KR101615734B1 - Multicore-Shell Nanoparticle - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 망간 함유 자기나노입자(Mn-Magnetic Nanoparticle: Mn-MNP) 멀티코어(multi-core); 및 (b) 상기 멀티코어를 코팅하는 실리카 셸(silica shell)을 포함하는 코어-셸 나노입자에 관한 것이다.
본 발명에서 이용되는 코어-셸 나노입자는 높은 포화 자화율(M s) 값 및 횡축 이완도(R 2) 값을 가지므로, 이를 이용하는 본 발명의 센서는 크게 개선된 민감도로 분석물을 검출할 수 있다. 본 발명에 의한 개선된 민감도에 의해 극미량의 분석물, 예를 들어, 혈액 내 항암 마커 단백질 또는 핵산분자, 화학 물질 등을 검출할 수 있다.
따라서 본 발명의 코어-셸 나노입자의 우수한 자기적 특성, 생체 내 비독성, 고-수용성 및 용이한 표면 변형성은 효율적이고 실용적인 자기 나노입자 시스템 및 이를 이용한 자기 센싱 또는 조영제 등에 유용하게 이용될 수 있다.(A) Mn-Magnetic Nanoparticle (Mn-MNP) multi-core; And (b) a silica shell coating the multi-core.
Since the core-shell nanoparticles used in the present invention have a high saturation magnetic susceptibility ( M s ) value and a transverse axis relaxation ( R 2 ) value, the sensor of the present invention using the same can detect an analyte with greatly improved sensitivity have. Due to the improved sensitivity according to the present invention, trace amounts of analytes such as anticancer marker proteins or nucleic acid molecules in blood, chemicals, and the like can be detected.
Therefore, the excellent magnetic properties, in vivo nontoxicity, high-water-solubility, and easy surface deformability of the core-shell nanoparticles of the present invention can be effectively used for an efficient and practical magnetic nanoparticle system and a magnetic sensing or contrast agent using the same .

Description

멀티코어-셸 나노입자{Multicore-Shell Nanoparticle}Multicore-Shell Nanoparticle < RTI ID = 0.0 >

본 발명은 높은 포화 자화율(M s, emu/g) 또는 횡축 이완도(transverse relaxivity; R 2, s-1mM-1)를 가지는 멀티코어-셸 나노입자를 이용한 자기센싱 또는 자기공명 이미징에 관한 것이다.
The present invention relates to magnetic sensing or magnetic resonance imaging using multicore-shell nanoparticles with high saturation magnetic susceptibility ( M s , emu / g) or transverse relaxivity ( R 2 , s -1 mM -1 ) will be.

자기 나노입자(Magnetic nanoparticles, MNPs)는 자기 기구, 촉매 지지체 또는 바이오 이미징 등의 다양한 적용을 위하여 연구되어 왔다(1). 특히, 최근 ‘나노-바이오 분야(nano-bio field)’로 불리고 있는 나노물질의 생물 관련 분야에의 응용을 위하여 비독성, 고-수용성, 용이한 표면 변형 등의 독특한 특성이 필수적으로 요구된다.Magnetic nanoparticles (MNPs) have been studied for various applications such as magnetic instrumentation, catalyst support, or bioimaging (1). In particular, unique properties such as non-toxicity, high-water-solubility, and easy surface deformation are indispensable for application to bio-related fields of nanomaterials recently called "nano-bio field".

산화철(iron oxide)에 기초한 MNPs는 우수한 생체적합성(biocompatibility)을 가지는 것으로 알려져 있어, 인비보 또는 인 비트로에서 DNA/약물의 전달체, 자기공명 시약 또는 단백질/유전자의 자기분리(magnetic separation)에 이용될 수 있는 것으로 보고되고 있다(2). Iron oxide it is known to have MNPs are excellent biocompatibility (biocompatibility), based on (iron oxide), to be used in vivo or the delivery system of the DNA / drug in vitro, magnetic separation of the magnetic resonance reagents or protein / gene (magnetic separation) (2).

그러나, 산화철 나노물질은 중금속 이온으로 이루어져 있으므로 여전히 인체 내에서 세포독성을 가질 가능성을 가지고 있다(3). 따라서, 생체분야의 적용을 위하여 덱스트란 또는 무정형(amorphous)/다공성(mesoporus) 실리카(SiO2) 등의 생체적합성 유기 또는 무기 중합체를 금속나노입자 표면에 개질함으로써 금속이온의 독성을 감소시키고 친수성을 증가시키기 위한 노력이 이루어지고 있다(4). 실제로, 실리카 코팅 나노-조성물, 코어-셸(core-shell) 구조는 (ⅰ) 잘 알려진 실리콘의 화학구조에 의해 실리카-셸 상에서 원하는 화합물 또는 생체분자로 쉽게 변형될 수 있고, (ⅱ) 코어 MNP로부터 방출되는 금속 이온으로부터 보호되며, (ⅲ) 다양한 유기 염료와 혼합되어 자기 및 형광의 이중 이미징(dual imaging)될 수 있는 이점을 가지고 있다. However, since iron oxide nanomaterials are composed of heavy metal ions, they still have cytotoxicity in the human body (3). Thus, biocompatible organic or inorganic polymers such as dextran or amorphous / mesoporous silica (SiO 2 ) are modified on the surface of metal nanoparticles for application in the biomedical field, thereby reducing the toxicity of metal ions and reducing hydrophilicity (4). Indeed, the silica-coated nano-composition, core-shell structure can be easily modified to (i) the desired compound or biomolecule on the silica-shell by the well-known chemical structure of silicon, and (ii) And (iii) can be mixed with various organic dyes to be dual imaged with magnetic and fluorescence.

한편, 이와 같은 이점에도 불구하고 MNP-실리카 구조는 여전히 다른 문제점을 가지고 있다. 예를 들어, 포화 자화율(M s, emu/g) 또는 횡축 이완도(transverse relaxivity; R 2, s-1mM-1)와 같은 코어 MNP의 자기적 특성은 실리카 셸을 형성한 뒤에 감소하여, 자기 센싱 또는 자기공명영상으로 응용시 민감도가 떨어진다. 유용한 적용을 위하여, 나노물질은 광범위한 T 2 변화를 유도하기 위하여 더 높은 R 2 값을 가져야 한다. R 2는 M s 2·d 2에 대한 비를 나타내고, M s 및 d는 각각 MNP의 자기화도 및 직경을 나타내기 때문에(5), 더 높은 R 2는 강한 자기장의 MNP 조성물을 사용하거나 코어 MNP의 크기를 증가시킴으로써 얻을 수 있다. 특히, 자기 센싱 및 자기공명 이미징의 민감도는 주로 R 2 값에 좌우된다(6). On the other hand, despite these advantages, the MNP-silica structure still has other problems. For example, the magnetic properties of the core MNP, such as saturation magnetic susceptibility ( M s , emu / g) or transverse relaxivity ( R 2 , s -1 mM -1 ) Sensitivity is reduced when applied to magnetic sensing or magnetic resonance imaging . For useful applications, nanomaterials should have a higher R 2 value to induce broad T 2 changes. Since R 2 represents the ratio to M s 2 · d 2 and M s and d represent the magnetization and diameter of the MNP, respectively (5), the higher R 2 uses the strong magnetic field MNP composition or the core MNP By increasing the size of the film. In particular, the sensitivity of magnetic sensing and magnetic resonance imaging depends mainly on the R 2 value (6).

화학 조성물을 변화시키거나 MNP의 크기를 증가시킴으로서 더 높은 R 2 값을 얻는 것은 한계가 있다. 본 발명자들은 멀티코어 MNP 시스템이 높은 R 2 값을 얻는 최선의 방책이라는 사실을 발견하였다. 현재, MyOne(인비트로젠, Dynabeads) 또는 Ademtech particle(www.adamtech.com)과 같은 멀티-나노입자 코어물질이 상업적으로 구입 가능하며 외부자기장을 가한 후 다양한 타겟을 분리하는데 사용되어지고 있다. 그러나, 이들 방법도 서브-마이크로미터 사이즈의 나노입자들이 수용액상에서 균질적인 분산이 이루어질 수 없기 때문에 자기 센싱이나 인 비보 적용에 적합하지는 않다. 따라서, 자기 측정 또는 혈관 순환시에 심각한 침전 및 축적의 문제를 야기시킨다.Obtaining a higher R 2 value by changing the chemical composition or increasing the size of the MNP is limited. The present inventors have found that multicore MNP systems are the best way to obtain high R 2 values. Currently, multi-nanoparticle core materials such as MyOne (Invitrogen, Dynabeads) or Ademtech particles (www.adamtech.com) are commercially available and are being used to separate various targets after applying an external magnetic field. However, these methods are not suitable for magnetic sensing or in-vivo application because sub-micrometer-sized nanoparticles can not be homogeneously dispersed in an aqueous solution. Thus causing serious precipitation and accumulation problems during self-measurement or vascular circulation.

이에 본 발명자들은 큰 M s 값과 높은 R 2 값을 가지며 다양한 세기의 자기장에서 용액 내 우수한 용해성을 가지는 효율적이고 실용적인 실리카-코팅 멀티-코어 MNP 시스템을 개발하고자 하였다.
Accordingly, the present inventors developed an efficient and practical silica-coated multi-core MNP system having a high M s value and a high R 2 value and having excellent solubility in a solution in a magnetic field of various intensities.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 우수한 자기적 특성을 가지며 생체 내 우수한 수용성을 가지는 효율적이고 실용적인 자기 나노입자 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 실리카-셸 코팅 멀티-코어 자기 나노입자 시스템이 높은 포화 자화율(M s) 값 및 횡축 이완도(R 2) 값을 가지면서 친수성, 비독성 및 용이한 표면 변형성을 가진다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to develop an efficient and practical magnetic nanoparticle system having excellent magnetic properties and good water solubility in vivo. As a result, we have found that silica-shell coated multi-core magnetic nanoparticle systems have a high saturation magnetic susceptibility ( M s ) value and a transverse axis relaxation ( R 2 ) value and are hydrophilic, non-toxic and easily surface deformable , Thereby completing the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 멀티코어-셸 나노입자를 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide multicore-shell nanoparticles.

본 발명의 다른 목적은 이는 형광 이미징 제제(fluorescence imaging agent)를 제공하는데 있다. It is another object of the present invention to provide a fluorescence imaging agent.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 코어-셸 나노입자를 포함하는 조영제(magnetic imaging agent)를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a magnetic imaging agent comprising the core-shell nanoparticles of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 코어-셸 나노입자를 포함하는 자기센서를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide a magnetic sensor comprising the core-shell nanoparticles of the present invention.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 망간 함유 자기나노입자(Mn-Magnetic Nanoparticle: Mn-MNP) 멀티코어(multi-core); 및 (b) 상기 멀티코어를 코팅하는 실리카 셸(silica shell)을 포함하는 코어-셸 나노입자를 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a magnetic nanoparticle comprising: (a) Mn-Magnetic Nanoparticle (Mn-MNP) multi-core; And (b) a silica shell coating the multi-core.

본 발명자들은 우수한 자기적 특성을 가지며 생체 내 우수한 수용성을 가지는 효율적이고 실용적인 자기 나노입자 시스템을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 실리카-셸 코팅 멀티-코어 자기 나노입자 시스템이 높은 포화 자화율(M s) 값 및 횡축 이완도(R 2) 값을 가지면서 친수성, 비독성 및 용이한 표면 변형성을 가진다는 사실을 발견하였다. The present inventors have made extensive efforts to develop an efficient and practical magnetic nanoparticle system having excellent magnetic properties and good water solubility in vivo. As a result, it was found that the silica-shell-coated multi-core magnetic nanoparticle system has a high saturation magnetic susceptibility ( M s ) value and a transverse axis relaxation ( R 2 ) value while having hydrophilicity, non-toxicity and easy surface deformability .

