 골 부전(renal bone dystophy), 및 파제트 골 질환을 포함한다.
본 발명의 세포 조성물은 단독으로 또는 다른 세포와 혼합물로서 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여할 수 있는 세포는, 그외 다능성 또는 다분화성 세포, 연골세포, 연골모세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 골 라이닝 세포, 줄기세포 또는 골수세포가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 여러가지 타입의 세포는 투여하기 바로 전 또는 곧 본 발명의 조성물과 혼합할 수 있으며, 또는 이는 투여하기전에 일정기간 함께 배양할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 다른 유익한 약물이나 생물 분자(성장 인자, 영양 인자)와 함께 투여할 수 있다. 다분화성 성체 세포를 다른 물질와 함께 투여하였을때, 이들은 단일 약학 조성물로 다른 물질과 함께 또는 개별적인 약학 조성물로, 다른 물질과 동시에, 또는 연속적으로(다른 물질의 투여 전 또는 후) 투여할 수 있다. 함께 투여할 수 있는 생체활성 인자로는 항-세포사멸제(예, EPO, EPO 항체모방체(mimetibody), TPO, IGF-I 및 IGF-II, HGF, 카스파제 저해제); 항-염증제(예, p38 MAPK 저해제, TGF-beta 저해제, 스타틴, IL-6 및 IL-1 저해제, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS, 및 NSAID(비스테로이드성 항-염증제; 예, TEPOXALIN, TOLMETIN, SUPROFEN); 면역억제제/면역조절제(예, 사이클로스포린, 타크롤리무스와 같은 칼시뉴린(calcineurin) 저해제; mTOR 저해제(예, SIROLIMUS, EVEROLIMUS); 항-증식제(예, 아자티오프린(azathioprine), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)); 코르티코스테로이드(예, 프레드니솔론(prednisolone), 하이드로코르티손); 단일클론 항-IL-2Rα 리셉터 항체와 같은 항체(예, 바실릭시맵(basiliximab), 다클리주맵(daclizumab)), 다클론성 항-T- 세포 항체(예, 항-흉선 세포 글로불린(ATG); 항-림프구 글로불린(ALG); 단일클론 항-T 세포 항체 OKT3)); 항-혈전제(anti-thrombogenic agents)(예, 헤파린, 헤파린 유도체, 유로키나제, PPack(덱스트로페닐알라닌 프롤린 아르기닌 클로로메틸케톤), 항트롬빈 화합물, 혈소판 리셉터 길항제, 항-트롬빈 항체, 항-혈소판 리셉터 항체, 아스피린, 디피리다몰, 프로타민, 히루딘, 프로스타글란딘 저해제 및 혈소판 저해제); 및 항-산화제(예, 프로부콜(probucol), 비타민(vitamin) A, 아스코르브산, 토코페롤, 코엔자임 Q-1O, 글루타티온, L-시스테인, N-아세틸시스테인) 뿐만 아니라 국소 마취제를 포함한다. 다른 예로서, 세포는 미국 특허 제 5,827,735호에 언급된 바와 같이, 흉터 저해 인자와 함께 공동 투여할 수 있으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 예에서, 본 발명의 세포 조성물은 미분화된 세포로서, 즉 배양 배지내 배양한 것으로서 투여된다. 대안적으로, 세포 조성물은 원하는 표현형, 예컨대 골형성 표현형으로 분화를 자극하는 조건으로 배양물을 노출시킨 다음 투여할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 복구 또는 확대가 필요한 부위에, 수술을 통해 이식, 주사, 전달(예, 카테터나 또는 시린지를 이용하여)하거나, 그렇지 않다면 직접 또는 간접적으로 투여할 수 있다. 세포는 매트릭스에 의해 투여될 수 있다(예, 3차원의 골격(scaffold)). 세포는 기존의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 세포, 조성물 또는 성분(예, ECM, 세포 융혈물, 조건 형성된 배지(conditioned medium))의 투여 경로는 근육내, 눈, 비경구(정맥내 포함), 동맥내, 피하, 경구 및 코 투여를 포함한다. 비경구 투여의 특정 경로로는 근육내, 피하, 복막내, 뇌내, 뇌실내(intraventricular), 대뇌뇌실내(intracerebroventricular), 경막내, 수조내(intracisternal), 척추내 및/또는 말초-척추 투여 경로가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
세포를 반고형 또는 고형 장치내에 투여하는 경우에는, 신체에 정확한 위치에 외과 이식하는 것이 전형적으로 적합한 투여 방식이다. 그러나, 액체 또는 유체성의 약학 조성물은 이들이 예컨대 화학적 신호에 대한 반응으로 특정 위치로 이동하는 1곳 이상의 일반적인 위치(예, 확산시키는 부위를 통해)에 투여할 수 있다.
다른 예는 세포 조성물(예, 세포 융혈물 또는 그 성분) 또는 산물(예, 유전자 변형을 통해 생산된 세포외 매트릭스, 영양인자 및 그외 생물학적 인자)를 포함하는 약학 조성물의 투여에 의한 치료 방법을 포함한다.
본원에 개시된 세포 조성물을 투여하기 위한 투약 형태 및 요법은 각 환자의 상태, 예로 치료중인 증상의 특성 및 정도, 연령, 성별, 체중 및 일반적인 의학적인 상태와, 의료 실무자들에게 공지되어 있는 그외 인자를 고려하여, 우수한 의학 실무에 따라 개발된다. 따라서, 환자에게 투여되는 약학 조성물의 유효량은 당업계에 공지된 바와 같이 이러한 고려사항에 따라 결정된다.
본 발명의 일부 예에서, 본 발명의 세포 조성물을 이용한 치료 개시 전에, 환자의 면역을 억제하는 것이 필수적이거나 또는 바람직하지 않을 수 있다. 따라서, 동종이형 또는 이종의(xenogenoic) 다분화성 성체 세포 이식은 일부 경우에서는 허용될 수 있다.
그러나, 다른 경우에서는, 세포 요법을 개시하기 전에 환자의 면역을 약물학적으로 억제하는 것이 바람직하거나 적절할 수 있다. 이는 전신성 또는 국소 면역억제제를 이용하여 달성할 수 있으며, 또는 캡슐화된 장치를 통해 세포를 전달함으로써 수행할 수 있다. 다분화성 성체 세포는 세포가 필요로하는 영양분 및 산소와 치료 인자가 투과가능하지만, 면역 체액성 인자 및 세포에는 비투과성인 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 바람직하게는, 캡슐화제는 저자극성이며, 표적 조직에 용이하고 안정적으로 위치시킬 수 있으며, 이식된 구조물에 대한 방어를 제공한다. 이식된 세포에 대한 면역반응을 감소 또는 없애기 위한 이러한 및 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다. 대안적으로, 다분화성 성체 세포는 유전자 변형시켜 그들의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
이식된 세포의 살아있는 환자에서의 생존성은 CAT(computerized axial tomography) 또는 CT 스캔, MRI(magnetic resonance imaging), 또는 PET(positron emission tomography) 스캔과 같이 다양한 스캐닝 기법을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 이식물의 생존 측정은 사후 표적 조직을 적출하여 이를 가시화하거나 또는 현미경으로 검경하여 실시할 수 있다. 대안적으로는, 세포를 특정 계통의 세포에 특이적인 염료로 처리할 수 있다. 이식된 세포는 또한 로다민- 또는 플루오레세인-표지된 미세구, 패스트 블루(fast blue), 비스벤즈아미드, 페릭 미세입자와 같은 트레이서 염색제의 전처리나, 또는 β-갈락토시다제 또는 β-글루코로니다제와 같이 유전자 도입된 리포터 유전자 산물에 의해 동정할 수 있다.
대상체에 이식된 세포의 기능적 통합(functional integration)은 손상 또는 질병에 걸린 기능의 회복, 예컨대 관절이나 골 기능 회복 또는 기능 증대를 조사함으로써 평가할 수 있다.
본 발명의 세포 조성물은 하나 이상의 생체활성 인자를 포함할 수 있으며, 그 예로는 성장 인자, 분화-유도 인자, 카스파제 저해제와 같은 새포 생존 인자, p38 키나제 저해제와 같은 항-염증제가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
대안적으로 이식되는 세포는 성장 인자, 항산화제, 항- 세포자살제, 또는 항-염증제를 발현하기 위해 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체내에 동질적인 또는 이종적인 세포 집단, 그의 세포외 기질이나 세포 융혈물, 또는 조건형성된 매질을 포함할 수 있다. 본 발명의 세포에 대한 약학적으로 허용가능한 담체로는 본 발명의 세포, 그 조성물 또는 성분과 유해하게 반응하지 않는, 적합한 유기 또는 유기 담체 물질을 포함한다. 생체친화적인 범위로, 약학적으로 허용가능한 적합한 담체로는 물, 염 용액(링거액), 알코올, 오일, 젤라틴 및 락토스, 아밀로스 또는 전분과 같은 탄수화물, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로스 및 폴리비닐 피롤리돈이 있다. 이러한 조제물들은 멸균할 수 있으며, 적절한 경우에 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 삼투압을 위한 염, 완충액 및 발색제와 같은 보조제와 혼합할 수 있다. 본 발명에 이용하기 적합한 약학 담체는 당업계에 공지되어 있으며, 예로 Pharmaceutical Sciences(17.sup.th Ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.) 및 WO 96/05309에 개시되어 있다.
그외 하나 이상의 성분을 이식된 세포에 첨가할 수 있으며, 상기 성분은 당업계에 공지된 한가지 타입 이상의 콜라겐과 같은 선택된 세포외 기질 성분, 및/또는 성장 인자, 혈소판이 풍부한 혈장 및 약물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 세포는 성장 인자 발현 및 생산을 위해 유전자 조작될 수 있다. 본 발명의 세포의 유전자 조작에 대한 구체적인 내용은 본원에 기재되어 있다.
비제한적인 예에 있어서, 본 발명의 세포를 포함하는 제형은 골 조직과 같이 새로운 조직 형성을 원하는 부위에 직접 투여하기 위해 제조된다. 예컨대, 비제한적으로, 세포는 주사용 하이드로겔 용액에 현탁할 수 있다. 본 발명에 이용하기에 적합한 하이드로겐의 예로는, 자가-조립성 펩티드, 예컨대 RAD16이 있다. 대안적으로, 세포를 포함하는 하이드로겔 용액은 예컨대 몰드에서 경화되어, 이식하기 전에 세포가 분산되어 있는 매트릭스를 제조할 수 있다. 또한, 매트릭스가 경화된 후, 세포 형성물은 이식전에 세포가 유사분열하도록 배양할 수 있다. 하이드로겔은 공유, 이온 또는 수소 결합을 통해 가교되어 물 분자를 포획하여 젤을 형성하는, 3차원의 개방형 격자 구조를 형성하는, 유기 폴리머(천연 또는 합성)이다. 하이드로겔 형성에 사용할 수 있는 물질의 예로는 알기네이트 및 그의 염과 같은 다당류, 펩티드, 폴리포스파진 및 각각 온도 또는 pH에 의해 가교된 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블럭 공중합체와 같은 이온 가교된 폴리머 또 블록 폴리머인 폴리아크릴레이트가 있다. 일부 예에서, 세포 지지체는 생분해성이다.
본 발명의 일부 예에 있어서, 제형은 미국 특허 특허 공개번호 2002/0022676; Anseth et al, 2002; Wang et al., 2003에 기술된 바와 같이, 정 위치(in situ) 중합성 겔(polymerizable gel)을 포함한다.
일부 예들에서, 폴리머는 하전된 측기 또는 그의 1가 이온성 염을 가지는 물, 완충화된 염 용액 또는 수계 알코올 용액과 같은 수용액 중에 적어도 일부 가용적이다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측기를 가지는 폴리머의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산과 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트) 및 설폰화된 폴리스티렌과 같은 설폰화된 폴리머가 있다. 아크릴 또는 메타크릴산과 비닐 에테르 모노머 또는 폴리머의 반응에 의해 형성된 산성 측기를 가지는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성기의 예로는 카르복시산기, 설폰산기, 할로겐화된(바람직하기로는 플루오르화된) 알코올기, 페놀의 OH기, 및 산성 OH기가 있다.
음이온과 반응할 수 있는 염기 측기를 가지는 폴리머의 예는, 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸) 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이다. 폴리머의 암모늄 또는 4급 염은 벡본 니트로겐 또는 달린 이미노기로부터 형성할 수 있다. 염기 측기의 예는 아미노 및 이미노기이다.
알기네이트는 이가 양이온들과, 수중에서, 실온에서 이온 가교하여, 하이드로겔 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 온화한 조건으로 인해, 알기네이트는 Lim의 미국 특허 제 4,352,883호에 개시된 바와 같이, 하이브리도마 세포의 캡슐화에 가장 일반적으로 사용되는 폴리머이다. 상기 방법으로, 캡슐화되는 생물 물질을 포함하고 있는 수용액을 수용성 폴리머 용액 중에 현탁하고, 현탁물을 소적(droplet)으로 만든 다음, 다가 양이온과의 접촉에 의해 개별적인 미세캡슐로 변환시켜, 이후 미세캡슐 표면을 폴리아미노산과 가교시켜 캡슐화된 물질 주변의 반투과성 막을 형성시킨다.
폴리포스파젠은 교대로 있는 단일 결합 및 이중 결합에 의해 떨어져 있는 니트로겐 및 포스포로스로 구성된 백본을 가지는 폴리머이다. 각 포스포러스 원자는 2개의 측쇄와 공유 결합되어 있다.
가교에 적합한 폴리포스파젠은 2가 또는 3가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있으며 산성인 측쇄기 대부분을 가지고 있다. 바람직한 산성 측기의 예는 카르복시산기 및 설폰산기이다. 가수분해적으로 안정적인 폴리포스파젠은 Ca2 + 또는 Al3+과 같은 2가 또는 3가 양이온에 의해 가교된 카르복시산 측기를 가지고 있는 모노머들로 형성된다. 가수분해로 분해되는 폴리머는 이미다졸, 아미노산 에스테르 또는 글리세롤 측기를 가지는 모노머들의 통합에 의해 합성할 수 있다. 예컨대, 폴리양이온성 폴리[비스(카르복실아토페녹시)]포스파젠(PCPP)을 합성할 수 있으며, 이는 실온 또는 실온 보다 낮은 온도에서 수계 매질중에 용해된 다가 양이온과 가교하여, 하이드로겔 매트릭스를 형성한다.
생분해성 폴리포스파젠은 2 이상의 상이한 타입의 측쇄, 다가 양이온과 염 브릿지를 형성할 수 있는 산성 측기 및 생체내 조건에서 예컨대 이미다졸 기, 아미노산 에스테르, 글리세롤 및 글루코실을 가수 분해하는 측기를 가지고 있다.
측쇄의 가수 분해로 폴리머는 마멸(erosion)된다. 가수 분해성 측쇄의 예는 비치환된 및 치환된 이미디졸, 및 기가 아미노 연결을 통해 포스포러스 원자에 결합되어 있는 아미노산 에스테르이다(R 기 둘다가 이러한 방식으로 부착된 폴리포스파젠 폴리머는 폴리아미노포스파젠이라함). 폴리이미다졸포스파젠의 경우, 폴리포스파젠 벡본상의 "R" 기들중 일부는 고리의 질소 원자를 통해 벡터의 포스포러스에 부착되어 있는 이미다졸 고리이다. 그외 "R"기는 메틸 페녹시기 또는 Allcock et al, Macromolecule 10:824(1977)의 과학 논문에 기재된 다른 기와 같이, 가수 분해에 관여하지 않는 유기 잔기일 수 있다. 하이드로겔 물질의 합성 방법과 이러한 하이드로겔 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다.
또한, 제형에 다른 성분들이 포함될 수 있으며, 비제한적으로, (1) 적합한 pH 및 등장성을 제공하기 위한 완충제; (2) 윤활제; (3) 투여 부위나 근처에서 세포를 보유하기 위한, 예컨대 알기네이트, 아가 및 식물성 검을 포함한 점성 물질; 및 (4) 투여 부위에 원하는 효과, 예컨대 조직 형성 또는 물리화학적 특징의 증강 또는 변형, 세포의 생존 능력 지지로서, 또는 감염 또는 거부 반응 저해를 형성할 수 있는 다른 타입의 세포들 중 임의의 것을 포함한다. 세포는 상기 부위에서 이탈되는 것을 방지하기 위한, 적합한 상처 커버링으로 피복될 수 있다. 상기 상처 커버링은 당업계에게 공지되어 있다.
피브린 글루( Fibrin glue )
피브린 글루는 다양한 임상 조건에서 사용되어온 외과용 봉합제(surgical sealant) 중 하나이다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 본 발명의 조성물에 다수의 봉합제를 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 예는 본 발명의 세포를 이용하는 피브린 글루의 용도에 관한 것이다.
본원에서, 용어 "피브린 글루"는 칼슘 이온의 존재시에 피브린 폴리머의 가교에 의해 형성되는 불용성 매트릭스를 나타낸다. 피브린 글루는 피브리노겐 또는 그 유사체나 대사산물, 피브린(가용성 단량체 또는 폴리머) 및/또는 피브린 매트릭스를 형성하는 생물 조직 또는 체액으로부터 유래된 그것의 복합체로부터 형성될 수 있다. 대안적으로, 피브린 글루는 재조합 DNA 기술로 제조한 피브리노겐, 그 유사체, 그 대사산물 또는 피브린으로 형성될 수 있다.
또한, 피브린 글루는 피브리노겐과 피브린 글루 형성 촉매제(예, 트로빈 및/또는 팩터 XIII)의 상호작용에 의해 형성될 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 피브리노겐은 (트롬빈과 같은) 촉매제의 존재시에 단백질 분해에 의해 절단되어, 피브린 단량체로 전환된다. 피브린 단량체는 다시 가교되어 피브린 글루 매트릭스를 형성할 수 있는 폴리머를 형성할 수 있다. 피브린 폴리머의 가교는 팩터 XIII과 같은 촉매의 존재에 의해 증강될 수 있다. 피브린 글루 형성의 촉매는 혈장, 동결침전물 또는 피브리노겐이나 트롬빈을 함유하고 있는 그외 혈장 분획물로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 촉매는 재조합 DNA 기술에 의해 제조할 수 있다.
응고 속도는 피브리노겐이 혼합된 트롬빈의 농도에 의존적이다. 효소 의존적인 반응이므로, 온도가 높을수록(최대 37 ℃), 응고 속도는 빨라진다. 응고물의 장력 강도는 사용한 피브리노겐의 농도에 의존적이다.
