KR101615314B1 - 약재의 발효 추출물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 - Google Patents
약재의 발효 추출물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 약재 혼합물의 발효물을 포함하고, 상기 약재는 어성초를 포함하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 대한 것이다.
Description
본 발명은 약재의 발효 추출물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 대한 것이다.
모발은 머리보호, 외향에 대한 영향, 머리의 온도유지 등 인체에서 다양한 역할을 담당하고 있으며, 생명유지에 중요한 기관은 아니지만, 건강상태의 척도이자 외모를 결정짓는 신체의 중요한 일부분이다[1]. 탈모가 일련의 노화현상으로 인식되어왔으나, 최근 여러 유전적인 요인과 함께 스트레스, 서구화된 식습관, 영양불균형, 사회활동의 변화 등의 다양한 원인에 의해 탈모가 진행됨이 밝혀지고 있다.
모발은 두피 기저부에 있는 기질세포의 계속적인 증식으로 피부가 함입된 구조인 모낭에서 생성되고, 다양한 성장단계를 포함한 모발 주기를 가진다. 모발은 정상 모발의 90%를 차지하는 성장기(anagen, growing phase), 생장정지와 모근이 위축되는 퇴행기(catagen, transitional phase), 모구가 건조되고 곤봉모가 되는 휴지기(telogen, resting phase) 그리고 탈락기(exogen)의 4단계의 성장주기에 따라 성장과 탈모를 반복한다.
탈모의 원인은 유전적 요인과 스트레스 및 노화 등이 있는데, 그 대표적인 기전은 남성호르몬인 testosterone(T)이 5α-reductase(RD)에 의하여 dihydrotestosterone(DHT)으로 전환되어 두피의 모낭을 위축시켜 탈모를 유발하는 것이다. 나이가 들면 DHT가 증가되어 모낭세포의 단백질 합성이 지연되고 이로인해 휴지기 모낭의 비율이 증가되면서 탈모의 진행이 빠르게 진행된다고 볼 수 있다.
모발의 형성은 주기적으로 순환하는 패턴을 가진다. 즉, 정상모발의 90%를 차지하는 성장기(anagen, gowing phase), 생장정지와 모근이 위축되는 퇴행기(catagen, transitional phase), 모구가 건조되고 곤봉모가 되는 휴지기(telogen, resting phase), 그리고 탈락기(exogen) 등 4 단계의 모주기(hair cycle)을 거치면서 모발은 성장과 탈모를 거듭한다. 특히, 퇴행기동안 많은 모낭이 세포사(apoptosis)가 진행되어 휴지기에 들어가면서 모낭의 크기가 줄어들게 된다.
이러한 탈모증상의 치료제로는 미녹시딜(minoxidil) 도포제가 주로 사용되는데, 이는 경구 피나스테리드(finasteride) 제제와 함께 남성용 탈모증 주된 치료제로 사용되고 있다. 그러나 이들 약물은 장기간 사용하여야 하며 심혈관계장애, 피부자극, 성기능감소, 기형유발, 가려움증, 홍반, 표피박리, 건성피부염과 같은 부작용을 동반하기 때문에 최근에는 천연물에 대한 관심이 고조되고 있다.
그러므로 기존 제품의 이러한 단점을 보완하여 지속적인 사용에도 안전하고 효과가 있는 제품에 대한 요구에 대응하여 최근에는 전통적으로 탈모예방 및 발모에 효능이 있는 것으로 알려진 한방 처방 및 한약재를 비롯한 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
예컨대, 한국등록특허 10-1498201호에는 몽우리청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 또는 발모개선용 조성물이 기재되어 있으며, 한국등록특허 10-1484033 호는 또한 땅콩 껍질 추출물을 포함하는 탈모방지 또는 발모촉진용 조성물에 대한 것이다.
본 발명자들은 탈모 예방 및 발모 촉진 효과가 한층 더 뛰어난 천연 소재를 연구하던 중 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
약재 혼합물의 발효물을 포함하고, 상기 약재는 어성초를 포함하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은
약재 혼합물을 준비하는 단계;및 상기 약재 혼합물에 균을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 탈모 방지 및 발모 촉진 효능이 있다.
도 1은 발효 시간에 따른 복합 발효물의 성분 변화를 나타낸다.
도 2는 제모한 마우스에 시료들을 각각 도포한 후 시간에 따른 발모 효과를 보여준다.
도 3은 마우스 피부의 ALP 및 γ-GT 활성 변화를 나타낸다. 값들은 5마리 마우스들의 평균±표준편차를 나타낸다. 시험 물질들은 3주 간 C57BL/6 마우스들의 등에 적용되었다. 대조군: 식염수, S-1: 복합 추출물, S-2: 복합 발효물, 미녹시딜: 5% 미녹시딜.