본 명세서에서 용어“멀티코어”는 나노입자로 이루어진 복수개의 코어가 군집(aggregation)하여 이루어진 나노 구조체를 말한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 멀티코어는 씨드-매개 성장(seed-mediated growth) 방법을 통하여 제작될 수 있다.As used herein, the term " multicore " refers to a nanostructure formed by aggregation of a plurality of cores of nanoparticles. According to the present invention, the multicore of the present invention can be produced through a seed-mediated growth method.

본 명세서에서 용어 “실리카 셸(silica shell)”은 실리카(SiO2)로 대상표면을 코팅하여 형성된 개질막(coating layer)를 말한다. 실리카 셸의 형성은 당업계에 공지된 다양한 유기 및 무기화합물을 이용하여 실시할 수 있으며, 바람직하게는 TEOS(Tetraethylorthosilicate)를 이용한다. The term "silica shell (silica shell)" herein refers to a modified film (coating layer) formed by coating a target surface with a silica (SiO 2). The formation of the silica shell can be carried out using various organic and inorganic compounds known in the art, preferably TEOS (Tetraethylorthosilicate).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 실리카 셸 안쪽에 유기 형광 염료를 추가적으로 포함한다. According to a preferred embodiment of the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention further comprise an organic fluorescent dye inside the silica shell.

본 발명에 따르면, 본 발명의 코어 셸 나노입자는 다양한 유기 염료와 혼합되어 자기 및 형광의 이중 이미징(dual imaging) 제제로 이용될 수 있다. 또한, 대부분의 유기염료가 산소 분자와 반응하면서 빛에 노출되면 쉽게 탈색되는 단점이 있는 것에 비하여, 멀티코어 나노입자를 유기 형광 염료로 1차 코팅한 후 2차 실리카 코팅을 함으로서 산소 분자의 침투를 효율적으로 막아 상기와 같은 유기염료의 광-탈색(photo-bleaching) 현상을 극복할 수 있다. 따라서 본 발명의 나노입자는 형광 강도가 지속적으로 유지되는 효율적인 이미징 제제로서 이용될 수 있다.
According to the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention can be mixed with various organic dyes and used as a dual imaging preparation of magnetic and fluorescence. In addition, most organic dyes react with oxygen molecules and are easily discolored when exposed to light. On the other hand, when multi-core nanoparticles are first coated with organic fluorescent dyes and then subjected to secondary silica coating, Thereby effectively preventing the photo-bleaching phenomenon of the organic dyes as described above. Therefore, the nanoparticles of the present invention can be used as an effective imaging preparation in which fluorescence intensity is maintained constantly.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 실리카 셸의 두께는 9-90 nm 이다. 본 발명에 따르면, 실리카 셸의 두께를 조절함으로서 전체 코어-셸 나노입자의 크기를 조절할 수 있다. 하기의 실시예에서 상술할 바와 같이 실리카 셸의 두께는 Mn-MNP 및 TEOS의 농도 비율을 변화시킴으로서 다양하게 조절할 수 있다. 실리카 셸의 두께가 증가할수록 코어 MNP와 주변의 물분자 간의 상호작용이 방해를 받아 R 2 값은 감소하게 된다. According to a preferred embodiment of the present invention, the thickness of the silica shell of the present invention is 9-90 nm. According to the present invention, the size of the entire core-shell nanoparticle can be adjusted by adjusting the thickness of the silica shell. The thickness of the silica shell, as described in the following examples, can be varied by varying the concentration ratio of Mn-MNP and TEOS. As the silica shell thickness increases, the interaction between the core MNP and the surrounding water molecules is disturbed and the R 2 value decreases.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 15-100 nm 의 크기를 가진다. 보다 바람직하게는 50-90 nm 의 크기를 가지며, 가장 바람직하게는 약 70 nm 의 크기를 가진다.According to a preferred embodiment of the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention have a size of 15-100 nm. More preferably a size of 50-90 nm, and most preferably a size of about 70 nm.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Mn-MNP는 실리카 셸 내부에 나노입자 형태로 존재하며 30-150개의 Mn-MNP 나노입자가 멀티-코어를 형성한다. 보다 바림직하게는 50-100개의 Mn-MNP 나노입자가 멀티-코어를 형성하며, 가장 바람직하게는 약 80개의 Mn-MNP 나노입자가 멀티코어를 형성한다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the Mn-MNP of the present invention is present in the form of nanoparticles inside the silica shell, and 30-150 Mn-MNP nanoparticles form a multi-core. More precisely, 50-100 Mn-MNP nanoparticles form a multi-core, and most preferably about 80 Mn-MNP nanoparticles form a multicore.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 Mn-MNP는 Mn과 Fe의 산화물이다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the Mn-MNP of the present invention is an oxide of Mn and Fe.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 횡축 이완도(transverse relaxivity; R 2)가 400-550 s-1mM-1 이다. 횡축 이완도는 포화 자화율의 제곱과 비례하는 값으로서(R 2 = M s 2·d 2), 횡축 이완도의 상승은 포화 자와율의 증가를 가져온다. 자화율(μ)은 일정한 자기장 하에서 입자가 갖는 자기 모멘트를 의미하며 높은 자기장에서 이 값이 포화된 것이 자성 나노 입자의 포화 자화율(M s )을 의미한다. 따라서 높은 포화 자화율(M s )을 갖는 나노 입자는 응용 기술의 성능을 크게 향상 시킬 수 있기 때문에 그 개발이 대단히 중요하다. 나아가 자기 센싱 또는 자기공명영상으로 응용시 민감도를 높이기 위해서는, 나노물질은 광범위한 T 2 변화를 유도하기 위하여 더 높은 R 2 값을 가져야 한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention have a transverse relaxivity ( R 2 ) of 400-550 s -1 mM -1 . The transverse axis relaxation is a value proportional to the square of the saturation susceptibility ( R 2 = M s 2 · d 2 ), and the increase in the transverse axis relaxation leads to an increase in saturator and rate. The magnetic susceptibility (μ) means the magnetic moment of a particle under a constant magnetic field, and the saturated magnetic susceptibility ( M s ) of the magnetic nanoparticle in a high magnetic field. Therefore, nanoparticles with high saturation magnetic susceptibility ( M s ) can greatly improve the performance of the application technology, and development thereof is very important. Furthermore, in order to increase susceptibility to magnetic sensing or magnetic resonance imaging applications, nanomaterials must have a higher R 2 value to induce broad T 2 changes.

본 발명에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 동일한 크기에서 단일금속 도핑 산화철 나노입자 중 550 s-1mM-1을 상화하는 매우 높은 R 2 값을 보였다.
According to the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention exhibited very high R 2 values of 550 s -1 mM -1 in single-metal-doped iron oxide nanoparticles at the same size.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 타겟팅 모이어티(targeting moiety)가 표면에 결합되어 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention have a targeting moiety attached to the surface.

본 명세서에서 용어 “타겟팅 모이어티”는 분리하고자 하는 타겟물질에 대하여 특이적 결합능을 가지는 물질을 의미한다. 타겟팅 모이어티는 분리하고자 하는 물질에 대하여 결합 친화성이 있는 물질이면 어떠한 것도 가능하다. 타겟팅 모이어티의 비-제한적 예는 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 항체, 항원, 앱타머(RNA, DNA 및 펩타이드 앱타머), 수용체, 호르몬, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 렉틴, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트, 효소, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질, 효소기질, 합텐(hapten), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 셀렉틴 (selectin), 칼슘 설페이트, 기체 결합제(예: Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh 및 Ru)를 포함한다.
As used herein, the term " targeting moiety " means a material having a specific binding capacity for the target material to be separated. The targeting moiety can be any substance with binding affinity for the substance to be separated. Non-limiting examples of targeting moieties include nucleic acid molecules (DNA or RNA), proteins, antibodies, antigens, aptamers (RNA, DNA and peptide aptamers), receptors, hormones, streptavidin, avidin, biotin, lectins, ligands , An agonist, an antagonist, an enzyme, a coenzyme, an inorganic ion, an enzyme cofactor, a sugar, a lipid, an enzyme substrate, hapten, neutravidin, protein A, protein G, selectin, calcium sulfate, (E.g., Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh, and Ru).

상기 타겟팅 모이어티는 코어-셸 나노 입자의 표면에 직접 또는 간접적으로, 공유 또는 비공유 방식으로 결합된다. 예를 들어, 타겟팅 모이어티는 코어-셸 나노 입자의 표면에 직접적인 공유 또는 비공유 방식, 예컨대 이온결합, 정전기적 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 공유결합, 친수성 결합, 또는 반데르 발스 결합에 의해 결합될 수 있다. 또한, 결합제는 중간 매개체(intervening agent)를 통하여 간접적으로 아연-함유 자성 나노 입자의 표면에 결합될 수 있다.The targeting moiety is bonded either directly or indirectly to the surface of the core-shell nanoparticles in a covalent or non-covalent manner. For example, the targeting moiety may be attached to the surface of the core-shell nanoparticle by direct covalent or noncovalent means such as ionic, electrostatic, hydrophobic, hydrogen, covalent, hydrophilic, or van der Waals bonds . In addition, the binding agent may be indirectly bound to the surface of the zinc-containing magnetic nanoparticles through an intervening agent.

본 명세서에서 “타겟물질”은 분리(또는 분리와 검출, 또는 분리, 검출 및 정량)하고자 하는 시료 내 물질을 의미한다. 타겟물질은 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 펩타이드, 항원, 당, 지질, 세균, 바이러스, 세포, 유기 화합물, 무기화합물, 금속 및 무기이온을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경 시료를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 생물학적 시료는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.As used herein, the term " target material " means a material in a sample to be separated (or separated and detected, or separated, detected and quantified). The target material includes, but is not limited to, nucleic acid molecules (DNA or RNA), proteins, peptides, antigens, sugars, lipids, bacteria, viruses, cells, organic compounds, inorganic compounds, metals and inorganic ions. The sample includes, but is not limited to, a biological sample, a chemical sample, and an environmental sample. The biological sample may be, for example, blood, plasma, serum, virus, bacterium, tissue, cell, lymph, bone marrow fluid, saliva, milk, urine, feces, eye liquid, semen, brain extract, spinal fluid, Solutions, cell tissue fluids, and cell culture fluids.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟팅 모이어티는 바이오틴, 스트렙타비딘, 아비딘, 항체, 앱타머, 폴리펩타이드, 펩타이드, 리간드, 수용체, 렉틴, 당, 지질, 당지질 또는 핵산이다.
According to a more preferred embodiment of the present invention, the targeting moieties of the present invention are biotin, streptavidin, avidin, antibodies, aptamers, polypeptides, peptides, ligands, receptors, lectins, sugars, lipids, glycolipids or nucleic acids.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 코어-셸 나노입자를 포함하는 조영제(imaging agent)를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 조영제는 MR(magnetic resonnance) 조영제이다.According to another aspect of the invention, the present invention provides an imaging agent comprising the core-shell nanoparticles of the present invention. Preferably, the contrast agent of the present invention is an MR (magnetic resonance) contrast agent.

자성 분리, 자기 저항 센서, 자기 이완 센서, 및 고주파 자기장 열방출 등에 있어서도 높은 자화율을 갖는 입자가 사용되었을 때, 그 성능이 크게 개선될 수 있는 것과 마찬가지로, 나노 입자의 자화율은 조영 효과의 증강에 매우 중요하다. When the particles having high magnetic susceptibility are used in the magnetic separation, the magnetoresistive sensor, the magnetic relaxation sensor, and the high frequency magnetic field heat release, the magnetic susceptibility of the nanoparticles can be greatly improved It is important.