피브린 글루의 용도 및 그것의 제조 및 이용 방법은 Hirsh 등의 미국 특허 제 5,643,192호에 기재되어 있다. Hirsh는 하나의 공여체로부터 피브리노겐 및 트로빈 성분 추출과 피브린 글루로서 이용하기 위한 이들 성분들만의 조합을 언급하였다. Marx의 미국 특허 제 5,651,982호에는 다른 조제물 및 피브린 글루의 이용 방법이 기재되어 있다. Marx는 포유류 국소 봉합제로서 사용하기 위한 리포좀을 이용한 피브린 글루를 제시한다. 조제물 및 국소 피브리노겐 복합체(TFC)의 상처 치유에 있어서의 용도는 당해분야에 공지되어 있다. The American Red Cross의 PCT 출원번호 PCT/US95/15876, PCT 공개번호 WO96/17633에는 예컨대 PCT 공개번호 WO96/17633의 16-18페이지에 피브리노겐, 트롬빈 및 칼슘 클로라이드를 함유하는 TFC 조제물이 논의되어 있다.
수개의 공개문헌들에도 치료제 전달에 있어 피브린 글루의 용도가 언급되어 있다. 예컨대, 미국 특허 제 4,983,393호에는 아가로스, 아가, 염수 용액 글리코사미노글리칸, 콜라겐, 피브린 및 효소를 포함하는 질내 삽입체로서 사용하기 위한 조성물이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 제 3,089,815호에는 피브리노겐 및 트롬빈으로 구성된 주사용 약학 조제물이, 미국 특허 제 6,468,527호에는 체내 특정 부위에 다양한 생물학적 제제 및 비-생물학적 제제의 전달을 용이하게 하는 피브린 글루가 개시되어 있다.
골 조직 패치의 제형
미리 모양을 잡아둔 웰에서 본 발명에 따른 세포의 배양 또는 공동 배양으로 미리 결정된 두께 및 체적의 조직 패치를 제조할 수 있다. 제조되는 조직 패치의 체적은 웰의 체적과 다분화성 성체 세포의 수에 의존적이다. 미리 결정된 최적 체적을 갖춘 조직은 전술한 파라미터중 하나 또는 둘다를 변형시켜, 일반적인 실험으로 제조할 수 있다.
세포가 접촉하는 웰 표면에는 다분화성 성체 세포의 세포 접촉성 표면에 세포 부착을 방해하는 분자를 코팅할 수 있다. 바람직한 코팅제는 실리콘 기반의 시약, 즉 디클로로디메틸실란 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 기반의 시약, 즉 TEFLON을 포함한다. 실리콘 기반의 시약, 특히 디클로로디메틸실란으로 물질을 코팅하는 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, Sambrook et al.(1989) "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 세포가 웰 표면에 부착되는 것을 예방하는 생체적합한 시약을 본 발명의 실시에 사용할 수 있음을 이해한다.
대안적으로, 웰은 그 자체가 세포의 부착을 허용하지 않는 유연한 또는 형태를 만들 수 있는 생체적합한 물질로부터 만들 수 있다. 이러한 세포 부착을 방지하는 바람직한 물질은 아가로스, 유리, 무처리 세포 배양 플라스틱, 및 폴리테트라플루오로에틸렌, 즉 TEFLON을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 무처리 세포 배양 플라스틱, 즉 전정기적 전하를 띄지 않는 물질로 처리 또는 만들어지지 않은 플라스틱을 시중에서 구입가능하며, 예컨대 Falcon Labware, Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ에서 구입할 수 있다. 그러나, 전술한 물질로 한정되는 것은 아니다. 다분화성 성체 세포의 부착을 본래 방해하는 모든 그외 유연한 또는 형태를 만들 수 있는 생체적합한 임의 물질이 본 발명의 실시에 이용할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 세포는 현탁액 중에서, 미리 형태를 만들어 둔 웰에 접종하여 배양하였다. 세포는 웰 배양시 연골형성 또는 골형성 표현형으로 분화하도록 유도될 수 있으며, 또는 웰에 접종하기 전에 분화를 유도할 수 있다. 세포는 mL 당 약 1 x 105 내지 1 x 109 세포 밀도로 배양 배지에 첨가함으로써 희석할 수 있다.
세포는 세포의 점착성 플러그(cohesive plug)를 형성할 수 있다. 세포의 점착 플로그를 웰에서 취하여, 조직 결함부로 수술에 의해 이식할 수 있다. 본 발명의 다분화성 성체 세포는 정위치에서 분화하여 생체내에서 조직을 형성할 수 있을 것으로 생각된다.
골 결손은 CAT(computer aided tomography) 스캐닝: X-레이 시험, MRI(magnetic resonance imaging), 활액(synovial fluid) 또는 혈청 마커 분석, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 공정을 이용하여 추론으로 동정할 수 있다. 또한, 포유류에서 결함은 관절경 검사 또는 관절의 개복 수술 중에 시각적으로 쉽게 식별가능하다. 결함 치료는 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 관절경 검사 또는 개복 수술 중에 수행될 수 있다.
따라서, 결함이 동정되면, 결함은 (1) 본 명세서에 기재된 방법으로 제조된 조직 패치를 미리 결정한 부위에 수술로 이식하는 단계; 및 (2) 상기 조직 패치를 미리 결정한 부위에 삽입하는 단계로, 치료될 수 있다.
조직 패치는 선택적으로 패치가 결함부에 이식되었을때 이식된 조직의 가장자리는 결함부의 가장자리와 직접 접촉하는, 크기와 모양을 갖추고 있다. 또한, 조직 패치는 수술 중에 바른 위치에 고정할 수 있다. 이는 패치를 생분해성 봉합사로 수술로 고정하거나 및/또는 생점착제를 패치와 결함부가 접촉하는 부위에 적용함으로써, 달성할 수 있다.
일부 예에서, 손상된 조직은 조직 패치를 이식하기 전에 외과적으로 적출할 수 있다.
스캐폴드를 이용한 세포 이식
본 발명의 세포 조성물 또는 그의 공동-배양물은 3차 구조의 스캐폴드 상에 또는 내에 접종하여, 생체내 이식하고, 접종된 세포를 프레임워크상에서 증식하여 환자의 세포와 공동으로 골 조직과 같은 대체 조직을 생체내에서 형성하게 될 것이다.
예컨대, 스캐폴드는 스캐폴드 구조가 (1) 이후 분해되지 않고 접종된 세포를 유지하고; (2) 조직 이식물이 숙주 세포 조직에 의해 리모델링될 때까지 접종후 세포를 지탱하고; (3) 접종된 세포가 스캐폴드가 분해된 시점에 시험관내에서 스스로를 지탱하는데 충분한 기계적 완전성(mechanical integrity)을 가지는 조직 구조로 부착, 증식 및 발생하도록 설계될 수 있다. 이러한 스캐폴드 설계의 재검토는 Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn., 12(l):107-124(2001)에 의해 이루어졌다.
본 발명의 스캐폴드는 조직 형성을 자극하거나 그렇지 않으면 본 발명의 실시를 증강 또는 개선시키는, 하나 이상의 성장 인자, 세포, 예컨대 줄기 세포, 골수세포, 연골세포, 연골모세포, 골세포, 조골세포, 파골세포, 골 라이닝 세포 또는 이들의 전구체, 약물 또는 본원에 개시된 다른 성분들과 병용 투여할 수 있다. 스캐폴드상에 접종되는 본 발명의 세포는 성장 인자나 약물을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다.
본 발명의 세포를 사용하여 시험관내에서 새로운 조직을 제조한 다음, 조직 회복, 대체 또는 확대를 원하는 부위에 임플란트(implant), 이식(transplant) 또는 삽입할 수 있다.
비제한적인 예에 있어서, 본 발명의 세포를 사용하여 시험관내에서 3차 구조의 조직 구조체를 제조한 다음, 생체내에 이식한다. 3차 구조의 조직 구조체의 제조 예로 미국 특허 제 4,963,489호를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예로, 본 발명의 세포는 3차 구조의 프래임워크나 스캐폴드에 분주 또는 접종하여 시험관내에서 증식 또는 성장시켜, 생체내 이식할 수 있는 살아있는 조직을 형성할 수 있다.
본 발명의 세포는 서브-컨플루언스 또는 컨플루언스로 배양 용기에서 자유롭게 성장시키고, 배양물에서 떠서 3차 구조의 프래임워크상에 분주할 수 있다. 3차 구조 프래임워크에 세포를 고농도로, 예컨대 mL 당 약 106 내지 5 x 107 세포수로 분주함으로써, 비교적 짧은 기간에 3차 구조 지지체를 만들 수 있을 것이다.
본 발명에서 사용할 수 있는 스캐폴드의 예는, 부직포 매트, 다공성 폼 또는 자가 조립성 펩티드를 포함한다. 부직포 매트는 예컨대 상표명 VICRYL(Ethicon, Inc., Somerville, N. J.)로 판매되고 있는 글리콜산 및 락트산(PGA/PLA)의 흡착성 합성 공중합체로 구성된 섬유를 이용하여 제조할 수 있다. 예컨대 미국 특허 제 6,355,699호에서 논의된 바와 같이, 냉동-건조 또는 동결건조와 같은 공정으로 제조한 폴리(엡실론-카ㅡ롤락톤)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 폼 역시 가능한 스캐폴드이다. 자가-조립성 펩티드(예, RAD16)와 같은 하이드로겔을 또한 사용할 수 있다. 이들 물질은 조직 생장의 지지체로서 흔히 사용된다.
3차 구조의 프래임워크는 모노-, 디-, 트리-, α-트리-, β-트리-, 및 테트라-칼슘 포스페이트, 하이드록시아파티트, 플루오로아파티트, 칼슘 설페이트, 칼슘 플루오라이드, 칼슘 옥사이드, 칼슘 카르보네이트, 마그네슘 칼슘 포스페이트, BIOGLASS(University of Florida, Gainesville, FIa.)와 같은 생물학적으로 활성인 유리, 및 이들의 조합을 비제한적으로 포함하는, 세라믹 물질로 제조할 수 있다. 현재, 상품명 SURGIBON(Unilab Surgibone, Inc., Canada), ENDOBON(Merck Biomaterial France, France), CEROS(Mathys, A. G., Bettlach, Switzerland), 및 INTERPORE(Interpore, Irvine, Calif., United States)으로 시중에서 구입할 수 있는 적정 다공성 생체적합성 세리믹 물질과, HEALOS(Orquest, Inc., Mountain View, Calif.) 및 VITOSS와 같은 미네랄화된 콜리겐 골 이식 제품, RHAKOSS, 및 CORTOSS(Orthovita, Malvern, Pa.)가 다수 있다. 프래임워크는 천연 및/또는 합성 물질의 혼합물, 브랜드 또는 복합물(composite)일 수 있다. 일부 예에서, 스캐폴드는 케이지(cage) 형태이다. 바람직한 예에서, 스캐폴드는 콜라겐으로 코팅된다.
바람직한 예에 있어서, 프래임워크는 펠트(felt)이며, 생체흡수성 물질, 예컨대 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 브랜드, 또는 히알루론산으로 제조된 다중필라멘트 얀으로 구성될 수 있다. 얀은 크림핑(crimping), 커팅(cutting), 카딩(carding) 및 꿰매기(needling)로 이루어진 표준적인 직물 가공 기법을 이용하여 펠트로 제조된다.
본 발명의 다른 바람직한 예에 있어서, 본 발명의 세포는 복합 구조일 수 있는 폼 스캐폴드상에 접종된다. 또한, 3차 구조 프래임워크는 귀, 골, 관절 또는 그외 복구, 대체 또는 확대가 필요한 신체 특정 구조의 외부 구조와 같이 유용한 모양으로 몰딩할 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 세포는 미국 특허 제 6,200,606호에 개시된 바와 같이, 환자 이식용 인공 기구를 포함하는 프래임워크상에 접종되며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 언급되어 있는 바와 같이, 골 및 연골 이식 과정에 이용하기 위한 임상적으로 유용한 다양한 인공 기구가 개발되었다(예, Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. M. B. Habal & A. H. Reddi, W. B. Saunders Co., 1992). 예컨대, 유효한 무릎 및 엉덩이 대체 장치는 계속적으로 임상 환경에 널리 사용되고 있다. 신체에서 안전하게 기능하는 다수의 이들 장치들은 면역원성이 낮은 다양한 무기 물질을 이용하여, 제조된다. 시도되고 입증된 합성 물질의 예로는 티타늄 합금, 칼슘 포스페이트, 세라믹 하이드록시아파티트, 및 다양한 스테인레스 스틸 및 코발트-크롬 합금이 있다. 이러한 물질은 구조 지지체를 제공하며, 숙주의 가시화 및 세포 이동을 발생시킬 수 있는 스캐폴딩을 형성할 수 있다.
프래임워크는 본 발명의 세포 분주전에 세포 부착을 증강시키기 위해 처리될 수 있다. 예로, 본 발명의 세포 분주 전에 나일론 매트릭스를 0.1 몰 아세트산으로 처리하고, 폴리라이신, PBS 및/또는 콜라겐 중에 배양하여 나일론을 코팅할 수 있다. 폴리스티렌은 황산을 이용하여 이와 유사하게 처리할 수 있다.
또한, 3차 구조 프래임워크의 외표면을, 프래임워크의 플라즈마 코팅 또는 하나 이상의 단백질(예, 콜라겐, 탄력 섬유, 아교 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(예, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 더마탄 설페이트, 케라틴 설페이트), 세포 매트릭스 및/또는 비제한적으로 젤라틴, 알기네이트, 아가, 아가로스 및 식물성 검과 같은 다른 물질의 첨가에 의해, 세포의 부착 또는 성장 및 조직 분화를 개선시키기 위해 변형할 수 있다.
일부 예에서, 스캐폴드는 이에 비-혈전 형성력을 부여하는 물질로 구성되거나, 또는 처리된다. 또한, 이러한 처리제 및 물질은 내피 세포 성장, 이동 및 세포외 기질 침착을 촉진 및 유지할 수 있다. 이러한 물질 및 처리제의 예로는, 기저 막 단백질, 예컨대 라미닌 및 IV형 콜라겐과 같은 천연 물질, ePTFE와 같은 합성 물질, 및 PURSPAN(The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.)과 같은 분할된 폴리유레탄유레아 실리콘(segmented polyurethaneurea silicone)이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이들 물질은 스캐폴드를 비-혈전형성형으성을 부여하기 위해 추가적으로 처리될 수 있다. 이러한 처리제는 헤파린과 같은 항-혈전제와, 플라즈마 코팅과 같은 물질의 표면 전하를 바꾸는 처리제를 포함한다.
일부 예에서, 스캐폴드의 표면은 짜서 만든다(textured). 예컨대, 본 발명의 일부 측면에서, 스캐폴드는 그로브(groove) 및 리지(ridge) 패턴으로 제공된다. 그로브는 바람직하기로는 약 500 ㎛ 미만이고, 더 바람직하기로는 약 100 ㎛ 미만이고, 가장 바람직하기로는 약 10 nm 내지 10 ㎛이다. 이러한 "마이크로그로브"는 세포가 표면 그로브에 의해 정렬 및/또는 이동되게 한다.
일부 예에서, 본 발명의 세포를 생체내 이식 또는 시험관내에서 사용하기 전까지 성장하는 정도는 바뀔 수 있어, 생체내에서 나타나는 세포의 미세환경을 배양시에 재창출하는 것이 중요하다. 또한, 성장 인자, 연골 분화 유도제, 골 유도제 및 혈관신생 인자를, 세포의 분주 전에, 도중에 또는 이후에 배양 배지에 첨가하여, 세포 또는 그 후대에 의한 분화 및 조직 형성을 촉발시킬 수 있다.
3차 구조의 프래임워크를 변형하여, 세포의 성장 및 그로부터 조직 형성을 증강시키거나, 또는 임플란트의 거부 위험성을 낮출 수 있다. 따라서, 비제한적으로, 항-염증제, 면역억제제, 또는 성장 인자를 포함하는 하나 이상의 생물학적으로 활성인 화합물을 프래임워크에 첨가할 수 있다.
본 발명은 다분화성 성체 세포를 동정 및/또는 분리함에 있어 마커로서의 조직 비특이적인 알카리 포스파타제(TNAP)의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 농화된 세포 집단 및 이들 세포의 치료학적 용도를 제공한다.
도 1. STRO-3-선별한 BAF-3 세포의 유세포 분석
STRO-3 표면 Ag를 발현하는 BAF-3의 점진적인 농화. 자기 비드/mAb 포획 및 농화 과정에 의해 선택적으로 분리한 BAF-3 세포는 STRO-3 mAb로 면역표지하였고, 1회 선별(A), 2(B) 및 3(C)회 선별한 후 유세포 측정기로 분석하였다. 자기 비드 선별 및 농화는 Ag 발현 동질성이 확보될때가지 수행하였다.
도 2. STRO-3 표면 Ag를 발현하는 BAF-3 세포로부터 분리한 게놈 DNA로부터 프로바이러스 cDNA의 PCR 회수
넓은 범위의 PCR을 실시하여 STRO-3 표면 Ag를 발현하는 BAF-3 세포에서 분리한 cDNA 삽입체를 회수하였다. 사용한 PCR 프라이머는 레트로바이러스 벡터에서 다중 클로닝 부위에 인접한 서열에 상보적이다. 방법에 기재된 바와 같이 증폭을 수행하고, PCR 산물은 1.0% 아가로스젤에서 전개시키고 EtBr 염색으로 가시화하였다.
도 3. STRO-3 항원 유래의 PCR 산물의 FASTA 정렬 분석
부분적인 서열분석을 수행한 다음, 수득되는 뉴클레오티드 서열을 표준적인 "FASTA 정렬 분석"을 통해 Genbank/EMBL 조합 데이타베이스에 입력된 서열과 비교하고, ALP 상보적인 DNA 서열의 BLK 이소형(Genbank accession # H37944)과 100% 상동함으로 확인하였다.
도 4. BAF-3 형질감염체에서 ALP의 BLK 이소형을 STRO-3 mAb가 인지한다.
BLK-ALP cDNA(5' 및 3' 비코딩 부위와 전체 코딩 서열을 가지고 있음)의 1.7 kb BamHI-XhoI 제한효소 단편을 pRUF.neo 벡터에 서브클로닝하고, 레트로바이러스 형질전이에 의해 BAF-3 세포에 도입하였다(재료 및 방법 참조). 제조된 G418-내성 세포 집단을 간접 면역형광으로 염색하고 유세포 측정기로 분석하였다. 데이타는 리스트 모드 데이타 IgG1 대조군(얇은 검정 선)으로서 수집한 단일-파라미터 형광(FITC) 히스토그램, 1 x 104 광산란 현상(light-scatter gated event)으로서 나타낸다; (A) mAb STRO-3; (B) mAb B4-78; (C) mAb B4-50 및 (d) mAb 8B6.
도 5. STRO-3 mAb는 ALP의 효소학적 활성형을 식별한다.
