KR101599281B1 - 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 비병원성인 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 백신의 면역원으로 사용함으로써 병원성 폐렴연쇄상구균 감염 및 이로 인한 질환에 대한 면역화를 유도할 수 있으므로, 상기 막소포체는 병원성 폐렴연쇄상구균의 감염을 예방 및 치료할 수 있는 비병원성의 무독성 백신으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균 백신 조성물{Streptococcus pneumoniae vaccine composition comprising membrane vesicles derived from Streptococcus pneumoniae}

본 발명은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비병원성인 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 백신접종하여 병원성인 협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 면역반응을 유도하는 백신 조성물에 관한 것이다.

외막소포체(Outer Membrane Vesicles, OMV)는 세균의 몇 가지 분비 기작 중의 하나로 외막이 부풀어 오른 다음 균에서 떨어져 나가 소포체를 형성하는 것이다. 그렇기 때문에 OMV는 외막이 존재하는 그람음성균에서 분비되는 것으로 알려져 왔다. OMV는 구형의 인지질 이중층으로 되어 있고, 그 크기가 20~200nm 이며 여러 가지 외막 단백질을 가지고 있다. 이러한 OMV는 세균 증식을 돕고, 숙주와의 정보 교환, 병원성 요인 및 유전 물질의 전달 등의 역할을 하며, 이와 같은 역할은 숙주세포의 병인에 중요한 요인이 된다고 알려져 있다. 게다가, 최근 대부분의 OMV는 숙주의 면역반응을 유도하는 것으로 밝혀지면서 백신 개발에도 활용될 가능성이 높은 것으로 보고되고 있다.

이러한 OMV는 그 동안 그람음성균에서만 생성되는 것으로 알려져 있었고, 그람양성균의 경우에는 세포 외막이 없고 세포막이 세포벽에 둘러싸여 있어 막소포체를 분비한다는 것이 알려진 바 없었으나, 최근 그람양성균인 포도상구균에서 OMV와 유사한 막소포체(Membrane Vesicles)가 발견됨으로써 그람양성균에서도 세포 밖으로 막소포체가 분비될 수 있다는 사실이 확인되고 있다.

나아가, 최근 막소포체는 차세대 비세포성비복제성 백신 후보물질 중의 하나로서 관심이 커지고 있다. 막소포체가 백신 후보물질로서 주목받는 이유는 바이오-나노 천연 입자이면서, 한꺼번에 여러 항원들을 동시에 전달할 수 있는 전달체로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 구형의 막소포체인 특성을 지녀 부가적 기능을 도입할 수 있는 기반이 되어 다기능성 백신 전달체로 개발될 수 있기 때문이다. 그러나 현재 뇌수막염균에서 자연생산된 것만이 임상시험 단계를 거치고 있고, OMV 또는 막소포체 백신은 아직까지 본격적으로 상용화되지는 못하고 있는 실정이다.

한편, 연쇄상구균(Streptococcus)은 사람의 구강과 호흡기도에 존재하는 이질적인 그람양성균이다. 이 중 주요 병원성균인 폐렴연쇄상구균(Streptococcus. pneumoniae)은 사람의 구강에 존재하는 상주균으로서 건강한 사람의 40~60%가 보균자인데, 보균자의 대다수는 병독성이 약한 종류의 균을 지니고 있고 보균상태도 영구적이 아니라 산발적이며 간헐적인 것이 특징이다. 이러한 페렴연쇄상구균은 호흡기를 통하거나 맥관 계통에 의해서 확산되며, 신체의 다른 부위로 이동하여 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증 등을 일으키는 것으로 알려져 있다(Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005). 2010년 통계청의 자료에 따르면, 폐렴으로 인한 사망률은 10만명 중 14.9명으로 전체 사망 원인 중 6위, 감염으로 인한 사망에 있어서는 1위를 차지하고 있어 폐렴연쇄상구균은 질병 및 사망의 주된 원인으로 여겨진다.