본 발명의 코어-셸 나노입자는 높은 포화 자화율 또는 횡축 이완도로 인하여 MRI 조영제로 이용하였을 때 기존의 산화철 기반의 조영제에 비해 그 조영효과가 크게 향상될 수 있음을 보여, 암 진단 등에 있어 현재 기술보다 월등히 우수한 조기 진단이 가능함을 시사한다.
The core-shell nanoparticles of the present invention show a high saturation magnetic susceptibility or a horizontal axis relaxation, and thus the contrast enhancement can be greatly enhanced as compared with conventional iron oxide-based contrast agents when used as an MRI contrast agent. Suggesting that excellent early diagnosis is possible.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 코어-셸 나노입자를 포함하는 자기센서를 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 코어-셸 나노입자는 포화 자화율 또는 횡축 이완도 등의 자기적 특성이 우수하여 향상된 민감도 및 정확도로 분석물(analyte)을 검출 또는 정량할 수 있다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a magnetic sensor comprising the core-shell nanoparticles of the present invention. According to the present invention, the core-shell nanoparticles of the present invention are excellent in magnetic properties, such as saturation magnetization or transverse axis relaxation, so that an analyte can be detected or quantified with improved sensitivity and accuracy.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 높은 포화 자화율(M s) 값 및 횡축 이완도(R 2) 값을 가지는 실리카-셸 코팅 멀티-코어 자기 나노입자 시스템을 제공한다.(a) The present invention provides a silica-shell coated multi-core magnetic nanoparticle system having a high saturation magnetic susceptibility ( M s ) value and a transverse axis relaxivity ( R 2 ) value.

(b) 본 발명은 우수한 자기적 특성을 가지며 생체 내 비독성, 고-수용성 밑 용이한 표면 변형성을 가지는 효율적이고 실용적인 자기 나노입자 시스템 및 이를 이용한 자기 센싱 또는 조영제 등에 유용하게 이용될 수 있다.
(b) The present invention can be effectively used for an efficient and practical magnetic nanoparticle system having excellent magnetic properties, non-toxic in vivo, high-water-soluble and easy surface deformability, and magnetic sensing or contrast agent using the same.

도 1은 도 1은 단일 코어 MNP 및 실리카 코팅을 한 멀티 코어 MNP의 특성을 나타낸 그림이다. 셸 내의 나노입자는 단일-분산 16 nm 크기로 검출되었다. 도 1a는 단일 코어 MNP 실리카의 TEM 이미지로서 MNP 및 TEOS의 농도 비율을 달리함으로서 실리카 셸의 두께가 15 nm - 20 nm 범위에서 조정이 가능하다. 다양한 두께의 셸로 코팅된 NMP는 약 84 NMP를 포집하고 있다(도 1b). 도 1c는 제조된 9 nm 셸 NMP 및 코팅되지 않은 NMP의 결정구조를 비교한 그림이다. 스피널 구조 패턴 및 폭의 변화가 없어 코어 NMP 구조가 실리카 셸 코팅과정에서 변화가 없음을 알 수 있다. 9 nm 셸 NMP는 높은 포화 자화율 값(101 emu/g[M])을 가지며. 300k에서 초-상자성을 띈다(도 1d).
도 2는 다양한 셸 두께의 NMP 및 셸 코팅하지 않은 NMP의 r 1 및 r 2 완화도를 측정한 비교 결과를 나타낸 그림이다. 16 nm 크기의 망간 도핑 자기나노입자(MnFe2O4, Mn-MNP)를 물에 분산시킨 후 측정한 r 2 값은 414 s-1mM-1 이다. 9 nm 셸 코팅 NMP는 군집을 이루면서 r 2 값이 535 s-1mM-1로 크게 증가하였으나, 셸의 두께가 12, 16 및 140 nm 로 증가하면서 자기 코어와 물분자 간의 거리 증가로 인하여 r 2 값은 감소하였다(도 2a). 반면, 군집 형태는 r 1 값에 영향을 주지 못했으며, 실리카 셸의 두께가 증가할수록 r 1 값은 점점 감소하였다(도 2b). 높은 r 2 값을 가지는 얇은 셸의 NMP는 동일한 농도에서 가장 높은 명암대비를 나타냈다. 두꺼운 셸의 NMP(140 nm)는 Mn-MNP와 유사한 명암대비를 보였다(도 2c).
도 3은 NIR 유기염료 도핑 NMP의 광안정화를 보여주는 그림이다. 도 3a는 이중 셸 적용 NMP(NMP(VT680), 유기중합체 코팅 나노입자(CLIO-VT680) 및 순수 염료를 250W UV 광선에 노출시켜 그 형광세기를 비교함으로써 실리카 셸 내의 비-탈색(non-bleaching) 염료의 효율을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. NMP(VT680)는 광-탈색 현상이 거의 일어나지 않았으며, 97%의 형광강도를 유지하였다. 이는 형광 검출을 위한 공초점 현미경 실험을 통해서도 확인되었다. 도 3b는 유리 염료(free dye)를 흡수한 세포가 측정 후 10분 안에 형광광도의 절반이 감소하고 1시간 내에 완전히 탈색됨을 보여주는 사진이다. 반면, NMP(VT680)가 함입된 세포는 형광 강도의 변화가 크지 않았다.
도 4는 VT680 결합 NMP의 동시적 센싱 및 형광-자기 이미징을 이용한 다양한 생체적 적용을 보여주는 그림이다.
도 5는 상업적으로 구입 가능한 멀티-코어 입자와 제조한 멀티-코어 입자(MyOne, Master Bead 및 NMP)를 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 마이크로미터 이하 사이즈의 MyOne 및 Master bead는 세포, 단백질 등의 분류 목적으로 유용하다. 나아가, 이들은 최근 단일코어입자 시스템에 비하여 높은 r 2 및 Ms 값 때문에 자기 센싱에 이용되기도 한다. 그러나, 이들은 본 발명자들의 최근의 실험을 통해 낮은 생산성, 타겟팅 이후 완화기간동안 큰 사이즈로 인해 입자가 침전한다는 점 및 용액 내에서 이질상(heterogeneous phase)으로 존재한다는 사실 등의 문제점을 가지고 있음이 확인되었다. 제조된 NMP 시스템은 더 큰 단일입자(약 16 nm)로 구성되고 더 높은 값의 r 2 및 M s를 가지는 멀티-코어 및 실리카 코팅을 가지며, 인비보 적용시 약 80 nm 의 전체크기와 완충액에서의 동질상(homogeneous phase)을 보여주었다. T 2 값의 재생능력을 비교하기 위하여 완충용액 내 모든 입자들의 완화시간(T 2)을 측정하자 MyOne 및 Master bead에서는 시간의 흐름에 따른 침전문제로 인해 재현 데이터를 얻지 못했다
도 6는 씨드-매개(seed-mediated) 방법을 통하여 제작된 다양한 크기의 Mn 도핑 자성 나노입자에 대한 TEM 분석결과를 나타낸 그림이다. 효율적인 멀티-코어 시스템을 수득하기 위해선, 더 큰 나노입자를 단일 입자로 사용해야 하며 이를 위해 씨드-매개 입자제조 방법을 이용하게 된다. 먼저, 작은 크기의 나노입자(9 nm 이하)를 고온(300℃)에서 Mn(acac)2, Fe(acac)3 및 순한 산화제(1,2-hexadecanediol)로부터 쉽게 제작할 수 있으며, 이들로부터 동일한 양의 금속원을 첨가하면서 12 - 16 nm 까지 크기를 증가시킨다. TEM 분석으로부터, 작은 크기(왼쪽), 중간크기(가운데) 및 큰 크기(오른쪽)의 씨드 나노입자가 정형성, 구형 및 높은 결정성을 보이며 이들은 각각 9 nm, 12 nm 및 16 nm의 다른 크기를 가진다는 사실을 확인하였다(scale bar = 10 nm).
도 7은 SQUID를 이용하여 9 nm 실리카 셸 NMP의 자기 특성을 측정한 결과를 나타낸 그림이다. 16 nm 멀티 코어 Mn-MNP는 상온(300 K)에서 초-상자성을 가졌으며, 낮은 온도(5 K)에서는 더 높은 Ms 값(110 emu/[M]g)을 보였다. ZFC(zero-field-cooling) 및 FC(field-cooling) 실험에 따르면, 방해 온도(T B)는 250K 였으며, 이는 초-상자성이 관찰되는 온도이기도 하다.
도 8은 다양한 나노입자 시스템에서의 r 1 및 r 2 값을 요약한 결과를 나타낸 그림이다. CLIO(cyclo-dextran linked iron oxide) 나노입자는 이미징, 센싱 등에 유용한 물질로 보고되었다(12). 이는 단일코어 나노입자가 크기가 작기 때문에(평균 5 nm 이하) 상대적으로 낮은 r 2 값을 가진다. 제작된 16 nm 크기의 자성 나노입자는 CLIO와 동일한 화학적 조성을 가지나 크기가 더 커서 4.7배 더 높은 r 2 값을 보인다. 또한 자성체의 화학적 조성을 Mn 도핑을 통해 변형시켰을 때, 동일한 크기(16 nm)에서의 값은 414 s-1mM-1로 크게 증가하였다. 더 큰 크기의 Mn-MNP(특히 20 nm)가 16 nm 크기와 유사한 r 2 값을 가짐을 확인하여 전체 크기의 증가를 통해서 더 이상 r 2 값에 영향을 미치지 못함을 알 수 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 16 nm Mn-MNP 및 얇은 셸 NMP (9 nm)로 이루어진 멀티-코어 시스템(NMP)를 채택하였으며, 훨씬 높은 r 2 값(538 s-1mM-1)을 보였다.
도 9는 항체접합을 위한 NMP의 표면변형을 나타낸 그림이다. NMP(VT680)의 표면을 PEG 분자 및 1차 아민 작용기로 처리하여 친수성을 증가시키고 활성부분을 제공하였다. 이후 노보넨 분자와 클릭 화학(click chemistry)에 의해 빠르게 반응하는 테트라진 프로세싱 화합물을 단순한 EDC/NHS 반응으로 일차 아민에 결합시켰다. 테트라진 및 노보넨의 자세한 제조과정은 다음과 같다; 모든 화합물은 Sigma-Aldrich 또는 Acros에서 구입하였으며 변형없이 사용하였다. 테트라진(3-(p-benzylamino)-1,2,4,5-tetrazine) 및 (1S,2S,4S)-비사이클로[2.2.1]헵타-5-엔-2-일 아세틱 애시드의 숙시니미딜 에스터는 공지된 방법(3)으로 제조하였다. 예비적 HPLC는 335 요오드 에레이 검출기, 701 분별 수집기 및 Varian RPC18 컬럼(모델 A6002250X212)이 장비된 Varian ProStar model 210를 이용하여 21 mL/min 유속에서 수행하였다. 모든 HPLC 수행에 있어서, 용액 A는 0.1% TFA가 포함된 물로 구성되고, 용액 B는 10% 물 및 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴로 구성된다. 1H(400 MHz) 스펙트럼은 Bruker Advance-400 NMR 스펙트로미터를 이용하여 CD3OD와 TSP(3-(trimethylsilyl)-propionic-2,2,3,3-D4acid sodium salt)를 내부 기준물질로 하여 수집하였다. 질량 분광학 데이터는 Micromass ZQ4000 ESI-MS 기구를 이용하여 얻었다.
도 10은 CLIO 및 제조된 NMP의 세포독성 측정을 위한 MTT 분석결과를 나타낸 그림이다. BT474 유방암 세포 및 3T3 섬유아세포를 다양한 농도의 자기 나노입자로 처리하고 세포생존성을 MTT 분석으로 측정하였다. 세포 생존성은 모든 그룹에서 90% 를 상회하였고, 이로 인해 십분의 수 마이크로그램 수준의 양(0.4 mgmL-1)으로는 제조되고 변형된 나노입자가 24시간 내에 급성 세포독성을 나타내지 않음을 보여준다.FIG. 1 is a graph showing the characteristics of a single core MNP and a silica-coated multicore MNP. FIG. The nanoparticles in the shell were detected with a single-dispersion 16 nm size. FIG. 1A is a TEM image of single-core MNP silica, and the thickness of the silica shell can be adjusted in the range of 15 nm to 20 nm by varying the concentration ratio of MNP and TEOS. NMP coated with shells of varying thickness collected about 84 NMP (FIG. 1B). FIG. 1C shows a comparison of the crystal structures of the prepared 9 nm shell NMP and uncoated NMP. The core NMP structure was not changed during the silica shell coating process because there was no change in the spinel structure pattern and width. 9 nm shell NMP has a high saturation susceptibility value (101 emu / g [M]). And is supra-paramagnetic at 300k (Fig. 1d).
Fig. 2 is a graph showing the results of comparison between r 1 and r 2 relaxation measurements of NMP and shell-coated NMP of various shell thicknesses. The r 2 value measured after dispersing 16 nm sized manganese-doped magnetic nanoparticles (MnFe 2 O 4 , Mn-MNP) in water is 414 s -1 mM -1 . The 9 nm shell-coated NMP was clustered and the r 2 value increased to 535 s -1 mM -1 . However, the shell thickness increased to 12, 16, and 140 nm, and r 2 Value decreased (Fig. 2a). On the other hand, clusters form had not affecting the value of r 1, as the thickness of the silica shell increases r 1 value was gradually decreased (Figure 2b). Thin shell NMP with high r 2 values showed the highest contrast at the same concentration. NMP (140 nm) of the thick shell showed a contrast similar to that of Mn-MNP (Fig. 2C).
FIG. 3 is a graph showing photostabilization of NIR organic dye doped NMP. FIG. Figure 3a shows the non-bleaching in a silica shell by comparing the fluorescence intensities of a double-shell applied NMP (NMP (VT680), organic polymer coated nanoparticles (CLIO-VT680) NMP (VT680) showed almost no photo-decolorization phenomenon and maintained a fluorescence intensity of 97%, which was confirmed by confocal microscopy experiments for fluorescence detection. 3b is a photograph showing that half of the fluorescence intensity is completely decolorized within 1 hour after 10 minutes of the fluorescence intensity of the cells absorbing the free dye, whereas the cells containing NMP (VT680) .
FIG. 4 is a diagram showing various biochemical applications using simultaneous sensing and fluorescence-magnetic imaging of a VT680-coupled NMP.
FIG. 5 is a graph showing a result of comparing commercially available multi-core particles with manufactured multi-core particles (MyOne, Master Bead and NMP). MyOne and Master beads of sub-micrometer size are useful for classification of cells, proteins, and the like. Furthermore, they are also used for magnetic sensing due to their high r 2 and Ms values compared to the recent single core particle systems. However, they have found through recent experiments of the present inventors that they have problems such as low productivity, precipitation of particles due to large size during the relaxation period after the target, and existence of a heterogeneous phase in the solution . The fabricated NMP system has a multi-core and silica coating with higher values of r 2 and M s , consisting of larger single particles (about 16 nm) and has a total size of about 80 nm Of homogeneous phase. We measured the relaxation time ( T 2 ) of all the particles in the buffer to compare the regenerative capacity of T 2 values. In MyOne and Master bead, we could not obtain reproducible data due to precipitation over time
FIG. 6 is a TEM analysis of Mn-doped magnetic nanoparticles of various sizes prepared through a seed-mediated method. In order to obtain an efficient multi-core system, larger nanoparticles should be used as single particles, and seed-mediated particle manufacturing methods are used for this purpose. First, small size nanoparticles (9 nm or less) can be easily fabricated from Mn (acac) 2 , Fe (acac) 3 and 1,2-hexadecanediol at high temperature (300 ° C.) Of the metal source is added to increase the size to 12 - 16 nm. From the TEM analysis, seed nanoparticles of small size (left), middle size (middle) and large size (right) exhibit positive, spherical and high crystallinity, which differ in size of 9 nm, 12 nm and 16 nm, respectively (Scale bar = 10 nm).
Figure 7 Figure 9 shows the results of measuring the magnetic properties of 9 nm silica shell NMP using SQUID. 16 nm multicore Mn-MNPs were supercritical at room temperature (300 K) and showed higher Ms values (110 emu / [M] g) at lower temperatures (5 K). According to zero-field-cooling (ZFC) and field-cooling (FC) experiments, the disturbance temperature ( T B ) was 250 K, which is also the temperature at which supercriticality is observed.
Figure 8 is a plot of r 1 < RTI ID = 0.0 > And r 2 The results are summarized as follows. CLIO (cyclo-dextran linked iron oxide) nanoparticles have been reported to be useful for imaging and sensing (12). This is because the single core nanoparticles are small in size (less than 5 nm on average) and have a relatively low r 2 value. The magnetic nanoparticles of the fabricated 16 nm size seems to 4.7 more, the same chemical composition and size gajina CLIO cursor times higher r 2 value. In addition, when the chemical composition of the magnetic body was modified through Mn doping, the value at the same magnitude (16 nm) was greatly increased to 414 s -1 mM -1 . It was found that Mn-MNP (especially 20 nm) of larger size had an r 2 value similar to that of 16 nm, and it was found that the r 2 value was no longer influenced by the increase of the total size. To solve this problem, the present inventors adopted a multi-core system (NMP) consisting of 16 nm Mn-MNP and thin shell NMP (9 nm) and a much higher r 2 value (538 s -1 mM -1 ) It looked.
Fig. 9 is a diagram showing the surface deformation of NMP for antibody conjugation. Fig. The surface of NMP (VT680) was treated with PEG molecules and primary amine functionalities to increase hydrophilicity and provide active moieties. The tetrazine processing compound, which reacts rapidly with norbornene molecules and click chemistry, is then coupled to the primary amine by a simple EDC / NHS reaction. Detailed preparation of tetrazine and norbornene are as follows; All compounds were purchased from Sigma-Aldrich or Acros and used without modification. Tetra binary (3- (p -benzylamino) -1,2,4,5- tetrazine) and (1S, 2S, 4S) - bicyclo [2.2.1] hepta-5-en-2-yl acetic acid The succinimidyl ester was prepared by the known method (3). Preliminary HPLC was performed at a flow rate of 21 mL / min using a Varian ProStar model 210 equipped with a 335 iodine detector, a 701 fractionation collector and a Varian RPC18 column (model A6002250X212). For all HPLC runs, Solution A consists of water with 0.1% TFA and Solution B consists of acetonitrile with 10% water and 0.1% TFA. 1 H (400 MHz) spectra were obtained using CD 3 OD and TSP (3- (trimethylsilyl) -propionic-2,2,3,3-D 4 acid sodium salt) using a Bruker Advance-400 NMR spectrometer as internal reference material Respectively. Mass spectroscopy data were obtained using a Micromass ZQ4000 ESI-MS instrument.
FIG. 10 is a graph showing the results of MTT analysis for measuring cytotoxicity of CLIO and manufactured NMP. FIG. BT474 breast cancer cells and 3T3 fibroblasts were treated with various concentrations of magnetic nanoparticles and cell viability was measured by MTT assay. Cell viability was greater than 90% in all groups, indicating that produced and modified nanoparticles with a level of a few micrograms (0.4 mg mL -1 ) did not show acute cytotoxicity within 24 hours.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험방법Experimental Method