비-형질감염(A) 및 STRO-3 양성(B) BAF-3 세포의 사이토스핀(cytospin) 조제물을 유리 슬라이드상에 두고 70% 에탄올로 고정하였다. 이후, 슬라이드는 시그마 알카리 포스파타제 기질 키트(AM0100)을 이용하여 제조사의 권고안에 따라 알카리 포스파타제 기질과 함께 인큐베이션하였다. 그 결과, STRO-3을 발현하는 BAF-3 세포(B)는 알카리 포스파타제 효소의 활성형을 함유하고 있는 것으로 나타났다(보라/빨강). 세포는 헤마톡실린(블루)로 대조 염색하였다.
도 6. ALP 특이적인 PCR
방법에 기재된 바와 같이 RT-PCR을 사용하여 STRO-3 세포 표면 Ag를 발현하는 BAF-3 세포로부터 분리한 총 RNA를 이용하여 cDNA에 의해 코딩되는 알카리 포스파타제 이소형을 동정하였다. 사용한 PCR 프라이머는 Sato 등(1994) (Sato et al., 1994)이 개시한 바와 같이 (L) 간(216 bp) 또는 (B) 골(215 bp)의 알카리 포스파타제 이소형 중 어느 하나에 특이적인 서열을 식별하였다. PCR 증폭을 수행한 후, 산물은 1.5% 아가로스 젤상에 전개시키고 EtBr로 염색하였다. 그 결과, STRO-3 항원을 발현하는 BAF-3 세포는 골 특이적인(B) 알카리 포스파타제 이소형에 해당되는 전사체만을 발현하는 것으로 나타났다.
도 7. 인간 골 조직에서의 STRO-3 항원 발현
또한, 방법에 기재된 바와 같이 면역조직화학을 이용하여 발생중인 골수의 섹션에서 STRO-3 mAb의 면역반응성을 조사하였다. 파라핀 포매한 55일된 인간 사지의 5 ㎛ 섹션을 방법에 개시된 바와 같이 STRO-3 mAb로 염색하였다. STRO-3 항원(TNAP)의 발현은 골수 스페이스(BM)의 간엽 세포, 혈관주위(PV) 및 성장판 부위의 경계에서 명확하였지만, 골막(P) 또는 연골(C)에서는 염색이 관찰되지 않았다.
도 8. 클론형성 세포는 인간 BM의 STRO-3 mAb 양성 분획에만 제한적이다.
미분획화한 BM(Pre)의 단일 세포 현탁액과 MACD 선별한 TNAP 양성(TNAP +) 및 TNAP 음성(TNAP-) 인간 BM을 정해진 성장 배지(Gronthos et al., 2003)에 접종하여, 각 세포 분획에서 유착성 콜로니 형성 세포 발생을 조사하였다. 배양한지 12일 경과 후, 방법에 언급된 바와 같이 콜로니(50개 이상의 세포의 응집체)를 염색하고 계수하였다. 막대 그래프는 2번의 개별 실험을 평균한 접종한 105 세포 당 각 세포 분획의 클론형성 콜로니 수를 나타낸다. 데이타는 CFU-F가 BM의 TNAP 양성 분획으로만 제한됨을 보였다.
도 9. 성인 BMMNC에 의한 TNAP 및 간엽 전구세포 마커, STRO-1의 공동-발현
STRO-1 MACS-선별된 BMMNC와 간접 표지된 FITC가 커플링된 염소 항-설치류 IgM 항체(X 축) 및 PE가 커플링된 염소 항-설치류 IgG로 간접 표지된 STRO-3 mAb(설치류 IgG1)(Y 축)을 인큐베이션하여, 2색 면역형광 및 유세포 측정을 수행하였다. 돗 플롯 히스토그램은 리스트모드 데이타로 수득한 5 x 104 건을 나타낸다. 수직선 및 수평선은, 동일한 조건하에서 처리한 이소타입이 부합되는 대조군 항체들, 1B5 (IgG) 및 1A6.12 (IgM)을 이용하여 수득한 <1.0% 평균 형광의 반응성 수준으로 설정되었다. 그 결과는, STRO-1 bright 세포의 소수 집단은 TNAP를 공동-발현하지만(사분면 상위 우측), 나머지 STRO-1+ 세포는 STRO-3 mAb와 반응하지 못함을 나타낸다. 사분면 전체에서 FACS에 의해 분리한 세포는 CFU-F 발생에 대해 분석하였다(표 2).
도 10. STRO-3 mAb 농화 세포에 의한 CD45, CD34, 3G%, CC9 및 STRO-1과 TNAP의 공동 발현
도 11. STRO-3 mAb로 선별한 세포는 여러번의 계대 이후에 STRO-1 발현을 높은 수준으로 유지한다.
도 12. 결합하는 항체를 이용하여 선별한 골수 유래 세포에서의 STRO-1 발현.
도 13. STRO-3 mAb 선별한, 배양 증폭시킨 다분화성 세포의 초기(P2) 및 후기(P5) 계대의 표현형 특징
STRO-3로 선별한 다분화성 성체 세포(P1)는 높은 수준의 CC9, STRO-1 및 STRO-3 항원 발현을 특징으로하는 표면 표현형을 가진 집단이다. 5계대 배양 후, 세포 집단(P5)은 STRO-1 발현의 현저한 정체를 보인다.
도 14. STRO mAb로 선별한 세포의 지방세포로의 분화
STRO-3 mAb로 선별한 세포 2 로트(lot) 2242A 및 2070C를 분화 능력에 대해 조사하였다. 그래프는 지방세포 유도 배지로 유도한 세포의 상대적 형광 단위 평균(Avg RFU) 대 유도하지 않은 대조군 세포를 나타낸다.
도 15. STRO-3 mAb로 선별한 세포의 골세포로의 분화
칼슘 농도를 알고 있는 샘플을 OD 550nm에서 측정하여 표준 곡선을 구하였다. STRO-3 mAb로 선별한 세포의 2 로트, 2242A 및 2070C를 골형성 유도 배지로 유도하였다. 유도 및 비유도 세포의 세포 추출물을 준비하여 OD 550nm에서 측정하였다.
도 16. STRO-3 mAb로 선별한 세포의 기능적 조골세포로의 분화
A - STRO-3 mAb로 선별한 다분화성 성체 세포를 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 포스페이트가 보강된 α-MEM 배지에서 3주간 배양하고, Alizarin Red로 미네랄 침착을 염색하였다. B - STRO-3 mAb로 선별한 다분화성 성체 세포를 0.5 mM 메틸이소부틸메틸크산틴, 0.5 μM 하이드로코르티손, 및 60 μM 인도메타신의 존재시에 배양한 후, 세포를 오일 레드 O로 염색하였다. C - 프로테오글리칸 합성을 확인하기 위해 세포 배양물에 10 ng/ml TGF-β3을 처리하고 Alcian Blue로 염색하였다. D - 이식한 후 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 다분화성 성체 세포의 조직 조사.
도 17. STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 세포 투여 후 척추 유합율.
도 18. STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 세포를 처리한 양에서의 양호한 척추 유합.
도 19. 양의 척추경 스크류 고정 모델에서 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포.
도 20. 임계 크기의 양의 경골 결함부(segmental tibial defect)에서, STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 동계 세포에 의한 투여량-의존적인 골 성장.
도 21. 임계 크기의 경골 결함이 있는, STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 세포를 처리한 그룹에서의 우수한 유합율(rate of union).
도 22. STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 세포는 랫의 심근 경색 발생이후의 2주째에 심장 기능을 현저하게 개선시킨다.
도 23. 양쪽 사선 관상 동맥의 급성 결찰을 수행한 후 즉시 양의 심장에 직접 주사한 동계 양의 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 세포(5계대)의 효과
A - 방출비율%, B - 이완 체적 변화%, 및 C - 수축 체적 변화%.
도 24. 피브리 접착제 중에 전달시 염수 용액에 비해 증가된 세포 생존율.
본 발명은 하기 비제한적인 예를 들어 보다 상세하게 설명된다.
실시예 1: mAb STRO -3 생산
재료 및 방법
인간 MPC 배양물
기존에 개시된 바를 기초로 기질 배양물을 확립하였다(Gronthos et al., 2003). 이러한 연구들에서의 정상 골수(BM) 세포의 사용은 Royal Adelaide Hospital, Australia의 인간 윤리 위원회로부터 승인받았다. "HHF(H20mM HEPES 및 5% FCS으로 보충된 anks buffered Salt Solution (HBSS))" 에서 3번 세정한 후, 1-5 x 107의 골수 단핵구 세포(BMMNC)를 엽산(0.01 mg/ml), myo-이노시톨(0.4 mg/ml)(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 50 mM/L 2-머캅토에탄올, 1 mM/L 하이드로코르티손 소듐 숙시네이트(Sigma), 12.5% FCS 및 12.5% 말 혈청(CSL, Melbourne, Australia)이 보충된 이글스 배지(α-MEM: Flow Laboratories, Irvine, Scotland)의 알파-변형 배지 10 ml에 재현탁하고, 25 cm2의 플라스크(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)에서 배양하였다. 컨플루언트(confluent) 기질 층이 형성되면, PBS(Gibco) 중의 0.05% (w/v) 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 탈착한 다음, 2 x 75 cm2의 조직 배양 플라스크(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)에 약 1-2 x 104 세포/cm2로 동일 배지중에 접종하였다.
결과 및 고찰
배양한 인간 BM 기질 세포와로 면역화한 마우스 유래의 비장 세포를 융합하여, 인간 MPC에 반응하는 마우스 단일클론 항체 패널을 제조하였다. 정상적인 인간 골 세포(NHBC) 및 MPC와는 반응하지만 대부분의 BMMNC와는 제한된 반응성을 보이는 mAb를 동정하기 위해 예비 스크린을 설계하였다. 여러가지 세포주와의 독특한 반응성 패턴으로 인한 추가적인 분석을 위해, 먼저 mAb, STRO-3을 선별하였다. 96웰 플레이트에서 한계 희석법으로 STRO-3 하이브리도마 제3 클론을 분리하였고, 상기와 같이 스크리닝하였다. 다양한 기질 세포 타입의 STRO-3 분포 패턴을 표 1에 종합하였다. mAb STRO-3은 높은 비율로 NHBC 및 MPC에 대해 반응성을 보였지만, BMMNC는 낮은 비율로만 반응성을 보였다. 제3의 하이브리도마 상층액의 STRO-3 면역글로불린 이소타입dmf 이소타입 검출 키트(Roche)를 이용하여 IgG1인 것으로 결정하였다.
상기 방법에 개시된 정위치 면역형광을 이용한 여러가지 세포 타입에 대한 3차 클로닝한 하이브리도마 유래의 STRO-3 상층액의 면역반응성.
세포 타입 정위치 면역형광 염색
말초 혈액 단핵구 세포 NS
골수 단핵구 세포 +/- (호중구)
생체외(Ex vivo) 증폭시킨 MPC +/-
배양한 정상적인 인간 골 세포 ++/-
인간 포피 섬유아세포 +/-
인간 제대 동맥의 내피세포 NS
설치류의 골수 기질 세포주 BMS2 NS
인간 골육종 세포주 SAOS-2 ++
인간 골육종 세포주 MG63 NS
인간 골육종 세포주 HOS ++
(+) 모든 세포에서 형광 염색이 약함
(++) 모든 세포에서 형광 염색이 강함
(NS) 세포에 형광 염색 안됨
(+/-), (++/-) 세포의 아형(subpopulation)이 형광 염색됨
실시예 2: STRO -3 항원의 분자 특징
재료 및 방법
STRO -3 항원을 코딩하는 cDNA 의 발현 클로닝
mAb STRO-3으로 동정된 세포 표면 항원을 코딩하는 cDNA를 이전 방법(Zannettino et al., 1996)에 따라 인간 골수 기질 세포 cDNA 라이브러리로부터 레트로바이러스 벡터, pRUFneo로 분리하였다. 간략하게는, HBMSC 배양물의 mRNA로부터 합성한 cDNA를 레트로바이러스 벡터 pRUFneo에 클로닝하였다. 라이브러리로부터 수득한 플라스미드 DNA를 사용하여 바이러스 패키징 세포주(PA317)에 형질감염하였다. 이들 세포 유래의 바이러스 함유 상층액을 사용하여 패키징 세포주 ψ2를 감염시키고, 이후 설치류 인자-의존적인 세포주 BAF-3를 감염시켰다. 감염된 세포는 G418 내성으로 선별하였고, STRO-3 항체로 표지한 다음 면역자기 비드 선별에 의해 세포에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하였다(Dynabead, Dynal, Oslo, Sweden). 선별한 최초 세포를 배양물로 증폭시킨 다음, 면역자기 비드 선별을 2번 더 수행하였다. STRO-3 항체에 특이적인 결합성(약 60%)을 보인 BAF-3 세포를 FACS(fluoresence-activated cell sorting)로 정제하고, 기존 방법과 같이 반고형 배지에서 배양하여 클론을 분리하였다(Zannettino et al., 1996). STRO-3 항원에 해당하는 프로바이러스 cDNA 삽입체를 회수하기 위해, 레트로바이러스 특이적인 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 3종의 STRO-3 발현성 BAF 클론으로부터 준비한 게놈 DNA를 대상으로 기존 방법과 같이 수행하였다(Zannettino et al., 1996).
PCR -회수한 cDNA 클론의 부분 서열분석 및 컴퓨터 분석:
기존에 개시된 바와 같이(Zannettino et al., 1996), PCR로 제조한 cDNA 클론을 정제하여 제조사의 권고안에 따라 pGEM-T 벡터(Promega, Madison, WI)에 서브클로닝하였다. 표준 알카리 세포용혈법인 "미니-프랩" 방법(Qiagen miniprep Kit)으로 이중가닥 DNA를 제조하였고, 서열분석 반응 당 1-2 ㎍을 사용하였다. 반응은 제조사의 권고안에 따라 PRISM™ 레디 반응 사이클 서열분석 키트(Applied Biosystem, Foster City, CA)를 이용하여 준비하였다. 2개의 cDNA 가닥 분석 반응은 Applied Biosystems 373 자동 서열 분석기로 수행하였고, 각 클론마다 5' 및 3'의 500-600 bp의 서열 데이타가 통상적으로 수득되었다. 서열 데이타는 이후 NCBI(National Centre for Biotechnological Information)의 Genbank 및 European Molecular Biology laboratory (EMBL) 데이타베이스에 입력하여 분석하였다.
STRO -3 항원 cDNA 클론의 pRUFneo 로의 재클로닝 및 표면 항원 발현 확인
게놈 DNA로부터 프로바이러스 cDNA 삽입체를 PCR로 회수한 다음, 5' 및 3' 양 끝에 각각 존재하는 고유한 BamHI 및 XhoI 제한효소 부위를 이용하여, cDNA를 레트로바이러스 벡터 pRUFneo에 "재클로닝"하였다. E. coli DH10B 세포를 형질전환시키고, 제조사의 권고안에 따라 Qiagen-tip 100 컬럼(Qiagen, Victoria, Australia)을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해 안정적인 G418 내성의 ψ2 바이러스-생산 세포주를 제조하였으며, 이를 사용하여 기존 방법에 따라 공동-배양에 의해 BAF-3 세포를 감염시켰다(Zannettino et al., 1996). 이후 G418 내성 FDC-P1 세포를 간접 면역형광ㅂ법 및 유세포 측정기에 의해 항원 발현을 분석하였다.
RT - PCR ( Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction ) 분석
제조사의 권고에 따라, RNAzolB 추출 방법(Biotecx Lab. Inc., Houston, TX)을 이용하여 STRO-3 항원 세포, BAF-3 세포로부터 전체 세포 RNA를 준비하였다. 각 서브집단으로부터 분리한 RNA를 cDNA 합성에 주형으로 사용하였고, 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)로 제조하였다. ALP 전사체의 골 및 간/신장 이소형 발현은 기존의 표준 방법을 이용한 PCR 증폭으로 분석하였다(Gronthos et al., 1999). 본 실험에 사용한 알카리 포스파타제 프라이머 세트는 기존에 개시된 것이다(Sato et al., 1994). 증폭시킨 후, 각 반응 혼합물을 1.5% 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하고, EtBr 염색으로 가시화하였다. RNA 완전성(integrity)은 GAPDH 발현(Gronthos et al., 1999)으로 평가하였다.
결과 및 고찰
본 실험실에서 개척한 레트로바이러스 발현 라이브러리 전략을 이용하여, STRO-3 mAb에 의해 동정된 단백질 코딩 서열을 확인하였다(Zannettino et al., 1996). 간략하게는, 설치류 세포주 BAF-3에서 배양한 인간 MPC 유래의 cDNA 라이브러리로부터 구축한 레트로바이러스 입자를 감염시켰다. STRO-3에 반응성인 BAF-3 클론은 양 항-마우스 IgG 자기 비드를 이용한 면역자기 비드 선별에 의해 분리하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 비드 선별의 7회 라운드 이후에 회수된 세포의 유세포 분석으로 인지가능한 수준으로 STRO-3 항원을 발현함을 확인하였다. STRO-3-발현성 BAF-3 세포의 클론은 이후 전술한 방법과 같이 반고형 메틸셀룰로스에 저밀도로 면역자기 비드-선별한 세포 풀을 접종하여 준비하였다. 이후, 무작위로 BAF-3 클론을 선별 및 분리하고, 설치류의 IL-3 및 G418이 보충된 액체 배양에서 증폭시켰다, STRO-3에 높은 반응성을 보이는 선별한 클론을 배양으로 증폭시키고, 전술한 방법과 같이 게놈 DNA를 제조하였다. 이후, cDNA 삽입체를 기존 방법(Zannettino et al., 1996)과 원거리 PCR 증폭에 의해 프로바이러스로부터 회수하였다.
STRO-3에 대한 대표적인 클론의 PCR 증폭은 도 2에 나타낸다. 아가로스젤 전기영동 및 EtBr 염색한 후, 3종의 상이한 클론의 해당 PCR 산물을 제조사의 권고안에 따라 QIAquick 젤 추출 키트(QIAGEN Inc. Chatsworth, CA, USA)를 이용하여 젤에서 정제하고, pGEM-T 벡터에 클로닝하였다. PCR 산물의 뉴클레오티드 서열은 PRISMTM Ready Reaction DyeDeoxyTM Terminator Cycle 서열분석 키트(Applied Biosystems Inc., Foster City, California, USA)로 제조사의 설명서에 따라 서열분석하여 유추하였다. 반응은 Applied Biosystems 373 자동 서열 분석기로 수행하였고, 각 클론마다 수백 bp의 핵산 서열 데이타를 수득하였다. 수득되는 부분-뉴클레오티드 서열을 표준적인 FASTA 정렬 분석을 통해 Genbank/EMBL 데이타베이스에 입력된 것과 비교하였다. 2개의 항원에 대한 부분적인 DNA 서열을 확인하였다(도 3). EMBL/Genbank 데이타베이스 조합으로 서열을 분석한 결과, STRO-3 항원이 골/간/ 신장형 알카리 포스파타제, 즉 TNAP에 상응하는 것으로 확인되었다.
