KR101610084B1 - 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 리신 변이체는 약학 조성물, 소독제, 항생제 및 항균제로 광범위하게 활용될 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체{Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or antibacterial activity}

본 발명은 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체, 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 제조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체, 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하여 병원성 세균을 방제하는 방법, 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 병원성 세균 방제용 조성물, 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물, 항생제 및 소독제에 관한 것이다.

박테리오파지 (bacteriophage)는 세균을 감염시켜 용균 (lysis)시키는 바이러스로 숙주에 침투하여 복제 과정을 통해 증폭한 후 숙주 세포벽을 분해하고 숙주 밖으로 나온다. 이를 위해 세포벽 분해 효소인 리신 (lysin)을 발현하는데, 이 리신 단백질은 세포벽의 경직성과 기계적 강도를 유지하는 펩티도글리칸 (peptidoglycan)을 분해하여 세포벽을 파괴하는 효소이다.

박테리오파지가 생산하는 리신 효소는 박테리아를 사멸시키는 효소 항생제 (enzybiotics)라고 불릴 정도로 우수한 항균력을 갖는다 (Wu et al ., 2012, BMC Microbiology 12: 54). 즉, 효소로 항생제 역할을 할 수 있다는 것이 강조된 것으로 기존의 항생제에 대한 내성 문제가 심각해지면서 항생제로 치료 불가능한 다제-내성 (multi-drug resistant) 병원균에 대하여 그 효용이 부각되고 있다 (Hermoso et al., 2007, Current Opinion in Microbiology 10:461-472).

물론 항생제에 의존하는 치료가 세균 감염 치료의 주류를 이루고 있다. 하지만 다제-내성 (multi-drug resistant) 병원균의 출몰이 빈번해지고, 기존의 모든 항생제에 내성이 생기도록 (pan-resistant) 조작된 박테리아의 제작마저 가능해지면서 바이오테러와 바이오전쟁 병원균의 위협이 현실로 다가오고 있다. 따라서 기존의 전통적인 항생제에 내성을 갖는 박테리아의 치료를 위한 새로운 개념의 항생제 개발이 필요하다. 또한 그러한 항생제의 타겟이나 치료 방법은 기존의 항생제와는 확실히 다른 것이라면 더욱 의미 있는 치료 효과를 기대할 수 있을 것이다.

바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)는 동물 및 사람에게 치명적인 탄저병을 일으키는 치명적인 병원균이다. 호흡기로 흡입했을 경우의 치사율은 거의 100%에 가까울 정도로 무서운 병원균이다. 바실러스 안트라시스 균은 잘 알려진 항생제 시프로플록사신 (ciprofloxacin) 같은 항생제로 치료 가능하지만, 체내에서 생산된 독소로 인해 그 후유증이 심각하다. 또한 자연적으로 또는 인위적으로 항생제 내성이 생긴 변이주들이 출몰하거나 제작될 가능성이 있어서 기존의 항생제가 무용지물이 될 가능성이 상존한다. 실제 구 소련에서 그러한 탄저 균주가 만들어진 적이 있다고 보고된 바 있다.

기존 항생제에 내성이 생긴 바실러스 안트라시스 균을 제어하는 방법 중 하나는 세균에 특이적인 파지 (phage)를 활용하거나 그 파지가 내는 용균 효소인 리신 (lysin)을 활용하는 것이다. 바실러스 안트라시스 세균-특이적인 용균 효소인 리신은 여러 종류가 알려져 있는데, 그 중에서도 PlyPH 리신이 활성이 높은 것으로 보고되었다 (Yoong et al ., 2006, Journal of Bacteriology 188:2711-2714). 용균효소인 리신은 앞에 기술한 것처럼 파지가 숙주 밖으로 나올 때 숙주의 세포벽을 분해하는 역할을 한다. 따라서 용균 효소의 활성에 의존하여 바실러스 안트라시스에 대한 항균력 차이가 발생하는 것은 당연할 것이다.