실험재료Experimental material

Fe(acac)3(Iron(Ⅲ) acetylacetonate)(99.9%), Fe(acac)2(Iron(Ⅱ) acetylacetonate)(99.9%), 1,2-헥사데칸디올(1,2-Hexadecandiol, 90 %), 올레산(OA, 99%), 올레일아민(OY, 70%), Co(acac)2(Cobalt (Ⅱ) acetylacetonate, 97%), Mn(acac)2(Manganese (II) acetylacetonate), ODE(1-Octadecene, 95 %), 클로로포름(99%), DMSA(2,3-Dimercaptosuccinic acid, 98%), 트리에틸아민(99%), DMSO(Dimethyl sulfoxide, 99.9%), PVP(poly-vinylpyrrolidone) 용액(PVP, Mr 55,000 Da), VT680(Vivotag-680), TEOS(Tetraethyl orthosilicate 99.999 %), Si-PEG (2[methoxy(polyethyleneoxy)propyl]trimethoxysilane), APS(3-aminopropyltriethyoxysilane), EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride), Sulfo-NHS(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, 98.5 %) 및 3-(p-벤질아미노)-1,2,4,5-테트라진은 Sigma-Aldrich 또는 Gelest에서 구입하였으며, 별도의 변형을 가하지 않았다. 이소프로판올(99.5 %), 헥산(98.5 %), 에탄올(99.5 %) 및 NaHCO3 는 Fisher Scientific에서 구입하였으며, 별도의 변형을 가하지 않았다.
 Fe (acac) 3 (Iron ( Ⅲ) acetylacetonate) (99.9%), Fe (acac) 2 (Iron (Ⅱ) acetylacetonate) (99.9%), 1,2- hexahydro-decanediol (1,2-Hexadecandiol, 90% ), oleic acid (OA, 99%), oleyl amine (OY, 70%), Co (acac) 2 (Cobalt (ⅱ) acetylacetonate, 97%), Mn (acac) 2 (Manganese (II) acetylacetonate), ODE (99%), DMSA (2,3-Dimercaptosuccinic acid, 98%), triethylamine (99%), DMSO (dimethyl sulfoxide, 99.9%), polyvinylpyrrolidone (PVP, Mr 55,000 Da), VT680 (Vivotag-680), TEOS (Tetraethyl orthosilicate 99.999%), Si-PEG (2-methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane), APS (3-aminopropyltriethyoxysilane) - (3-Dimethylaminopropyl) -N'-ethylcarbodiimide hydrochloride), Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, 98.5%) and 3- ( p- benzylamino) -1,2,4,5- It was purchased from Aldrich or Gelest and did not undergo any modification. Isopropanol (99.5%), hexane (98.5%), ethanol (99.5%) and NaHCO 3 were purchased from Fisher Scientific and were not modified.