각각의 골, 간 및 신장 ALP 이소형 간에 보존적인 에피토프를 인지하는 알카리 포스파타제 특이 항체, B4-78, 50(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)을 이용하여 TNAP 발현성 BAF-3 클론의 면역형광 및 유세포 분석을 수행한 다음, STRO-3 mAb의 특이성을 독립적으로 확인하였다(도 4).
또한, 골 AP 효소에 특이적인 것으로 기존에 확인된 mAb B4-50(Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)은 TNAP 형질감염체와 면역반응성을 보였다. 대조적으로, TNAP 형질감염체를 인간 태반 AP 항체에만 존재하는 에피토프를 동정하는 mAb 8B6(DAKO)으로 염색하였을 때에는, 반응성이 관찰되지 않았다. 게다가, TNAP-BAF-3 cDNA 삽입체로 재-형질감염시킨 BAF-3 세포에서는, 알카리 포스파타제 기질의 존재시 양성 반응성으로 나타난 바와 같이, 알카리 포스파타제의 활성형을 발현하는 것으로 확인되었다(도 5). 골 및 간의 알카리 포스파타제 형태에 대한 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석(Sato et al., 1994)으로, 전사체가 골-특이적인 것으로 확인되었다(도 6).
실시예 3: BM 트레파인 ( Trephine ) 섹션내 STRO -3 mAb 에 의한 면역조직화학적 TNAP 검출
재료 및 방법
파라핀 포매한 정상적인 출생 이후의 골 섹션 5 ㎛을 3-아미노프로필-트리에톡시실란이 코팅된 슬라이드 위에서 자르고, 3% H2O2/메탄올로 인큐베이션하여 내인성 페록시다제 활성을 차단시켰다. 1 mM EDTA, pH 8.0 완충액의 존재하에 마이크로파 항원 복원을 수행하였다. 슬라이드를 40 ℃로 냉각시키고, 실온에서 한시간동안 3% 정상적인 말 혈청과 함께 섹션을 인큐베이션하여 비특이적인 결합을 차단하였다. 이후, 슬라이드는 이소타입이 일치되는 비-결합성 대조군 mAb (1B5, IgG1) 또는 STRO-3 mAb 중 어느 하나와 함께 철야 인큐베이션하였다. 결합된 항체는 슬라이드를 (a) 친화성-정제한 HRP-접합된 염소 항-마우스 항체(Dako, Botany, NSW, Australia), (b) 친화성-정제한 호르세라디시 페록시다제(HRP)-접합된 돼지 항-염소 면역글로불린(Tago, Burlingame, CA, USA), 및 (c) 기질로서 하이드로겐 페록사이드 및 염료로서 아미노 에틸카르바졸(AEC, Sigma, St Louis, MO)와 순차적으로 인큐베이션하는 3단계 면역페록시다제 방법(Gronthos et al., 2000; Gronthos et al., 2003)으로 확인하였다. 슬라이드를 헤마톡실린 용액으로 간단하게 대조염색하여, Gurr Aquamount(BDH, Poole, UK)에 두었다.
결과 및 고찰
55일된 인간 사지 유래의 발생성 골수 섹션에서 STRO-3 mAb의 면역반응성을 평가하였다. 골막 또는 연골에서 염색은 관찰되지 않았다(도 7). 그러나, 골수강의 간엽 세포, 혈관주위 영역 및 성장판 부위의 인터페이스에서 TNAP 발현이이 현저하였다.
실시예 4: STRO -3 mAb 를 이용한 인간 골수 세포의 분리
Royal Adelaide Hospital의 윤리 위원회로부터 승인받은 절차에 따라, 골수를 건강한 정상 성인 지원자(20-35세)으로부터 수득하였다. 간략하게는, BM 40 ml을 후장골능(posterior iliac crest)으로 리튬-헤파린 항응혈-함유성 튜브로 뽑아내었다. BMMNC는 기존의 방법(Zannettino et al., 1998)에 따라 Lymphoprep™(Nycomed Pharma, Oslo, Norway)를 이용하여 밀도 구배 분리로 준비하였다. 30분간 400 xg로 4 ℃에서 원심분리한 다음, 연층(buffy layer)을 트랜스퍼 파이펫으로 제거하고, 5% 소태아 혈청(FCS, CSL Limited, Victoria, Australia)이 포함된 HBSS(Hank's balanced salt solution; Life Technologies, Gaithersburg, MD)로 구성된 "HHF"로 3번 세정하였다.
다음으로, 기존의 방법에 따라 자기 활성화된 세포 분리법으로 TNAP+를 분리하였다(Gronthos et al., 2003; Gronthos et al., 1995). 간단하게는, 약 1-3 x 108 BMMNC를 HHF 중에 10%(v/v) 정상적인 토끼 혈청으로 구성된 차단 완충액 중에 20분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포는 얼음 위에서 한시간동안 차단 완충액 중에 10 ㎍/ml STRO-3 mAb 용액 200 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 세포는 400 x g에서 원심분리에 의해 HHF 중에 2회 세정하였다. 염소 항-마우스 γ-바이오틴(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)의 HHF 완충액 중의 1/50 희석물을 첨가하여, 세포를 얼음 위에서 한시간 인큐베이션하였다. 전술한 바와 같이 세포를 MACS 완충액(Ca2 + - 및 Mn2 + - 결핍성 PBS, 1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 소듐 아자이드 보충됨)으로 2번 세정하고, MACS 완충액에 최종 부피 0.9 ml로 재현탁하였다.
스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany) 100 ㎕을 세포 현탁물에 첨가하여 15분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 세포 현탁물을 2번 세정하고, MACS 완충액 0.5 ml에 재현탁한 다음, 미니 MACS 컬럼(MS Columns, Miltenyi Biotec)에 주입하고 MACS 완충액 0.5 ml로 3번 세정하여 STRO-3 mAb에 결합하지 않는 세포를 회수하였다. 1 ml의 MACS 완충액을 첨가한 후, 컬럼을 자석으로부터 제거하고 TNAP-양성 세포를 양압(positive pressure)으로 분리하였다. 각 분획의 세포 분획물은 스트렙타비딘-FITC로 염색할 수 있으며, 유세포 측정기로 순도를 평가하였다. STRO-3 mAb가 BMMNC의 소수의 서브집단(<1%)을 동정하는 것으로 확인되었다.
기존에 개시된 바와 같이(Gronthos et al., 1995), 20% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민 및 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트가 보충된 α-MEM에 도말함으로써 MACS 분리된 TNAP+ 세포로부터 일차 배양물을 확립하였다.
실시예 5: STRO -3 mAb 에 의해 선별된 인간 골수 세포는 CFU -F가 된다.
재료 및 방법
자기 활성화된 세포 분리( MACS )
TNAP+ 세포의 CFU-F 성장 가능성을 평가하기 위해, MACS 분류를 수행하여 골수에서 TNAP+ 및 TNAP- 세포를 분리하였다. 일반적으로 기존 방법(Gronthos and Simmons, 1995; Gronthos et al., 2003)에 따라 수행하였지만 STRO-3 mAb를 이용하였다. 간략하게, 정상적인 인간 골수 단핵세포 약 1-3 x 108을 STRO-3 상층액, 항-IgG-바이오틴, 스트렙타비딘 마이크로비드 및 마지막으로 스트렙타비딘 FITC(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)와 인큐베이션한 다음, 제조사의 설명서에 따라 미니 MACS 자기 컬럼(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)상에서 분리하였다.
FACS( Fluorescence - Activated Cell Sorting )
CFU-F 성장 능력 역시 STRO-1의 양성 및 음성 발현을 기준으로 분류한 STRO-3 선택 세포를 대상으로 조사하였다.
기존에 개시된 바에 따라(Gronthos and Simmons, 1995; Gronthos et al., 2003), 수행하였다. 간력하게는, 정상적인 인간 골수 단핵구 세포 약 1-3 x 108을 STRO-1 상층액, 항-IgM-바이오틴, 스트렙타비딘 마이크로비드 및 마지막으로 스트렙타비딘 FITC(Caltag Laboratories, Burlingame, CA)와 인큐베이션한 다음, 제조사의 설명서에 따라, 미니 MACS 자기 컬럼(Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)으로 분리하였다.
STRO-1+ MACS 분리한 세포를 FITC 접합된 스트렙타비딘으로 표지하고, 정제된 STRO-3 mAb이나 이소타입의 대조군 1B5(10 ㎍/ml) 중 어느 하나와 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하고, 세정한 다음, PE(phycoerythrin)가 접합된 염소 항-마우스 IgG 항체(1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL)와 얼음 위에서 20분간 더 인큐베이션하였다. 세포는 FACStarPLUS 유세포 측정기(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)를 이용하여 분류하였다. STRO-1bri/STRO-3+ 또는 STRO-1bri/STRO-3- 세포를 20% 소 태아 혈청, L-글루타민 2 mM, 아스코르베이트-2-포스페이트(100 μM)가 보충된 Eagle's 배지의 알파-변형 배지 중에 배양하여, 5% CO2, 37 ℃의 습윤한 대기하에서 일차 배양을 개시하였다.
결과 및 고찰
CFU-F 성장용 세포를 분리하기 위한 단일 시약으로서 STRO-3 mAb 이용 가능성을 조사하기 위한 실험을 설계하였다(도 8). TNAP 발현을 토대로한 MACS 분리로, 클론형성성 CFU-F가 오직 TNAP+ BMMNC 분획에서만 검출되는 것으로 확인되었다.
STRO-3(IgG1)의 에피토프가 STRO-1(IgM)의 에피토프와 다르다는 것을 감안하여, STRO-3의 클론형성성 CFU-F를 동정하는 능력을 MACS 방법을 이용하여 분리한 STRO-1+ 세포와의 공동-발현을 토대로한 2색 FACS 분석에 의해 평가하였다(도 9). STRO-3 mAb는 독특한 결합 패턴, 높은 수준으로 STRO-1 항원을 발현하는 STRO-1+ BMMNC 분획(STRO-1bright 분획)의 서브세트와 반응하고, 효율적으로 분리되며 MPC 집단을 농화하는 패턴을 보였다(표 2). 더욱이, mAb STRO-3은 인간 성인의 골수 천자액의 CD34 양성인 조혈 줄기세포와 반응하지 못하였다(데이타 미기재).
세포 표면 마커 STRO-1 및 TNAP의 공동-발현을 토대로한 2색 FACS 분석에 의한 인간 골수 세포의 농화(도 9 참조). FACS로 분류한 세포는 20% FCS가 보충된 알파-MEM에서 표준적인 클론 형성 조건하에서 배양하였다. 데이타는 접종 세포 105 당 14일째 콜로니 형성 세포(CFU-F)의 평균 갯수 + SE(n=3 상이한 골수 흡입물)로 나타낸다. 이들 데이타는, 인간 MPC가 오직 STRO-1 항원을 강하게(brightly) 공동-발현하는 BM의 TNAP 양성 분획으로만 한정됨을 시사하다.
골수 분획 CFU -F/10 5 세포 빈도 농화 (배수 증가)
분획화하지 않은 BMMNC 11.0 + 2.2 1.0
TNAP+/STRO-1bright 4,511 + 185 410
TNAP+/STRO-1dull / int 0.0 0.0
실시예 6: 배양 증폭( culture expansion ) 이전 및 이후의 STRO -3 mAb 선별 세포의 표현형
재료 및 방법
근본적으로 Gronthos et al. (1999)에 기재된 바와 같이, 단색 유세포 측정을 수행하였다. 간략하게, 각 계대의 세포 배양물을 트립신/EDTA로 처리하고 차단 완충액 중에서 30분간 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 약 1 x 105의 세포를 상기와 같이 세정하여 일차 항체 또는 항체들 200 ㎕에 한시간동안 얼음 위에서 재현탁하였다. 마우스 IgM 단일클론 항체 STRO-1 및/또는 인간 CC9 및 STRO-3에 대한 마우스 IgG 단일클론 항체를 포화 농도로 포함하는 일차 항체를 사용하였다. 사용한 다른 항체는 CD45, CD34 및 3G5에 결합하는 mAb를 포함한다.
마우스 이소타입의 IgM 및 IgG 음성 대조군 mAbs를 동일한 조건하에 처리하였다. 세포를 세정한 다음, 염소 항-마우스 IgM μ-체인 특이적인-FITC (1/50 희석)과, 염소 항-마우스 IgG γ-특이적인-PE (1/50 희석) 또는 항-토끼 Ig-특이적인-PE(1/50 희석)(Southern Biotechnology Associates) 중 어느 하나로 이루어진 최종 부피 100 ㎕에 이차 표지물(들)을 첨가하였다. 세포를 얼음 위에서 45분간 인큐베이션하고, 2번 세정한 다음, FACs FIX(PBS, 1%(v/v), 2%(w/v) D-글루코스, 0.01% 소듐 아자이드 첨가됨) 중에 고정하였다. 이후, Epics®-XL-MCL 유세포 측정기(Beckman Coulter, Hialeah, FL)에서 세포를 분석하였다. 돗 플롯 히스토그램은 리스트모드(listmode) 데이타로서 수집된 5 x 104 건을 나타낸다.
결과 및 고찰
도 10에서 알 수 있는 바와 같이, 자기 표지gks STRO-3 mAb를 이용한 인간 골수 단핵구 세포의 면역선별로, 강한 TNAP 및 CD45 표면 항원 발현을 특징으로 하는 세포 집단을 분리하였고, TNAP+ 세포의 약 90%는 CD45를 공동-발현하였다(도 10). 반면, STRO3 mAb를 이용하여 분리한 TNAP+ 농화된 세포의 1% 미만이 조혈 줄기세포 마커인 CD34를 발현하였다. 또한, 본 발명의 방법으로 농화시킨 TNAP+ 세포의 5% 이하는 STRO-1, CC9/CD146, 및 3G5를 포함하여 MPC를 분리하기 위해 기존에 사용한 임의 마커를 공동-발현하였다.
배양-증폭 이후에, 본 발명의 방법으로 농화한 TNAP+ 세포는 농화된 새롭게 분리한 세포와는 다른 안정적인 표현형을 보였다(도 11). 초기(2 계대) 및 후기(5 계대)로 배양 증폭시킨 STRO-3 선별 세포는 CC9/CD146 및 HLA 클래스 I 분자를 높은 수준으로 동질적으로 발현하지만, CD45, HLA 클래스 II, CD14, CD19, CD3, CD11a-c, CD31, CD86 및 CD80에 대해서는 한결같이 음성인 것으로 확인되었다. STRO-3 mAb에 의해 검출된 TNAP의 표면 발현은 초기 배양 계대(2 계대)에서 전반적으로 양성이었지만, 후기 배양 계대(5 계대)에서는 음성이었다.
배양 증폭시킨 후 STRO-3 반응성이 점진적으로 소실되는 거와는 반대로, STRO-3 선별에 의해 농화한 TNAP+ 세포에서는 STRO-1 항원의 표면 발현의 점진적인 증가가 나타났다(도 11 및 13). 2 계대까지, 세포의 약 84%는 IgM 이소타입 대조군에 비해 STRO-1 양성이었으며, 약 절반(52%)은 STRO-1을 (STRO-1 음성 세포보다 STRO-1 표면 발현이 2 log 크기로 더욱 높은 것으로 정의된 바와 같이) 강하게 발현하였다. 5계대까지, 대부분의 세포는 STRO-1 양성(약 69%)을 유지하였지만, 낮은 비율의 세포는 STRO-1을 강하게 발현하였다(약 21%).　 이는, STRO-3로 선별한 TNAP+ 세포의 초기 배양시에는 자발적인 분화없이 증폭함으로 반영하는 것으로 추측되는 STRO-1 항원이 상향 조절되지만, 배양을 계속하면 STRO-1 항원 강도가 강한(bright)에서 중간 발현으로 하향 조절됨을 나타낸다.
특히 대조적으로, 인간 골수 단핵수 세포의 자기 표지한 STRO-1 mAb를 이용한 면역선별로, 높은(약 50%) STRO-1 발현 및 CD45 무발현을 특징으로 하는 세포 집단이 분리된다(도 12, 및 WO/2004/085630). 초기 STRO-1 발현 수준은 높지만, STRO-1로 선별한 세포의 배양 증폭시 4 계대에서 6계대까지 STRO-1 발현이 점진적으로 감소된다. 배양-증폭 이후의 STRO-1 수준 감소는, 출발 집단과 동일한 4 내지 6 계대까지 STRO-4 선별에 의해 농축한 배양-증폭한 TNAP+ 세포 모두에 비해 현저하게 감소되었다(도 11).
종합하면, 이러한 결과는, 처음에 새롭게 분리하였을때와 배양-증폭한 이후에 표현형 특징 측면에서, STRO-3 선별에 의한 TNAP+ 농화 집단은 STRO-1+ 농화 집단과 별개임을 나타낸다.
실시예 7: TNAP + 세포의 분화 - 지방세포 형성
재료 및 방법
지방세포형성 분석 절차
지방세포형성 유도 배지의 제조: 세포가 100% 컨플루언트(약 5-13일)로 되었을때 지방세포형성 유도 배지를 사용하여야 한다. 세포가 컨플루언트가 되기 전에 배지를 준비한다:
1. 70% v/v 에탄올 또는 이소프로판올로 지방세포형성 유도 배지(PT-3102B) 및 하기 SingleQuots®의 외표면을 소독한다:
a. h-인슐린(재조합)
b. L-글루타민
c. MCGS
d. 덱사메타손
e. 인도메타신
f. IBMX (3-이소부티-1-메틸-크산틴)
g. Pen/Strep
2. 무균적으로 상기 SingleQuots를 열고, 내용물을 지방세포형성 유도 배지 175 ml에 첨가한다
3. 각 SingleQuot 바이알을 배지로 헹군다.
4. 오직 세포의 지방세포형성 유도를 위해 보강된 배지를 이용한다. 사용하기 전까지 암조건으로 2 ℃ 내지 8 ℃에 보관한다.
하기와 같이 지방세포형성 유지 배지를 제조한다:
1. 70% v/v 에탄올 또는 이소프로판올로 지방세포형성 유지 배지(PT-3102A) 및 하기 SingleQuots의 외표면을 소독한다:
a. h-인슐린(재조합)
b. L-글루타민
c. MCGS
d. Pen/Strep
2. 무균적으로 상기 SingleQuots를 열고, 내용물을 지방세포형성 유지 배지 175 ml에 첨가한다
3. 각 SingleQuot 바이알을 배지로 헹군다.