폐렴연쇄상구균 감염을 예방하기 위하여 현재 시판되고 있는 23가 다당류 백신은 협막 다당류(APS)를 유효 항원으로 하고 있으나 영유아에서는 항체 생성률이 낮아 효과가 없고 기억반응(memory response)이 없다는 단점이 있다. 이러한 23가 백신의 단점을 해결하기 위해 개발된 7가 콘쥬게이트 백신은 7종의 CPS를 담체 단백질에 컨쥬게이션(conjugation)하여 제조한 것이나, 고가이고 95개 이상의 폐렴연쇄상구균 중에서 단지 7가지 타입의 폐렴연쇄상구균에 대해서만 방어 효과가 있으므로 폐렴연쇄상구균 감염의 예방 백신으로서 사용이 매우 제한적이다. 따라서 폐렴연쇄상구균 감염을 예방 또는 치료하기 위하여 항원성이 높은 면역원을 포함하면서 신체에 도입시 안전성이 보장되는 비병원성 백신의 개발이 절실한 상황이다.

본 발명의 목적은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 포함하는 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래 막소포체(membrane vesicles)를 유효성분으로 포함하는 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 폐렴연쇄상구균 감염에 대하여 개체를 면역화하는 방법을 제공한다.

본 발명의 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체는 소낭 형태로 세포 밖으로 분비되는 비세포성 물질이고, 한꺼번에 여러 항원들을 동시에 전달할 수 있으며, 비병원성인 비협막성 폐렴연쇄상구균으로부터 유래된 것임에도 불구하고 비협막성균 뿐만 아니라 병원성인 협막성균에 대해서도 우수한 면역 백신 효과를 나타내므로, 상기 막소포체는 병원성 폐렴연쇄상구균이 감염되어 발생하는 질환을 예방 및 치료하기 위한 백신 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 Cryo-TEM으로 확인한 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 전자현미경 사진에 관한 그림으로서, 화살표는 막소포체를 나타낸 것이다.
도 2는 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 백신접종 모식도를 나타낸 그림이다.
도 3은 비협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 효과를 나타낸 그림이다:
대조군-1 그룹 : PBS 주사;
대조군-2 그룹 : 2주 간격으로 PBS 3회 주사 후 BAA-255 균주 주사;
막소포체 백신접종 그룹 : 2주 간격으로 BAA-255의 막소포체 3회 주사 후 BAA-255 균주 주사.
도 4는 협막성 폐렴연쇄상구균 균수에 따른 마우스 사망률을 나타낸 그림이다.
도 5는 협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 효과를 나타낸 그림이다:
대조군-1 그룹 : 2주 간격으로 PBS 3회 주사;
대조군-2 그룹 : 2주 간격으로 PBS 3회 주사 후 KCC-1941569 균주 주사;
막소포체 1회 백신접종 그룹 : 2주 간격으로 1회 BAA-255 막소포체 주사 후 KCC-1941569 균주 주사;
막소포체 2회 백신접종 그룹 : 2주 간격으로 2회 BAA-255 막소포체 주사 후 KCC-1941569 균주 주사;
막소포체 3회 백신접종 그룹 : 2주 간격으로 3회 BAA-255 막소포체 주사 후 KCC-1941569 균주 주사.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체는 체내 또는 주변 환경에 서식하는 폐렴연쇄상구균이 자연적 또는 인공적으로 분비하는 소포체를 의미하며, 세포밖 소포체(extracellular vesicles)와 상호 혼용 가능한 의미이다.

본 발명에서 일컫는 백신은 질병의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 조성물로서, 항원을 포함하거나 항원을 발현할 수 있으며, 이것에 의해 항원에 대한 면역 반응을 유도하여 면역성을 부여하는 물질을 의미한다.

본 발명에서 일컫는 백신접종(vaccination)은 백신의 접종에 의해 생물의 체내 또는 배양계에 능동적으로 면역(체액성 면역 또는 세포성 면역)을 만들게 하는 것을 의미한다. 이것에 의해 병원체의 감염, 증식, 전파 및/또는 유행 등을 저지할 수 있다. 또한, 병원체 감염 후 증상의 발증 및/또는 진전을 억제할 수 있다.