서로 다른 윗첨자를 갖는 값들(a, b, c, d)는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 4는 복합 추출물 및 복합 발효물이 IGF-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다.
결과들은 평균±표준편차로 나타내었다(n = 5). 서로 다른 윗첨자를 갖는 값들은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 5는 복합 추출물 및 복합 발효물이 VEGF(vascular endothelial growth factor) A의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다. 결과들은 평균±표준편차로 나타내었다(n = 5). 서로 다른 윗첨자를 갖는 값들은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 6은 복합 추출물 및 복합 발효물이 TGF-β1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다. 결과들은 5마리 마우스들의 평균±표준편차를 나타낸다. 대조군: 식염수, S-1: 복합 추출물, S-2: 복합 발효물, 미녹시딜: 5% 미녹시딜.
도 2는 제모한 마우스에 시료들을 각각 도포한 후 시간에 따른 발모 효과를 보여준다.
도 3은 마우스 피부의 ALP 및 γ-GT 활성 변화를 나타낸다. 값들은 5마리 마우스들의 평균±표준편차를 나타낸다. 시험 물질들은 3주 간 C57BL/6 마우스들의 등에 적용되었다. 대조군: 식염수, S-1: 복합 추출물, S-2: 복합 발효물, 미녹시딜: 5% 미녹시딜.
서로 다른 윗첨자를 갖는 값들(a, b, c, d)는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 4는 복합 추출물 및 복합 발효물이 IGF-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다.
결과들은 평균±표준편차로 나타내었다(n = 5). 서로 다른 윗첨자를 갖는 값들은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 5는 복합 추출물 및 복합 발효물이 VEGF(vascular endothelial growth factor) A의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다. 결과들은 평균±표준편차로 나타내었다(n = 5). 서로 다른 윗첨자를 갖는 값들은 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
도 6은 복합 추출물 및 복합 발효물이 TGF-β1의 발현에 미치는 영향을 나타낸다. 상기 시험 결과는 실시간 PCR을 이용하여 얻어졌다. 결과들은 5마리 마우스들의 평균±표준편차를 나타낸다. 대조군: 식염수, S-1: 복합 추출물, S-2: 복합 발효물, 미녹시딜: 5% 미녹시딜.
본 발명은
약재 혼합물의 발효물을 포함하고,
상기 약재는 어성초를 포함하는, 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물에 대한 것이다.
또한 본 발명은
약재 혼합물을 준비하는 단계;및
상기 약재 혼합물에 균을 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는,
탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 제조 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
약재
본 발명의 약재는 어성초를 포함한다. 본 발명의 약재는 어성초 외 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초로부터 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약재는 어성초, 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초의 혼합물이다. 본 발명의 약재는 시중에 판매되는 약재를 구입하여 사용하여도 되고 직접 채취하거나 재배하여 이용하여도 된다.
약재 혼합물
본 발명의 약재 혼합물은 어성초를 포함한 복수 개의 약재들의 혼합물이다. 예컨대, 본 발명의 약재 혼합물은 어성초, 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초의 혼합물이다. 바람직하게는 본 발명의 약재 혼합물은 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함한다.
약재 혼합물의
발효물
본 발명의 약재 혼합물의 발효물은 약재 혼합물에 균주를 접종하여 발효시킨 후 이를 추출하여 제조한다. 이 때, 상기 약재 혼합물을 살균한 다음 살균된 약재 혼합물에 균주를 접종하는 것이 바람직하다. 이 때, 살균 전 또는 후에 약재 혼합물에 물을 첨가할 수 있다. 상기 물은 약재 혼합물의 중량의 5 배 내지 15배로 첨가할 수 있다.
상기 균주는 유산균인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스이고, 더더욱 바람직하게는 락토바실러스 속 균주들의 혼합물, 즉 복합 균주이다. 가장 바람직하게는 상기 균주는 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주들의 혼합물, 즉 복합균주이다.
상기 발효는 상기 약재 혼합물에 균주를 접종한 후 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효하여 수행한다. 발효 조건은 일반적인 조건이면 되고 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 추출은 약재 혼합물의 발효물에 열을 가하여 수행한다. 이 때, 약재 혼합물의 발효물의 수분 함량이 너무 낮은 경우에는 물을 추가하여 열수 추출할 수도 있다.