본 발명에서는 N-말단 촉매 도메인 (N-terminal catalytic domain) 및 C-말단 세포벽 결합 도메인 (C-terminal cell wall binding domain)으로 구성된 리신 PlyPH3을 개량하여 항균력이 개선된 리신 효소 변이체를 제공하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제0914163호에는 '황색포도상구균에 특이적인 포도비리대 박테리오파지 유래의 항균 단백질'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0988771호에는 '엔테로코쿠스 및 스트렙토코쿠스 특이적 사멸능을 갖는 신규한 리신 단백질'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 탄저균인 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)에 대한 항균 능력을 가진 PlyPH3 리신 효소 단백질 코딩 유전자를 변이시킨 후, 항균 및 용균 능력이 향상된 PlyPH3 리신 효소 변이체를 선발하였고, 선발한 PlyPH3 리신 효소 변이체의 염기서열을 결정하여 변이 아미노산 서열을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다.

본 발명에서는 탄저병을 일으키는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 및 식중독을 일으키는 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)에 대한 사멸능이 향상된 plyPH3 리신 변이체를 확인하였다. 본 발명의 리신 변이체는 약학 조성물, 소독제, 항생제 및 항균제로 광범위하게 활용될 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 박테리오파지에서 분리한 리신과 본 발명에서 제조한 리신 변이체의 용균 활성을 비교하기 위해 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 도말된 평판배지에 리신 또는 리신 변이체를 세포 표면에 발현하는 대장균을 접종하여 각 리신 변이체의 투명환 (halo) 역가를 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 PlyPH3 리신을 대장균의 표면에서 발현시키기 위해 사용한 빙핵활성 단백질 INP (ice-nucleation protein)를 포함하는 표면 발현 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 3은 빙핵활성 단백질 INP에 의한 PlyPH3의 세포 표면 발현 및 투명환 역가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 변이-유발 (error-prone) PCR에 의한 PlyPH3 라이브러리의 제조를 나타낸다.
도 5는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)에서 리신의 발현 및 투명환 역가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 확보된 PlyPH3 리신 변이체의 변이 위치를 확인하기 위해 PlyPH3과 78.0%의 상동성을 갖는 plyB의 촉매 도메인 (catalytic domain)의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 PlyPH3 리신 변이체의 변이 위치를 단백질 3차 구조상에서 나타낸 것이다.
도 8은 PlyPH3(4342PlypH)과 극히 유사한 PlyPH 및 AmpD 리신의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 66번째, 74번째, 81번째, 94번째, 112번째, 177번째, 193번째 또는 204번째 아미노산 중 어느 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 PlyPH3 리신 효소 변이체를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 리신 효소 변이체는 서열번호 1의 81번째 아미노산인 아스파르트산이 아스파라긴(N, Asparagine)으로 치환된 변이체(D81N), D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 아미노산인 이소루신(I, Isoleucine)이 루신(L, Lecine)으로, 193번째 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)이 아스파르트산으로 및 204번째 아미노산인 이소루신이 페닐알라닌(F, Phenylalanine)으로 치환된 변이체(D81N/I177L/E193D/I204F), D81N/I177L/E193D/I204F 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 112번째 아미노산인 아르기닌(R, Arginine)이 루신으로 치환된 변이체(D81N/R112L/I177L/E193D/I204F), 상기 D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 74번째 아미노산인 글루타민(Q, Glutamine)이 루신으로 치환된 변이체(Q74L/D81N), Q74L/D81N 변이체에 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 94번째 아미노산인 리신(K, Lysine)이 아르기닌으로 치환된 변이체(Q74L/D81N/K94R) 또는 66번째 아미노산인 이소루신이 발린(V, Valine)으로 치환된 변이체(I66V/Q74L/D81N)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 병원성 세균은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자는 D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N/K94R 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 I66V/Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

리신 효소 변이체를 코딩하는 합성 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로, 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 리신 효소 변이체 코딩 유전자는 D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자, Q74L/D81N/K94R 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자 또는 I66V/Q74L/D81N 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 리신 효소 변이체는 D81N, D81N/I177L/E193D/I204F, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F, Q74L/D81N, Q74L/D81N/K94R 또는 I66V/Q74L/D81N일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법을 제공한다.