본 발명에서 일컫는 면역화는 항원에 노출시킨 후 면역을 유도하는 것을 의미한다.

아울러, 본 발명에서 일컫는 예방은 백신 조성물의 투여에 의해 병원체, 특히 폐렴연쇄상구균의 감염을 억제시키거나, 질병, 특히 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 발병을 지연시키는 것을 의미한다. 또한 본 발명에서 일컫는 치료는 백신 조성물의 투여에 의해 병원체, 특히 폐렴연쇄상구균 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물

본 발명의 일 측면은 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 유효성분으로 포함하는 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.

상기 예방은 백신 조성물의 투여에 의해 폐렴연쇄상구균 감염을 억제시키거나 발병을 지연시키는 것을 의미하고, 상기 치료는 백신 조성물의 투여에 의해 폐렴연쇄상구균 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

상기 막소포체는 비병원성 폐렴연쇄상구균 유래일 수 있고, 상기 비병원성 폐렴연쇄상구균은 비협막성 폐렴연쇄상구균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. 본 발명의 막소포체가 비병원성 균주로부터 유래한다는 것은 병원성이 없고 무독성인 백신 제조를 위해 바람직하다.

상기 막소포체는 폐렴연쇄상구균 세포 밖으로 분비되는 세포밖 소포체(extracellular vesicles)인 것이 바람직하고, 폐렴연쇄상구균 배양액으로 분비되는 것, 자연적으로 분비되는 것 또는 인공적으로 분비되는 것을 모두 포함한다.

본 발명의 백신 조성물에 포함되는 상기 막소포체는

1) 폐렴연쇄상구균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;

2) 상기 수득된 상등액을 1차 여과하여 불순물 및 세포를 제거하는 단계;

3) 상기 수득된 여과물을 300 kDa 내지 1000 kDa의 분자량 컷오프(cutoff), 바람직하게는 500 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 막으로 2차 여과하여 상기 컷오프값 이상의 분자량을 갖는 분획물을 수득하는 단계; 및

4) 상기 수득된 분획물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 분리 방법에 의해 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 분리 방법에 있어서, 단계 1)의 폐렴연쇄상구균은 비병원성인 비협막성 균인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 단계 3)의 2차 여과 후, 그 여과물을 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 단계 4) 이후에 수득된 침전물을 자당(sucrose) 농도구배식 초원심분리함으로써 침전된 막소포체를 보다 순수하게 분리하는 단계를 추가로 수행하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 최종적으로 수득된 침전물을 현탁하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 비병원성인 비협막성 폐렴연쇄상구균으로부터 막소포체를 분리하기 위하여, 비협막성 폐렴연쇄상구균 배양액을 8,000 rpm으로 원심분리하여 배지 성분만을 수득한 후, 이를 0.2 ㎛ 여과막으로 여과하여 배지에 남아있는 세포와 부유물을 제거하고 2차 여과를 통해 500 kDa 이상의 물질만을 수득하였다. 그런 다음, 얻어진 용액을 초고속 원심분리하여 침전된 막소포체를 회수하고, 섞여있는 단백질들을 제거하기 위하여 자당농도구배를 이용한 2차 초고속 원심분리를 실시함으로써 막소포체가 보다 순수하게 분리된 것을 확인하였다(도 1 참조).

상기 폐렴연쇄상구균 매개 질환은 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 폐렴연쇄상구균의 감염에 의해 발생하는 모든 질환을 예방 및 치료하기 위하여 본 발명의 백신 조성물의 접종이 가능하다. 폐렴연쇄상구균은 일반적으로 인간 비인강(nasopharynx)의 점막 표면을 콜로니화 하는 편리 공생체로서, 숙주가 생물체의 하기도 접근을 허용하는 경우, 왕성한 염증 반응이 일어나고 폐포 공간에 삼출물이 차면서 경화를 야기시킨다. 이러한 상태를 통상 폐렴이라 칭한다. 폐렴연쇄상구균 감염의 심각한 징후로서 패혈증, 수막염, 또는 패혈증과 수막염 모두에 의하여 악화될 수 있는 균혈증이 있으며, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염 또는 심내막염을 일으킬 수 있다(Suzuki et al., J Clin Microbiol, 43: 4528-4534, 2005). 본 발명의 백신 조성물은 면역반응을 효과적으로 유도시킬 수 있으면서도 향후 독성이 있는 균주로 전환되지 아니하므로, 사용상 위험성 없이 상기 폐렴연쇄상구균 매개 질환들에 대하여 적용 가능하다.