본 발명은 약재 혼합물을 단순 추출, 예컨대 단순히 열수 추출하지 않고, 약재 혼합물을 발효시킨 후 추출함으로써 부작용을 줄이고 탈모 방지 및 발모 촉진 효과를 증진시킨다.
탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물
본 발명의 조성물은 탈모 방지, 탈모 완화, 탈모 개선, 탈모 치료, 발모 촉진, 두피 혈행 개선, 두피 위생 상태 개선, 두피의 염증 완화, 두피의 피부 자극 완화, 피부 진정, 두피의 피지 분비 억제, 모발 밀도 증가 또는 모발 굵기 증가 효능을 갖는다.
본 발명의 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학적 조성물이다.
본 발명의 화장료 조성물은, 당업계의 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말, 샴푸 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 화장료 조성물은 모발, 두피에 사용하는 모든 형태의 화장료 조성물을 포함한다. 예컨대 본 발명의 화장료 조성물은 샴푸, 헤어 컨디셔너, 헤어젤, 헤어 로션, 헤어팩, 헤어 에센스, 헤어 영양제 등두발용 화장료의 형태가 될 수 있으며, 두피에 도포 또는 분무하는 현탁액, 스프레이, 유탁액 등 두피용 화장료의 형태가 될 수도 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 두피에 처리하는 단계를 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진을 위한 미용 방법을 제공하는데, 이때, 두피에 도포, 분무 등의 방법을 통하여 본 발명의 조성물을 두피에 처리할 수 있다. 이때, 본 발명의 조성물은 두피에 처리하는 구체적인 처리 방법 자체는 당업자가 적절히 선택할 수 있으며, 이를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물 100 중량부에 대하여 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 0.01 내지 99 중량부 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.02 내지 60 중량부 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 30 중량부 포함할 수 있다. 그러나 이는 투여자의 필요에 따라 증감할 수 있으며, 두피의 상태, 염증 유무, 탈모의 진행 정도 등 상황에 따라 적절히 증감할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하나, 바람직하게는 피부에 도포하여 경피 흡수용으로 투여한다. 본 발명의 약학적 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태 또는 피부 도포용 유액 등의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 또는 화장용으로 허용 가능한 통상의 담체를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 피부 상태, 연령 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 피부 1 cm2 당 0.01 μg 내지 200 μg, 바람직하게는 0.01 μg 내지 50 μg 의 용량으로 투여될 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 피부 건강 유지 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 투여의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 식품은 건강보조식품, 건강기능식품, 기능성 식품 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 첨가하는 것도 포함된다.
본 발명의 식품 조성물은, 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 그대로 유효 성분으로서 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.
상기 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.
약재 혼합물의 준비 단계
본 발명의 약재 혼합물의 준비 단계는 상기 약재 혼합물을 준비하여 발효시킬 수 있도록 하는 단계이다. 이 때, 물을 추가하거나 살균 처리를 추가로 할 수 있다.
약재 혼합물의 발효 단계
본 발명의 약재 혼합물의 발효 단계는 상기 약재 혼합물에 균주를 접종한 후 이를 발효시키는 단계이다.
본 발명의 탈모 방지 및 발모 촉진용 조성물의 제조 방법은 상기 발효 단계 이후 상기 발효물의 추출 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 추출 단계는 발효물을 열 추출 또는 열수 추출하여 수행할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<재료 및 방법>
재료
어성초, 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초는 경동시장(서울)에서 구입하여 냉장 보관하여 사용하였다.
복합균주는 락토바실러스 아디코필루스(Lactobacillus adicophilus) DDS-1, 락토바실러스 브레비스(Lb. brevis) KCTC 13094, 락토바실러스 플란타룸 서브에스피. 플란타룸(Lb. plantarum subsp. plantarum) KCTC3106을 각각 동량으로 액체 배지에서 배양하여 준비하고, 이하 본 발명의 실험에서 사용하였다.
복합 추출물의 제조
어성초, 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초를 각각 동량(중량 기준)으로 혼합하였다. 상기 혼합물과 물을 1 : 10의 중량비로 혼합한 후 95 내지 100 ℃에서 6시간 동안 열수 추출하였다. 그리고 열수 추출물을 여과포를 이용하여 여과하고, 상기 여과물을 진공회전 농축기를 사용하여 2배 농축하였다. 상기 농축물을 복합 추출물로서 하기 실험들에서 사용하였다.