본 발명의 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 방법은 리신 효소 변이체를 직접적으로 유해 세균에 처리하거나, 리신 효소 변이체를 표면에 발현하는 대장균을 유해 세균에 처리하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명의 상기 조성물은 유효성분으로 D81N, D81N/I177L/E193D/I204F, D81N/R112L/I177L/E193D/I204F, Q74L/D81N, Q74L/D81N/K94R 또는 I66V/Q74L/D81N 변이체를 함유하며, 상기 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리함으로써 병원성 세균을 방제할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명을 통하여 발굴된 각 변이 아미노산 잔기의 각각 또는 조합을 통하여 더 나은 역가를 갖는 변이체를 개발하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는, 본 발명의 리신 효소 변이체는 전술한 바와 같이 바실러스 안트라시스 및 바실러스 세레우스를 특이적으로 사멸시키므로, 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발되는 질환의 치료에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 바실러스 안트라시스에 의해 유발되는 대표 질환인 탄저병에 대한 치료에 이용될 수 있으며, 바실러스 세레우스에 의한 식중독의 치료에도 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 (i) 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발된 질환의 억제; 및 (ii) 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발된 질환의 경감을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다.

본 명세서에 있어서, 용어 '항생제'는 항균제, 살균제 및 방부제를 총칭한다.

본 발명의 항생제는 일차적으로 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질병에 대한 예방 및 치료제로 활용될 수 있다. 또한 기본 항생제에 대한 내성을 획득한 다재 내성 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의한 질환 치료에도 활용될 수 있다.

본 발명의 리신 변이체는 기존 항생제에 비하여 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 가지고 있다. 이는 유용한 다른 균은 죽이지 않고 병원균인 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스만을 선택적으로 죽일 수 있으므로 부작용이 상당히 감소된 항생제로서 매우 가치가 있다고 할 수 있다. 또한 본 발명의 리신 변이체를 항생 물질로 이용하게 되면 기존의 항생제를 이용하는 것과는 달리 병원균의 내성 내지 저항성(resistance)을 유도하지 않는 장점을 갖기 때문에 기존의 항생 물질에 비해 제품수명주기(life cycling)가 긴 신규 항생제로서 이용될 수 있다. 다시 말해, 대부분의 항생 물질들은 내성 증가에 직면함에 따라 갈수록 사용범위가 줄어들 수밖에 없는데 반해, 본 발명의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제는 내성 문제를 근본적으로 해결할 수 있기에 그만큼 항생제로서의 제품수명 주기가 길어질 것으로 기대된다. 따라서 병원성 세균인 바실러스 안트라시스를 특이적으로 사멸시키는 본 발명의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제는 항균 효과, 살균 효과 및 방부 효과가 뛰어난 항생제로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 상기 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제는 병원 2차 감염 예방, 식품위생, 및 축산업 분야에서의 소독제로 그 활용가치가 높다. 이 소독제는 식품산업에서 소독제 및 식품첨가제로 활용될 수 있으며, 조리 장소 및 조리 설비의 소독제로도 유용하게 사용될 수 있다. 특히 상기 리신 단백질은 병원 2차 감염 예방에 효과적이다. 즉, 병원 2차 감염의 예방이나 병원 2차 감염에 대한 치료 목적에 활용될 수 있다. 현재 병원 2차 감염은 매우 심각한 상황이며 병원 2차 감염 때문에 발생하는 미국의 일 년간 치료비용이 약 300억불에 달한다고 한다. 이는 병원 2차 감염의 심각성을 보여 준다 할 수 있다.