본 발명의 백신 조성물은 경구, 비경구 또는 국소 사용에 적합하게 만들어질 수 있고, 정제, 캡슐제, 좌약제, 용액, 현탁액 또는 임의의 다른 적합한 수단 또는 투약 형태로 개체에게 투여될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 또는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기의 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 주사제는 생리식염액 및 링겔액 등의 수성용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예를 들어, 올레인산에칠 등) 및 알코올류(예를 들어, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신 조성물의 유효성분인 상기 막소포체 내에 보충성 활성성분들이 혼입될 수 있고, 약독화 유도제와 함께 투여될 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 면역원성을 확인하고, 이의 접종에 의한 백신 효과를 검증하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로, 투여시 개체에 해가 없는 무독성의 안전한 백신을 제조하기 위하여, 비병원성인 비협막성 폐렴연쇄상구균으로부터 분리한 막소포체를 백신의 면역원으로 사용하였다(도 2 참조). 상기 막소포체를 백신 투여한 마우스에 비협막성 및 협막성 폐렴연쇄상구균을 각각 감염시킨 경우, 상기 막소포체를 1회 내지 3회에 걸쳐 백신접종함으로써 마우스의 생존률이 현저히 증가한 것으로 확인되었다(도 3 및 도 5 참조). 특히, 막소포체를 3회에 걸쳐 추가 접종한 경우 1회 또는 2회 접종한 경우보다 높은 마우스 생존율을 나타내어, 일정 간격으로 수회 재접종을 실시하는 것이 면역반응 상승효과를 유도할 수 있다는 것을 확인하였다(도 5 참조).

상기와 같이, 본 발명을 통해 비협막성 폐렴연쇄상구균에서 유래한 막소포체를 이용하여 비협막성 뿐만 아니라 협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 가능성을 확인하였다. 따라서, 비병원성 폐렴연쇄상구균으로부터 유래한 막소포체가 병원성균에 대해서도 백신 효과가 우수하므로, 상기 막소포체는 독성이 적고 백신 효과가 뛰어난 폐렴연쇄상구균 감염용 백신의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

2. 폐렴연쇄상구균 감염에 대하여 개체를 면역화하는 방법

본 발명의 다른 측면은 폐렴연쇄상구균 감염과 관련이 있거나 이의 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료하기 위한 면역화 방법을 제공하고, 면역화를 필요로 하는 개체에게 전술한 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

상기 백신 조성물에 관해서는 상기 "1. 폐렴연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae) 유래 막소포체(membrane vesicles)를 유효성분으로 포함하는 폐렴연쇄 상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물" 항목에서 설명한 바와 동일하다. 따라서 이에 관해서는 상기 "1. 폐렴연쇄상구균( Streptococcus pneumoniae ) 유래 막소포체( membrane vesicles )를 유효성분으로 포함하는 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물" 항목의 설명을 원용하여 상세한 설명은 생략하도록 하고, 상기 폐렴연쇄상구균 감염에 대하여 개체를 면역화하는 방법에 특이적인 구성에 대해서만 설명한다.

본 발명의 면역화 방법에 있어서, 상기 백신 조성물을 투여 가능한 개체는 폐렴연쇄상구균의 감염 대상이 될 수 있는 모든 척추동물이고, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으며, 구체적으로 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이, 침팬지 및 인간 등과 같은 개체가 포함될 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 인체 또는 수의용으로 제형화 되어 다양한 경로로 투여될 수 있다.