복합
발효물의
제조
어성초, 상엽, 자초근, 상백피, 박하잎, 질경, 자소엽, 동백씨, 인삼씨, 녹차 및 감초를 각각 동량(중량 기준)으로 혼합하였다. 상기 혼합물과 물을 1 : 10의 중량비로 혼합한 후 autoclave(1.5 기압, 121℃, 15분)하여 살균하였다. 그리고 상기 살균된 혼합물에 복합균주(락토바실러스 아디코필루스 DDS-1, 락토바실러스 브레비스 KCTC 13094 및 락토바실러스 플란타룸 서브에스피. 플란타룸 KCTC3106)를 접종하고, 30 ℃에서 5일간 배양하여 발효물을 얻었다. 상기 발효물을 95 내지 100 ℃에서 6시간 동안 가열하여 추출하였다. 그리고 상기 추출물을 여과포를 이용하여 여과하고, 상기 여과물을 진공회전 농축기를 사용하여 2배 농축하였다. 상기 농축물을 복합 발효물로서 이용하였다.
마우스
6주령의 C57BL/6 수컷 마우스를 대한바이오링크에서 입수하였으며, 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 12시간 조명주기 조건하에서 사육하였다. 이 때, 식이와 식수는 자유롭게 섭취토록 하였으며 7일간의 적응기간 후 실험에 사용하였다. 시료를 도포하는 군별로 5마리씩 4군을 실험하였으며, 총 20마리의 실험동물을 사용하였다.
모든 동물실험은 고려대학교 동물실험윤리위원회의 연구윤리지침에 따라 진행하였다(KUIACUC-2014015-2).
발모 실험
펜토바비탈(50 mg/kg, 엔토발, 한림제약)을 복강 주사하여 마취시킨 다음 이발기를 이용하여 마우스의 등 부위 털을 제거하였다. 피부 속에 남아있는 모낭과 미세한 털을 제거하기 위하여 제모제(니크린, 일동제약)를 피부에 도포하여 5분간 방치한 후 제모주걱을 이용하였다. 제모된 C57BL/6 수컷 마우스는 미지근한 물로 피부에 남아있는 제모제를 씻어내고, 24시간 회복기를 거친 뒤 정상군(control), 실험군(S-1, S-2), 미녹시딜군(minoxidil)로 분리하여 각각의 약물을 매일 1회 제모된 등 부위에 마리당 200 μl씩 도포하였다. 정상군은 생리식염수를, 미녹시딜군은 추출용매에 용해한 5% 미녹시딜(minoxidil) 용액을, 시험군은 복합 추출물(S-1) 및 복합 발효물(S-2)을 도포하였다.
육안적 평가에의 한 발모 효과의 분석
실험시작 후 7, 14, 21일에 털이 자라는 상태를 확인하기 위하여 가볍게 마취한 후 디지털 카메라를 이용해 사진 촬영을 하였다. 털이 자란 상태를 육안으로 판단하여 점수화하고 군별로 비교하였다; 0% 내지 20% (0), 20% 내지 40% (1), 40% 내지 60% (2), 60% 내지 80% (3), 80% 내지 100% (4).
각 군별로 평균치를 산정하였다. 또한 실험 21일차에 마리당 10개씩 등 부위의 털을 뽑아 털 길이의 평균과 털 무게를 측정하였다.
피부조직의 효소활성도 측정
실험 3주차에 피부조직을 절취하여 빙냉 하에서 미세절편으로 만들었다. 상기 미세절편들 중 일정량을 칭량한 후, 피부조직의 4배량(중량 기준)의 인산완충용액(phosphate buffer solution, PBS)을 가하여 마쇄기(homogenizer)를 이용하여 균질액을 만들었다. 이 균질액을 원심분리기를 이용하여 4 ℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하였다. 그리고 원심 분리 후 상층액에 대하여 자동생화학 분석기(Konelab 20XT, Thermo, Finland)를 이용하여 Alkaline phosphatase(ALP) 및 γ-Glutamyl transpeptidase(γ-GT)를 분석하였다.
실시간 정량적 중합효소 연쇄반응을 이용한 분자생물학적 분석
모발성장인자로 알려진 IGF-1, VEGF와 모발성장억제 및 탈모 유발인자인 TGF-β1의 발현 정도를 알아보기 위하여 Ha 등의 방법으로 실시간 PCR(real time polymerase chain reaction [PCR])을 이용하여 분석하였다(Ha, W. H.; Park, D. H., Effect of seaweed extract on hair growth promotion in experimental study of C57BL/6 mice. Archives of Craniofacial Surgery 2013, 14, (1), 1-10). 분석조직으로부터 trizol(Takara Bio, Shiga, Japan)을 이용하여 RNA를 분리하고, iNtRON사의 RT premix kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 2 × SYBR Premix Ex Taq(Takara bio)을 사용하여 MJ mini thermal cycler system(Biorad, Hercules, CA, USA)으로 측정하였다. 시료는 95 ℃에서 30초간 반응 후 95 ℃에서 5초, 60 ℃에서 30초씩 40회 반응시켰다. 각 유전자의 상대적 정량을 위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH: internal 대조군)의 발현 정도를 이용하여 보정하였다.
