KR101609923B1 - Transgenic dwarf plants - Google Patents
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Abstract
본 발명은 난쟁이 식물을 제조하기 위한 RNA 간섭 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 난쟁이 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터를 이용하면 물을 덜 소비하고 바람과 강우 피해에 강한 난쟁이 식물체를 제조할 수 있다. 이러한 난쟁이 식물체는 기후 변화에 강하고 꽃과 과일 생산에 에너지를 집중하여 생산성이 높다. 또한 키가 작고 꽃이 작아 화단용, 절화용, 조경용, 분화용으로 적합하다. The present invention relates to an RNA interference recombinant vector for producing dwarf plants and dwarf plants transformed therewith. The use of the RNA interference recombination vector of the present invention makes it possible to produce dwarf plants that consume less water and are resistant to wind and rainfall damage. These dwarf plants are strong against climate change and are highly productive by focusing energy on flower and fruit production. It is also suitable for flower beds, cut flowers, landscaping, and differentiation because of its small size and small flowers.
Description
본 발명은 난쟁이 식물을 제조하기 위한 RNA 간섭 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 난쟁이 식물체에 관한 것이다. The present invention relates to an RNA interference recombinant vector for producing dwarf plants and dwarf plants transformed therewith.
2008년 조사에 의하면 전세계 화훼산업 분야의 시장 규모는 연간 약 26조원 정도이며, 경제 발전에 따라 꾸준히 성장해 왔다. According to a 2008 survey, the market size of the flower industry in the world is about 26 trillion won per year, and has grown steadily with economic development.
화훼산업을 선도하는 네덜란드의 화훼 생산 규모는 연간 약 5조원에 달하여 전세계 화훼산업의 상당 부분을 차지하고 있다. 네덜란드의 수도 암스테르담 부근의 알스미어 화훼 경매장은 세계 최대 규모로서 하루에 세계 꽃 거래량의 80%인 2000만 송이의 꽃과 200만 개의 화분이 거래된다. 또한 네덜란드는 전 세계에서 수입한 꽃들을 개량하여 신품종을 개발하고 높은 로열티를 벌어들이는 것으로도 유명하다. The Netherlands, leading the flower industry, produces about 5 trillion won annually, which accounts for a large part of the world flower industry. The Alsmeer Flower Market in Amsterdam, the capital of the Netherlands, is the largest in the world, trading 20 million flowers and 2 million pots, 80% of the world's flower trade each day. The Netherlands is also renowned for developing new varieties of flowers imported from around the world and earning high royalties.
국내 화훼 시장 규모는 1988년 서울 올림픽을 계기로 1990년대 중반까지 연간 약 19~58% 씩 급성장하였고, 1997년 IMF로 인하여 잠시 주춤하였으나 그 후에도 꾸준히 성장하여 2008년에는 약 1조 105억원에 이르렀다. 화훼 농가의 수도 1980년 불과 2733호로 집계되었던 것이 2012년 기준 9450호로 집계되어 32년만에 약 5배로 증가하였다. 1991년에는 양재동에 2만 1000평 규모의 한국농수산식품유통공사 aT 화훼공판장이 문을 열었고, 그 외에 서울고속버스터미널 꽃 도매상가, 구파발 화훼 단지, 종묘 상가 등 곳곳에 화훼 단지가 조성되어 있다. 이와 같이 국내 화훼 산업이 외형상 크게 성장하였으나, 기후 변화로 인한 피해, 유가 상승으로 인한 생산 비용 증가, 및 해외에 지불하는 품종에 대한 로열티 증가 등으로 인하여 수익성이 떨어지는 실정이다. The size of the domestic flower market grew rapidly by 19 ~ 58% annually until the mid 1990s with the 1988 Seoul Olympic Games, and after a short lapse due to the IMF in 1997, it grew steadily afterwards, reaching about 1,010.5 billion won in 2008. The number of flower farmers was only 2,733 in 1980, and it was counted as 9450 in 2012, which is about five times in 32 years. In 1991, Daejeon-dong, Seoul, opened the doors of the 21,000-pyeong Korea Agricultural and Fisheries Food Distribution Corporation aT Flower Delegation. In addition, flower complexes have been established in various places such as Seoul Flower Express Bus Terminal Flower wholesaler, Kupahal flower garden and Jongmyo shopping street. Although the domestic flower industry has grown significantly outside of the country, profitability is deteriorating due to damage caused by climate change, increased production costs due to rising oil prices, and increased royalties for varieties paid overseas.
따라서 생산성이 높은 신품종의 개발이 시급한 상황인데, 이러한 상황에 대한 해법이 될 수 있는 것이 바로 난쟁이 식물의 개발이다. 난쟁이 식물은 정상 크기의 식물에 비해서 바람과 강우 피해 및 병해충에 대한 피해에도 더 강한 경향이 있다. 또한 물을 덜 소비할 뿐 아니라 줄기나 잎을 만드는 대신 종자나 과일을 만드는 데 더 많은 비율의 에너지를 투자하여 생산성이 높은 것으로 알려져 있다. 그리고 실내외 유휴 공간을 꾸밀 수 있는 관상 식물로서도 가치가 높다. Therefore, it is urgent to develop new varieties with high productivity. The development of dwarf plants is a solution to this situation. Dwarf plants tend to be more resistant to wind and rain damage and pest damage than normal size plants. It is also known to be more productive by not only consuming less water, but also by investing more energy in seeds and fruits to make stems and leaves. It is also valuable as an ornamental plant that can decorate indoor and outdoor spaces.