상기 '약제학적으로 유효한 양'은 백신 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 정확한 투여 농도는 개체의 나이, 체중, 건강, 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요인에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여 횟수는 일정 간격으로 1회 내지 수회 투여 가능하고, 1회 내지 3회 투여하는 것이 바람직하며, 3회 투여하는 것이 효과적인 면역화에 보다 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 경우에 따라서 적절한 횟수로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 또한, 다양한 연쇄상구균 타입에 대한 백신 칵테일의 일부로서 포함될 수도 있다.

본 발명의 백신 조성물은 비경구, 동맥내, 피내, 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구 및 비강내 중 하나의 경로로 투여될 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 적합한 경로에 의해 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체를 마우스 개체에 투여한 결과 비협막성 또는 협막성 폐렴연쇄상구균 감염에 의한 사망률이 현저히 감소하는 것으로 나타났으므로, 병원성 폐렴연쇄상구균 감염을 예방 및 치료하기 위한 면역화 방법에 있어서 상기 막소포체는 백신으로서 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 분리

<1-1> 폐렴연쇄상구균의 배양 및 회수

비협막성 폐렴연쇄상구균(BAA-255)을 4ℓ의 배양액(Thdd-Hewitt broth, BD, 미국)에 첨가하고 0.5% 효모추출물(THY)을 추가하여 고압멸균한 다음, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 흡광도(optical density) 0.9가 될 때까지 정체 배양하였다. 그런 다음, 배양한 균을 4℃에서 8,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상등액인 배지 성분과 세포를 분리하였다.

<1-2> 막소포체(Membrane Vesicles, MVs)의 분리 및 확인

상기 실시예 <1-1>에서 회수된 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 배지에 포함된 세포와 부유물을 제거한 다음, QUIXStand^TM system(GE, 미국)을 이용하여 500 kDa 이하의 물질들을 제거하고 500 kDa 이상만을 수득하여 이를 200 ㎖ 이하로 농축하였다. 이렇게 얻어진 용액을 초고속원심분리기를 사용하여 원심 분리한 다음 바닥에 가라앉은 막소포체를 회수하였다. 그런 다음, 회수한 막소포체에 섞여있는 단백질들을 제거하기 위하여 자당(sucrose)을 사용하여 농도 구배를 만든 후, 2차 초고속원심분리를 실시하여 순수한 막소포체를 회수하였다. 이와 같이 회수된 막소포체를 확인하기 위하여 전자현미경(Cryo-TEM)을 사용하여 분리된 막소포체를 육안으로 확인하였다.

그 결과, 폐렴연쇄상구균 배양물의 배지 성분으로부터 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체가 분리되었음을 확인하였다(도 1).

<실시예 2>

비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 백신접종( vaccination )

상기 실시예 1에 따라 비협막성 폐렴연쇄상구균으로부터 분리한 막소포체를 100㎕ 의 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 혼합하여 이 혼합액 200㎍ 을 8주령의 암컷 마우스(C57BL/6)에 복강주사하였다. 총 8개의 그룹으로 나누어 각 그룹별로 10마리의 마우스에 주사하였고, 이중 대조군(control) 그룹은 PBS를 주사하였다. 2주 간격으로 동량의 막소포체를 2회 더 주사하여 폐렴연쇄상구균의 막소포체에 대한 백신접종을 실시하였다(도 2).

< 실시예 3>

비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 비협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 효과 확인

상기 실시예 2에 따라 2주 간격으로 총 3회 막소포체를 접종한 마우스 그룹과 총 3회 PBS만을 주사한 대조군 마우스 두 그룹으로 나누어 비협막성 폐렴연쇄상구균에 의한 마우스 사망 정도를 확인하였다. 구체적으로, 각 그룹에 비협막성 폐렴연쇄상구균(BAA-255)을 1×10¹⁰의 수로 주사하여 1주일 동안 폐렴연쇄상구균에 의해 사망하는 마우스의 수를 확인하였다.

그 결과, 일단 PBS만 주사한 대조군 그룹은 생존에 아무런 영향이 없어 복강주사 자체에 의한 영향은 없는 것을 확인하였다. PBS만 주사한 뒤 비협막성 폐렴연쇄상구균을 감염시킨 대조군 그룹의 경우 하루만에 90%가 사망한 것으로 확인되었으나, 막소포체로 백신접종한 그룹의 경우에는 60%의 생존율을 나타냈다(도 3).