통계처리
SPSS 18.0 for windows(SPSS Inc., USA) 통계프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였다. 각 그룹 간의 차이를 검정하기 위하여 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였다. 본 연구의 통계학적인 유의성 검증은 p<0.05로 하였다.
<실험예 1> 발효 시간에 따른 성분 변화 분석
상기 <복합 발효물의 제조>에서 제조한 복합 발효물에 대하여 발효 시간에 따른 성분 변화를 분석하였다.
그 결과, 5일째까지 균수가 지속적으로 증가를 하다가 그 이후에는 균의 증가량이 미미한 것으로 확인되었다. 총 당(Total sugar)의 함량은 발효가 진행될수록 감소하는 경향을 보였으며, 활성물질인 산성당(uronic acid), 폴리페놀들(polyphenols), 플라보노이드들(flavonoids)은 발효 5일까지 지속적으로 증가를 하다가 그 이후에 약간 증가하는 경향을 보였다. 활성물질의 변화는 균수의 증가량과 유사한 경향을 보였다. 발효과정중의 성분 변화를 측정한 결과 복합 발효물의 발효는 발효 5일째가 가장 적합한 것으로 판단 되었으므로 이하, 실험들은 상기 5일 동안 발효시킨 복합 발효물을 이용하여 수행하였다(도 1).
<실험예 2> 발효 여부에 따른 성분 변화 분석
복합 추출물 및 복합 발효물 간의 성분 차이를 분석하였다.
그 결과, 복합 추출물의 경우 총 당(total sugar) 함량이 235.6 mg/ml이었으나 복합 발효물의 경우 65.4 mg/ml로 나타나 발효에 의하여 총 당의 함량이 감소하는 것으로 나타났다. 한편, 식물 소재의 활성물질인 산성당(uronic acid), 폴리페놀들(polyphenols), 플라보노이드들(flavonoids)은 복합 발효물의 경우 각각 8.9 mg/ml, 648.7 μg/ml 및 203.3 μg/ml로 발효 전에 비하여 증가한 것으로 확인되었다. 이는 발효과정을 통해 식물 세포내에 함유되었던 활성물질들이 유리되어 나온 것으로 추측되었다(표 1).
<실험예 3> 발효 효과의 육안 평가
C57BL/6 마우스는 사람과 유사한 검은색의 체모를 가져 모발성장의 성장주기를 색으로 쉽게 판정할 수 있다는 장점을 가지고 있기 때문에 모발연구에서 가장 널리 사용되고 있는 모델이다. 6주령부터 모발 주기가 휴지기로 들어가는 유전적인 특성이 잘 알려져 있기 때문에 이 시기에 실험을 시작하면 많은 장점이 있다.
마우스를 제모한 후 본 발명의 복합 추출물 및 복합 발효물을 매일 도포하면서 털이 자라는 양상을 육안적으로 관찰하고, 디지털 카메라를 이용하여 기록하였다.
그 결과, 시료를 도포한지 1일에는 모든 군의 등쪽 피부색이 선홍빛을 띄고 있었으며, 시료 도포 7일째에도 모든 군에서의 발모현상을 관찰할 수 없었다. 그러나 시료 도포 14일째에서는 미녹시딜(minoxidil)군과 복합 발효물군(S-2)에서 제모되었던 전체 피부에서 발모가 시작되었으며, 복합 추출물을 도포한 실험군인 S-1군은 한마리는 확연히 발모되는 현상이 나타났으나 나머지 3마리는 피부색이 흑색을 띠었다. 반면 대조군은 일부 피부가 흑색을 띄었다. 시료 도포 14일째에는 군 간의 차이를 확인할 수 있었다. 21일째에는 미녹시딜군과 복합 발효물군(S-2)은 전체적으로 발모가 진행되었으며, 복합 추출물군(S-1)은 일부 쥐에서의 발모 현상이 나타났으나, 대조군에서는 발모 진행상황이 미미하였다(도 2).
털이 자란 상태를 육안적으로 판단하여 점수화하여 비교한 결과 실험군인 복합 추출물군(S-1), 복합 발효물군(S-2) 및 미녹시딜군은 모두 대조군보다 높은 발모상태를 보였다. 특히, 그 중에서도 복합 발효물을 도포한 S-2군과 미녹시딜 군이 가장 수치가 높았다(표 2).