현재까지는 난쟁이 식물을 만들기 위해 주로 적심을 통해 줄기생장을 억제하거나 왜화제를 이용하는 방법이 이용되어 왔다. 이 중 왜화제를 이용하는 방법이 가장 용이하여 여러 작물에 적용되고 있으나, 왜화제로 널리 사용되는 트리아졸계 농약은 환경오염을 야기하고 식물 및 이를 섭취한 동물에게 생리장해를 유발할 위험이 있다는 단점이 있다. 따라서 환경오염이나 생리장해의 위험이 없는 식물의 왜화 방법의 개발이 필요하다. Until now, methods to inhibit stem growth or to use topical agents have been used to make dwarf plants mainly by wetting. Among these, the method of using a topical agent is most easily applied to various crops, but triazole-based pesticides widely used as a topic cause environmental pollution and a risk of causing a physiological disorder to a plant and an animal ingested . Therefore, it is necessary to develop a method of plant acclimation without any risk of environmental pollution or physiological disorder.
본 발명은 난쟁이 식물 제조를 위한 RNA 간섭 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용하여 난쟁이 식물을 제조하는 방법 및 형질전환된 난쟁이 식물을 제공함을 목적으로 한다. An object of the present invention is to provide an RNA interference recombination vector for producing dwarf plants, a method for producing dwarf plants using the recombinant vectors, and a transformed dwarf plant.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 서열을 포함하는 식물의 왜화 유도용 조성물을 제공한다. In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a composition for inducing dementia of a plant comprising the sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 서열의 전부 또는 일부의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 대한 안티센스 서열을 포함하는, 식물의 CPD(constitutive photomorphogenesis and dwarfism) 유전자에 대한 RNA 간섭 재조합 벡터를 제공한다.The invention of the plants, containing antisense sequence for all or part of the sense sequence and the sense sequence of the sequence described in SEQ ID NO: 1 CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarfism < / RTI > genes.
또한 본 발명은 서열번호 2의 센스 서열 및 서열번호 2에 대한 안티센스 서열을 포함하는, 식물의 CPD(constitutive photomorphogenesis and dwarfism) 유전자에 대한 RNA 간섭 재조합 벡터를 제공한다.In another aspect, the present invention of a plant, comprising the antisense sequence of the sense sequence and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2 CPD (constitutive 광형 and dwarfism < / RTI > genes.
본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터에서, 상기 센스 서열 및 안티센스 서열은 스페이서를 사이에 두고 서로 역방향이 되도록 배치되고, 상기 RNA 간섭 재조합 벡터는 선별마커, 프로모터, 및 터미네이터를 더 포함할 수 있다. 센스 서열과 안티센스 서열이 서로 역방향이 되도록 배치된다는 것은 센스 서열은 5'→3' 방향으로, 안티센스 서열은 3'→5' 방향으로 배치됨을 의미한다. In the RNA interference recombination vector of the present invention, the sense and antisense sequences are arranged to be opposite to each other with a spacer interposed therebetween, and the RNA interference recombination vector may further include a selectable marker, a promoter, and a terminator. The sense sequence and the antisense sequence are arranged to be opposite to each other, meaning that the sense sequence is arranged in the 5 '→ 3' direction and the antisense sequence is arranged in the 3 '→ 5' direction.
본 발명은 서열번호 2의 센스 서열, 서열번호 2에 대한 안티센스 서열, BAR 유전자 선별마커, CaMV35S 프로모터, CHSA 인트론, 및 옥토파인 신타제 터미네이터를 포함하고, 상기 서열번호 2의 센스 서열 및 안티센스 서열은 CHSA 인트론을 사이에 두고 서로 역방향이 되도록 배치된, 식물의 CPD(constitutive photomorphogenesis and dwarfism) 유전자에 대한 RNA 간섭 재조합 벡터를 제공한다.The present invention includes a sense sequence of SEQ ID NO: 2, an antisense sequence to SEQ ID NO: 2, a BAR gene selection marker, a CaMV35S promoter, a CHSA intron, and an octopine synthase terminator, and the sense and antisense sequences of SEQ ID NO: The plant's CPD ( constitutive photomorphogenesis < RTI ID = 0.0 & gt; and dwarfism < / RTI > genes.
상기 서열번호 1로 기재되는 서열은 본 발명자들이 에키네시아 퍼퓨레아(Echinacea purpurea)에서 분리하여 NCBI에 등록한 유전자로서(GeneBank accession number : KF170019), 23-알파-하이드록실라제 기능을 갖는다. 상기 유전자는 에키네시아 퍼퓨레아와 마찬가지로 국화과 초롱꽃목에 속하는 식물인 백일홍(Zinnia elegans)의 CPD 유전자(Genebank accession number AB231153)와 일부 상동성이 있는 것으로 확인되었다. 또한 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 cytochrome P450 90A1 유전자와도 관련성이 있는 것으로 확인되었다. The sequence described in SEQ ID NO: 1 has the function of 23-alpha-hydroxylase as GeneBank accession number: KF170019, which is a gene that the present inventors have registered in NCBI by isolating from Echinacea purpurea. This gene was confirmed to have some homology with the CPD gene (Genebank accession number AB231153) of Zinnia elegans, a plant belonging to the family Asteraceae, as well as Echinacea purpurea. It was also found to be associated with the cytochrome P450 90A1 gene of Arabidopsis thaliana.
CPD 유전자는 DWARF3, DWF3 등으로도 지칭되며, 본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터는 CPD 유전자의 발현을 억제하여 식물의 발달과 관련된 호르몬인 브라시노스테로이드의 생성을 억제함으로써 식물의 왜화를 유도한다. The CPD gene is also referred to as DWARF3, DWF3, etc., and the RNA interference recombination vector of the present invention inhibits the expression of CPD gene, thereby inducing plant dwarfing by inhibiting the production of brassinosteroid, a hormone related to plant development.
본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터는 서열번호 1로 기재되는 서열의 전부 또는 일부에 대한 센스 서열 및 상기 센스 서열에 대한 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열의 일부는 약 100 내지 약 500 bp 길이의 서열이 될 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 서열번호 1에 기재된 염기서열의 일부는 서열번호 2로 기재되는 서열이 될 수 있다. 상기 서열번호 2로 기재되는 서열은 서열번호 1로 기재되는 서열의 5′ 말단으로부터 1062 - 1473번째 염기에 해당하는 염기 부위(총 412 bp 길이)에 해당한다. The RNA interference recombinant vector of the present invention may comprise a sense sequence for all or part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 and an antisense sequence for the sense sequence. Preferably, a portion of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 may be a sequence of about 100 to about 500 bp in length. Most preferably, part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 may be the sequence of SEQ ID NO: 2. The sequence represented by SEQ ID NO: 2 corresponds to the base region corresponding to the 1062-1473th nucleotide from the 5'-end of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 (total length of 412 bp).