16 nm Mn-MNP의 합성 및 이들의 특성 확인Synthesis of 16 nm Mn-MNP and its characterization

본 발명자들은 10 nm Mn-MNP를 연속적인 합성을 위한 씨드(seed)로서 합성하였다. Fe(acac)3(4 mmoL, 1.4 g), Mn(acac)2(2 mmoL, 0.5 g), 1,2-헥사데칸디올(10 mmoL, 2.9 g), OA(6 mmoL, 1.9 mL), OY(6 mmoL, 2.8 mL) 및 ODE(20 mL)를 1시간 동안 N2를 흘려주면서 강하게 저어주며 혼합하였다. 혼합물은 가열 후 2시간동안 200℃를 유지시켰다. 이어서, 온도를 278℃까지 급격히 상승시켰다. 이 시점에서 용액은 암갈색에서 검은색으로 변했다. 환류 후에, 혼합물을 상온으로 냉각하고 이소프로판올(4mL)을 첨가하였다. Mn-MNP는 원심분리(3,000 x 15 min)에 의하여 수집한 후, 헥산용매 하에 분산시켰다. 씨드-매개 성장(seed-mediated growth)을 통하여 12 nm Mn-MNP를 만들기 위하여, 10 nm Mn-MNP(100 mg)을 같은 양의 금속 아세틸아세토네이트, 1,2-헥사데칸디올, OA, OY 및 ODE와 함께 상술한 바와 같이 헥산(10mL)에 용해시켰다. 혼합물을 가열하고 100℃로 1시간 동안 유지하며 N2 환류로 헥산을 제거하였다. 상기 혼합물을 다시 가열하여 200℃로 2시간 동안 유지시켰다. 마지막으로 온도를 300℃로 증가시키고 혼합물을 환류시킨 후 상온으로 냉각하였다. 입자들은 상술한 세척 및 분리 과정을 통해 수집하였다.We synthesized 10 nm Mn-MNP as a seed for continuous synthesis. Fe (acac) 3 (4 mmoL , 1.4 g), Mn (acac) 2 (2 mmoL, 0.5 g), 1,2- hexahydro-decanediol (10 mmoL, 2.9 g), OA (6 mmoL, 1.9 mL), OY (6 mmoL, 2.8 mL) and ODE (20 mL) were mixed with vigorous stirring with flowing N 2 for 1 h. The mixture was maintained at 200 < 0 > C for 2 hours after heating. Subsequently, the temperature was rapidly increased to 278 占 폚. At this point the solution turned from dark brown to black. After refluxing, the mixture was cooled to ambient temperature and isopropanol (4 mL) was added. Mn-MNP was collected by centrifugation (3,000 x 15 min) and then dispersed in hexane solvent. 10 nm Mn-MNP (100 mg) was added to the same amount of metal acetylacetonate, 1,2-hexadecanediol, OA, OY (100 mg) to make 12 nm Mn-MNP through seed- And ODE as described above in hexane (10 mL). Heat the mixture and maintain for 1 hour to 100 ℃ and the hexane was removed with N 2 under reflux. The mixture was heated again and held at 200 占 폚 for 2 hours. Finally the temperature was increased to 300 < 0 > C and the mixture was refluxed and cooled to ambient temperature. The particles were collected through the above-described washing and separation processes.

비슷한 방법으로, 12nm 입자를 씨드(seed)로 하여 16 nm Mn-MNP를 합성하였다. 본 발명자들은 TEM(transmission electron microscope, JEOL 2100, JOEL USA), X-레이 분말 회절계(XRD, RU300, Rigaku), ICP-AES(inductively-coupled plasma atomic emission spectrometer, Activa-S, HORIBA Jobin Yvon) 및 SQUID(superconducting quantum interference device) 자기계 (S600X, Cryogenic)를 이용하여 각각 Mn-MNP의 형태, 구조, 조성 및 자기 성질에 대해 특성화하였다. In a similar manner, 16 nm Mn-MNP was synthesized using 12 nm seeds. The present inventors have found that a TEM (transmission electron microscope, JEOL 2100, JOEL USA), an X-ray powder diffractometer (XRD, RU300, Rigaku), an inductively-coupled plasma atomic emission spectrometer (ICP-AES, HORIBA Jobin Yvon) And SQUID (superconducting quantum interference device) machine (S600X, Cryogenic) , respectively, to characterize the morphology, structure, composition and magnetic properties of Mn-MNP.

9 nm9 nm NMP(VT680)의 합성 및 특성 확인 Synthesis and Characterization of NMP (VT680)

제조한 16 nm Mn-MNP를 10 mL 클로로포름에 용해시키고 트리에틸아민 50 μL를 첨가하였다. 10 mL DMSO에 용해시킨 DMSA(50mg)을 나노입자 용액에 주입하였다. 혼합물이 차차 이질화 될 때까지 40℃에서 6시간 동안 흔들고 원심분리(3,000 rpm, 10 분)를 통해 침전시켰다. 과량의 DMSA를 제거하기 위하여 침전물을 에탄올로 조심스럽게 세척한 뒤에 균질기(homogenizer)를 이용하여 10 mL 에탄올에서 분산시켰다. 10 mL DMSO에 용해시킨 50 mg DMSA를 다시 나노입자 에탄올 용액에 첨가하고 전체 과정을 반복하였다. 최종 침전물을 50 mL H2O에서 분산시켰다. DMSA를 처리한 Mn-MNP는 결국 수용액 내에서 분산력이 생겼다. 실리카 셸을 VT680 유기염료로 코팅하려면, PVP 중합체 처리를 통한 St공정을 위하여 EtOH 용액에 용해시켜야 한다. Mn-MNP 용액(34.7 mL, 20 mgmL-1solution in water)을 PVP 용액(0.65 mL, 25.6 gL-1in H2O)에 첨가하고 혼합물을 상온에서 하루 동안 상온에서 저어주었다. 액상 아세톤(H2O/acetone = 1/10, v/v)을 첨가함으로써 PVP-안정화 Mn-MNP를 분리하고 4000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 침전된 입자를 에탄올(10 mL)에 재분산시켰다. EtOH에 용해되고 아세톤에 용해되지 않는 부분적으로 결집된 MNP를 만들기 위하여, 100 mg PVP를 처리한 Mn-MNP를 10 mL EtOH에 분산시키고 1mL 아세톤(EtOH/acetone, 10/1, v/v)을 첨가하였다. VT680에 의해 변형된 TMS(trimethoxysilane)를 APS와 함께 질소 하에서 Schlenk line 표준 기술을 이용하여 제작하였다. TEOS 및 APS-변형 VT680(TEOS/VT680 몰 비율=0.3/0.04) 혼합 용액을 PVP-안정화 Mn-MNP 에탄올 용액에 주입하였다. 암모니아 용액(0.86 mL, 30 wt% by NH3)을 촉매로 하여 개시되는 중합반응(Polymerization)에 의하여 유기 염료를 함유한 Mn-MNP-실리카 코어셸 나노입자를 제조하였다. 이들 입자를 에탄올에서 분산시키고 초 원심분리(18 000 rpm, 30 분)로 침전시켰다. 원심분리(18 000 rpm, 30 분)를 통해 NMP(370 mg)를 얻은 뒤 염기성 에탄올(50 mL ; pH12)에서 재분산시키고 Si-PEG(275 mg, 0.5 mmol) 및 APS(22 mg, 0.1 mmol)와 반응시킨 다음 2시간 동안 상온에서 질소 하에서 저어주었다. 생성된 MNP는 반응하지 않은 Si 화합물로부터 원심분리를 통해 분리한 뒤 에탄올로 수번 세척하였다. (NMP를 에탄올과 혼합하고 원심분리(13 000 rpm, 20분)를 통해 분리한 후 상층액을 제거하고 에탄올을 다시 첨가하였다. 침전된 입자를 20분간 초음파 분해(sonication)를 통해 재분산시켰다. 이러한 과정을 몇 번 반복하였다. 마지막으로 일차아민 말단화(primary amine terminated) NMP를 20 mL H2O로 재분산시켰다. 제조한 NMP는 TEM, UV/Vis 흡광 및 방사 현미경(emission spectroscopy)으로 확인하였다.
The prepared 16 nm Mn-MNP was dissolved in 10 mL of chloroform and 50 μL of triethylamine was added. DMSA (50 mg) dissolved in 10 mL DMSO was injected into the nanoparticle solution. The mixture was shaken at 40 ° C for 6 hours until it was gradually differentiated and precipitated through centrifugation (3,000 rpm, 10 minutes). The precipitate was carefully washed with ethanol to remove excess DMSA and then dispersed in 10 mL of ethanol using a homogenizer. 50 mg DMSA dissolved in 10 mL DMSO was added again to the ethanol solution of nanoparticles and the whole process was repeated. The final precipitate was dispersed in 50 mL H 2 O. Mn-MNP treated with DMSA eventually produced dispersing power in aqueous solution. To coat silica shells with VT680 organic dyes, they must be dissolved in EtOH solution for the St process through PVP polymer treatment. Mn-MNP solution (34.7 mL, 20 mg mL -1 solution in water) was added to the PVP solution (0.65 mL, 25.6 gL -1 in H 2 O) and the mixture was stirred at room temperature for one day at room temperature. PVP-stabilized Mn-MNP was isolated by adding liquid acetone (H 2 O / acetone = 1/10, v / v) and centrifuged at 4000 rpm for 10 min. The supernatant was removed and the precipitated particles were redispersed in ethanol (10 mL). In order to make partially aggregated MNP dissolved in EtOH and not dissolved in acetone, Mn-MNP treated with 100 mg PVP was dispersed in 10 mL EtOH and 1 mL acetone (EtOH / acetone, 10/1, v / v) . TMS (trimethoxysilane) modified by VT680 was prepared with APS under nitrogen using Schlenk line standard technique. A mixed solution of TEOS and APS-modified VT680 (TEOS / VT680 molar ratio = 0.3 / 0.04) was injected into the PVP-stabilized Mn-MNP ethanol solution. Mn-MNP-silica core shell nanoparticles containing organic dyes were prepared by polymerisation initiated with ammonia solution (0.86 mL, 30 wt% by NH 3 ) as catalyst. The particles were dispersed in ethanol and precipitated by ultracentrifugation (18 000 rpm, 30 minutes). NMP (370 mg) was obtained via centrifugation (18 000 rpm, 30 min), redispersed in basic ethanol (50 mL; pH 12), and Si-PEG (275 mg, 0.5 mmol) and APS ) And then stirred at room temperature under nitrogen for 2 hours. The resulting MNP was separated from unreacted Si compounds by centrifugation and washed several times with ethanol. (NMP was mixed with ethanol and centrifuged (13 000 rpm, 20 min), then the supernatant was removed and ethanol was added again. The precipitated particles were redispersed through sonication for 20 min. Finally, the primary amine terminated NMP was redispersed in 20 mL H 2 O. The prepared NMP was confirmed by TEM, UV / Vis absorption and emission spectroscopy Respectively.

바이오틴 또는 항체 접합 Biotin or antibody conjugation

바이오틴 3-설포-N-하이드록시숙시니미드에스터 소듐 염(Aldrich, Biotin-NHS, 90 %)과 접합시키기 위하여, 본 발명자들은 EDC 화학반응을 이용하여 NMP의 1차 아민으로부터 아마이드 결합을 생성하였다. NH2 말단화 NMP(25 mg)를 20 mL H2O에 분산시키고 혼합 후 EDC(5 mg)를 첨가하였다. 혼합 용액은 상온에서 3시간 동안 저어주었다. 접합 나노입자는 원심분리(12,000 rpm, 20분)에 의하여 침전시키고 H2O로 3번 세척하였다. 항체와 접합시키기 위하여 본 발명자들은 아마이드 결합을 형성함으로서 NMP를 테트라진(tetrazine)으로 처리하였다. 본 발명자들은 항체(anti-HER2/neu: Herceptin, 6mg·mL-1)를 1 mL PBS 완충액에 용해시키고 0.1 M NaHCO3를 첨가함으로서 pH 8.2로 조절하였다. 그 후 (1S,2S,4S)-비사이클로[2.2.1]헵타-5-엔-2-일 아세틱 애시드의 숙시니미딜 에스터 2 mg을 첨가하였다(SI 도 6). 그런 다음 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 노보렌-활성(norbornene-active) 항체를 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare Bio-Sciences)을 이용하여 정화시키고 즉시 테트라진 처리 NMP(5mg·mL-1)와 결합시켰다. 혼합물을 4℃에서 6시간 동안 흔들어주고 정화하였다. BCA(bicinchoninic acid) 분석결과((BCA protein assay kit, Pierce Biotechnology) 나노입자 당 항체의 숫자는 약 100개이다.
To conjugate with biotin 3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester sodium salt (Aldrich, Biotin-NHS, 90%), the present inventors generated an amide bond from the primary amine of NMP using EDC chemistry . The NH 2 -terminated NMP (25 mg) was dispersed in 20 mL H 2 O and mixed and EDC (5 mg) was added. The mixed solution was stirred at room temperature for 3 hours. The conjugated nanoparticles were precipitated by centrifugation (12,000 rpm, 20 min) and washed three times with H 2 O. [ To conjugate with the antibody, the present inventors treated NMP with tetrazine by forming an amide bond. The present inventors adjusted the pH to 8.2 by dissolving the antibody (anti-HER2 / neu: Herceptin, 6 mg · mL -1 ) in 1 mL PBS buffer and adding 0.1 M NaHCO 3 . 2 mg of succinimidyl ester of (1S, 2S, 4S) -bicyclo [2.2.1] hept-5-en-2-yl acetic acid was then added (SI diagram 6). The mixture was then incubated at 37 [deg.] C for 30 minutes. The norbornene-active antibody was purified using a PD-10 desalting column (GE Healthcare Bio-Sciences) and immediately bound with tetrazine-treated NMP (5 mg · mL -1 ). The mixture was shaken for 6 hours at < RTI ID = 0.0 > 4 C < / RTI > BCA (bicinchoninic acid) analysis (BCA protein assay kit, Pierce Biotechnology) The number of antibodies per nanoparticle is about 100.