본 발명은 PlyPH3 유전자를 변이시킨 유전자 라이브러리를 대장균 표면에 발현하여 개량된 변이효소의 역가를 대상 병원체인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, ATCC 4342) 세포가 도말된 플레이트에서 그 투명환을 비교함으로써 손쉽게 선별하는 기술을 제공한다. 그리하여 각 실시예에 예시되는 바와 같이 다양한 아미노산 잔기가 변이된 변이체를 제공한다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 81번째 아미노산인 아스파르트산(D, Aspartic acid)이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체를 포함하여 각 실시예에 포함되는 각종 변이 아미노산 잔기를 제공한다. 여기서 발굴된 각 변이 아미노산 잔기들은 각각 또는 조합으로 리신 역가를 개선할 수 있는 정보를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 바실러스 안트라시스 ( Bacillus anthracis ) 유래 리신 ( PlyPH3 )의 빙핵활성단백질 INP ( ice - nucleation protein )에 의한 대장균 표면 발현

1. 표면 발현 벡터의 제작

미생물 표면에 효소를 발현시키면, 미생물 세포를 파쇄하지 않고 세포 표면에 발현된 효소의 역가를 확인할 수 있다. 특히 세포벽 분해 효소처럼 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 전세포나 세포벽 복합 폴리머 물질에 대하여 그 역가를 측정해야 할 경우에는 세포 표면에 있는 효소 역가를 직접 측정하는 것이 특별한 장점을 갖는다. 본 발명에서는 이를 위하여 빙핵활성단백질 INP (ice nucleation protein)에 리신 단백질을 융합 (fusion)하여(도 2) 발현시킴으로써 리신 효소를 대장균 세포 표면에 발현되도록 하였다 (US Patent App. 10/185,990, 2002).

리신 (PlyPH3) 유전자 합성 후 합성 유전자 PlyPH3 (synthetic PlyPH3)을 주형으로 사용하여 Xma PlyPH3-F 프라이머(5'-GGTTCCCGGGATGGGTTATATTGTAGATATT-3'; 서열번호 2) 및 Nhe PlyPH3-R 프라이머(5'-GTCGCTAGCTTATTTAACTTCATACCACCA-3'; 서열번호 3)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 제한 효소 NheI 및 XmaI을 처리한 pGF101 벡터와 pGFPlyPH3을 라이게이션 (ligation)하여 대장균 JM109에 형질전환하였다.

2. 리신의 발현 및 투명환 ( halo ) 확인

리신 발현 및 투명환 (halo)을 확인하기 위해, 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus) ATCC 4342 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트를 만들었다. 역가를 측정하기 위해서는 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis) 세균의 세포 또는 세포벽을 함유한 플레이트를 제조하여 투명환 역가를 확인하여야 한다. 그러나 탄저병의 원인균인 바실러스 안트라시스는 고위험 병원균으로 3등급의 생물학실험실에서만 다룰 수 있는 병원균이다. 그러므로 용균 효소 (리신) 개량을 위한 균주로 다른 병원균 (surrogate host)을 사용할 수밖에 없다. 본 발명에서는 일반적으로 바실러스 안트라시스를 대체하여 실험할 수 있다고 알려진 균주인 바실러스 세레우스 ATCC 4342를 사용하였다 (Yoong et al ., 2006, Journal of Bacteriology 188:2711-2714.)

먼저 바실러스 세레우스를 LB 고체 배지에서 37℃ 조건으로 밤새 배양한 후, 단일 콜로니 (colony)를 선발하여 LB 액체 배지에 접종하였다. 접종한 콜로니는 37℃ 및 200 rpm 조건으로 밤새 배양한 후, 1%의 배양액을 LB 액체 배지에 다시 접종하고 37℃ 및 200 rpm 조건으로 하룻밤 더 배양하였다. 배양액은 원심분리하여 상등액을 제거하고, 바실러스 세레우스 세포 침전물만 모아 새로운 LB 액체 배지가 들어있는 1 L 삼각 플라스크에 현탁하였다. 바실러스 세레우스가 포함된 LB 액체 배지에 1.5% 아가 (Agar powder)를 첨가하여 고온 (121℃) 살균하였다. 마지막으로 IPTG (isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside) 및 앰피실린 (ampicillin)을 첨가한 후 잘 혼합하여 사각 플레이트에 분주했다.