또한 형질전환되는 식물체 내에서 발현되어 CPD mRNA와 결합하여 CPD 유전자의 발현을 저해할 수 있는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 변이체는 서열번호 1 또는 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함하며, 서열번호 1 또는 2의 염기서열의 대립유전자형 또는 종간 변이체, 또는 이의 단편들을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Also included within the scope of the present invention are variants of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 that are expressed in the transformed plant and bind to CPD mRNA to inhibit the expression of the CPD gene. The mutant includes a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, respectively And includes allelic variants or interspecies variants of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or 2, or fragments thereof. "% Of sequence homology" for polynucleotides and polypeptides is identified by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, with the polynucleotide and portion of the polypeptide sequence in the comparison region being the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I.e., a gap) as compared to a standard (not including additions or deletions).
본 발명에서 '안티센스 서열'은 상기 센스 서열에 대한 상보적인 서열을 의미한다. 센스 서열과 안티센스 서열을 단일 사슬상에 배열함으로써 센스 서열과 안티센스 서열간에 수소결합에 의해 '스템-루프(stem-loop)' 구조가 형성되며 이중가닥 RNA(dsRNA)가 생성되는데, 이중가닥 RNA는 식물체내에 존재하는 다이서(dicer)라는 효소에 의해 절단되어 RNA 간섭 현상을 일으켜 식물체에서 CPD 유전자의 발현을 억제한다. In the present invention, 'antisense sequence' means a complementary sequence to the sense sequence. By arranging the sense and antisense sequences on a single chain, a 'stem-loop' structure is formed between the sense and antisense sequences by hydrogen bonding to produce double stranded RNA (dsRNA) It is cleaved by an enzyme called dicer existing in the plant to cause RNA interference phenomenon and suppress the expression of CPD gene in the plant.
본 발명에 있어서 '벡터'는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. In the present invention, 'vector' means a DNA fragment (s) or a nucleic acid molecule which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. "Expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism.
본 발명의 벡터는 식물에서 발현시키기 위한 식물 발현 벡터이며, 일 예로 Ti-플라스미드 벡터가 될 수 있다. 또한 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터 역시 될 수 있다. 바람직하게는 좌측 경계(LB)와 우측 경계(RB) 사이에, 제초제 저항성을 가지는 BAR 유전자, CaMV35S 프로모터, 옥토파인 신타제(OCS) 터미네이터 및 CHSA 인트론을 포함하는 pFGC954 벡터가 될 수 있다. 그러나 벡터의 종류는 이에 제한되지 않는다. The vector of the present invention is a plant expression vector for expression in plants, and may be, for example, a Ti-plasmid vector. It may also be a viral vector such as may be derived from a double-stranded plant virus (e. G., CaMV) and single-stranded virus, germinavirus, and the like, such as an incomplete plant viral vector. Preferably a pFGC954 vector comprising a BAR gene having herbicide resistance, a CaMV35S promoter, an octopine synthase (OCS) terminator and a CHSA intron, between the left border (LB) and the right border (RB). However, the types of vectors are not limited thereto.
본 발명의 재조합 벡터에서 '스페이서(spacer)'는 스페이서 양쪽에 각각 존재하는 센스 서열 및 안티센스 서열이 수소 결합을 할 수 있는 한 어느 염기서열이라도 될 수 있으며, 그 길이는 특별히 제한되지 않지만, 통상적으로 1~10,000 bp 길이이다. 본 발명에 있어서 스페이서는 바람직하게는 CHSA 유전자(penunia chalcone synthase A)로부터 얻은 1,352 bp 인트론 ('CHSA 인트론')을 사용할 수 있다. The 'spacer' in the recombinant vector of the present invention may be any base sequence as long as the sense and antisense sequences present on both sides of the spacer are capable of hydrogen bonding, and the length thereof is not particularly limited, It is between 1 and 10,000 bp in length. In the present invention, the spacer may preferably be a 1,352 bp intron ('CHSA intron') obtained from the CHSA gene (penunia chalcone synthase A).
본 발명의 재조합 벡터에서 '센스 서열-스페이서-안티센스 서열'은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 유전자 서열과 프로모터가 작동가능하게 연결되었다고 함은 프로모터 서열이 목적하는 유전자 서열의 전사를 지시할 수 있게 하는 방식으로 연결되었음을 의미한다. 본 발명에서 사용가능한 프로모터는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터로서, CaMV35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터 등이 있으며, 바람직하게는 CaMV35S 프로모터가 사용된다. In the recombinant vector of the present invention, the 'sense sequence-spacer-antisense sequence' is operably linked to a promoter. The fact that the gene sequence and the promoter are operatively linked means that the promoter sequence is linked in such a way as to direct the transcription of the desired gene sequence. Promoters that can be used in the present invention include promoters capable of initiating transcription in plant cells, such as CaMV35S, actin, ubiquitin, pEMU, and histone promoter, preferably the CaMV35S promoter.
본 발명의 재조합 벡터는 또한 형질전환이 일어났는지 여부를 확인할 수 있게 하는 '선별 마커'를 포함할 수 있다. '선별 마커'는 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자를 의미하며, 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열을 말한다. 선별 마커의 예로는 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있다. 바람직하게는 본 발명의 재조합 벡터에 포함될 수 있는 선별 마커로는 제초제 저항성 유전자인 바스타 저항성 (BAR) 유전자가 사용된다. BAR 유전자는 제초제인 바스타(glufosinate ammonium) 에 대한 저항성을 부여한다. The recombinant vector of the present invention may also comprise a " selectable marker " that allows identification of whether transformation has occurred. A "selectable marker" refers to any gene capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell, and is usually a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method. Examples of selectable markers include antibiotic resistance genes such as glyphosate, herbicide resistance genes such as phosphinotricin, kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol. Preferably, a herbicide resistance gene, Bastar resistance (BAR) gene, is used as a selection marker which can be contained in the recombinant vector of the present invention. The BAR gene confers resistance to the herbicide glufosinate ammonium.