4. 보강된 지방세포형성 유지 배지는 사용하기 전까지 암조건으로 2 ℃ 내지 8 ℃에 보관한다.
지방세포형성 배양 프로토콜:
1. 조직 배양 표면적 cm2 당 MSCGM 0.2 내지 0.3 ml 중에 STRO-3 mAb 선별 세포 2.1 x 104를 접종한다. 예: 6웰 플레이트의 9.6 cm2 웰 당 배지 2 ml 중에 2 x 105 세포. 세포를 5% CO2의 습윤 대기에서 37 ℃에서 배양한다.
2. 배양물이 컨플루언스가 될때까지 배지를 새로운 MSCGM로 2-3일마다 전체 교체하여 세포에 공급한다(5-13일). 최적 지방세포 분화를 위해서는 세포는 컨플루언트이거나 또는 컨플루언트가 지나야 한다.
3. 100% 컨플루언스에서, 3회 주기의 유도/유지는 최적의 지방세포형성 분화를 자극할 것이다. 각 사이클은 보강된 지방세포형성 유도 배지를 세포에 공급하고 3일간 배양(37 ℃, 5% CO2)한 다음, 보강된 지방세포형성 유지 배지에서 1-3일간 배양하는 단계로 이루어져 있다. 비-유도성 대조군 세포에는 동일한 스케줄로 보강된 지방세포형성 유지 배지만을 공급한다. 지방세포형성 세포는 다루기 힘들기 때문에 세포내 수많은 지질 액포의 파괴를 방지하기 위한 주의가 요구된다. 배지를 교체할때 세포를 건조 상태로 두면 안된다.
4. 3번의 유도/유지 주기를 완료한 후, 세포를 보강된 지방세포형성 유지 배지에서 7일 이상 배양하며 배지는 2-3일마다 교체한다.
5. 지방세포 분화(Adipogenic differentiation) 정도는 유도된 세포내에서 현미경으로 관찰되는 지질 액포에 의해 알 수 있을 것이다. 지방세포 분화를 입증하기 위해, 배양물을 AdipoRed로 염색할 수 있다. 비-유도성 세포에는 지질 액포가 있다 하더라도 적을 것이다.
6. 비고정된 세포의 배양물은 지방세포에 필요한 분석에 이용될 수 있다.
시험관내 지방세포형성에 대한 AdipoRed ™ 분석
6-, 12-, 24- 및 48-웰 플레이트에 대한 프로토콜:
1. 세포를 30,000/cm2로 접종 및 배양하고, 전술한 바와 같이 적정 부피의 세포배양 배지를 이용하여 세포를 분화시킨다.
2. 분석하기 바로 전에, 각 플레이트를 PBS로 헹구고 표 3의 부피로 AdipoRed를 첨가한다.
AdipoRed ™ 분석 부피
헹구는데 사용되는 부피/웰 PBS의 최종 부피/웰 AdipoRed의 부피/웰
6-웰 플레이트 2 ml 5 ml 140 ㎕
12-웰 플레이트 1 ml 2 ml 60 ㎕
24-웰 플레이트 1 ml 1 ml 30 ㎕
48-웰 플레이트 0.4 ml 0.4 ml 12 ㎕
96-웰 플레이트 0.2 ml 0.2 ml 5 ㎕
3. AdipoRed를 첨가한 후, 각 웰의 내용물 50%를 파이펫으로 2회 상하 파이펫팅하여 시약을 잘 혼합한다(6웰 플레이트의 경우에는 3번). 블루 AdipoRed 시약의 동질적인 분산물을 얻는 것이 중요하다. 세포 단일층에 파이펫의 팁이 접촉하지 않도록 또는 웰 표면에서 세포를 적출하지 않도록 매우 조심하여야 한다.
4. 10분 후에, 플레이트를 형광분석기(fluorimeter)에 두어 여기 485 nm 및 방출 572 nm에서 형광을 측정한다. 형광분석기에 적절한 필터가 장착되어 있지 않다면, 일반적인 형광발색단(fluorophore) 플루오레세인(여기 485 nm; 방출 535 nm) 세팅을 사용할 수 있다.
결과 및 고찰
2 로트(lot)의 세포로 분화력을 분석하였다. 세포 앰플에 표시하였다:
2242A 2070C
P.2o P.2o
~30E6 세포 ~30E6 세포
02NOV2005 08NOV2005
그 결과는 도 14에 나타내며, STRO-3 mAb로 선별한 세포는 지방세포로 분화할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8: TNAP + 세포의 분화 - 골형성
재료 및 방법
골형성 분석 절차
골형성 유도 배지를 하기와 같이 준비한다:
1. 70% v/v 에탄올 또는 이소프로판올로 골형성 분화 기본 배지와 하기 SingleQuots의 외표면을 소독한다:
a. 덱사메타손
b. L-글루타민
c. 아스코르베이트
d. Pen/Strep
e. MCGS
f. 베타-글리세로포스페이트
2. 무균적으로 상기 SingleQuots를 열고, 내용물을 골형성 기본 배지 185 ml에 첨가한다.
3. 각 SingleQuot 바이알을 배지로 헹군다.
4. 보강된 골형성 분화 배지는 사용하기 전까지 암조건으로 2 ℃ 내지 8 ℃에 보관한다.
골형성 배양 프로토콜:
1. 조직 배양 표면적 cm2 당 MSCGM 0.2 내지 0.3 ml 중에 STRO-3 mAb 선별 세포 3.1 x 103을 접종한다. 예: 6웰 플레이트의 9.6 cm2 웰 당 배지 2 ml 중에 3 x 104 세포.
2. 5% CO2의 습윤 대기 및 37 ℃에서 MSCGM 중에 4 내지 24시간동안 세포가 배양 표면에 유착되게 한다.
3. MSCGM을 골형성 유도 배지로 교체하여 골형성을 유도한다.
4. 배지를 새로운 골형성 유도 배지로 완전히 교체함으로써 2-3주일간 3-4일마다 유도된 세포에 공급한다. 비-유도성 대조군 세포에는 동일한 스케줄로 MSCGM을 공급한다.
5. 골형성 유도된 세포는 분화하여 미네랄화됨에 따라 방추형에서 입방형으로 세포 형태에 변화가 있을 것이다. 컨플루언트가 지난 세포에서는 갭이 형성될 수 있는데, 세포의 배양물 표면이 얇은 판으로 갈라지기 시작할 수 있다. 이러한 갈라짐이 관찰된다면, 이는 칼슘 침착을 나타내므로 즉시 골형성 분화 분석을 수행하거나 또는 그외 골세포에 사용되는 분석에 유도된 세포를 이용한다.
6. 칼슘 침착 분석의 경우, 칼슘 무첨가 PBS로 헹구어 세포를 수득하고, 0.5 M HCl 존재하에 배양 표면으로부터 세포를 긁어모운다. 칼슘 함량에 대해 골형성 유도된 세포의 추출물을 분석하고 비-유도된 대조군 세포 추출물과 비교한다.
시험관내 골형성에 있어 칼슘 침착 분석
재료:
DPBS, 칼슘 또는 마그네슘 무첨가 - Cambrex catalog # 17-516Q
- 0.5N HCl
- 칼슘(CPC) Liquicolor 키트 - Stanbio Laboratory catalog # 0150-250
- 유도된 골형성 배양물
- 플레이트 판독기 또는 스펙트로포토미터
절차:
- 테스트 대상인 유도된 또는 대조군 세포를 포함하고 있는 6웰 배양 플레이트의 각 웰에서 모든 배양 배지를 흡입한다.
- 각 웰의 측면에 PBS 1 ml을 넣어 세포를 제거하지 않도록 조심하면서 플레이트에 있는 세포를 헹군다.
- PBS를 흡입 제거하고 상기와 같이 다시 헹군다.
- 2차 헹굼액을 흡입하고, 각 웰에 0.5 N HCl 0.5 ml을 첨가한다.
- 세포 리프터를 이용하여 표면으로부터 세포를 긁어 벗겨 세포와 HCl을 폴리프로필렌 튜브(1.5 ml의 에펜도르프 튜브 또는 꽉 맞는 뚜껑이 있는 2-5 ml의 임의 폴리프로필렌 튜브)로 이동시킨다.
- 각 웰에 0.5N HCl 0.5 ml을 첨가하여 웰에 남아있는 모든 세포를 회수하여 이를 적당한 튜브로 이동시킨다.
- 이를 즉시 테스트에 사용하지 않는다면 단단히 닫아 -20 ℃에 보관한다.
- 4 ℃에서 3-24시간동안 회전 진탕기(orbital shaker)에서 튜브를 진탕하여 세포로부터 칼슘을 추출한다. 냉동한 샘플을 사용한다면, 얼마간동안 샘플을 해동시킨다.
- 2분간 500 g로 샘플을 원심분리한다.
- 펠렛을 건드리지 않고 추출된 칼슘이 있는 상층액을 조심스럽게 모아 새 튜브에 옮긴다.
- Stanbio Laboratory Calcium (CPC) Liquicolor 키트에 제공된 설명서에 따라 칼슘 표준물에 대한 표준 곡선을 구한 다음, 각 대조군 및 골-유도한 샘플내 칼슘 양을 결정한다.
- 샘플과 분석 시약의 부피는 마이크로타이터 플레이트(200 ㎕)나 스펙트로포토미터 큐벳(2 ml)에 맞게 조절할 수 있다.
- 10 ㎕ - 100 ㎕의 샘플을 각 칼슘 양 결정에 사용한다. 사용하지 않은 샘플 추출물은 추후 재-분석을 위해 다시-냉동시킬 수 있다.
결과 및 고찰
결과는 도 15에 나타내며, 이는 STRO-3 mAb로 선별한 세포가 골세포로 분화할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9: TNAP + 세포의 분화 - 연골세포형성, 지방세포형성 및 골형성
연골세포성 분화는 기존에 개시된 바에 따라(Gronthos et al., 2003) 10 ng/ml TGF-β3으로 처리한 응집 배양물을 대상으로 조사하였다. Alcian Blue는 STRO-3 mAb로 선별한 세포가 프로테오글리칸을 생산할 수 있으며(도 16C), 따라서 연골세포가 될 수 있는 것으로 나타내었다.
또한, STRO-3 mAb로 선별한 세포는 10% FCS, 100 μM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 포스페이트가 보강된 αMEM에서 3주간 배양한 후 기능적인 조골세포로 분화되었다. 미네랄 침착은 Alizarin Red 양성 염색으로 동정하였다(도 16A).
유사하게, 기존에 개시된 바와 같이, 지방세포 형성은 0.5 mM 메틸이소부틸메틸크산틴, 0.5 μM 하이드로코르티손, 및 60 μM 인도메타신의 존재시에 유도되었다(도 16B). 오일 Red O 염색으로, 지질-적재된 지방 세포의 존재를 입증하였다.
실시예 10: STRO -3 mAb 로 선별한 증폭된 인간 세포의 이식은 생체내에서 새로운 골 형성을 유도한다.
STRO-3 mAb로 선별한 골수 세포로부터 파생된 생체외에서 증폭시킨 세포 약 5.0 x 106을 40 mg의 하이드록시아파티트/트리칼슘 포스페이트(HA/TCP) 세라믹 분말(Zimmer Inc, Warsaw, IN)과 혼합한 다음, 기존에 개시된 바와 같이(Gronthos et al., 2003), 6주령의 면역결함(immunocompromised) NOD/SCID 마우스(ARC, Perth, WA, Australia)의 등 표면에 8주간 이를 피하 이식하였다. 이러한 절차는 승인된 동물 프로토콜의 상세 사항에 따라 수행하였다(University of Adelaide Ethics Number M19/2005). 수확한 임플란트를 4% 파라포름알데하이드에서 고정하고, 10 EDTA 용액으로 탈석회화한 다음, 파라핀으로 포매하였다. 8주된 이식편의 횡단면 섹션의 H & E 염색이 확인되었다. 조직학적 조사 결과, 새로운 골 형성이 입증되었다(도 16D).
실시예 11: STRO -3 mAb 로 선별한 세포는 골 복구에 이용가능하다
재료 및 방법
경골의 임계 크기 결함
양을 앙와위(dorsal recumbency)로 두고, 좌측 뒷다리(대퇴부 중간)에서 발쪽으로 위에서 아래로 양털(wool)과 체모(hair)를 제거하였다. 경골위 피부를 포비돈-요오드(베타딘) 및 알코올로 번갈아 문질러 무균 수술을 준비하였다. 무균 수술을 위해 사지를 싸두었다. 수술 전후의 항생제 예방법(Ancef; 수술전 1 gm, 수술중에 1 gm, 그리고 상처 봉합 후 1 gm, 정맥내)을 이 시기에 시작하였다. 경골의 중앙 골간에 골막을 지나 연장되는 6-cm의 피부 절개를 만들었다. 골막과 덮혀져있는 연조직을 주위로 그대로 들어올렸다. 염수로 일정하게 냉각시키면서 진동 톱을 이용한 2번의 골절제 시술로 중간-골간에 5 cm 단편의 결함부를 만들었다.
결함은 로킹 골수강내 금속정(locking intermedullary nail)을 이용하여 회복시켰다. 금속정 삽입을 위해, 구부러지는 위치에 있는 무릎과 좌측 무릎(뒷무릎) 관절위에 정중선에 거의 가운데에 길이 방향으로 절개하였다. 관절낭이 좌우로 수축된 슬개건 및 관절내에 지방 조직이 없이 절개된 경골 고평부(tibial plateau)의 중앙으로 갈라졌다. 드릴로 6 mm의 도입 간문(entry portal)을 만들고, 금속정이 압입 프레스-피트(inserted press-fit)일 수 있을때까지 핸드 리머로 경골의 골간을 크게 하였다. 필요하다면, 금속정의 원위부를 수동적으로 삽입할 수 있도록 말단 경골 골간단(metaphysis)을 8 mm 드릴로 넓혔다. 금속정의 근위 끝에 연결된 삽입 핸들 및 드라이빙 헤드를 사용하여 금속정을 삽입하였다. 근위 및 원위 교합은 근위 및 원위 조준 장치로 수행하였다.
STRO -3 mAb 로 선별한 배양 증폭시킨 세포 및 HA / TCP 담체의 양 경골 임계 크 기의 결함부에 투여
결함부에 HA/TCP 담체 또는 HA/TCP+ STRO-3 mAb 선별한 배양 증폭시킨 세포를 채우고, OR 세팅으로 간단하게 인큐베이션한 다음 처리군(25M, 75M 또는 225M)에 따라 농도를 변경시키면서 테스트하였다. 이후, 결함부의 연조직을 봉합하여 담체와 세포 유출을 방지하였다.
동물은 일반적인 마취하에 측면 및 cranio-caudal(AP)로 평면 단순촬영(plain radiograph)하였다. 촬영은 하기 시점에 수행하였다: 0일(수술) 및 1달, 2달 및 3달.
방사선 사진은 하기 기준으로 해석하였다:
캘러스 가교(callus bridge)%는결함부로 확장된 미네랄화된 조직의 총 측정양이며, 이를 전체 결함부의 길이로 나누었다. 유합은 하기 점수 시스템으로 특정화하였다:
0 (유합 없음);
1 (중간정도의 유합);
2 (양호하게 상호연결된 유합).
척추 유합술 절차
양을 마취시키고, 양의 등쪽 요추 부위 털을 제거하고 수술대에 흉골을 아래로(sternal recumbency) 위치시켰다. 요추 부위를 이소프로필 알코올과 포비돈-요오드로 교대로 여러번 문질러 무균 수술을 준비하였다. 이 부분을 놓고 국소 마취제(Lidocaine)를 L4 및 L5에서 횡돌기(spinous processe)에 대하 후방 접근을 따라 주입하였다.
횡돌기(transverse process) 접근: 20 cm로 피부에 상처를 내면, 척추 주위 근육에서 횡돌기 및 박막(laminae)이 절제될 것이다. 후관절과 L3 및 L4 사이의 횡돌기가 노출될 것이다.
계측장비 및 척추 유합 기술: L3 및 L4의 횡돌기를 양방향으로 제거하였다. HA/TCP 그래프트 치환체(담체) 또는 담체 + 동계 세포 또는 자가 이식편을 횡돌기 사이에 두었다. 이 시기에, 양에 스크류 및 로드(rod)를 이용하여 척추경 나사못 고정을 수행하였다(Medtronic-Sofamor-Danek; CD-Horozon, M8 fixed screw head system). 수술 부위는 통상적으로 봉합하였다.
4개월 후, 모든 양을 안락사시키고, 커넥팅 로드를 제거한 후 바로 연장된 척추를 CT 스캔, 단순촬용 및 팩시트론(faxitron) 분석을 수행하였다.
척추의 기계적 테스트
안락사시킨 후 즉시, 무손상 요추(lumbar spine)를 수득하여 바로 기계적 테스트를 준비하였다. 다친(유합된) 추골 2개와 유합 위 및 아래에 있는 다른 척추골로 구성된 4개의 척추골 구조체를 요추에서 분리하였다. 이들 분리한 표본에서 인대와 소낭(facet capsule) 구조가 보존되도록 조심스럽게 척추 주변 연조직을 제거하였다. 최상부 척추골(cephalad vertebra)의 상위 종판에 스크류 몇개를 박고, 하부 척추골( caudad vertebrae)의 하위 종판을, 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)을 이용하여 고정시킨 스크류-척추골 구조체로, 금속 포팅 고정물(metal potting fixture)과 커플링시켰다. 표본은 전체 조작 및 테스트 과정 동안에 습윤한 상태로 두었다.
역학적 분석 - 로드( Load ) 적용 및 운동성 결정 범위
개별 설계한 척추 테스트 고정물(custom-designed spinal testing fixture)에 표본을 부착하였다. 테스트 고정물을 표준 서보하이드로릭스 테스트 프래임(standard servohydraulic testing frame (MTS))과 커플링하였고, 도르레 및 팽팽한 와이어(tensioned wire) 시스템을 이용하여 굽히기/펴기, 좌우 횡 굽힘 및 좌우 축 회전으로 표본에 순 모멘트(pure moment)를 적용하였다. 하중은 최대 5 N-m로 가하였다. 표본은 3번의 사이클동안 미리-알맞은 상태로 조절하였고, 4번째 사이클에서 데이타를 수집하였다.