위와 같이, 본 발명의 백신 조성물은 비협막성 폐렴연쇄상구균에 대하여 우수한 면역 효과를 나타내는바 상기와 같은 비협막성 폐렴연쇄상구균에 의한 감염을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 4>

비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 효과 확인

<4-1> 협막성 폐렴연쇄상구균 감염시 균수에 따른 마우스 생존율 확인

병원성인 혐막성 폐렴연쇄상구균(KCC-1941569)의 균수에 따른 마우스 사망률을 확인하기 위하여, 8주령 마우스에 1×10², 1×10³ 및 1×10⁴의 균수로 각각 주사하였다. 1×10²개의 균수로 주사한 경우 생존율은 시간이 지날수록 낮아져 6일째 20%만 생존하였고, 1×10³ 또는 1×10⁴개의 균수로 주사한 경우에는 2.5일 만에 모든 마우스가 사망한 것으로 나타났다(도 4). 따라서, 백신접종의 효과를 확실하게 확인하기 위하여, 이하 협막성 폐렴연쇄상구균의 처리시 마우스 사망률이 가장 높게 나타난 1×10³개의 균수로 실험을 실시하였다.

<4-2> 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체의 백신 접종 횟수에 따른 협막성 폐렴연쇄상구균에 대한 백신 효과 확인

상기 실시예 2에 따라 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 막소포체로 백신접종을 실시한 마우스 그룹에 협막성 폐렴연쇄상구균을 1×10³의 수로 주사하여 각각의 마우스 사망 정도를 측정하였다.

그 결과, PBS만 주사한 그룹의 경우 3.5일이 지난 후에 100%가 사망하였고, 막소포체로 1차 또는 2차 백신접종한 그룹의 경우 20%의 생존율을 보였으며, 막소포체로 3차 백신접종한 그룹의 경우 40% 생존하는 것으로 나타났다(도 5).

위와 같이, 본 발명의 백신 조성물은 협막성 폐렴연쇄상구균에 대하여 우수한 면역 효과를 나타내는바 상기와 같은 협막성 폐렴연쇄상구균에 의한 감염 및 그에 의한 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

Claims (12)

1. 500 kDa 이상의 분자량을 갖는, 비협막성 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae) 유래 세포밖 소포체(extracellular vesicles)를 유효성분으로 포함하는 폐렴, 이하선염, 결막염, 복막염, 중이염, 심내막염 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 협막성 폐렴연쇄상구균 매개 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 폐렴연쇄상구균 세포 밖으로 분비되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 세포밖 소포체는
   1) 폐렴연쇄상구균 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
   2) 상기 수득된 상등액을 1차 여과하여 불순물 및 세포를 제거하는 단계;
   3) 상기 수득된 여과물을 300 kDa 내지 1000 kDa의 분자량 컷오프(cutoff)를 갖는 막으로 2차 여과하여 상기 컷오프값 이상의 분자량을 갖는 분획물을 수득하는 단계; 및
   4) 상기 수득된 분획물을 초원심분리하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
6. 청구항 5에 있어서, 상기 단계 4) 이후에 침전물을 자당농도구배식 초원심분리함으로써 침전된 세포밖 소포체를 순수 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
7. 청구항 5에 있어서, 상기 단계 3)의 분자량 컷오프가 500 kDa인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
8. 삭제
9. 청구항 1에 있어서, 상기 백신 조성물은 생리학적 담체 또는 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
   
10. 비협막성 폐렴연쇄상구균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 협막성 폐렴연쇄상구균 감염에 대하여 인간을 제외한 개체를 면역화하는 방법.
    
11. 청구항 10에 있어서, 상기 개체는 마우스, 랫트, 기니피그(guinea pig), 토끼, 닭, 돼지, 양, 염소, 개, 소, 원숭이 및 침팬지로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 청구항 10에 있어서, 상기 백신 조성물은 복강내, 피부내, 근육내, 정맥내, 피하, 점안, 비강내 및 경구 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 경로에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.

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