또한 본 발명의 재조합 벡터는 전사를 종결시킬 수 있는 터미네이터를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 터미네이터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 터미네이터일 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으며, 바람직하게는 옥토파인 신타제(OCS) 터미네이터가 사용될 수 있다. The recombinant vector of the present invention may also comprise a terminator capable of terminating transcription. Terminators that can be used in the present invention may be terminators commonly used in the art, such as nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agrobacterium tumefaci The terminator of the Octopine gene of agrobacterium tumefaciens, the rrnB1 / B2 terminator of Escherichia coli, and the like, preferably an octopine synthase (OCS) terminator.
본 발명은 상기 RNA 간섭 재조합 벡터를 포함하는 식물의 왜화 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터에 의해 왜화가 유도된 식물은 초장(식물의 키)이 크게 감소하며, 또한 꽃의 크기가 감소하여 상품화 가치가 높은 꽃을 피우게 된다. The present invention provides a composition for inducing dementia of a plant comprising the RNA interference recombination vector. Plants induced by induction of the RNA interference recombination vector of the present invention have a greatly reduced plant height (plant height), and also have a reduced flower size, resulting in a flower having a high commercial value.
본 발명에 있어서, 상기 식물은 바람직하게는 국화과에 속하는 식물일 수 있으며, 예를 들어 백일홍, 에키네시아 퍼퓨레아, 코레옵시스(Coreopsis rosea), 달리아(Dahlia pinnata) 등이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 에키네시아 퍼퓨레아가 될 수 있다. 그러나 식물의 종류는 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 RNA 간섭 재조합벡터에 의해 CPD 유전자 발현이 저해되는 식물은 모두 포함된다. In the present invention, the plant may be preferably a plant belonging to the family Asteraceae, and may be, for example, Corynebacterium, Echinacea purpurea, Coreopsis rosea, Dahlia pinnata, Preferably Echinacea purpurea. However, the type of plant is not limited thereto, and all the plants in which expression of CPD gene is inhibited by the RNA interference recombinant vector of the present invention are all included.
상기 에키네시아 퍼퓨레아(Echinacea purpurea)는 초롱꽃목 국화과에 속하는 식물로서, 드린국화, 자주 루드베키아 등의 명칭으로도 불리며, 영어로는 coneflower라고도 종종 지칭된다. 에키네시아 퍼퓨레아는 그 초장이 1 ~ 1.7 m 내외로 키가 비교적 큰 초화류이며, 꽃이 아름다워 화단용 또는 절화용으로 이용되고 있고 국내외 수요가 점차 증가하는 추세에 있다. The above-mentioned Echinacea purpurea is a plant belonging to the family Asteraceae, and is also called a coneflower in English. Echinacea purpurea has a relatively long height of about 1 ~ 1.7m and its flowers are beautifully used for flower beds or cut flowers, and domestic and overseas demand is increasing.
본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터는 감염, 형질도입, 트랜스펙션, 전기천공 및 형질전환과 같은 주지된 기술을 이용하여 배양된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. The RNA interference recombinant vector of the present invention can be introduced into host cells cultured using well known techniques such as infection, transfection, transfection, electroporation and transformation.
본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터에 의한 식물체의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및/또는 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. Transformation of a plant with an RNA interference recombinant vector of the present invention can be carried out by any method of transferring DNA to a plant. Such transfection methods do not necessarily have regeneration and / or tissue culture periods. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants.
예를 들어, 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316 호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 DNA 전달 방법이 사용될 수 있다. For example, the calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373) (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), microinjection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. (Klein et al., 1987, Nature 327, 70), infiltration of plants or the transformation of Agrobacterium species by transformation of mature pollen or microparticles And infection by (non-integrative) viruses in Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer (EP 0 301 316). Preferably, an Agrobacterium-mediated DNA delivery method can be used.
아그로박테리움 벡터에 의한 식물체의 형질전환을 위한 최적 절차는 형질전환될 식물체의 종류에 따라 다양하다. 아그로박테리움 매개 형질전환을 위한 대표적인 방법은 멸균된 묘목 및/또는 작은 식물체로부터 유래된, 배축, 정단(shoot tip), 줄기 또는 잎 조직의 외식편의 형질전환을 포함한다. 그와 같은 형질전환된 식물체는 유성생식으로 또는 세포 또는 조직 배양에 의해 번식될 수 있다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 이전에 다수의 상이한 종류의 식물체를 위해 기재되었으며 그와 같은 형질전환을 위한 방법은 당업계에 공지된 문헌에서 찾을 수 있다.The optimal procedure for transformation of the plant by the Agrobacterium vector varies depending on the kind of plant to be transformed. Representative methods for Agrobacterium-mediated transformation include transformation of somites of dorsal, shoot tip, stem or leaf tissue derived from sterile seedlings and / or small plants. Such transformed plants can be propagated by ovarian reproduction or by cell or tissue culture. Agrobacterium-mediated transformation has previously been described for a number of different kinds of plants and methods for such transformation can be found in literature known in the art.
본 발명에서 사용가능한 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 균주라도 사용이 가능하다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 큰 것으로 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스, 더욱 바람직하게는, 하이그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자 pCAMBIA 1300 플라스미드가 들어 있는 GV3101 계통의 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용할 수 있다.As the Agrobacterium strain for plant transformation that can be used in the present invention, any strain commonly used can be used. Specifically, in the present invention, Agrobacterium tumefaciens, which is known to have high virulence necessary for penetrating plant samples and transferring foreign genes, more preferably GV3101 strain containing the hygromycin resistance gene pCAMBIA 1300 plasmid Of Agrobacterium tumefaciens can be used.