각각의 값은 평균±표준편차를 나타낸다.(n = 5).
털 재성장 점수 인덱스(Hair regrowth scoring index): 0%-20% (0), 20%-40% (1), 40%-60% (2), 60%-80% (3), 80%-100% (4).
a)p<0.05, 대조군에 비하여 상당히 차이가 남
<실험예 3> 털 길이 및 털 무게 평가
상기 <실험예 2>의 마우스들의 제모한 등 부위 발모상태에서 털을 뽑아 털 길이와 털 무게를 측정하였다.
그 결과, 실험 4주차에서의 털 길이는 양성대조군인 미녹시딜군, 실험군인 S-1, S-2, 대조군 순으로 등 부위 털이 긴 것으로 관찰되었으며, 각 군간에 유의적인 차이를 보였다. 특히 육안관찰 시 차이가 없었던 S-2와 미녹시딜군은 유의적인 차이가 확인되었다.
털 무게에 있어서는 대조군과 실험군인 S-1은 S-2 및 미녹시딜군과는 달리 등의 전체적인 부위에서 발모가 이루어지지 않아, 털이 있는 부위의 털만을 대상으로 측정하였으므로, S-2 및 미녹시딜군과의 비교 시 의미가 없기는 하다. 그러나 그럼에도 불구하고, 대조군과 실험군인 S-1은 털이 있는 부위의 털만을 대상으로 측정하였으며, 이러한 털들도 S-2 및 미녹시딜군의 털들과는 현저한 차이를 보였다. 또한 S-2 및 미녹시딜 군 사이에서도 유의적인 차이를 확인할 수 있었다(p<0.05)(표 3).
각각의 값은 평균±표준편차를 나타낸다.(n = 5).
대조군: 식염수, S-1: 복합 추출물, S-2: 복합 발효물, 미녹시딜: 5% 미녹시딜
동일 열의 a, b는 ANOVA 및 Duncan's multiple range tests에서 상당히 차이가 나는 것이다(p<0.05).
<실험예 4> 피부조직의 효소활성도 변동
상기 <실험예 2>의 마우스들에 대하여 실험 3주차에 피부조직을 절취하고, 이를 이용하여 효소 활성도 변동을 평가하였다.
피부조직 내 ALP의 효소 활성도를 측정한 결과, 양성대조군인 미녹시딜군이 498.70 IU/mg으로 가장 높은 활성을 보였으며, 실험군 S-2은 453.50 IU/mg으로 역시 높은 활성을 보였다(도 3A). 미녹시딜군은 대조군에 비해 55.1%, S-1 및 S-2에 대하여는 각각 41.1%, 24.1%로 통계적으로 유의하게 ALP의 효소 활성도가 높았다(p<0.05).
한편, 피부조직 내 γ-GT 활성을 측정한 결과, 미녹시딜군(52.42 IU/mg)은 대조군(34.72 IU/mg)에 비해 약 51.0% 유의하게 높은 활성을 나타낸 반면 S-1(39.15 IU/mg)군에서는 유의성이 없었다. γ-GT 활성은 미녹시딜> S-2> S-1>대조군 순으로 높은 활성을 보였다(도 3B).
주로 혈관 신생에 관여하는 ALP는 진피 유두에 밀집된 모세혈관에 영양을 공급하여 발모작용을 원활하게 해주는 지표로서 ALP 측정으로 발모작용을 간접적으로 추측할 수 있으며, non-growth 부위에 비해 re-growth 부위에서 ALP 활성이 현저히 증가함이 보고되고 있다(Iida, M.; Ihara, S.; Matsuzaki, T., Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Development, growth & differentiation 2007, 49, (3), 185-195.). 본 실험의 피부조직 내 ALP의 효소 활성도 측정 결과에서 실험군의 경우 용량상관적인 유의한 증가가 관찰되고 있어 시험물질에 의한 ALP 증가가 발모효과에 영향을 주었을 것으로 판단되었다.
γ-GT는 글루타티온이나 트리펩타이드로부터 시스테인을 분리하여 케라틴 단백질을 합성하는 작용을 촉진하는 효소로서 발모주기의 성장기가 유도될 때 더 많이 발현되어 발모 표지 성분중 하나로 제시되고 있다(Hamada, K.; Suzuki, K., Evaluation of biochemical indices as a hair cycle marker in C3H mice. Experimental Animals 1996, 45, (3), 251-256.). 본 실험에서 피부조직 내 γ-GT 활성은 실험군 S-1은 유의한 차이가 없었지만 S-2는 대조군과 비교시 유의적 증가를 보여 역시 복합 발효물이 발모 효과에 영향을 주었을 것으로 판단되었다.