하중-의존적인 3차원 변위를 입체사진측량으로 계산하였다. 비-공선상의 마커 3종이 유합에 관여한 하부 및 상부 포팅(potting) 고정물 양쪽에 부착될 것이다. 3개의 고행상도 카메라(Vicon Peak, Centennial, CO, USA)를 이용하여 이들 마커에 의해 반사되는 빛을 검출하였고, 수집한 데이타는 맞춤 설계한 소프트웨어(Spinal Flexibility Testing Software, MFLEX)로 처리하여 유합 메스(fusion mass)를 관통하는 적정 추간각(intervertebral angle)을 결정하였다. 얻어지는 데이타는 중립적인 존과 관여한 수위와 3개의 굽힘 판(bending plane) 모두와 인접한 섹션을 교차하는 모션 데이타 범위를 제공한다.
통계 분석
처리군들 간의 전술한 파라미터의 통계적인 유의성은 다중 비교로 최소유의차 PLSD post hoc 테스트(StatView, SAS Institute Inc. Cary, NC, USA)를 이용하여 표준적인 일원식 ANOVA로 수행하였다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주될 것이다.
동물은 일반적인 마취하에 측면 및 cranio-caudal(AP)로 평면 단순촬영(plain radiograph)하였다. 촬영은 하기 시점에 수행하였다: 0일(수술) 및 1달, 2달, 3달 및 4달. 또한, 팩시트론 분석은 마모그래피 필름을 이용하여 치사 시간에 수행하였다.
방사선 사진은 하기 기준으로 해석하였다:
0 (유합 없음);
1 (중간정도의 유합);
2 (양호하게 상호연결된 유합)
결과 및 고찰
도 17은 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포가 X-레이 분석에 의하면 양의 척추경 스크류 고정 척추 모델(transpedicular screw fixation spine model)에 HA/TCP 담체를 투여한 후 대조군 단독 또는 자가이식편에 비해 유의하게 척추 유합을 형성함을 나타낸 것이다. 유의한 척추 유합은 빠르면 3달째에 관찰되었고, 4달째에 계속 증가하였다. 이러한 작용은 가장 낮은 투여량을 사용하였을 때, 대조군 담체 및 자가이식편에 비해, 유의하게 척추 유합이 이루어지지만, 투여량 의존적인 것으로는 나타나지 않았다.
도 18은 척추경 스크류 고정 척추 양 모델(transpedicular screw fixation spine model)에 HA/TCP 담체와 함께 투여한 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포가, 계측장비를 철수시킨 치사 시기에 담체 대조군에 비해 척추 유합이 양호하다는, 마모그래피 필름을 이용한 팩시트론 분석에 의해 평가한 영역을 나타낸 것이다. 다능성 세포는 모든 투여량에서 자가이식편의 표준적인 취급시에 해당되는 척수 유합 밀도를 보인다.
도 19는 척추경 스크류 고정 척추 양 모델(transpedicular screw fixation spine model)에 HA/TCP 담체와 함께 투여한 STRO-3 mAb로 선별한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포가, 자가이식편 대조군과 기계적으로 유사한 유합을 보임을 나타낸 것이다. 다능성 세포는 모든 투여량에서 유합된 골의 운동 기계적 하중 특징의 굽힘, 옆으로 펴기 및 비틀림 범위를 보였다.
도 20은 양의 임계 크기의 5 cm 결함 경골 모델에 HA/TCP 담체와 함께 투여한 STRO-3 mAb로 선택한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포가 투여량 의존적인 양상으로 초기에 골 성장을 보임을 나타낸 것이다. HA/TCP 담체와 병용한 225M 세포는 상처 발생 후 빠르면 3개월째에 60%을 웃도는 캘러스 골 형성을 보였다.
도 21은 양의 임계 크기의 5 cm 결함 경골 모델에 HA/TCP 담체와 함께 투여한 STRO-3 mAb로 선택한 배양 증폭시킨 동계 다분화성 성체 세포가 담체 단독 대조군에 비해 유합율(union rate)이 증가함을 나타낸 것이다. 75M 및 225M 세포 단독 투여시에는 3개월깨에 X-레이 분석으로 확인한 바와 같이 유합을 형성하였다.
이러한 결과는 본 발명의 증폭시킨 세포가 골 재생을 증강시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 12: STRO -3 mAb 로 선별한 다분화성 성체 세포는 심장 기능을 개선시킨다
재료 및 방법
흉강 절개술 절차
양의 흉곽과 상복부를 잘라 비누와 물로 준비하고, 건조 가능한 베타딘 용액을 칠하였다. 수술 부위에 멸균 드레이프를 덮고 수술대 주변의 모든 사람들은 전부 가운, 마스크, 장갑 및 모자를 착장하였다. 모든 흉부 수술은 좌측 흉부로 행한다. 가능한 최소한으로 절개하였고, 3차, 4차 또는 5차 인터스페이스를 도입하였다. 피부 절개는 스케펠(scapel)로 수행하였다. 피하 조직과 근육은 지혈 개선을 위해 소작 도구로 통상적으로 나누었다. 심막을 열고, 심장은 심막 크래들(pericardial cradle)로 지지하였다. 심외막 에코카디오그램( epicardial echocardiogram)을 멸균 기법하에 수행하였다. 폴리프로필렌(#0) 봉합사를 사용하여 적합한 관상 동맥과 결찰하였다. 이 동물 모델에서 속발성 심근경색증(anteroapical infarction)이 기존에 잘 확립되어 있다. 간단하게, 좌측 전하행동맥(LAD)의 1/3 말단의 봉합사 결찰 및 제2 관상 동맥 대각지(diagonal coronary artery branch) 결찰은, 일정하게 좌심실의 약 20-25%를 차지하는 속발성 심근경색증을 형성할 것이며; 이 기법은 시간에 따라 심실 리모델링과 울혈성 심부전(CHF)이 되는 상해를 계속적으로 확실하게 형성한다. 흉부 상처를 런닝 3-0 Vicryl 봉합자로 봉합하였다. 피부는 3-0 Vicryl 의 피하 봉합사로 봉합하였다. 흉부를 덮기 전에, 수술 부위에서 늑간 신경 차단을 bupivicaine(5 cc의 0.25% 용액)를 이용하여 수행하였다. 흉관 좌측 흉막강(pleural space)에 위치시켰고, 동물에서 발관될때까지 20 cm의 체액 흡입 배액 상태로 두었다.
수술하는 동안에 마취하에서 계속적으로 동물을 모니터링하였다(예, BP- arterial line, Cardiac output- Swan-Ganz/conductance catheter). 완전히 깨어나 일어설때까지 발관한 후 수시간동안 본 실험실에서 동물을 주의깊게 주시하였다. 부정맥 또는 심장 입력 신호가 낮으면 이후 6-24시간동안 근접 관찰하고, 통증 대조군, 체액 체류(fluid retention) 또는 필요에 따라 식욕 감소에 대해 모니터링하고 처리하였다.
누드 랫에서 다른 개흉술을 수행하였다. 좌전하행 동맥 결찰을 일반적인 마취하에 수행하였고, 이후 동물의 경색부 주위에 세포를 주사하고, 심막과 상처를 봉합하고, 치사시키는 2주일째까지 생존시켰다.
다분화성 성체 세포의 투여
37℃ 수조에서, 양의 시험관내에서 증폭시킨 STRO-3 mAb로 선별한 골수 세포 또는 대조군 Profreeze 배지를 해동하였다. 이후, 4 ml 바이얼을 알코올로 축인 후, 혈관내(angiocath) 바늘 시린지를 사용하여 1 ml을 뽑아내어 41 ml의 시린지로 옮겼다. 총 4 ml 중 3.5 ml을 회수하였다. 각각 1 ml의 시린지에 27 게이지 바늘을 꽂고 약 16-20회의 주사를 통해 경색부 주위 경계존 부위에 0.2 ml을 주사하였다.
1,000,000개의 세포가 있는 배지 0.2 ml을 경색부 주위 경계존에 27 게이지 바늘로 랫에 주사하였다.
초음파심장진단술( Echocardiography )
경횡격막의 정량적인 초음파심장진단술을 위한 개복술
양의 경우, 경횡격막의 정량적인 초음파심장진단술을 수행하기 위해, 경색된지 4주 후에 즉시 베이스라인으로 각 동물을 일반적인 전신 마취(이소플루란)하에 개복하였다. 양에서 정량 분석에 적절한 흉강을 통한 또는 식도를 통한 초음파심장진단 이미지를 얻기가 불가능하므로, 개복술이 필요하다. 이 동물은 심장 전체를 싸고 있는 거대한 폐를 가지고 있다. 폐 속 공기는 실질적으로 이미지의 해상도를 저하시킨다. 본 연구를 수행하는 동안에 혈압, 심박율 및 심박출량과 같은 혈액동역학을 주의깊게 모니터링하였다.
구체적으로, 상복부를 자르고 비누와 물로 준비시킨 후 건조되는 베타딘 용액을 칠하였다. 수술 부위에 멸균 드레이프를 덮고 수술대 주변의 모든 사람들은 전부 가운, 마스크, 장갑 및 모자를 착장하였다. 폐의 중첩으로 인해, 초음파심장진단 사진을 횡경막하 시야로 취하였다. 정중선에 스칼펠로 최초로 절개하고, 소작 도구로 피하와 근육층을 뚫었다. 복막강을 열었다. 멸균 플라스틱 백내에서 에코 프로브를 횡격막 아래에 도입하고, 멸균 조건하에서 모든 실험을 수행하였다. 심막과 뒷쪽 붕대(posterior fascia)에 O-프롤렌 봉합사를 간단하게 개입시켜, 상처를 봉하였다. 피하 조직은 3-0 running Vicryl로 봉합하였다. 피부는 3-0 피하 Vicryl로 봉합하였다.
랫의 경우, 심장 수축성 및 이완성 체적 파라미터를 측정하기 위해 2D 초음파심장진단술을 사용하였다.
데이타 분석
모든 이미지는 오프-라인으로 분석하였다. LV 강 면적이 가장 작은 프래임으로 동정된 마지막 심장 수축기에 모두 측정하였다. 3차원 렌더링을 보이는 모든 플롯은 Tecplot(Version 10; Amtec Engineering, Bellevue, Washington)을 이용하여 구하였다. 스플라인 표면 핏(Spline surface fit)과 가우스 곡률은 Matlab에서 계산하였다. 모든 측정값은 평균 + SD로 나타낸다. 쌍을 이룬 t 테스트로 베이스라인과 경색후를 비교하였다. 장축 및 단축 모두에서 2DCE 데이타에 대해 수행한 이미지 처리 및 데이타 분석은 기존에 언급되어 있다. 간략하게, 심내막곡률(endocardialcurvature)(K)과 심실벽 두께(h)는 경색 전 그리고 경색 후 1시간이 경과한 시점에 경계존에서 측정하였다. 모든 3DCE 회전식 횡단멱 이미지를 다음과 같이 분석하였다. 심내막 및 심외막의 윤곽은 본 발명의 가설을 모르는 초음파심장진단술 기술자가 추적하였다(UTHSCSA ImageTool; Department of Dental Diagnostic Science, University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas).
심내막 및 심외막은 각각의 회전식 횡단면 모두를 각가 추적함으로써 최종 수축기에 재구성되었다. 각 심내막 및 심외막 위치에서, 심근 관류의 존재 또는 부재를 결정하였고; 그 결과, 관류 상태는 정확하고 명확한 경계존 심근 결정이 가능한 LV 형태(LV geometry)로 등록하였다. 횡단면 데이타를 조합하여 관류 상태가 색인된 LV 심내막 및 심외막 표면의 3차원 도면을 다시 만들었다. 심내막 및 심외막 표면은 부드러운 박막 스플라인(x)를 이용하여 딱 맞게 하였고, 공간 조명하는 가우스 곡률을 포함한 표면의 특징을 계산하였다.
결과 및 고찰
도 22는 좌 하행 관상 동맥의 급성 결찰을 수행한지 24시간 후에 마우스 5마리의 심장에 직접 5회 계대배양물을 주사한 다음, 인간 STRO-3 mAb로 선별한 세포의 작용을 나타낸 것이다. 2주째에, 세포는 대조군 배지 단독 주사시에 비해 50%의 높은 분획 면적 변화율(fractional area change)을 유도하였다.
도 23은 양쪽 사선 관상 동맥(diagonal coronary artery)의 급성 결찰을 수행한 후 즉시 양의 심장에 5대 계대 배양한 것을 직접 주사한 다음 동계 양의 STRO-3 mAb로 선별한 세포의 작용을 나타낸 것이다. 4주 및 8주째에, STRO-3으로 선별한 세포를 처리한 동물에서는 대조군 배지 단독 처리한 동물에 비해, 방출비율(ejection fraction)(A)이 현저하게 증가하였고, 이완(B) 체적과 수축(C) 체적이 현저하게 낮았다.
이러한 결과는, 본 발명의 증폭시킨 세포가 심장 기능을 개선시킬 수 있음을 보이는 것이다.
실시예 13: (1) 골 재생 또는 (2) 심장 기능 회복/혈관 형성 증가가 필요한 인간 환자에 대한 인간 STRO3-선별 및 배양-확장시킨 TNAP 농화 세포의 이용
재료 및 방법
Cell Therapies Pty Ltd (affiliated with Peter MacCullum Institute of Cancer Research Melbourne, Australia)의 표준 작동 프로토콜을 골 재생 또는 심장 기능/혈관 형성이 요구되는 환자에서 이를 생체내에서 이용할 수 있는, 배양 증폭시키고 STRO-3로 면역선별한 인간 BM 유래의 TNAP+ 농화 세포에 사용하였다.
골수 흡입 과정
1. 골수(BM)는 통상적으로 장골능(엉덩이뼈) 뒷쪽에서 약 1/2 내지 1 cm 떨어져 있는 2곳 이상의 부위에서 취한다.
2. 피부를 마취하기 위해 엉덩이 피부에 국소 마취제를 주사한다. 피부를 조금 절개하여 바늘을 골 내부에 넣는다.
3. 골수 5 - 20 ml을 천자(aspirate)하고, 바늘을 뺀 다음, 동일한 피부 절개를 통해 기존에 천자한 부위에서 떨어진 뼈의 다른 부위에 골수 40 ml이 적출될때까지 재삽입한다.
4. 다른 항-응고제도 가능하지만, 통상적으로 리튬-헤파린이 함유된 튜브로 BM을 뽑아낸다. 골수 천자물은 적출후 1시간 이내에 하기와 같이 처리되는 것이 바람직하다.
골수 단핵구 준비 - 밀도 구배 분리
모든 기법은 Biological Safety Cabinet Class II에서 수행하였다.
1. BM 천자물 40 ml은 보통 4개의 튜브(약 10 ml/튜브)에 수용될 것이다.
2. 균등하게 혼합하기 위해 모든 BM 분획을 50 ml의 튜브(Falcon, Becton Dickinson)에 모운다. BM을 동량으로 2개의 50 ml 튜브에 나눈다. 동량의 차단 완충액을 첨가한다.
3. WCF(white cell fluid)를 이용하여 백혈구를 계산한다. 세포 수를 평가한다(처리전 갯수).
4. 70 mm의 세포 분리기(cell strainer)(Falcon, Becton Dickinson)를 이용하여 희석한 BM을 2개의 50 ml 원심분리 튜브로 여과하여, 작은 응고물과 골 단편물 모두를 제거한다.
5. "둥근 바닥"의 14 ml 폴리스티렌 튜브(Falcon, Becton Dickinson)에 Ficoll-Hypaque (Lymphoprep) 용액 3 ml을 넣는다.
6. 여기에 BM 7.5 ml의 lymphoprep을 조심스럽게 적층한다.
7. 실온에서 30분간 400 x g (1400 rpm)로 원심분리한다. 원심분리 브레이크는 작동시키지 않는다.
8. 멸균 캐뉼러로, 백혈구 밴드(연층, buffy coat)로부터 약 _cm 위가 될때까지 배지를 진공하에 뽑아낸다. 일회용 플라스틱 파스테르 파이펫으로 단핵구 층을 조심스럽게 취하여 50 ml 튜브에 모운다.
9. 세정 완충액으로 세포를 40 ml로 희석하고, 강한 브레이크를 작동시키고 10분간 400 x g (1400 rpm)로 원심분리한다.
10. 세포 펠렛 바로 위까지 완충액을 뽑아 제거한다.　 튜브를 볼텍스하고 HHF 50 ml을 첨가한다. 단계 9를 반복한다.
TNAP 양성 세포의 MACS( Magnetic Activated Cell Sorting )
1. 면역표지하기 전에, BMMNC(약 1 - 2 x 108 세포)를 차단 완충액 0.5 ml에 재현탁하고 얼음 위에서 30분간 인큐베이션하여, 항체의 Fc 리셉터-매개 결합 가능성을 차단한다.
2. 차단 완충액에 10 mg/ml로 미리 희석한 STRO-3 mAb 500 ㎕를 BMMNC에 첨가하여 서서히 혼합하면서 4 fC에서 60분간 인큐베이션한다.
3. BMMNC는 HHF로 2회 세정하고, 바이오틸화된 염소 항-마우스 IgG(g-chain specific, Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)를 1/50 희석으로 포함하고 있는 0.5 ml의 HHF에 재현탁하여 45분간 4 fC에에서 인큐베이션한다.
4. BMMNC를 MACS 완충액(Ca2 + - 및 Mn2 + - 무첨가성 PBS, 1% BSA, 5 mM EDTA 및 0.01% 소듐 아자이드 첨가됨)으로 3번 세정하고, 50 ㎕의 스트렙타비딘 마이크로비드(Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)가 첨가(90 ㎕의 MACS 완충액 중의 10 ㎕의 마이크로비드/107 세포)된 MACS 완충액 450 ㎕에 재현탁한다.
5. 정제 과정을 모니터링하기 위해(옵션), 스트렙타비딘-PE 접합체(1/50) (Caltag Laboratories, San Francisco, CA)을 5분간 세포 현탁액에 직접 첨가한다.
6. 빙냉한 MACS 완충액으로 1번 세정한 다음, 세포 소량(약 200K)을 취하여 유세포분석(pre sample)한다. 나머지 세포는 미니 MACS 컬럼(컬럼 용량: 108 세포, Miltenyi Biotec, MS 컬럼)에 이동시킨다. TNAP-세포(음성 분획)은 컬럼내에 남지 않으며 중력하에 유출물로 통과하여 나오지만, TNAP+ 세포는 자기화된 매트릭스에 부착되어 남게된다.
7. 비특이적으로 결합된 TNAP- 세포를 제거하기 위해 컬럼을 0.5 ml MACs 완충액으로 3회 세정한다.
8. 컬럼에 자기장을 철회한 후, MACS 완충액으로 컬럼을 수세하여 TNAP+ 세포를 회수한다. 각 조제물, 양성 및 음성 분획의 샘플 소량을 취하여 FACS Fix(PBS 중의 1%(v/v) 포르말린, 0.1 M D-글루코스, 0.02% 소듐 아자이드) 중에 고정하여 순도 및 회수 정도를 조사하기 위해 유세포 측정기로 분석하였다.