이에 본 발명은 본 발명은 상기 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 상기 미생물은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스, 보다 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 LBA4404 세포가 될 수 있다. 그러나 미생물의 종류는 이에 제한되지 않으며, 그 외의 박테리아, 예를 들면, 대장균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피무리움 역시 본 발명의 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 미생물에 해당한다. 한편 미생물에 대한 적당한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다. Accordingly, the present invention provides a microorganism transformed with said RNA interference recombinant vector. The microorganism may preferably be Agrobacterium tumefaciens, more preferably Agrobacterium tumefaciens LBA4404 cells. However, the type of the microorganism is not limited thereto, and other bacteria, such as E. coli, Streptomyces and Salmonella typhimurium, are also microorganisms that can be transformed into the RNA interference recombination vector of the present invention. On the other hand, suitable culture media and conditions for microorganisms are known in the art.
또한, 본 발명은 상기 RNA 재조합 벡터로 형질전환하는 것을 포함하는, 난쟁이 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 있어서 '난쟁이 식물체'는 왜화가 유도되어 초장이 감소하고 꽃의 크기 역시 감소된 식물을 의미한다. In addition, the present invention relates to a method for producing dwarf plants, which comprises transforming with said RNA recombinant vector. In the present invention, the term 'dwarf plant' refers to a plant which has been induced to induce an anomaly and whose plant height is decreased and flower size is also reduced.
본 발명은 상기 RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환된 난쟁이 식물체를 제공한다. 상기 식물은 바람직하게는 국화과에 속하는 식물일 수 있으며, 예를 들어 백일홍, 에키네시아 퍼퓨레아, 코레옵시스(Coreopsis rosea), 달리아(Dahlia pinnata) 등이 될 수 있고, 가장 바람직하게는 에키네시아 퍼퓨레아가 될 수 있다. 그러나 식물의 종류는 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 RNA 간섭 재조합벡터에 의해 CPD 유전자 발현이 저해되는 식물은 모두 포함된다. The present invention provides a dwarf plant transformed with the RNA interference recombinant vector. The plant may preferably be a plant belonging to the family Asteraceae, and may be, for example, Corynebacterium, Echinacea purpurea, Coreopsis rosea, Dahlia pinnata and the like, Can be perfused. However, the type of plant is not limited thereto, and all the plants in which expression of CPD gene is inhibited by the RNA interference recombinant vector of the present invention are all included.
또한 본 발명은 상기 RNA 간섭 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 난쟁이 식물체의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 1) 상기 RNA 간섭 재조합 벡터로 미생물, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시키고, 2) 상기 미생물을 식물체에 감염시키는 단계를 포함할 수 있다. The present invention also provides a method for producing dwarf plants, comprising transforming a plant with the RNA interference recombinant vector. The method may include 1) transforming the microorganism, preferably Agrobacterium tumefaciens, with the RNA interference recombinant vector, and 2) infecting the microorganism with the plant.
본 발명을 이용하면 물을 덜 소비하고 바람과 강우 피해에 강한 난쟁이 식물체를 제조할 수 있다. 이러한 난쟁이 식물체는 기후 변화에 강하고 꽃과 과일 생산에 에너지를 집중하여 생산성이 높다. 또한 키가 작고 꽃이 작아 화단용, 절화용, 조경용, 분화용으로 적합하다. The present invention makes it possible to produce dwarf plants that consume less water and are resistant to wind and rainfall damage. These dwarf plants are strong against climate change and are highly productive by focusing energy on flower and fruit production. It is also suitable for flower beds, cut flowers, landscaping, and differentiation because of its small size and small flowers.
도 1은 에키네시아 퍼퓨레아 CPD 유전자의 전체 염기서열(서열번호 1)을 나타낸 도이다.
도 2의 A는 본 발명의 pFGC5941/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터 구축에 사용된 에키네시아 퍼퓨레아 CPD 유전자의 5′ 말단으로부터 1062~1473번째 염기에 해당하는 염기 부위(총 412 bp 길이. 서열번호 2)를 나타낸 도이고, 도 2는 본 발명의 pFGC5941/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 야생형 에키네시아 퍼퓨레아(A)와 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체(B)의 초장을 비교한 도이다.
도 4는 야생형 에키네시아 퍼퓨레아(A)와 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체(B, C)의 꽃 크기를 비교한 도이다.
도 5는 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체에서 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터의 도입 유무를 확인하기 위한 genomic PCR 결과를 나타낸 도이다(WT는 야생형, Tg는 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체를 의미). BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the entire nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the Echinacea purpurea CPD gene. FIG.
FIG. 2 (A) shows the base region corresponding to nucleotides 1062 to 1473 from the 5 'end of the Echinacea purpurea CPD gene used for constructing the pFGC5941 / shEpCPD RNA interference recombination vector of the present invention (total length 412 bp, SEQ ID NO: 2 And Fig. 2 is a schematic diagram showing the structure of the pFGC5941 / shEpCPD RNA interference recombination vector of the present invention.
FIG. 3 is a chart comparing plant lengths of wild-type Echinacea purpurea (A) and Echinacea perpurea (B).
Figure 4 compares the flower sizes of wild-type Echinacea purpurea (A) and Echinacea purpurea transformants (B, C).
FIG. 5 shows the result of genomic PCR for confirming the introduction of pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombination vector in Echinacea purpurea transformant (WT is wild type and Tg is echinacea purpurea transformant ).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It will be apparent to those skilled in the art that these embodiments are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
실시예Example 1. One. RNARNA 간섭 재조합 벡터 제작 Interference recombination vector production
1-1. 1-1. 에키네시아Echinacea 퍼퓨레아Furfurea CPDCPD 유전자의 분리 Isolation of genes
23-알파-하이드록실라제 기능을 갖는 에키네시아 퍼퓨레아의 CPD 유전자를 확인하고 유전자 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록하였다(GeneBank accession number: KF170019). 상기 에키네시아 퍼퓨레아의 CPD 유전자는 서열번호 1로 기재하고, 도 1에 나타내었다. The CPD gene of Echinacea purpurea having 23-alpha-hydroxylase function was identified and the gene information was registered in NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (GeneBank accession number: KF170019). The CPD gene of Echinacea purpurea is shown in SEQ ID NO: 1 and shown in FIG.