세포배양Cell culture

BT474 유방암 세포주를 습기를 가한 5 % CO2 대기하에서 37℃를 유지하면서10 % 우태아혈청이 포함된 RPMI 1640 배지(Hyclone, Logan, UT)에서 배양하였다.
BT474 breast cancer cell lines were cultured in RPMI 1640 medium (Hyclone, Logan, UT) containing 10% fetal bovine serum at 37 ° C in a humidified 5% CO 2 atmosphere.

MR & FMT 이미징MR & FMT Imaging

MRI 시료를 4.7 T 임상전 MRI 기구(BioSpec 47/40 Ultra Shielded Refrigerated, Bruker BioSpin, Corp., Billerica, MA)에 적용하였다. 이러한 MRI 기구는 AVANCE 콘솔을 마주보는 40 cm 수평 마그넷 보어(magnet bore)를 가지며, 12 cm 경사 세트(gradient set)(BGA-12)를 장비하여 720 mT/m SR(slew rate) 6000 T/m/s로 720 mT/m의 자기를 제공할 수 있다. 35 mm 내경을 가진 새장형 코일(birdcage coil)을 사용하여 RF를 전송하고 MR 신호를 수신하였다. 스카우트 이미지는 경사에코 연쇄(gradient echo sequence)와 함께 삼면에서 얻어져서 연구를 위한 적합한 위치를 결정할 수 있게 한다. MRI 이미지를 얻기 위하여 고속 스핀-에코인 RARE 연쇄를 사용하였다. 256 x 256 매트릭스의 연쇄를 하기의 파라미터로 수행하였다: 유효 에코시간 ms, 반복시간 5000 ms, 에코 트레인 길이 8, 시계(field of view) 3 x 3 cm2, 평균 숫자 2. 전체 종양 커버는 틈새가 없는 12x1 mm 두께의 축방향 슬라이스를 통해서 얻었다. 각각의 동물들은 N2O 및 O2(7:3)의 혼합기체 하에서 이소플루란(isoflurane, 5 % induction, 1.5 % maintenance)으로 마취하였다. 직장 온도는 온풍기를 이용하여 유지하였다.
MRI samples were applied to 4.7 T pre-clinical MRI apparatus (BioSpec 47/40 Ultra Shielded Refrigerated, Bruker BioSpin, Corp., Billerica, MA). This MRI instrument has a 40 cm horizontal magnet bore facing the AVANCE console and is equipped with a 12 cm gradient set (BGA-12) to provide a 720 mT / m slew rate of 6000 T / m / s to provide 720 mT / m of magnetism. RF was transmitted and MR signals were received using a birdcage coil with an inner diameter of 35 mm. The scout image is acquired on three planes with a gradient echo sequence, allowing you to determine the appropriate location for your study. A fast spin-echo RARE chain was used to obtain MRI images. A chain of 256 x 256 matrices was performed with the following parameters: effective echo time ms, repetition time 5000 ms, echo train length 8, field of view 3 x 3 cm 2 , Was obtained through an axial slice of 12x1 mm thickness. Each animal was anesthetized with isoflurane (5% induction, 1.5% maintenance) under a mixed gas of N 2 O and O 2 (7: 3). The rectal temperature was maintained using a hot air fan.

MTT 분석MTT analysis

MTT 분석키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 나노입자 존재 하에서의 세포 생존성을 측정하였다. 마우스 NIH/3T3 섬유아세포를 우태아혈청 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신(1%), L-글루타민(1%), 소듐 비카보네이트(2%)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 인간 HCT116 결장암 세포를 McCoy's 5a 배지에서 배양하였다. 양 세포주는 습기를 가한 5 % CO2의 대기하에서 37℃로 유지해주었다. 합류시점에서 세포를 세척하고 트립신 처리를 한 후 배양배지에서 재부유(resuspend)시켰다. 세포들을 96-웰 조직배양 프레이트에 5,000 cells/well의 농도로 넣어주고 5 % CO2 하에서 37℃로 밤새 배양하였다. 나노입자 용액을 배양배지에 다양한 농도로 첨가하고 세포들을 다시 나노입자 존재 하에서 37℃로 5 % CO2 대기 하에서 24시간 동안 배양하였다. 세포 생존성을 시험하기 위하여, 배양배지를 MTT 용액으로 교체하였다. 37℃, 5 % CO2 대기 하에서 3시간 배양 후, MTT 가용화 용액(MTT solubilization solution)을 첨가하여 얻어진 포르마잔 크리스탈을 용해시켰다. 결과는 배경 흡광도를 690 nm로 하여 570 nm 파장에서 분광학적으로 측정함으로서 세포 생존성을 결정하였다.
MTT assay kit (Sigma-Aldrich) was used to measure cell viability in the presence of nanoparticles. Mouse NIH / 3T3 fibroblasts were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum, penicillin and streptomycin (1%), L-glutamine (1%) and sodium bicarbonate (2%). Human HCT116 colon cancer cells were cultured in McCoy's 5a medium. Both cell lines were maintained at 37 ° C in an atmosphere of humidified 5% CO 2 . Cells were washed at confluence and trypsinized and resuspended in culture medium. Cells were plated in 96-well tissue culture plates at a concentration of 5,000 cells / well and cultured overnight at 37 ° C under 5% CO 2 . The nanoparticle solution was added to the culture medium at various concentrations, and the cells were again cultured in the presence of nanoparticles at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere for 24 hours. To test cell viability, the culture medium was replaced with MTT solution. After incubation for 3 hours at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere, MTT solubilization solution was added to dissolve the formazan crystals. The cell viability was determined by spectrophotometry at 570 nm wavelength with background absorbance of 690 nm.

실험결과 Experiment result

16 nm Mn-MNP의 합성 및 이들의 특징 확인Synthesis of 16 nm Mn-MNP and characterization of these

본 발명자들은 우선 망간에 도핑된 산화철 자기 나노입자(Mn-MNP)를 좁은 공간에 집중시켜 산화금속 나노입자 중에서 비교적 M s 값이 큰 코어형태로 합성한 후, Mn-MNP 크기를 16 nm 까지 증가시켜 R 2 값을 seed-growth 방법에 따라 증가시켰다.(7) 이들 입자를 수득하기 위하여, 우선 Fe(acac)3, Mn(acac)2 및 1,2-헥사데카네디올을 고온(300℃)에서 반응시킴으로써 10 nm 의 Mn-MNP를 씨드(seed)로써 제작하였다. 금속원 화합물을 첨가한 후 반응을 반복함으로서 12 - 16 nm까지 차차 커지면서 크기 선택성이 없는 단분산 분포를 이룬다.The inventors of the present invention first synthesized manganese-doped iron oxide magnetic nanoparticles (Mn-MNP) in a narrow space and synthesized them in the form of a core having a relatively large M s value among metal oxide nanoparticles, and then increased the Mn-MNP size to 16 nm The R 2 value (acac) 3 , Mn (acac) 2 and 1,2-hexadecanediol were reacted at high temperature (300 ° C.) to obtain 10 nm Mn-MNP as a seed. By repeating the reaction after the addition of the metal source compound, the size gradually increases up to 12 - 16 nm, resulting in a monodisperse distribution with no size selectivity.

실리카 셸을 코팅하기 위하여, 수성 및 알콜용매에 용해시켜야 한다. 불행하게도, 제조된 상태의 Mn-MNP는 헥산이나 클로로포름 등의 비극성 유기용매에서만 분산이 된다. 따라서, Mn-MNP의 표면은 2가지 다른 화합물, 즉 DMSA(2,3-dimercaptosuccinic acid) 및 PVP(polyviny-pyrrolidone, Mw = 55 kDa) 중합체로 순차적으로 처리해 줌으로서, 알콜 용해성 Mn-MNP를 수득하였다. Mn-MNP는 동일한 크기에서 단일금속 도핑 산화철 나노입자 중 가장 높은 R 2 값을 보이는 0.5 T에서 비교적 높은 R 2, 420 s-1·mM-1 값을 보였다. 예를 들어, 본 발명자들이 이전에 제조한 CoFe2O4 및 Fe3O4 나노입자는 각각 214 및 237 s-1·mM-1를 나타낸 바 있다. 본 발명자들은 Mn-MNP가 더 높은 R 2 값의 우수한 코어 자기물질이 될 수 있다고 결론지었다. 본 발명자들은 알콜 용해성 Mn-MNP에 실리카 셸을 씌우는 과정은 St방법을 이용하였다. 요약하자면, TEOS(tetraethyl orthosilicate, 99.999%)를 나노입자 에탄올 용액에 혼합한 후 30 % NH4OH를 첨가함으로서 pH를 8.2로 조절하였다. 이 시점에서, 실리카 셸의 두께는 MNP 및 TEOS의 다양한 농도 비율에 따라 변할 수 있다(도 1a). 단일코어 MNP 및 실리카 셸 입자는 수용액에서 높은 용해성을 보이며 다른 생체관련 분야에의 적용에 적합하다(8). 그러나, 단일코어 물질은 코팅되지 않은 Mn-MNP에 비하여 낮은 R 2 이완도(0.5T에서 54 s-1mM-1)를 보였다. 실리카 셸은 코어 MNP와 주변의 물분자 사이의 자기 상호작용을 방해할 수 있는데, 이러한 현상은 낮은 R 2 값에 기인한 민감도의 감소를 야기하는 문제를 일으킨다. R 2 값 감소를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 부분적으로 군집한 MNP를 도입하여 멀티코어 MNP 시스템을 만들고 실리카 셸 코팅을 하였다. 또한 인 비보 적용을 위하여 전체 크기를 100 nm 이하로 유지하였다(도 1b). To coat the silica shell, it must be dissolved in aqueous and alcoholic solvents. Unfortunately, Mn-MNP in the prepared state is dispersed only in a non-polar organic solvent such as hexane or chloroform. Thus, the surface of two different compounds of the Mn-MNP, i.e. DMSA (2,3-dimercaptosuccinic acid) and PVP as a zoom process in order to (polyviny-pyrrolidone, M w = 55 kDa) polymer, an alcohol-soluble Mn-MNP . Mn-MNP showed relatively high R 2 , 420 s -1 · mM -1 at 0.5 T showing the highest R 2 value among single metal-doped iron oxide nanoparticles at the same size. For example, the CoFe 2 O 4 and Fe 3 O 4 nanoparticles previously prepared by the present inventors exhibited 214 and 237 s -1 · mM -1 , respectively. The present inventors have concluded that Mn-MNP can be an excellent core magnetic material with a higher R 2 value. The inventors used the St method to cover the silica shell with alcohol soluble Mn-MNP. To summarize, TEOS (tetraethyl orthosilicate, 99.999%) was added to the ethanol solution of nanoparticles and the pH was adjusted to 8.2 by adding 30% NH 4 OH. At this point, the thickness of the silica shell can vary depending on various concentration ratios of MNP and TEOS (FIG. 1A). Single-core MNP and silica shell particles show high solubility in aqueous solutions and are suitable for application in other bio-related fields (8). However, the single core material exhibited lower R 2 relaxation (54 s -1 mM -1 at 0.5 T) than uncoated Mn-MNP. The silica shell can interfere with the magnetic interaction between the core MNP and the surrounding water molecules, which causes problems causing a reduction in sensitivity due to low R 2 values. In order to overcome the R 2 value reduction, we have introduced a partially clustering MNP to create a multicore MNP system and a silica shell coating. The total size was kept below 100 nm for in vivo application (FIG. 1B).