STRO -3 mAb 로 선별한 세포의 확립 및 생체외 ( Ex Vivo ) 배양물
1. TNAP+ 농화 집단(5 x 104/cm2)를 20% 소 태아 혈청, 100 mM L-아스코르베이트-2-포스페이트, 2mM L-글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신(CSL)이 보충된 이글스 배지의 알파 변형 배지가 있는 조직 배양 플라스크 또는 플레이트에서 2주간, 37℃로 4% CO2 하에서 배양한다.
2. 배양이 80-90% 컨플루언시가 되었을때 일차 세포 집단을 계대(passage)하여야 한다. 부착성 배양물은 무혈청 HBSS로 1번 세정하고, 2 ml의 0.5% 트립신/EDTA 용액(JRH)/T75 플라스크로 5-10분간 37℃에서 효소 분해하여 세포를 탈착시켜야 한다. 세포 현탁물을 모아 10% FBS가 보충된 α-MEM 배양 배지에 재접종한다.
3. 일상적으로, 배양 증폭한 세포의 단일세포 현탁액은 전술한 바와 같이 트립신/EDTA 분해에 의해 제조된다. 이후, 세포를 희석하고 차가운 HFF로 세정한다. 원심분리한 다음, 세포 펠렛을 FBS에 5 x 106/ ml로 현탁하여 얼음 위에 유지시킨다. 세포를 서서히 혼합하면서 동일 부피의 동결믹스(freeze mix)(차가운 FBS 중의 20% DMSO)를 최종 농도 2.5 x 106/ml(10% DMSO/FBS)가 되도록 서서히 첨가한다. 이중 1 ml을 얼음 위에 둔 1.8 ml 냉동바이얼(NUNC)에 넣고, 즉 튜브당 1 ml, 속도 조절 냉동기를 이용하여 분당 -1℃의 속도로 동결한다. 동결된 바이얼을 장기 보관을 위해 액체 질소로 이동시킨다. 동결된 스톡은 37℃의 수조에서 세포를 신속하게 해동시킴으로써 회수한다. 이후 세포는 차가운 HFF에 현탁하여 10분간 280 x g로 회전시킨다. 세포 생존성을 평가하기 위해, 0.4% 트립판 블루/PBS 중에 1:5 희석하고, 혈구계수기로 세포 수를 결정한다. 전형적으로, 이러한 과정의 생존성은 80-90%이다.
세포 조제물의 품질 관리
1. BMSSC 배양물은 트립신/EDTA 분해에 의해 준비한 다음 30분간 차단 완충액에 현탁한다.
2. 최종적인 세포 품질은 이하를 포함한다: 그람 염색 음성, 14일일 배양시 세균 및 진균 없음, 내독소 테스트 음성 및 트립판-블루 염료 배제법(trypan-blue dye exclusion)에서 70% 생존성.
3. 세포는 면역표현형 STRO-1+, TNAP+, CD146+, CD44+, CD3-,CD14-, 콜로니 형성 분석(Colony Forming Units-Fibroblasts(CFU-F) 및 유도성 조골세포 분화)에 의해 특정화된다.
자가 배양-증폭시킨 세포는 얼음 위에 둔 상태로 골 재생이 요구되는 환자에 이식하기 위해 호주 멜버른의 로얄 멜버른 병원으로, 그리고 심장의 기능 회복 및/또는 신생 혈관 형성이 요구되는 환자에 심근내 이식하기 위해 호주 뉴캐슬의 존 헌터 병원에 이송되었다.
경피적인 NOGA -유도( Guided ) 골수 세포 이식 절차
NOGA(Biosense) 좌심실 전기기계적 맵핑 시스템은 우대퇴동맥을 통해 경피로 도입되어 좌심실로 삽입된 8fr 심내막-맵핑 카테터 조종하기 위한 자기 기법을 이용한다. 카테터는 국소 R파 전위(local R wave electrical potential) 포착하며 심내막 표면에 놓여있다. 전기 신호는 표면 ECG 전극에 도달하고, 그로인해 국소 심실벽의 운동(국소 선형 단축 스코어)에 대한 정보를 제공한다. 허혈성이나 생명력이 있는 심근 영역은 보존된 R 파 전위가 아닌 LLS(local linear shortening) 부위로서 NOGA에 의해 검출될 것이다. 사전에 정해진 정상 심근의 NOGA 파라미터는 전기 활성 > 5 mV 및 LLS > 12%인 영역이다. 경색된 심근은 전기 활성 < 5 mV이고 LLS가 <4%인 영역을 가질 것이다. 허혈성이나 생명력이 있는 심근의 전위 활성은 5 mV 이상이고 LLS는 4-12%일 것이다. NOGA는 Cardiac Catheterisation Laboratory에서 온라인으로 심근 생체활성을 평가하는 툴로서 널리 검증되었다. 바이오센스 Myo-Star TM 인젝션 카테터는 공간에 위치가능한 그것의 팁에 자기 센서가 있다는 점에서 맵핑 카테터와 유사하다. 이것은 넣을 수 있는 바늘(retractable needle)이 포함되어 있으며, 이는 표적 부위로 골수 세포를 정확하게 주입하는데 사용할 수 있다. 이 시스템은 심내막 표면에 접촉함으로 골수 세포를 심내막으로 정확하고 안전하게 주입가능하다.
결과 및 고찰
STRO3 -선별 및 배양-증폭시킨 TNAP - 농화 세포의 대퇴부 불유합 골절( Non -Union Fracture) 환자에 이식
모토사이클 사고로 9개월 전에 대퇴골 결절되었으며 로드 및 스크류의 수술 이식에도 불구하고 치유되지 않은 로얄 멜버른 병원에 입원중인 19세 남성. 지속적이고 비-치유성 5 cm 결합이 지속됨
환자의 동의를 구한 후, 환자에게 골수 천자하여, 상기와 같이 골수 단핵구 세포의 STRO-3 mAb 선별 및 이들 세포의 배양-증폭을 수행하였다. 약 6주간의 배양후 200,000,000-225,000,000개의 세포가 수득되었으며, 수술로 주입하기 위해 준비하였다.
주입시, 세포는 멸균한 염수/plasmalyte에 5-10 ml로 현탁하고, 소의 콜라겐(MastergraftTM Matrix)이 함유된 인공 합성 골 매트릭스(HA/TCP)와 혼합하였다.
시술은 순조롭게 진행되었고, 부작용도 없었으며, 결함부는 완전하게 봉합되었다.
다발성 관상동맥 혈관 폐색 및 난치성 흉통 환자 2명에 STRO3 -선별 및 배양-증폭시킨 TNAP-농화 세포의 이식
40-65세의 존 헌터 병원에 입원중인 남성 환자 2명은 의학 또는 수술 치료로 다루기 어려운 활동시 흉통과 다혈관 관상동맥 폐색을 가지고 있다.
환자의 동의를 구한 후, 환자에게 골수 천자하여, 상기와 같이 골수 단핵구 세포의 STRO-3 mAb 선별 및 이들 세포의 배양-증폭을 수행하였다. 약 6주간의 배양후 각 환자로부터 100,000,000-120,000,000개의 세포가 수득되었으며, NOGA (Biosense) 심장 카테터에 의해 심근내 주입하기 위해 준비하였다.
각 환자에 대해 NOGA 카테터-유도성 심근내 배양 세포 주입을 수행하였다. 각 표적 부위에 0.2 m 함유성 세포를 10-12회 주사하였다.
심실벽이 관통되어 심장압전(pericardial tamponade)이 발생되지 않도록 시술하는 동안과 시술한 후 바로 초음파심장진단을 수행하였다. 시술후, 관동맥질환 집중 치료실(Coronary Care Unit)에서 환자를 24시간 관찰하였다. 초음파심장진단사진과 심장 효소 농도를 관동맥질환 집중 치료실에 있는 동안 8시간마다 조사하였다. 이식 시술 후 24시간동안 초음파심장진단사진을 수득하였다.
수술시나 수술후에도 부작용은 관찰되지 않았다. 각 환자를 2달동안 지켜보았다. 이 기간동안, 각 환자에서는 흉통 발생 빈도 및 중증도 감소가 나타났고, 힘든 노동에 대한 관용성(exertional tolerance)도 증가되었다.
이들 데이타는, 증폭시킨 세포의 이식은 폐색된 관상혈관에 의해 공급받는 손상된 및"위험한" 심근 영역으로의 혈류 증가를 발생시킴을 나타낸다.
실시예 14: 피브린 글루로 전달하였을때 세포 생존율 증가
재료 및 방법
피브린 글루 제조
피브린 글루(Tisseal VH, Baxter)를 제조사의 설명에 따라 제조하였다. 간략하게, 동결-건조된 Sealer Protein Concentrate, 피브린분해 저해 용액 및 트롬빈이 함유된 바이얼을 수조에서 37℃로 승온시켰다. 피브린분해 저해 용액을 동결-건조된 Sealer Protein Concentrate이 있는 바이얼로 DUPLOJECT 제조 및 적용 시스템에 구비된 멸균 재구성 성분을 이용하여 이동시켰다. 바이알은 1분간 37℃에 정치한 다음, 원운동으로 단순하고도 왕성하게 빙빙 돌린(과도한 거품 발생은 금지) 후 15분동안 수조에 두었다. 칼슘 클로라이드 용액을 따뜻하게 되면 트롬빈 용액으로 이동시켯다.
세포의 재현탁 및 주입
PBS 중의 5,000,000개의 배양 증폭시킨 면역선별한 인간 MPC를 희석한 트롬빈 용액으로 옮겼다. 트롬빈/세포 용액과 재구성된 Sealer 단백질 용액을 무침의 1cc 인슐린 시린지(Beckton Dickinson) 및 27G 5/8" 바늘 (Beckton Dickinson)이 적재된 변형된 DUPLOJECT Application system에 주입하였다.
누드 랫의 LAD 결찰 및 경색 발생 후 48시간째에, 좌측 흉강 절개부를 다시 개복하고 조심스럽제 유착을 용리(lysis)시켰다. 경색부를 확인하고, 총 부피 0.33 cc(1:5로 희석한 피브린 글루 중에 1,000,000개의 세포를 함유하고 있음)를 경색부 주변에 동량으로 분할하여 3번 주사하였다. 층층이 절개를 봉합하고, 동물을 회복시켰다. 48시간 후에 동물을 죽여, 심장 조직과 총 DNA를 표준 방법에 따라 적출하였다.
인간의 베타-글로불린 유전자의 PCR을 랫에서 적출한 심장 조직 DNA를 대상으로 수행하여 표준 곡선으로부터 인간 세포의 생존율을 추산하였다.
결과 및 고찰
도 24는 본 발명의 배양 증폭시킨 MPC가 피브린 글루 중에 전달되었을때 생체내에서 조직내 생존율이 증가됨을 나타낸 것이다.
당업자라면 가장 넓은 본 발명의 사상 또는 범위를 이탈하지 않고, 구체적인 예에 나타낸 바와 같이 본 발명에 대한 여러가지 변형 및/또는 수정을 가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 예는 예시된 모든 측면으로 고려되며, 한정되지 않는다.
상기에서 논의된 모든 공개문헌은 그 전체가 본원에 포함된다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌, 작용, 물질, 장치, 기사 등은 단독으로 본 발명의 내용을 제시한다. 이건 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재된 바와 같이, 이러한 임의 또는 모든 내용이 종래 분야의 일부를 형성하거나, 또는 본 발명이 관련된 분야에서 주지된 것으로 인정되지 않는다.
참고 문헌
Allcock et al. (1977) Synthesis of Poly[(amino acid alkyl ester)phosphazenes] Macromolecule 10, 824-830.
Anseth et al. (2002) In situ forming degradable networks and their application in tissue engineering and drug delivery. J Control Release 78, 199-209.
Bianco et al. (2001). Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 19, 180-92.
Bregni et al. (1992). Human peripheral blood hematopoietic progenitors are optimal targets of retroviral-mediated gene transfer. Blood 80, 1418-22.
Chatterjee et al. (1996) Adeno-associated virus vectors for gene therapy of the hematopoietic system. Curr Top Microbiol Immunol 218, 61-73.
Cole et al. (1984) Human monoclonal antibodies. Mol . Cell Biochem . 62, 109-20.
Cote et al. (1983) Generation of human monoclonal antibodies reactive with cellular antigens. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 80, 2026-30.
Danos et al. (1988) Safe and efficient generation of recombinant retroviruses with amphotropic and ecotropic host ranges. Proc . Natl . Acad . Sci. USA. 85, 6460-4
De Broe et al. (1992). Introduction: recent developments in alkaline phosphatase research. Clin Chem 38, 2485.
Dennis et al. (2002). The STRO-1+ marrow cell population is multipotential. Cells Tissues Organs 170, 73-82.
Ducy et al. (1997). Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell 89, 747-54.
Finer et al. (1994) kat: a high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50.
Frey et al. (1998) High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitors and precursor cells by adenovirus vectors. Blood 91, 2781-92.
Fukushi et al. (1998). Intracellular retention and degradation of tissue-nonspecific alkaline phosphatase with a Gly317-->Asp substitution associated with lethal hypophosphatasia. Biochem . Biophys . Res . Commun . 246, 613-8.
Gronthos et al. (1994). The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. Blood 84, 4164-73.
Gronthos et al. (2000). Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and invivo. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 13625-30.
Gronthos et al. (1995). The growth factor requirements of STRO-1-positive human bone marrow stromal precursors under serum-deprived conditions in vitro. Blood 85, 929-40.
Gronthos et al. (1996). The biology and application of human bone marrow stromal cell precursors. J Hematother 5, 15-23.
Gronthos et al. (1999). Differential cell surface expression of the STRO-1 and alkaline phosphatase antigens on discrete developmental stages in primary cultures of human bone cells. J Bone Miner Res 14, 47-56.
Gronthos et al. (2003). Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 116, 1827-35.
Harris (1990) The human alkaline phosphatases: what we know and what we don't know. Clin . Chim . Acta 186, 133-50.
Hooper (1997). Glycosyl-phosphatidylinositol anchored membrane enzymes. Clin. Chim . Acta 266, 3-12.
Hutmacher et al. (2001) Scaffold design and fabrication technologies for engineering tissues--state of the art and future perspectives. J Biomater Sci Polym Ed . 12, 107-124.
Kohler et al. (1975). Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-7.
Kozbor et al. (1985). Specific immunoglobulin production and enhanced tumorigenicity following ascites growth of human hybridomas. J. Immunol. Methods 81, 31-42.
Magnusson et al. (2002). Monoclonal antibodies against tissue-nonspecific alkaline phosphatase. Report of the ISOBM TD9 workshop. Tumour Biol 23, 228-48.
McComb et al. (1979). Alkaline Phosphatases, Plenum Press, New York.
Miller et al. (1986) Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol. 6, 2895-902.
Miller et al. (1989) Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. Biotechniques. 7, 980-82, 984-86, 989-990.
Miura et al. (1994) Differences between the sugar moieties of liver- and bone-type alkaline phosphatases: a re-evaluation. Ann . Clin . Biochem . 31, 25-30.
Mornet et al. (2001). Structural evidence for a functional role of human tissue nonspecific alkaline phosphatase in bone mineralization. J. Biol. Chem . 276, 31171-8.
Moss (1992). Perspectives in alkaline phosphatase research. Clin Chem 38, 2486-92.
Mulivor et al. (1985). Quantitative analysis of alkaline phosphatases in serum and amniotic fluid: comparison of biochemical and immunologic assays. J. Lab . Clin . Med . 105, 342-8.
Nosjean et al. (1997). Human tissue non-specific alkaline phosphatases: sugar-moiety-induced enzymic and antigenic modulations and genetic aspects. Biochem. J. 321, 297-303.
Oda et al. (1999). A general method for rapid purification of soluble versions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins expressed in insect cells: an application for human tissue-nonspecific alkaline phosphatase. J. Biochem . ( Tokyo ) 126, 694-9.
Owen et al. (1988). Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Found Symp 136, 42-60.
Pear et al. (1993) Production of High-Titer Helper-Free Retroviruses by Transient Transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396.
Pearson et al. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85, 24444-8.
Prockop (1997). Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 276, 71-4.
Quesenbery et al. (eds) (1998) Stem Cell Biology and Gene Therapy, John Wiley & Sons.
Rucker et al. (1996) Regions in 베타-chemokine receptors CCR5 and CCR2b that determine HIV-1 cofactor specificity. Cell 87, 437-46 .
Sato et al. (1994). Preferential usage of the bone-type leader sequence for the transcripts of liver/bone/kidney-type alkaline phosphatase gene in neutrophilic granulocytes. Blood 83, 1093-101.
Simmons et al. (1991). Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, STRO-1. Blood 78, 55-62.
Stewart et al. (1999). Further characterization of cells expressing STRO-1 in cultures of adult human bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res 14, 1345-56.
Wang et al. (2003) Synthesis and characterization of a novel degradable 포스페이트-containing hydrogel. Biomaterials 24, 3969-3980.
Weiss et al. (1986). Isolation and characterization of a cDNA encoding a human liver/bone/kidney-type alkaline phosphatase. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 83, 7182-6.
Weiss et al. (1988). Structure of the human liver/bone/kidney alkaline phosphatase gene. J Biol Chem 263, 12002-10.
Whyte (1994). Hypophosphatasia and the role of alkaline phosphatase in skeletal mineralization. Endocr Rev 15, 439-61.
Xu et al. (1994). Correction of the enzyme deficiency in hematopoietic cells of Gaucher patients using a clinically acceptable retroviral 상층액 transduction protocol. Exp . Hemat . 22, 223-30.
Zannettino et al. (1996). A powerful new technique for isolating genes encoding cell surface antigens using retroviral expression cloning. J Immunol 156, 611-20.
Zannettino et al. (1998) The sialomucin CD164 (MGC-24v) is an adhesive glycoprotein expressed by human hematopoietic progenitors and bone marrow stromal cells that serves as a potent negative regulator of hematopoiesis. Blood 92, 2613-28.