1-2. 1-2. RNARNA 간섭 재조합 벡터 제작 Interference recombination vector production
서열번호 1의 에키네시아 퍼퓨레아 CPD 유전자의 5′ 말단으로부터 1062~1473번째 염기에 해당하는 염기 부위(총 412 bp 길이, 서열번호 2로 기재)에 대해 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 상기 염기 부위에 대한 센스(sense) 서열 및 안티센스 서열을 각각 증폭하였다. PCR was carried out using the primers shown in Table 1 for the base region (total 412 bp in length, represented by SEQ ID NO: 2) corresponding to nucleotides 1062 to 1473 from the 5'end of the Echinacea purpurea CPD gene of SEQ ID NO: To amplify the sense and antisense sequences for the base region, respectively.
각 프라이머는 제노텍(한국) 사에 의뢰하여 제작하였다. 상기 프라이머는 정방향은 AscI 및 SwaI의 제한효소 부위를 갖도록 하였고 역방향은 BamHI 및 XbaI의 제한효소 부위를 갖도록 디자인하였다. Each primer was made by Genotech (Korea). The primers were designed to have restriction sites of AscI and SwaI in the forward direction and restriction sites of BamHI and XbaI in the reverse direction.
PCR 조건은 전변성 94℃에서 5분, 변성 94℃에서 1분, 어닐링 55℃에서 1분, 신장 72℃에 서 1분, 확장 72℃에서 10분간 총 30회 수행하였다. The PCR conditions were 30 cycles of total denaturation at 94 ° C for 5 min, denaturation at 94 ° C for 1 min, annealing at 55 ° C for 1 min, extension at 72 ° C for 1 min and extension at 72 ° C for 10 min.
[표 1][Table 1]
상기 각 PCR 산물 3㎕, 2X 반응 버퍼 5㎕, pGEM-T 벡터(Promega, USA) 1㎕와 T4 DNA 라이게이즈(ligase)를 이용하여 25℃에서 2시간동안 라이게이션한 후, E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킨 다음, 이로부터 E. coli 플라스미드를 추출하였다(이하 서열번호 2에 대한 센스 서열이 삽입된 플라스미드를 pGEM-T-센스 CPD 벡터, 서열번호 2에 대한 안티센스 서열이 삽입된 플라스미드를 pGEM-T-안티센스 CPD 벡터로 지칭). Each PCR product was ligated with 3 μl of each PCR product, 5 μl of 2 × reaction buffer, 1 μl of pGEM-T vector (Promega, USA) and T4 DNA ligase at 25 ° C. for 2 hours, DH5a and heat shocked at 42 DEG C for 90 seconds. Then, the E. coli plasmid was extracted therefrom. (Hereinafter, the plasmid in which the sense sequence was inserted in SEQ ID NO: 2 was inserted into pGEM-T-sense CPD Vector, the plasmid into which the antisense sequence for SEQ ID NO: 2 is inserted, is referred to as pGEM-T-antisense CPD vector).
pGEM-T-센스 CPD 벡터를 AscI 및 SwaI로 절단하여 서열번호 2에 대한 센스 서열을 준비하는 한편, CaMV35S(Cauliflower mosaic virus 35S) 프로모터, CHSA(chalcone synthase A) 인트론, OCS(octopine synthase) 3′ 터미네이터(OCS 3')와 BAR(phosphinothricin acetyl transferase gene) 선별유전자를 지니는 RNA 간섭 백터인 pFGC5941 벡터 (식물 내 이중가닥 RNA 제조를 위한 이원 벡터 (http://www.chromdb.org/rnai/vector_info.html))를 AscI 및 SwaI로 절단하였다. 절단된 서열번호 2에 대한 센스 서열 유전자 5㎕, 절단된 pFGC5941 벡터 3㎕, 10X 반응버퍼 1㎕와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 25℃에서 2시간동안 라이게이션한 후(정방향), E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킨 다음, E. coli 플라스미드를 분리하였다. 분리된 서열번호 2에 대한 센스 서열이 삽입된 pFGC5941 벡터를 BamHI 및 XbaI로 절단하였다. 한편 pGEM-T-안티센스 CPD 벡터를 BamHI 및 XbaI로 절단하여 서열번호 2에 대한 안티센스 서열을 준비하였다. 상기 서열번호 2에 대한 안티센스 서열 유전자 5㎕, 상기 서열번호 2에 대한 센스 서열이 삽입되고 BamHI 및 XbaI로 절단된 pFGC5941 벡터 3㎕, 10X 반응버퍼 1㎕와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 25℃에서 2시간동안 라이게이션한 후(역방향), E. coli DH5a에 첨가하여 42℃에서 90초 동안 heat shock을 주는 방법으로 형질전환시킴으로써, E. coli 플라스미드 pFGC9541/shEpCPD 벡터 (도 2B)를 구축하였다. 2 was prepared by digesting the pGEM-T-sense CPD vector with AscI and SwaI to prepare a sense sequence for SEQ ID NO: 2, and a CaMV35S (
실시예Example 2. 아그로박테리움 2. Agrobacterium 투메파시엔스Tumefacians 형질전환 Transformation
상기 실시예 1에서 준비한 형질전환된 E. coli에서 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터를 추출하였다. In the transformed E. coli prepared in Example 1, pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombination vector was extracted.