<실험예 5> 복합 추출물 및 복합 발효물이 모발 성장 인자 관련 유전자 발현에 미치는 영향
모발 성장은 성장의 핵심부인 진피유두에 생장을 촉진하고 이에 영향을 받은 진피유두 세포들이 모낭 상피세포에 성장인자 혹은 저해인자를 방출하여 성장과 퇴화 상태로 순환한다. 알려진 성장인자로는 insulin-like growth factor (IGF)-1, vascular endothelial growth factor (VEGF)들이 있다. 본 실험에서는 복합 추출물(S-1)과 복합 발효물(S-2)에 의한 IGF-1과 VEGF 발현 변화를 시료 적용 21일째에 관찰하였다.
<5-1> IGF-1의 발현 평가
Insulin-like growth factor (IGF)-1은 in vitro에서 배양된 모낭 및 상피세포의 성장을 촉진하며 모발 세포의 세포사를 방지하며 모발 성장을 촉진한다고 알려져 있다. 또한 IGF transgenic 동물에서 모발의 성장이 유의성 있게 증가한다는 보고가 있다(Tang, L.; Bernardo, O.; Bolduc, C.; Lui, H.; Madani, S.; Shapiro, J., The expression of insulin-like growth factor 1 in follicular dermal papillae correlates with therapeutic efficacy of finasteride in androgenetic alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology 2003, 49, (2), 229-23). 복합 추출물 또는 복합 발효물에 의해 촉진된 모발의 성장이 IGF-1 와 관련이 있는지 확인하기 위해 시험물질 도포 개시 후 21일째에 채취한 조직을 사용하여 IGF-1의 발현을 확인하였다.
그 결과, IGF-1의 발현의 증가가 미녹시딜군과 S-2 군에서 뚜렷하게 나타났다. 미녹시딜에 의한 IGF-1의 발현은 정상군에 비해 3.73배 증가 하였고 복합 발효물을 처리한 군 S-2는 3.47배 증가하는 것으로 나타났다(도 4).
<5-2> VEGF의 발현 평가
VEGF는 혈관내피 성장인자(Vascular endothelial growth factor)로서 대표적인 성장인자 중 하나로 알려져 있다. 이는 혈관 내피를 성장시켜 혈액 순환을 개선하여 모발의 성장과 모근세포의 분화를 강화시키는 인자로 알려져 모발관련 연구에 사용되는 지표인자 중 하나이다(Li, L. F.; Guo, J.; Gao, Z. F., Overexpression of skin protein kinase C-alpha in anagen hair follicles during induced growth of mouse hair. Clinical and experimental dermatology 2003, 28, (4), 429-33.). 복합 추출물 및 복합 발효물의 발모 촉진 효과가 혈액순환과 관련이 있는지 확인하기 위해 시험물질 도포 개시 후 21일째 조직을 사용하여 VEGF의 발현을 확인하였다.
그 결과 S-2군에서 VEGF의 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었고, S-2군은 미녹시딜군보다 높은 수준의 VEGF 발현량을 보였으나 유의적인 차이는 없었다. 미녹시딜에 의한 VEGF의 발현은 정상군에 비해 2.3배 증가 하였고 S-2을 처리한 군은 3.3배 증가함을 보였다(도 5).
<5-3> TGF-β1의 발현 평가
TGF-β1는 성장기인 모발을 퇴행기로 진입하게 하여 성장을 저해하는 기전을 통해 탈모를 유발한다고 알려져 있다. TGF-β1은 모낭(hair follicle)의 발달(development) 및 성숙(maturation)을 방해하는 것으로 알려졌다(Tang, L.; Bernardo, O.; Bolduc, C.; Lui, H.; Madani, S.; Shapiro, J., The expression of insulin-like growth factor 1 in follicular dermal papillae correlates with therapeutic efficacy of finasteride in androgenetic alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology 2003, 49, (2), 229-233., Inui, S.; Fukuzato, Y.; Nakajima, T.; Yoshikawa, K.; Itami, S., Androgen-inducible TGF-β1 from balding dermal papilla cells inhibits epithelial cell growth: a clue to understand paradoxical effects of androgen on human hair growth. The FASEB journal 2002, 16, (14), 1967-1969.). 또한 TGF-β1는 모낭주기 중 퇴행기의 유도에 중요한 역할을 한다(Tsuji, Y.; Denda, S.; Soma, T.; Raftery, L.; Momoi, T.; Hibino, T., A potential suppressor of TGF-beta delays catagen progression in hair follicles. The journal of investigative dermatology. Symposium proceedings / the Society for Investigative Dermatology, Inc. [and] European Society for Dermatological Research 2003, 8, (1), 65-8.). 또한 TGF-β1는 모낭의 기질 내에 유도되어 기질세포의 apoptosis를 일으켜 성장기의 모낭을 퇴행기로 유발한다. 즉, TGF-β1의 양이 증가하면 털의 기질세포와 외모근초 세포들이 apoptosis를 유도하며 이로써 휴지기 모낭이 증가하며 성장기 모낭이 퇴행기 모낭으로 바뀌게 되고 모낭 재생이 불완전하여 재생된 모낭의 크기가 축소하여 쉽게 빠지며 가늘고 짧은 모발이 생성 된다(Lee, Y.-J.; Lee, J.-Y., Clinical analysis and treatments for androgenetic alopecia of men. Journal of Korean Society of Cosmetology 2007, 13, (2), 799-810.). 따라서 TGF-β1는 모낭의 성장을 억제하는 것으로 보고되고 있다.