American Type Culture Collection PTA-7282 20051219
SEQUENCE LISTING <110> Angioblast Systems, Inc. <120> Marker for enrichment of adult multipotential cells <130> 504292 <150> US 60/670,250 <151> 2005-04-12 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ile Ser Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Thr Cys Leu Thr Asn 1 5 10 15 Ser Leu Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Lys Tyr Trp Arg Asp Gln 20 25 30 Ala Gln Glu Thr Leu Lys Tyr Ala Leu Glu Leu Gln Lys Leu Asn Thr 35 40 45 Asn Val Ala Lys Asn Val Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val 50 55 60 Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn 65 70 75 80 Pro Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala 85 90 95 Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly 100 105 110 Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Ser Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly 130 135 140 Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser 145 150 155 160 Val 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460 Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile 465 470 475 480 Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His 485 490 495 Cys Ala Trp Ala Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu 500 505 510 Leu Pro Leu Ala Val Leu Ser Leu Pro Thr Leu Phe 515 520 <210> 3 <211> 524 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Ile Leu Pro Phe Leu Val Leu Ala Ile Gly Pro Cys Leu Thr Asn 1 5 10 15 Ser Phe Val Pro Glu Lys Glu Lys Asp Pro Ser Tyr Trp Arg Gln Gln 20 25 30 Ala Gln Glu Thr Leu Lys Asn Ala Leu Lys Leu Gln Lys Leu Asn Thr 35 40 45 Asn Val Ala Lys Asn Ile Ile Met Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly Val 50 55 60 Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Leu His His Asn 65 70 75 80 Thr Gly Glu Glu Thr Arg Leu Glu Met Asp Lys Phe Pro Phe Val Ala 85 90 95 Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Thr Asn Ala Gln Val Pro Asp Ser Ala Gly 100 105 110 Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Ala Asn Glu Gly Thr Val 115 120 125 Gly Val Ser Ala Ala Thr Glu Arg Thr Arg Cys Asn Thr Thr Gln Gly 130 135 140 Asn Glu Val Thr Ser Ile Leu Arg Trp Ala Lys Asp Ala Gly Lys Ser 145 150 155 160 Val Gly Ile Val Thr Thr Thr Arg Val Asn His Ala Thr Pro Ser Ala 165 170 175 Ala Tyr Ala His Ser Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Ser Asp Asn Glu Met 180 185 190 Arg Pro Glu Ala Leu Ser Gln Gly Cys Lys Asp Ile Ala Tyr Gln Leu 195 200 205 Met His Asn Ile Lys Asp Ile Asp Val Ile Met Gly Gly Gly Arg Lys 210 215 220 Tyr Met Tyr Pro Lys Asn Arg Thr Asp Val Glu Tyr Glu Leu Asp Glu 225 230 235 240 Lys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Asp Gly Leu Asp Leu Ile Ser Ile Trp 245 250 255 Lys Ser Phe Lys Pro Arg His Lys His Ser His Tyr Val Trp Asn Arg 260 265 270 Thr Glu Leu Leu Ala Leu Asp Pro Ser Arg Val Asp Tyr Leu Leu Gly 275 280 285 Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Gln Tyr Glu Leu Asn Arg Asn Asn Leu 290 295 300 Thr Asp Pro Ser Leu Ser Glu Met Val Glu Val Ala Leu Arg Ile Leu 305 310 315 320 Thr Lys Asn Pro Lys Gly Phe Phe Leu Leu Val Glu Gly Gly Arg Ile 325 330 335 Asp His Gly His His Glu Gly Lys Ala Lys Gln Ala Leu His Glu Ala 340 345 350 Val Glu Met Asp Glu Ala Ile Gly Lys Ala Gly Thr Met Thr Ser Gln 355 360 365 Lys Asp Thr Leu Thr Val Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe Thr 370 375 380 Phe Gly Gly Tyr Thr Pro Arg Gly Asn Ser Ile Phe Gly Leu Ala Pro 385 390 395 400 Met Val Ser Asp Thr Asp Lys Lys Pro Phe Thr Ala Ile Leu Tyr Gly 405 410 415 Asn Gly Pro Gly Tyr Lys Val Val Asp Gly Glu Arg Glu Asn Val Ser 420 425 430 Met Val Asp Tyr Ala His Asn Asn Tyr Gln Ala Gln Ser Ala Val Pro 435 440 445 Leu Arg His Glu Thr His Gly Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Lys 450 455 460 Gly Pro Met Ala His Leu Leu His Gly Val His Glu Gln Asn Tyr Ile 465 470 475 480 Pro His Val Met Ala Tyr Ala Ser Cys Ile Gly Ala Asn Leu Asp His 485 490 495 Cys Ala Trp Ala Ser Ser Ala Ser Ser Pro Ser Pro Gly Ala Leu Leu 500 505 510 Leu Pro Leu Ala Leu Phe Pro Leu Arg Thr Leu Phe 515 520

Claims (45)

  1. TNAP(조직 비특이적인 알카리 포스파타제, tissue nonspecific alkaline phospatase)+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단으로서, 상기 농화 세포 집단의 최소 1%는 인비트로에서 배양하여 지방세포, 골세포 및 연골세포를 생성할 수 있는 TNAP+, STRO-1+ 다분화성 세포인, TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는농화 세포 집단.
  2. 제1항에 있어서, 상기 농화 세포 집단의 최소 10%는, 인비트로에서 배양하여 지방세포, 골세포 및 연골세포를 생성할 수 있는 TNAP+, STRO-1+ 다분화성 세포인, TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단.
  3. 제1항에 있어서, 상기 농화 세포 집단의 최소 20%는, 인비트로에서 배양하여 지방세포, 골세포 및 연골세포를 생성할 수 있는 TNAP+, STRO-1+ 다분화성 세포인, TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STRO-1+ 세포는 STRO-1bright인, TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단.
  5. 조직 특이적 위탁 세포 집단(tissue specific committed cell population)을 생산하는 방법으로서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단을 하나 이상의 자극 인자의 존재하에서 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 집단을, 상기 다분화성 성체 세포의 특이적인 조직 타입으로의 분화를 편향시키는 조건에 두는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단의 배양물의 증폭 집단을 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 TNAP+ 다분화성 성체 세포를 포함하는 농화 세포 집단을 사용하여 대상체에서 조직을 생성하거나 복구하는 의약을 제조하는 방법.
  8. 제6항의 조성물을 사용하여 대상체에서 조직을 생성하거나 복구하는 의약을 제조하는 방법.
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Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITRM20030376A1 (it) 2003-07-31 2005-02-01 Univ Roma Procedimento per l'isolamento e l'espansione di cellule staminali cardiache da biopsia.
EP1788986A1 (en) 2004-08-30 2007-05-30 Spineovations, Inc. Method of treating spinal internal disk derangement
CN101437938B (zh) * 2004-11-08 2015-05-13 约翰霍普金斯大学 心脏干细胞
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
WO2006108229A1 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 Angioblast Systems, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
WO2007079183A2 (en) 2005-12-29 2007-07-12 Anthrogenesis Corporation Placental stem cell populations
KR101475303B1 (ko) * 2006-07-12 2014-12-23 메소블라스트, 아이엔씨. 과다 혈관신생의 치료 방법
KR101240487B1 (ko) * 2006-11-09 2013-03-08 더 존스 홉킨스 유니버시티 성체 포유동물 심근세포의 심장 줄기 세포로의 역분화
TWI603736B (zh) * 2007-08-06 2017-11-01 安吉歐公司 活體內產生、修補及／或維持結締組織的方法
KR20160092062A (ko) * 2007-09-26 2016-08-03 안트로제네시스 코포레이션 인간 태반 관류액으로부터의 혈관형성 세포
US20100010549A1 (en) * 2008-03-05 2010-01-14 Neville Alleyne device and method of minimally invasive extracapsular ligamentous augmentation for canine stifle ligament injuries
US8469961B2 (en) * 2008-03-05 2013-06-25 Neville Alleyne Methods and compositions for minimally invasive capsular augmentation of canine coxofemoral joints
KR101776959B1 (ko) * 2008-06-25 2017-09-08 메소블라스트, 아이엔씨. 추간판의 치료 및/또는 재구성
CN102076844B (zh) 2008-06-30 2013-08-07 成血管细胞***公司 采用组合疗法的眼病和过度血管新生的治疗
DE102008032236A1 (de) * 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US10104880B2 (en) 2008-08-20 2018-10-23 Celularity, Inc. Cell composition and methods of making the same
CA2965883C (en) 2008-08-22 2020-05-12 Anthrogenesis Corporation Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations
US8367409B2 (en) 2008-11-19 2013-02-05 Anthrogenesis Corporation Amnion derived adherent cells
EP2350266B1 (en) * 2008-11-20 2015-07-29 Mesoblast, Inc. Method for treating or preventing a pancreatic dysfunction
US8309343B2 (en) 2008-12-01 2012-11-13 Baxter International Inc. Apparatus and method for processing biological material
WO2011031301A2 (en) * 2009-08-28 2011-03-17 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Intrapericardial delivery of periostin
MX2012011543A (es) 2010-04-08 2013-05-06 Anthrogenesis Corp Tratamiento de sarcoidosis empleando celulas madre placentarias.
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
AU2011274255B2 (en) 2010-07-02 2016-05-05 Mesoblast, Inc. Treatment of T-cell mediated immune disorders
WO2012048276A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Caridianbct, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
WO2012092485A1 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Anthrogenesis Corporation Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules
US8834928B1 (en) 2011-05-16 2014-09-16 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissugenic implants, and methods of fabricating and using same
AU2012255621A1 (en) * 2011-05-19 2013-05-02 Mesoblast, Inc. Methods for treating obesity and/or metabolic syndrome
CN113559126A (zh) 2011-06-01 2021-10-29 人类起源公司 利用胎盘干细胞治疗疼痛
KR101920277B1 (ko) 2011-06-03 2018-11-20 메소블라스트, 아이엔씨. 뇌졸중 증상을 치료하는 방법
WO2012162754A1 (en) * 2011-06-03 2012-12-06 Mesoblast, Inc Methods of treating or preventing neurological diseases
EP3653218A1 (en) 2011-07-04 2020-05-20 Mesoblast, Inc. Methods of treating or preventing rheumatic disease
CN107746830A (zh) 2011-07-06 2018-03-02 细胞治疗有限公司 从富血小板血浆制备血小板裂解物的方法
CA2847575C (en) 2011-09-09 2021-10-19 Mesoblast, Inc. Method for increasing osteoblastic function
EP2861238A4 (en) 2012-06-05 2016-03-16 Capricor Inc OPTIMIZED METHODS FOR GENERATING CARDIAC STEM CELLS FROM CARDIAC TISSUE AND THEIR USE IN CARDIAC THERAPY
EP2882445B1 (en) 2012-08-13 2019-04-24 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
KR102506612B1 (ko) 2012-12-12 2023-03-06 메소블라스트, 아이엔씨. 내피 기능장애 및 염증 질환의 치료
CA2893951C (en) * 2012-12-12 2022-05-03 Mesoblast, Inc. Methods of treating or preventing respiratory conditions
GB2516196B (en) * 2013-01-25 2015-09-09 Xcell Biosciences Inc Methods, compositions, kits, and systems for selective enrichment of target cells
EP3019598A1 (en) * 2013-07-11 2016-05-18 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for obtaining a population of isolated brite adipocytes
MX2016001247A (es) 2013-07-30 2016-08-17 Musculoskeletal Transplant Foundation Matrices derivadas de tejido suave acelular y metodos para preparar las mismas.
US10722338B2 (en) * 2013-08-09 2020-07-28 Merit Medical Systems, Inc. Vascular filter delivery systems and methods
CN105793411B (zh) 2013-11-16 2018-04-17 泰尔茂比司特公司 生物反应器中的细胞扩增
US9901478B2 (en) 2014-03-11 2018-02-27 Chine, Llc Methods and apparatuses for the external distraction in the assistance of spinal deformities
JP6783143B2 (ja) 2014-03-25 2020-11-11 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド 培地の受動的補充
SG11201607925SA (en) 2014-04-07 2016-10-28 Mesoblast Internat Sarl Improved stem cell composition
EP3154565B1 (en) 2014-06-10 2023-05-03 Mesoblast International Sàrl Treatment of immune disorders
US20160090569A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Terumo Bct, Inc. Scheduled Feed
AU2015327812B2 (en) 2014-10-03 2021-04-15 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
ES2779410T3 (es) 2014-11-07 2020-08-17 Arkema France Sistemas y métodos de recubrimiento extraíbles
CA2973727A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Spineovations, Inc. Method of treating spinal disk
KR102582602B1 (ko) 2015-05-05 2023-09-25 메조블라스트 인터내셔널 에스에이알엘 효능 검정
US10531957B2 (en) 2015-05-21 2020-01-14 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
CN109415696A (zh) 2016-05-25 2019-03-01 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
WO2017210652A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Cedars-Sinai Medical Center Cdc-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
WO2018057542A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
EP3656842A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
AU2018255346B2 (en) 2017-04-19 2024-05-02 Capricor, Inc. Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy
US20200325450A1 (en) 2017-05-04 2020-10-15 Mesoblast International Sàrl Mesenchymal lineage precursor or stem cells with enhanced immunosuppression
CN107475098B (zh) * 2017-08-15 2023-08-15 中国人民解放军第二军医大学第二附属医院 一种无菌条件下髌下脂肪垫快速匀浆分装装置及方法
TWI656215B (zh) * 2017-11-28 2019-04-11 宏齊科技股份有限公司 自周邊血液製備間質幹細胞群的方法及其用途
WO2019126068A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery
US20210388319A1 (en) 2018-10-31 2021-12-16 Mesoblast International Sarl Expansion of hematopoietic stem cells
JP2022515916A (ja) 2019-01-02 2022-02-22 メゾブラスト・インターナショナル・エスアーエールエル 腰痛を治療するための方法
EP3906036A1 (en) 2019-01-03 2021-11-10 Mesoblast International Sàrl Method for improving visual acuity
WO2020157660A1 (en) 2019-01-28 2020-08-06 Mesoblast International Sárl Method for treating or preventing gastrointestinal bleeding
GB2604400A (en) * 2021-03-05 2022-09-07 Qv Bioelectronics Ltd Biphasic injectable electrode
CN114085911B (zh) * 2022-01-19 2022-05-17 珠海圣美生物诊断技术有限公司 一种检测肿瘤细胞或肿瘤细胞碎片的方法
WO2024030976A2 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
CN115554467B (zh) * 2022-11-10 2024-01-30 奥精医疗科技股份有限公司 一种颅骨修复材料及其制备方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622871A (en) 1987-04-27 1997-04-22 Unilever Patent Holdings B.V. Capillary immunoassay and device therefor comprising mobilizable particulate labelled reagents
US3089815A (en) 1951-10-11 1963-05-14 Lieb Hans Injectable pharmaceutical preparation, and a method of making same
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
US4963489A (en) 1987-04-14 1990-10-16 Marrow-Tech, Inc. Three-dimensional cell and tissue culture system
US4983393A (en) 1987-07-21 1991-01-08 Maximed Corporation Intra-vaginal device and method for sustained drug release
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5226914A (en) 1990-11-16 1993-07-13 Caplan Arnold I Method for treating connective tissue disorders
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
AU4543193A (en) 1992-06-22 1994-01-24 Henry E. Young Scar inhibitory factor and use thereof
US5834256A (en) 1993-06-11 1998-11-10 Cell Genesys, Inc. Method for production of high titer virus and high efficiency retroviral mediated transduction of mammalian cells
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
US5591625A (en) 1993-11-24 1997-01-07 Case Western Reserve University Transduced mesenchymal stem cells
ATE241340T1 (de) 1994-02-17 2003-06-15 New York Blood Ct Inc Biologische bioadhäsive präparate, die fibrinkleber und liposomen enthalten, verfahren für ihre herstellung und verwendung
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
US6309853B1 (en) 1994-08-17 2001-10-30 The Rockfeller University Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof
EP0796115A1 (en) 1994-12-07 1997-09-24 The American National Red Cross Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use
US5736396A (en) * 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
US5643192A (en) 1995-04-06 1997-07-01 Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. Autologous fibrin glue and methods for its preparation and use
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
JP2000501614A (ja) 1995-12-15 2000-02-15 システミックス，インコーポレイテッド 高形質導入効率を有するレトロウイルスベクター上清を得るための方法
US6200606B1 (en) 1996-01-16 2001-03-13 Depuy Orthopaedics, Inc. Isolation of precursor cells from hematopoietic and nonhematopoietic tissues and their use in vivo bone and cartilage regeneration
US5824084A (en) * 1996-07-03 1998-10-20 The Cleveland Clinic Foundation Method of preparing a composite bone graft
JP2002542349A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 ダブリューエム・マーシュ・ライス・ユニバーシティー ポリ（プロピレンフマラート）−ジアクリレートマクロマーで交差結合された生体分解性のポリ（プロピレンフマラート）ネットワーク
US6355699B1 (en) 1999-06-30 2002-03-12 Ethicon, Inc. Process for manufacturing biomedical foams
AU2003901668A0 (en) 2003-03-28 2003-05-01 Medvet Science Pty. Ltd. Non-haemopoietic precursor cells
US6468527B2 (en) 2000-06-22 2002-10-22 Sam L. Austin Biological bioadhesive composition and methods of preparation and use
CA2419454A1 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Proskelia Regulator gene and system useful for the diagnosis and therapy of osteoporosis
GB2392674B (en) * 2001-07-06 2005-08-10 Geron Corp Mesenchymal cells and osteoblasts from human embryonic stem cell
JP2003052365A (ja) 2001-08-20 2003-02-25 Japan Science & Technology Corp 哺乳動物からの間葉系幹細胞の分離及びその利用方法
DE10242338A1 (de) * 2002-09-09 2004-03-18 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Antikörper zur Isolierung und/oder Identifizierung mesenchymaler Stammzellen und Verfahren zur Isolierung und/oder Identifizierung mesenchymaler Stammzellen
US7470538B2 (en) * 2002-12-05 2008-12-30 Case Western Reserve University Cell-based therapies for ischemia
WO2006108229A1 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 Angioblast Systems, Inc. Isolation of adult multipotential cells by tissue non-specific alkaline phosphatase
EP2979196B1 (en) 2013-03-28 2017-08-16 Level 3 Communications, LLC System and method for network provisioning

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Stewart, K. et al., Journal of Bone and Mineral Research, vol.14, no.8, 1 August 1999, pp.1345-1356

Also Published As

Publication number Publication date
EP1869165B1 (en) 2015-10-21
EP3327116A1 (en) 2018-05-30
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US8367405B2 (en) 2013-02-05
CA2604493A1 (en) 2006-10-19
DK1869165T3 (en) 2016-02-01
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US20160264683A1 (en) 2016-09-15
JP2014076055A (ja) 2014-05-01
US20150267171A1 (en) 2015-09-24
HK1123071A1 (en) 2009-06-05
US20180009905A1 (en) 2018-01-11
AU2006235211A1 (en) 2006-10-19
WO2006108229A1 (en) 2006-10-19
CA2604493C (en) 2015-12-22
KR20140094640A (ko) 2014-07-30
EP1869165A1 (en) 2007-12-26
US9783617B2 (en) 2017-10-10
ES2654428T3 (es) 2018-02-13
JP5972851B2 (ja) 2016-08-17
JP5462483B2 (ja) 2014-04-02
KR101446634B1 (ko) 2014-10-16
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