아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 세포 200㎕에 상기 제작된 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터를 1㎕ (50ng/㎕이상)를 넣고 ice에 30분간 방치한 후 알코올로 소독된 큐벳에 넣고 미세-전기천공 챔버를 이용하여 2.4kV의 전류를 가한 후 ice로 옮겨주었다. 이렇게 전류를 준 아그로박테리움 용액에 LB배지 800㎕를 넣고 피펫을 이용하여 15ml 튜브로 옮겨서 25℃에서 4시간 동안 키운 뒤 50 μg/mL 카나마이신(kanamycin) 및 25 μg/mL 리팜피신(rifampicin) 항생제가 들어간 LB 고체 배지에 도말하여 25℃에서 2일간 배양하였다.Agrobacterium Tome Pacifico Enschede (Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404 cells were mixed with 200 μl of the above prepared pFGC9541 /
배양된 아그로박테리움 단일 콜로니를 액체 배양하여, 플라스미드 DNA를 추출하여 아그로박테리움이 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환되었는지 여부를 PCR 방법으로 확인하였다. PCR 조건은 전변성 94℃에서 5분, 변성 94℃ 30초, 어닐링 55℃ 30초, 신장 72℃ 30초, 확장 72℃에서 7분, 그리고 총 30싸이클을 수행하였다. The cultured Agrobacterium single colonies were liquid cultured, and the plasmid DNA was extracted to obtain Agrobacterium pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombination vector was confirmed by PCR method. The PCR conditions were 30 cycles of denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 30 seconds, extension at 72 ° C for 7 minutes and a total of 30 cycles.
실시예Example 3. 아그로박테리움을 이용한 3. Using Agrobacterium 에키네시아Echinacea 퍼퓨레아의Furfural 형질전환 Transformation
3-1. 3-1. 에키네시아Echinacea 퍼퓨레아Furfurea 배양 culture
에키네시아 퍼퓨레아의 종자를 야생화 종자 전문업체인 ㈜ 우리꽃 으로부터 구입하였다. 에키네시아 퍼퓨레아를 무균상태에서 기내 발아시키기 위해, 에키네시아 퍼퓨레아 종자의 외피를 제거하고 70% 에탄올 용액에 1분, 1% NaOCl 용액에 20분간 침지시킨 후 멸균수로 10회 세척하여 남은 NaOCl 잔여물을 제거하였고 E1 agar 배지 (100 mg/L myo-inositol, 2 mg/L glycine, 1.5% sucrose, 0.7% micro agar, 2 ml/L plant preservation mix., pH 5.8)에 파종하였다. 에키네시아 퍼퓨레아 종자는 16시간 명상태, 8시간 암상태, 24ㅀC 배양 조건에서 배양하였으며, 약 6주에서 8주 후 생성된 어린잎을 약 1 cm2 크기로 잘라 잎 절편체를 확보하였다. Echinacea purpurea seeds were purchased from Uri Flower Co., Ltd., a wildflower seed company. Echinacea purpurea For in-flight germination in aseptic conditions, Echinacea purpurea The seeds were removed, and the seeds were immersed in 70% ethanol for 1 minute and 1% NaOCl solution for 20 minutes. The remaining NaOCl residues were removed by washing with sterilized water 10 times. E1 agar medium (100 mg / L myo-inositol, 2 mg / L glycine, 1.5% sucrose, 0.7% micro agar, 2 ml / L plant preservation mix, pH 5.8). Echinacea purpurea The seeds were cultured under the condition of 16 hour light condition, 8 hour dark condition and 24 ㅀ C culture. The young leaves were cut to about 1 cm 2 after about 6 to 8 weeks to obtain leaf slices.
3-2. 3-2. 에키네시아Echinacea 퍼퓨레아의Furfural 형질전환 Transformation
상기 실시예 2에서 준비한 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터가 형질전환된 재조합 아그로박테리움 LBA4404 세포를 3% 수크로스(sucrose)가 함유된 MS (Murashige & Skoog medium) broth 배지를 이용해 OD600 0.6 - 0.8 값으로 희석하여 재조합 아그로박테리움 LBA4404 희석액을 준비하였다. 실시예 3-1에서 준비한 잎 절편체를 상기 희석액에 10분간 침지시킨 후, 여분의 희석액을 제거하고 E1 agar 배지에 치상하고 이틀 동안 암상태에서 배양하여 형질전환된 에키네시아 퍼퓨레아의 분화를 유도하였다.The pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombination vector prepared in Example 2 was transformed with the transformed recombinant Agrobacterium LBA4404 cells were diluted to an OD 600 of 0.6-0.8 using MS (Murashige & Skoog medium) broth medium containing 3% sucrose to obtain recombinant Agrobacterium A dilution of LBA4404 was prepared. After the leaf slice prepared in Example 3-1 was immersed in the diluted solution for 10 minutes, the extra dilution was removed, and the mixture was incubated in an E1 agar medium for 2 days to induce the differentiation of transformed Echinacea purpurea Respectively.
한편 상기 3-1에서 확보한 잎 절편체에서 상기 형질전환 과정을 거치지 않은 것을 야생형(wild type) 대조군으로 하였다. On the other hand, in the leaf section obtained in the above 3-1, the wild-type control group which did not undergo the transformation was used.