본 발명자들은 나노입자의 크기 및 형태를 파악하기 위하여 TEM(transmission electron microscopy)를 이용한 결과 실리카 셸 내에서 마치 석류와 같은 완벽한 멀티-코어 입자를 관찰하였다. 본 발명자들은 이러한 코어-셸 나노입자를‘나노-자기 석류(nano-magnetic pomegranate)’라고 명명하였다. 실리카 셸의 두께는 단일 코어물질을 제작할 때와 같은 방법으로 Mn-MNP 및 TEOS 농도의 비율을 조절함으로서 9-140 nm 로 다양해질 수 있다. TEM 분석 및 x-레이 회절(XRD) 연구로부터(도 1c), 코어 내의 MN-MNP가 실리카 셸 형성 이전과 같이 16 nm 크기의 구형이고, 코팅되지 않은 Mn-MNP의 피크와 완전히 일치하는 역 스피넬 자성체 구조(inverse spinel ferrite structure)의 전형적 패턴을 가진다는 것이 밝혀짐으로서 각각의 Mn-MNP 나노입자가 코팅 과정에서 형태, 크기 및 결정성(crystallinity)에 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다. NMP는 작은 각도에서 실리카 셸에 대해 무정형의 광범위한 XRD 패턴을 가진다. 군집 코어의 전체 평균크기는 약 70 nm 이고, 실리카 셸 내부에 대략 83.7개 정도의 입자가 존재한다. 본 발명자들은 SQUID(superconducting quantum interference device) 자기계를 이용하여 NMP의 자기적 특성도 확인하였다. 9 nm 셸 NMP는 여전히 초-상자성(super-paramagnetic)을 가졌으며 300 K에서 더 높은 M s(101 emu/g [M])를 가진다. 또한 방해 온도(blocking temperature, T b)는 FC(field cooling) 및 ZFC(zero field cooling) 연구 결과 250 K로 측정되었다. NMP의 R 1 및 R 2 값을 비교하기 위하여, 본 발명자들은 9 nm 에서 140 nm 의 다양한 셸 두께의 NMP의 T 1 및 T 2 값을 다양한 농도에서 측정하였다. 이후, 금속 이온의 농도를 ICP-AES 기구(Activa-S, HORIBA Jobin Yvon)를 이용하여 분석하고 R 1 및 R 2 값으로 변환하였다. The present inventors observed complete multi-core particles such as pomegranate in a silica shell as a result of TEM (transmission electron microscopy) in order to grasp the size and shape of nanoparticles. The present inventors named these core-shell nanoparticles as "nano-magnetic pomegranate". The silica shell thickness can be varied from 9 to 140 nm by controlling the ratio of Mn-MNP and TEOS concentrations in the same way as when making a single-core material. From the TEM analysis and x-ray diffraction (XRD) studies (Fig. 1c), it was found that the MN-MNP in the core was spherical, 16 nm in size before silica shell formation, MNP nanoparticles were found to have typical patterns of inverse spinel ferrite structures, confirming that each Mn-MNP nanoparticle was not affected by shape, size and crystallinity during the coating process. The NMP has a broad XRD pattern amorphous to the silica shell at a small angle. The total average size of the cluster core is about 70 nm, and there are about 83.7 particles inside the silica shell. The present inventors also confirmed the magnetic properties of NMP using a SQUID (superconducting quantum interference device) magnetometer. The 9 nm shell NMP is still super-paramagnetic and has a higher M s (101 emu / g [M]) at 300 K. The blocking temperature ( T b ) was also measured at 250 K for field cooling (FC) and zero field cooling (ZFC) studies. To compare the R 1 and R 2 values of NMP, we measured the T 1 and T 2 values of NMP at various shell thicknesses from 9 nm to 140 nm at various concentrations. The concentration of metal ions was then analyzed using an ICP-AES instrument (Activa-S, HORIBA Jobin Yvon) and converted to R 1 and R 2 values.

R 1 및 R 2 값이 실리카 셸의 두께에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 두께(9, 12, 16 및 140 nm)의 NMP를 비교하였다. R 2 값은 셸 두께가 증가할수록 각각 538, 535, 486 및 434 s-1mM-1 으로 감소하였으며, 9 nm 셸 NMP는 코팅되지 않은 Mn-MNP(414 s-1mM-1)에 비하여 130% 높은 값을 가졌다. R 1 값은 두께가 증가할수록 점진적으로 감소하는 경향을 보였다(도 2a 및 2b) 본 발명자들은 덩어리화된 코어 MNP가 R 2 값을 증가시키고, 셸이 두꺼워질수록 코어 MNP와 셸 주변의 물분자 간의 자기 상호작용을 방해함으로써 인해 R 2 값을 감소시킨다고 생각하였다. 그러나 R 1 값은 코어 MNP와 물분자 간의 거리에만 좌우되기 때문에 셸의 두께가 증가할수록 감소하였다. In order to investigate the effect of R 1 and R 2 values on the thickness of the silica shell, we compared the NMPs of various thicknesses (9, 12, 16 and 140 nm). R 2 values decreased to 538, 535, 486 and 434 s -1 mM -1 , respectively, as the shell thickness increased. The 9 nm shell NMP showed a decrease of 130 from the uncoated Mn-MNP (414 s -1 mM -1 ) % ≪ / RTI > The R 1 value tended to decrease gradually as the thickness increased (FIGS. 2 a and 2 b). The present inventors found that when the agglomerated core MNP increases the R 2 value and the thicker the shell, the more the core MNP and the water molecules around the shell And that the R 2 value is reduced by interfering with the interactions between the two . However, R 1 The value decreased only with the thickness of shell because it depends on the distance between core MNP and water molecule.

T 2 대조도를 비교하기 위하여, 본 발명자들은 16 nm 전체크기를 가지고 크기 편차가 적은 Fe3O4, CoFe2O4 및 MnFe2O4와 같은 다양한 도핑 자성체를 제작하였다. 본 발명자들은 CLIO, Fe3O4, CoFe2O4, MnFe2O4 및 본 발명의 NMP(9 nm 및 140 nm)의 T 2 측정을 4.7 T MRI 기구를 이용하여 수행하였다. 도 2c에서 MnFe2O4 나노입자는 동일한 금속농도의 다른 자성 나노입자들보다 어둡게 나타냈다. 얇은 셸 NMP는 매우 낮은 농도(0.1 pM 이하)에서 유의한 명암신호를 보이고, 140 nm 셸 NMP는 R 2 값의 차이처럼 코팅하지 않은(bare) MNP와 유사한 강도를 보였다. 그 결과, 본 발명의 NMP 나노조성물 시스템은 자기 센싱 및 자기공명 이미징에 우수한 소재가 될 수 있음이 밝혀졌다.
In order to compare the T 2 contrast, the present inventors produced various doped magnetic materials such as Fe 3 O 4 , CoFe 2 O 4, and MnFe 2 O 4 having a total size of 16 nm and small size variations. The present inventors have found that CLIO, Fe 3 O 4 , T 2 measurements of CoFe 2 O 4 , MnFe 2 O 4 and NMP (9 nm and 140 nm) of the present invention were performed using a 4.7 T MRI apparatus. In Figure 2C, MnFe 2 O 4 nanoparticles were darker than other magnetic nanoparticles of the same metal concentration. Thin shell NMP showed significant contrast signal at very low concentration (less than 0.1 pM) and 140 nm shell NMP showed similar intensity to uncoated MNP as difference of R 2 value. As a result, it has been found that the NMP nanocomposite system of the present invention can be an excellent material for magnetic sensing and magnetic resonance imaging.

9 nm9 nm NMP(VT680)의 합성 및 특성 확인Synthesis and Characterization of NMP (VT680)

NMP 물질에 형광 특성을 부여하여 MR 이미징 뿐 아니라 동시에 형광 이미징에도 응용하기 위한 과정으로서, 본 발명자들은 근적외선(NIR, VT680) 유기염료를 공지된 방법(4)으로 코팅과정 동안 실리카 셸에 넣어주었다. 보통, 유기염료는 산소 분자와 반응하면서 빛에 노출되면 쉽게 탈색된다(9). 본 발명자들은 셸 두께가 약 6 nm 일때 NIR 염료로 1차 코팅 후 2차 실리카 코팅(약 3 nm 증가)을 함으로서 이러한 유기염료의 광-탈색(photo-bleaching) 현상을 극복하였다. 두 번째 코팅으로 인하여 산소 분자의 침투를 효율적으로 막을 수 있다. 실리카 셸 내부의 비-탈색 염료의 효율을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 광-탈색 실험을 수행하였다. 실험은 250W UV 광선을 다양한 시간에 노출시킨 후 형광 방사 스펙트럼을 수집하여 덱스트란 폴리머 코팅 나노입자(CLIO, cross-linked iron oxide), 단일 및 이중 처리 NMP 및 순수 염료 용액의 VT680 유기염료 방사 세기와 비교하면서 이루어졌다(도 3a). 순수 유리 유기염료는 300분 동안 노출시키면 빠르고 완전하게 탈색되었다. CLIO-VT680 및 단일 코팅 NMP(VT680)는 각각 원래의 45% 및 75%의 세기가 남아있었다. 반면, 이중 코팅된 NMP 내부의 염료는 아무런 변화 없이 동일한 세기를 유지하였다. 단일 및 이중 처리 셸의 광-탈색 결과로부터, 수용액 상의 산소분자가 3 nm 실리카 셸에 침투할 수 있으며, 염료 분자의 광-안정성에 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 실제 상황에서 광-안정성의 효율을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 Her2 항체 접합 NMP(VT680)를 암세포(BT474) 특이적 타겟팅에 이용하고 CLSM(confocal laser scanning microscope)에 의해 강력한 레이저에 노출시키면서 직접 형광강도의 변화를 모니터링하였다(도 3b). NMP(VT680)를 주입한 세포의 형광은 여전히 액상 실험에서의 강도를 유지하였으나 순수 유기 염료를 주입한 세포는 CLSM 측정 10분 후부터 형광 강도의 유의한 감소를 보였다.
As a process for imparting fluorescence properties to NMP materials, as well as for MR imaging as well as for fluorescence imaging, we have incorporated near-infrared (NIR, VT680) organic dyes into a silica shell during the coating process by a known method (4). Usually, organic dyes react with oxygen molecules and are easily discolored when exposed to light (9). We overcome the photo-bleaching phenomenon of these organic dyes by first coating with a NIR dye followed by a second silica coating (about 3 nm increase) when the shell thickness is about 6 nm. Due to the second coating, penetration of oxygen molecules can be effectively prevented. In order to confirm the efficiency of the non-decolorizing dye inside the silica shell, we performed photo-discoloration experiments. Experiments were performed by exposing 250 W UV light for various times and then collecting fluorescence emission spectra to determine the emission intensity of VT680 organic dyes in single and dual treated NMP and pure dye solutions, (Fig. 3A). Pure glass organic dyes quickly and completely decolorized upon exposure for 300 minutes. CLIO-VT680 and single-coated NMP (VT680) retained their original 45% and 75% strength, respectively. On the other hand, the dyes inside the double coated NMP maintained the same intensity without any change. The photo-decolorization results of the single and dual treated shells show that the oxygen molecules on the aqueous solution can penetrate the 3 nm silica shell and affect the photo-stability of the dye molecules. To demonstrate the efficiency of light-stability in real situations, we used Her2 antibody conjugated NMP (VT680) for tumor targeting (BT474) and exposed to a powerful laser by CLSM (confocal laser scanning microscope) The change in intensity was monitored (Figure 3b). Fluorescence of cells injected with NMP (VT680) remained intact in the liquid phase experiment, but the fluorescence intensity of the cells injected with pure organic dye decreased significantly after 10 minutes of CLSM measurement.