형질전환한 대장균 JM109-pGFPlyPH3을 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 발현을 확인하고 투명환으로 역가를 확인하였다(도 3).

실시예 2. PlyPH3 유전자의 변이-유발 ( error - prone ) PCR 및 변이 확인

리신 유전자의 변이를 유발하기 위해, PCR 무작위 돌연변이 키트 (Clontech, 미국)로 변이-유발 (Error-prone) PCR을 수행하였다. pGF-PlyPH3 플라스미드를 추출한 후, EPpGF102-F 프라이머 (5'-CAGAACGGGTGAGAACGGTGTTGA-3'; 서열번호 4) 및 EppGF102-R 프라이머 (5'-CCGCTTCTGCGTTCTGATTTAATCTGT-3'; 서열번호 5)를 이용하여 변이-유발 PCR을 수행하였다. 변이-유발 PCR 라이브러리 DNA 100 ng을 대장균 JM109에 형질전환하여 도말한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니를 모아 플라스미드 정제 키트를 이용하여 플라스미드를 추출하였다. 그 중 일부 플라스미드 20개를 모아서 염기서열을 결정하고 라이브러리 수율을 계산하였다. 그리고 일부 콜로니는 스탁 (stock)으로 만들어 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 3. 변이체 선발

변이-유발 PCR을 통해 확보된 형질전환체 대장균 JM109-pGFPlyPH3을 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 투명환 (halo)이 형성된 클론은 변이전의 대조 클론과 함께 사각 플레이트에 접종하였다.

1. 1차 선발

변이-유발 라이브러리들로부터 제조된 형질전환체에 의해 형성된 투명환의 크기를 비교하여, 리신 (lysin) 변이체 스크리닝을 수행하였다. 변이 라이브러리 DNA를 형질전환하여 확보한 약 60,000개의 클론 중 40~50%의 클론에서 투명환을 확인하였고, PlyPH3 대조구와 투명환을 비교하였다. 변이-유발 PCR(도 4)을 통해 확보한 리신 변이체 중에서 투명환 비교 및 활성 실험을 통해 변이체 6개를 선발하였고 (도 1 및 표 1), 그 중 역가가 가장 높은 클론으로 PlyPH3 38 (D81N)을 선발하였다.

선발된 PlyPH3 변이체들의 서열정보

	촉매 도메인 (1-190)	결합 도메인 (191-268)
PlyPH3-6	Q46P/ V122V	Q198L/T215A
PlyPH3-7	L40V/ N134D	Q196L
PlyPH3-38	D81N
PlyPH3-40	I14V/ Q46R/K71E/D97G/I100V	K201E
PlyPH3-43	F55V/ I100L/N134D/K136R/E187A	Q198R/S235P/T249S
PlyPH3-45	N52D/I107L	K255E

2. 2차 선발

리신 변이체 PlyPH3 38 (D81N)을 주형으로 이용하여 변이-유발 PCR을 수행하여 2차 라이브러리를 제작한 후 대장균 JM109에 형질전환하였다. 2차 형질전환체를 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)가 함유된 플레이트에 접종하여 추가로 리신 변이체 효소를 선발하였다. 라이브러리 콜로니 (library colony) 중 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에서 더 큰 투명환을 형성하는 클론을 선별하였다. 즉, PlyPH3 원효소와 PlyPH3 변이체를 다시 접종하여 형성된 투명환을 비교하였다. 2차 변이-유발 PCR을 통한 리신 라이브러리 선별 및 활성 실험을 수행한 결과, 변이체 PlyPH3 D81N/I177L/E193D/I204F, plyPH Q74L/D81N을 선발할 수 있었다.