신초 형성을 위해 상기 각 잎 절편체를 0.6 mg/L PPT (phosphinothricin)를 포함하는 E8 agar 배지 (MS salts, 100 mg/L myo-inositol, 0.5 mg/L glycine, 2% sucrose, 0.7% microagar, BAP 1.0 mg/L, NAA 0.01 mg/L)에 치상한 후 16시간 명상태, 8시간 암상태, 24ㅀC 배양 조건에서 배양하였다. 4주에서 6주 후 생성된 신초에서 뿌리의 재분화를 유도하기 위해 WPM 배지 (2.5 g/L Woody Plant Medium, 1.5% sucrose, 1.5 mg/L IBA, 0.4% phytagal)에 치상한 후 16시간 명상태, 8시간 암상태, 24ㅀC 배양 조건에서 배양하여 뿌리의 발달을 유도하였고 약 2달 정도의 뿌리 생성 기간을 거친 후 토양에 옮겨심어 형질전환 식물체의 성장을 유도하였다.For the shoot formation, the leaf slices were inoculated onto E8 agar medium containing 0.6 mg / L phosphinothricin (MS salts, 100 mg / L myo-inositol, 0.5 mg / L glycine, 2% sucrose, 0.7% microagar, BAP 1.0 mg / L, NAA 0.01 mg / L) and cultured for 16 hours, 8 hours, and 24 hours. (2.5 g / L Woody Plant Medium, 1.5% sucrose, 1.5 mg / L IBA, 0.4% phytagal) to induce root regeneration in shoots produced after 4 to 6 weeks. , 8 hours dark and 24 ㅀ C cultivation conditions, and root development was induced. After about 2 months of root development period, the plants were transplanted to soil and induced transgenic plant growth.
실시예Example 4. 형질전환체의 표현형 확인 4. Identification of phenotype of transformant
상기 실시예 3에서 준비한 형질전환 식물체와 야생형(wild-type)의 표현형을 비교하여 도 3 및 도 4에 나타내었다. The phenotype of wild-type was compared with the transgenic plants prepared in Example 3, and the results are shown in FIG. 3 and FIG.
도 3에 나타난 바와 같이, pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 아그로박테리움 LBA4404로 형질전환된 에키네시아 퍼퓨레아(B)의 초장은 야생형(wild-type) 대조군(A)에 비해 크게 감소하였다. As shown in Fig. 3, the plant length of Echinacea perflarea (B) transformed with the recombinant Agrobacterium LBA4404 transformed with the pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombinant vector was higher than that of the wild-type control (A) Respectively.
또한 도 4에 나타난 바와 같이 형질전환된 에키네시아 퍼퓨레아(B, C)의 꽃 크기 역시 야생형(wild-type) 대조군(A)에 비해 감소하였다.Also, as shown in Fig. 4, the flower size of the transformed Echinacea purpurea (B, C) was also decreased compared with the wild-type control (A).
실시예Example 5. 형질전환체에서 재조합 벡터의 도입 확인 5. Confirmation of introduction of recombinant vector in transformant
에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체에 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터의 도입 유무를 하기의 방법으로 확인하였다.The introduction of the pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombinant vector into the eicinafia furfura transformants was confirmed by the following method.
에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체의 잎 1 g을 LN2와 혼합한 후 막자사발에서 파쇄하고 GenElute Plant Genomic DNA Prep Kit (Sigma)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 동일한 방법으로 야생형 에키네시아 퍼퓨레아의 genomic DNA도 추출하였다. 추출된 각 genomic DNA 500 ng과 pFGC9541/shEpCPD RNA 간섭 재조합 벡터의 CHSA 인트론에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 에키네시아 퍼퓨레아 자체에 존재하는 18S rRNA 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(하기 표 2 참조)를 이용하여 PCR을 수행하였다.1 g of Echinacea purpurea transformant leaves were mixed with LN 2 and then disrupted in a mortar and genomic DNA was extracted using GenElute Plant Genomic DNA Prep Kit (Sigma). Genomic DNA of wild-type Echinacea purpurea was also extracted in the same manner. A primer that specifically binds to the CHSA intron of 500 ng of each extracted genomic DNA and the pFGC9541 / shEpCPD RNA interference recombinant vector and a primer that specifically binds to the 18S rRNA gene existing in Echinacea purpurea itself (see Table 2 below) ) Was used for PCR.
PCR 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5의 상단에서 Tg로 표시한 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체에서는 CHSA 인트론 PCR 산물의 밴드가 확인되나, WT로 표시한 야생형 에키네시아 퍼퓨레아에서는 CHSA 인트론 PCR 산물의 밴드가 나타나지 않음을 확인하여, 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체에 pFGC9541/shEpCPD RNAi 벡터가 도입되었음을 확인하였다. 한편 도 5의 하단에서 에키네시아 퍼퓨레아 18S rRNA 유전자는 에키네시아 퍼퓨레아 형질전환체 및 야생형에서 모두 확인되었다. The PCR result is shown in Fig. 5, the band of the CHSA intron PCR product was confirmed in the Echinacea purpurea transformant represented by Tg, but the band of the CHSA intron PCR product was not observed in the wild-type Echinacea purpurea labeled with WT Thus, it was confirmed that the pFGC9541 / shEpCPD RNAi vector was introduced into the Echinacea purpurea transformant. On the other hand, the
[표 2][Table 2]
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that various modifications, additions and substitutions are possible, without departing from the scope and spirit of the invention as disclosed in the accompanying claims. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Transgenic dwarf plants <130> P14-035-KHU <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1561 <212> DNA <213> Echinacea purpurea steroid 23-alpha-hydroxylase (CPD) mRNA, complete cds. <400> 1 gaacctgcaa cacaccaacc aactgtgtgt gagagagaaa ctcaaacaac ctcatctcac 60 aacacaatca taacttcaaa accatacacc accccattac tcccaaactt aaatcaccca 120 cacccatgat taccataata ctctcccctc tctctcttat cctctcactt tttctctcta 180 caatcatctt cctccttttc cgcaccacca ccgccgcccg ccggaacctc cgtccaccac 240 cgggaaccac cggctttcct ctcatcggcg aaacattcca gctcatatct gcttacaaga 300 cggagaaccc ggaaccgttc attgacacac gcgtggccag atatgggacc gtttttacaa 360 cgcatgtgtt tggcgaacgg acggtttttt cggcggatgc gaagacgaac cggtttatat 420 tgcagaatga aggacggttg ttcgagtcga gttatccgag ttccattgcg aatctggttg 480 ggaaacactc gttgttgctc atgagaggta gtttgcatag gagaatgcat tccttgacga 540 tgagttttgc taattcgact attattaagg atcatttgct ggtggatatc gaccggttgg 600 ttcggttgaa tttggattcg tggaccggtc 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