본 실험에서는 본 발명의 복합 추출물 및 복합 발효물이 TGF-β1의 발현에 미치는 영향을 측정하였다.
그 결과, 복합 추출물 및 복합 발효물 투여군들은 각각 대조군 대비 10%정도 TGF-β1의 발현량이 증가하였으나 유의적인 차이는 없었다. 양성대조군인 미녹시딜 처리군에서는 대조군 대비 13%정도 TGF-β1의 발현량이 감소하였으나 유의적인 차이는 없었다. TGF-β1의 발현량은 대조군, 실험군과 양성대조군인 미녹시딜 처치군에서 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 6).
<5-4> 결론
상기 <5-1> 내지 <5-3>의 결과를 종합하여 보면, 육안으로 평가한 모발의 성장, 털의 밀도 및 굵기의 변화뿐 아니라 모발성장인자인 IGF-1와 VEGF의 발현을 포함한 모든 부분에서 실험군인 S-2군이 양성대조군인 미녹시딜군에 뒤지지 않는 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 분자생물학적인 분석 결과를 근거로 복합 추출물 및 복합 발효물의 기전을 유추해보면 IGF와 VEGF 등 성장인자들을 조절하여 모낭 및 주변 조직의 성장을 촉진하고 혈액순환을 개선하여 발모를 촉진하는 것으로 추측된다.
Claims (10)
- 약재 혼합물의 발효물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 화장료 조성물로,
상기 약재 혼합물은 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경이 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함하며,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하고 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효하여 제조하는 것인, 탈모 방지 및 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 균주를 접종하여 발효시킨 후 이를 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 화장료 조성물.
- 약재 혼합물의 발효물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 식품 조성물로,
상기 약재 혼합물은 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경이 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함하며,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하고 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효하여 제조하는 것인,
탈모 방지 및 발모 촉진용 식품 조성물.
- 제 4항에 있어서,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 균주를 접종하여 발효시킨 후 이를 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 식품 조성물.
- 삭제
- 약재 혼합물의 발효물을 포함하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약학적 조성물로,
상기 약재 혼합물은 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경이 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함하며,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하고 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효하여 제조하는 것인,
탈모 방지 및 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 제 7항에 있어서,
상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 균주를 접종하여 발효시킨 후 이를 추출하여 제조하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 및 발모 촉진용 약학적 조성물.
- 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경이 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함하는 약재 혼합물을 준비하는 단계;및
상기 약재 혼합물에 상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하고 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효시키는 단계를 포함하는,
탈모 방지 및 발모 촉진용 화장료 조성물의 제조 방법.
- 어성초 100 중량부에 대하여 상엽 50 내지 200 중량부, 자초근 50 내지 200 중량부, 상백피 50 내지 200 중량부, 박하잎 50 내지 200 중량부, 질경이 50 내지 200 중량부, 자소엽 50 내지 200 중량부, 동백씨 50 내지 200 중량부, 인삼씨 50 내지 200 중량부, 녹차 50 내지 200 중량부 및 감초 50 내지 200 중량부를 포함하는 약재 혼합물을 준비하는 단계;및
상기 약재 혼합물에 상기 약재 혼합물의 발효물은 상기 약재 혼합물에 락토바실러스 아디코필루스, 락토바실러스 브레비스 및 락토바실러스 플란타룸으로 구성되는 군으로부터 선택되는 균주를 접종하고 25 내지 35 ℃에서 2일 내지 10일 간 발효시키는 단계를 포함하는,
탈모 방지 및 발모 촉진용 식품 조성물의 제조 방법.
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