3. 3차 선발

2차 선발에서 얻은 변이체 PlyPH3 D81N/I177L/E193D/I204F, PlyPH3 Q74L/D81N를 주형 (template)으로 하여 3차 변이-유발 PCR 라이브러리를 제작하였다. 3차 라이브러리 형질전환체도 바실러스 세레우스 세포 및 세포벽이 함유된 플레이트에 도말하여 투명환(halo)을 형성하는 콜로니를 선발하였다. PlyPH3 원효소와 선발한 PlyPH3 변이체를 함께 접종하여 투명환을 비교했으며, 투명환을 형성하는 약 100,000개 콜로니의 10~15%를 선발하였다. 최종적으로 선발한 36개의 변이체에 대해 염기서열을 분석한 결과, 서로 다른 3개의 변이체를 찾을 수 있었다.

실시예 4. 변이체의 염기서열 및 아미노산 잔기

변이-유발 PCR을 통해 선발한 리신 변이체들의 변이 아미노산 잔기를 정리하면 표 2와 같다.

PlyPH3 변이체의 변이 아미노산 잔기 정보

명칭	아미노산 변이 위치
PD84 vector control
PlyPH3 WT
PlyPH3 1차 선발	D81N
PlyPH3 2차 선발	D81N/I177L/E193D/I204F
	Q74L/D81N
PlyPH3 3차 선발	D81N/R112L/I177L/E193D/I204F
	Q74L/D81N/K94R
	I66V/Q74L/D81N

실시예 5. 바실러스 서브틸리스 ( Bacillus subtilis )에서 발현된 리신 변이체의 역가 비교

바실러스 발현 시스템에서 자가유도 발현 (autoinduction expression)으로 리신 변이체를 발현시킨 후 개량 역가를 확인하기 위하여 pGF101-PlyPH3을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. pD84 벡터와 pGF101-PlyPH3에 제한 효소 BamHI 및 BsiWI을 처리하여 대장균 DH5α에 형질전환한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 형성된 콜로니에서 플라스미드를 분리하여 바실러스 서브틸리스 DB 104에 형질전환하였다. 클로람페니콜 (chloramphenicol)이 포함된 바실러스 서브틸리스 포자 형성 배지 (sporulation media) 3 ㎖에 변이체 콜로니 6개를 각각 접종하여 37℃ 및 200 rpm 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 이어서 클로람페니콜이 포함된 DSM 액체 배지 300 ㎖에 1%의 배양액을 재접종하여 37℃ 및 200 rpm 조건으로 24시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포 침전물을 제외한 배지 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 50배 아세톤 (acetone)으로 농축한 후, 바실러스 세레우스가 함유된 DSM 플레이트에 동일한 양으로 각각 접종하였다. 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 투명환의 크기를 비교한 결과, 변이체들의 투명환이 더 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