바이오틴 또는 항체 접합 Biotin or antibody conjugation

특이성을 부여하기 위하여, Her2 수용체를 과발현하는 BT474 세포에 의해 선택적으로 인식될 수 있는 Her2 항체를 이용하여 표면을 변형하였다. 두 종류의 유기-실리콘 화합물인 Si-PEG(2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl]trimethoxysilane) 및 APS(3-aminopropyltriethyoxysilane)를 NMP(VT680)에 처리하여 Si-PEG에 의해 액상 완충액에서 우수한 친수성 및 용해성을 가지도록 하고, APS의 1차 아민을 통해 말단화에 적합하게 하였다. 본 발명자들은 테트라진 및 노보넨 분자의 작용기를 NMP(VT680)-PEG/NH2 및 항체로 변형하는 단순한 클릭 화학(click chemistry) 공정을 이용하여 Her2 항체에 고정된 NMP(VT680)-PEG/NH2를 제작하였다(SI, 도 6). BCA 분석(bicinchoninic acid protein assay kit; Pierce Biotechnology) 결과 NMP 당 항체의 숫자는 약 100개였다. 나아가, BT474 암세포에 대한 타겟팅의 검출 민감성을 DMR 기구를 이용하여 측정하였다(도 4)(10). ICP-AES를 이용하여 정량화한 세포 당 NMP의 숫자는 약 105개였다. 적정곡선을 통해 계산한 세포 완화도(cellular relaxivity)는 약 2.3×103 s-1[cell per microliter]-1였다. 검출 한도는 거의 수 개의 세포 수준(검출 부피에서 20개 세포 미만)이었으며, 이는 본 발명자들의 CLIO 나노입자에 관한 이전 연구에서 보여준 민감도를 크게 상회하는 것이다(11). 결론적으로, 이는 유기 염료 주입 NMP가 형광 이미징 뿐 아니라 자기 센싱에 매우 유용함을 보여주는 강력한 증거이다.
To impart specificity, the surface was modified using Her2 antibody, which could be selectively recognized by BT474 cells overexpressing the Her2 receptor. Two types of organosilicon compounds, Si-PEG (2- [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane) and APS (3-aminopropyltriethyoxysilane) were treated with NMP (VT680) to obtain excellent hydrophilicity and solubility And adapted for horsehairing via primary amines of APS. The inventors have tetrahydro particulates and a functional group of Novo norbornene molecule NMP (VT680) -PEG / NH 2 and an antibody to the chemical modification of a simple click (click chemistry) with using a step fixed to the Her2 antibody NMP (VT680) -PEG / NH 2 (SI, Fig. 6). The number of antibodies per NMP was about 100 in the bicinchoninic acid protein assay kit (Pierce Biotechnology). Further, the detection sensitivity of targeting to BT474 cancer cells was measured using a DMR instrument (Fig. 4) (10). The number of NMP per cell quantified using ICP-AES was about 10 5 . The cellular relaxivity calculated from the titration curve was about 2.3 × 10 3 s -1 [cell per microliter] -1 . The detection limit was at almost a few cell levels (less than 20 cells in the detection volume), significantly exceeding the sensitivity demonstrated in our previous work on CLIO nanoparticles (11). In conclusion, this is a strong evidence that organic dye-injected NMP is very useful for magnetic sensing as well as for fluorescence imaging.

FMT & MR 이미징FMT & MR Imaging

본 발명자들은 인 비보 마우스 모델에서 이러한 향상된 형광 및 자기 효율이 더 나은 암 영상화를 가능하게 한다는 사실을 증명하였다(도 4c). 10 mg[M]/kg NMP(VT680)-Her2Ab 용액을 마우스에 정맥주사한 후 FMT(fluorescence molecular tomography, Visen Medical) 및 7T MRI 기구를 이용하여 형광 및 MR(magnetic resonance) 이중 이미징을 실시하였다. NMP는 24시간 후에 간(liver)에서 강력한 흑 명암 신호(black contrast signal) 및 밝은 NIR 형광을 나타냈다. MRI 및 FMT를 이용하여 인 비보에서 시간에 따른 NMP의 순환을 모니터링한 결과, 마우스 간의 간세포(hepatocytes)에서 3시간 이내에 입자가 빠르게 축적되고 주입 24시간 후에 MRI 및 FMT 강도가 최대값이 됨을 확인하였다. MNP는 체내에서 점차 배출되었고, MRI 및 FMT을 이용한 동일위치분석(co-localization study)을 통해 2주 후엔 완전히 제거됨을 관찰하였다.
The inventors have demonstrated that this enhanced fluorescence and magnetic efficiency in the in vivo mouse model allows better imaging of the cancer (Figure 4c). Fluorescence and magnetic resonance (MRI) dual imaging were performed using fluorescence microscopy (MIM) and 7T MRI apparatus after intravenous injection of 10 mg [M] / kg NMP (VT680) -Her2 Ab solution . NMP showed a strong black contrast signal and bright NIR fluorescence in the liver 24 hours later. Monitoring of NMP circulation over time in in vivo using MRI and FMT showed that particles accumulate rapidly within 3 hours in mouse liver hepatocytes and that MRI and FMT intensity are maximal after 24 hours of injection . MNP was gradually released from the body and observed to be completely eliminated after two weeks through co-localization studies using MRI and FMT.

아비딘 적정Avidin titration

본 발명자들은 본 발명의 NMP 시스템에 대해 다른 생물학적 적용을 시도하였는데, 예를 들어 특이적 단백질에의 타겟팅 후 단백질 자기 센싱 분석이 그것이다(도 4b). 아비딘 분석(avidin assay)에서의 적정 결과로부터 아비딘의 양이 바이오틴-변형 NMP의 T 2 값 변화를 통하여 검출될 수 있음을 확인하였다. 실제로 MnFe2O4 및 CLIO 입자가 각각 25 및 2000 pM의 검출 한계를 가짐에 비해, NMP-바이오틴은 1.5 pM의 낮은 아비딘 농도에서도 매우 높은 검출 감도를 보여준다.
We have attempted other biological applications of the NMP system of the present invention, for example protein microsensivity analysis after targeting to specific proteins (FIG. 4b). From the titration results in the avidin assay, it was confirmed that the amount of avidin can be detected by changing the T 2 value of the biotin-modified NMP. Indeed, NMP-biotin exhibits very high detection sensitivity even at low avidin concentrations of 1.5 pM, whereas MnFe 2 O 4 and CLIO particles have detection limits of 25 and 2000 pM, respectively.

MTT 분석MTT analysis

또한 동일한 배양조건(농도, 시간 및 온도)에서의 NMP의 세포독성을 측정하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) 브로마이드 분석결과, 암세포나 섬유아세포에 대한 어떠한 급성 세포독성(acute cytotoxicity)도 보이지 않아 세포 생존성은 다량의 NMP(400 μg/mL) 하에서도 90%를 상회하였다. 상술한 인 비보 실험 데이터는 NMP가 생체적합성을 가진다는 사실 외에도, 인 비보 시스템에서 여하한 세포독성의 문제도 없이 순환 후 잘 배출됨을 보여준다. 따라서, 이들 NMP 시스템은 세포 추적, 전달 센싱 및 이미징 등과 같은 인 비보/비트로 생물학적 응용에 유용할 것이다.
The cytotoxicity of NMP at the same culture conditions (concentration, time and temperature) was also measured. As a result of analysis of MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium) bromide, no acute cytotoxicity to cancer cells or fibroblasts was observed, 400 μg / mL). In addition to the fact that NMP has biocompatibility , the above-mentioned in vivo test data show that the in vivo system is well discharged after circulation without any cytotoxic problems. Accordingly, these NMP system will be useful for in vivo / vitro biological applications such as cell tracking, passes the sensing and imaging.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

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12. EH Frederick, MR in mouse models of cardiac disease NMR in Biomedicine 20, 238-255 (2010)

Claims (10)

(a) 망간 함유 자기나노입자(Mn-Magnetic Nanoparticle: Mn-MNP) 멀티코어(multi-core); (b) 상기 멀티코어를 코팅하는 실리카 셸(silica shell); 및 (c) 상기 실리카 셸 표면에 컨쥬게이션된 항체를 포함하는 코어-셸 나노입자로서,
상기 실리카 셸의 두께는 9 nm이며,
상기 코어-셸 나노입자는 멀티코어로부터 상기 실리카 셸의 두께가 6 nm 일 때 유기 형광 염료가 코팅되고 이에 실리카가 추가적으로 코팅되어 상기 유기 형광 염료가 상기 실리카 셸 안쪽에 추가적으로 포함되며,
상기 컨쥬게이션은 상기 항체와 결합한 노보넨 화합물 및 상기 실리카 셸과 결합한 테트라진 화합물 간의 클릭 반응(click reaction)을 통해 하기 화학식 1로 표시되는 링커 화합물이 생성됨으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자:
화학식 1
Figure 112015105172657-pat00020

(a) Manganese-containing magnetic nanoparticles (Mn-MNP); multi-core; (b) a silica shell coating the multi-core; And (c) a core-shell nanoparticle comprising an antibody conjugated to the silica shell surface,
The thickness of the silica shell was 9 nm,
Wherein the core-shell nanoparticles are coated with an organic fluorescent dye when the thickness of the silica shell is 6 nm from the multicore, and silica is additionally coated so that the organic fluorescent dye is additionally contained inside the silica shell,
Wherein the conjugation is generated by a click reaction between a norbornene compound bonded to the antibody and a tetrazine compound bonded to the silica shell to form a linker compound represented by Formula 1 below: :
Formula 1
Figure 112015105172657-pat00020

 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 코어-셸 나노입자는 15-100 nm 의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자.
The core-shell nanoparticle of claim 1, wherein the core-shell nanoparticle has a size of 15-100 nm.
제 1 항에 있어서, 상기 Mn-MNP는 실리카 셸 내부에 나노입자 형태로 존재하며 30-150개의 Mn-MNP 나노입자가 멀티-코어를 형성하는 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자.
The core-shell nanoparticle of claim 1, wherein the Mn-MNP is present in the form of nanoparticles within the silica shell, and 30-150 Mn-MNP nanoparticles form a multi-core.
제 1 항에 있어서, 상기 Mn-MNP는 Mn과 Fe의 산화물인 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자.
The core-shell nanoparticle according to claim 1, wherein the Mn-MNP is an oxide of Mn and Fe.
제 1 항에 있어서, 상기 코어-셸 나노입자는 횡축 이완도(transverse relaxivity; R 2)가 400-550 s-1mM-1 인 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자.
The core-shell nanoparticle according to claim 1, wherein the core-shell nanoparticles have a transverse relaxivity ( R 2 ) of 400-550 s -1 mM -1 .
제 1 항에 있어서, 상기 노보넨 화합물은 (1S,2S,4S)-비사이클로[2.2.1]헵타-5-엔-2-일 아세트아마이드인 것을 특징으로 하는 코어-셸 나노입자.
The core-shell nanoparticle according to claim 1, wherein the norbornene compound is (1S, 2S, 4S) -bicyclo [2.2.1] hept-5-en-2-ylacetamide.
삭제delete 삭제delete
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