실시예 6. PlyPH3 변이 아미노산 잔기의 위치

확보된 변이체의 변이 위치 (mutation sites) 및 변이 위치가 단백질 3차 구조상 어디에 위치하는지 확인하기 위해, PlyPH3과 78.0%의 상동성을 갖는 plyB (plyBcat; 2NW0)의 구조를 통해 살펴보았다. 그 결과 G2, F76, N78, D97, M126, N164, I177 및 T243 아미노산 잔기에서 하나 이상의 변이 잔기들이 확인되었다 (도 6 및 7). 또한 이와 유사한 염기서열이 확인된 PlyPH와 AmpD는 각각 2개 또는 1개의 아미노산 서열의 차이가 있는 것으로 확인되어(도 8), 본 발명에서 확인한 역가 개량을 가능하게 하는 변이 아미노산 잔기 도입시, 역가가 개량될 것으로 동 업계에 종사하는 과학기술자라면 충분히 예상할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology GENOFOCUS CO., LTD. <120> Lysin enzyme variant having improved bacteriolytic or antibacterial activity <130> PN13388 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 268 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1 Met Gly Tyr Ile Val Asp Ile Ser Lys Trp Asn Gly Asn Ile Asn Trp 1 5 10 15 Asp Val Ala Ala Pro Gln Leu Asp Phe Val Ile Ala Arg Val Gln Asp 20 25 30 Gly Ser Asn Tyr Ile Asp Pro Leu Tyr Lys Ser Tyr Val Gln Ala Met 35 40 45 Lys Thr Arg Asn Ile Pro Phe Gly Asn Tyr Ala Phe Cys Arg Phe Ile 50 55 60 Ser Ile Ala Asp Ala Lys Lys Glu Ala Gln Asp Phe Trp Asn Arg Gly 65 70 75 80 Asp Lys Ser Ala Thr Val Trp Val Ala Asp Val Glu Val Lys Thr Met 85 90 95 Asp Asp Met Ile Ala Gly Thr Gln Ala Phe Ile Asp Glu Leu Arg Arg 100 105 110 Leu Gly Ala Lys Lys Val Gly Leu Tyr Val Gly His His Met Tyr Gly 115 120 125 Pro Phe Gly Met Ala Asn Val Lys Ser Asp Phe Val Trp Ile Pro Arg 130 135 140 Tyr Gly Gly Asn Lys Pro Ala Tyr Pro Cys Asp Ile Trp Gln Tyr Thr 145 150 155 160 Glu Thr Gly Asn Val Pro Gly Ile Gly Lys Cys Asp Leu Asn Gln Leu 165 170 175 Ile Gly Asn Lys Pro Leu Ser Trp Phe Thr Glu Ser Val Pro Lys Gln 180 185 190 Glu Asn Ile Gln Ala Gln Val Ser Lys Gln Asn Ile Ile Gln Ser Gly 195 200 205 Ala Phe Ser Pro Tyr Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser 210 215 220 Leu Lys Met Thr Ala Thr Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Val Thr Glu Pro Thr Ser Asp Thr Gln Leu Asn Ala Leu Lys Ser 245 250 255 Trp Leu Asp Arg Lys Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys 260 265 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttcccggg atgggttata ttgtagatat t 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtcgctagct tatttaactt cataccacca 30 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagaacgggt gagaacggtg ttga 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ccgcttctgc gttctgattt aatctgt 27

Claims (18)

1. 삭제
2. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 81번째 아미노산인 아스파르트산(D, Aspartic acid)이 아스파라긴(N, Asparagine)으로 치환된 것(D81N)을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 용균 또는 항균 능력이 개선된 리신 효소 변이체.
3. 제2항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 177번째 아미노산인 이소루신(I, Isoleucine)이 루신(L, Lecine)으로, 193번째 아미노산인 글루탐산(E, Glutamic acid)이 아스파르트산으로 및 204번째 아미노산인 이소루신이 페닐알라닌(F, Phenylalanine)으로 치환된 것(D81N/I177L/E193D/I204F)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.
4. 제3항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 112번째 아미노산인 아르기닌(R, Arginine)이 루신으로 치환된 것(D81N/R112L/I177L/E193D/I204F)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.
5. 제2항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 74번째 아미노산인 글루타민(Q, Glutamine)이 루신으로 치환된 것(Q74L/D81N)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.
6. 제5항에 있어서, 상기 리신 효소 변이체는 추가로 서열번호 1의 아미노산 서열 중 94번째 아미노산인 리신(K, Lysine)이 아르기닌으로 치환된 것(Q74L/D81N/K94R) 또는 66번째 아미노산인 이소루신이 발린(V, Valine)으로 치환된 것(I66V/Q74L/D81N)을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.
7. 제2항에 있어서, 상기 병원성 세균은 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)인 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체.
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자.
9. 제8항의 리신 효소 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
11. 제9항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환하여 리신 효소 변이체 코딩 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 리신 효소 변이체의 생산 방법.
12. 제11항의 방법에 의해 생산된 리신 효소 변이체.
13. 제2항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 병원성 세균에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 병원성 세균의 방제 방법.
14. 제2항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 병원성 세균 방제용 조성물.
15. 제2항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 의해 유발되는 질환의 치료용 약학적 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 바실러스 안트라시스 또는 바실러스 세레우스에 의해 유발되는 질환은 탄저병 또는 식중독인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
17. 제2항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 항생제.
18. 제2항 내지 제7항, 제12항 중 어느 한 항의 리신 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 소독제.

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