KR101596369B1 - Method for reforming the pancreatic islet using synthetic material with chitosan catechol - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갑각류에서 유래된 양전하를 갖는 다당류인 키토산과 카테콜 합성물질을 이용한 췌장소도 막의 표면 개질 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명의 표면 개질 방법에 의해 변형된 췌장소도는 기존의 클러스터 형태에서 단일 세포로 쉽게 부서지는 성질이 완화되고 혈액과의 초기 접촉시 나타나는 염증 매개 물질 활성화를 억제하여 혈액응고를 방지하여 이식 초기의 췌장소도 손실을 최소화할 수 있고, 또한 키토산이 결합된 췌장소도 막 표면에 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 가교제로 이용하여 다층성 표면개질을 추가적으로 도입하여 숙주 면역 반응을 최소화하고 이식된 췌장소도의 생존기간을 연장시킬 수 있다.
The present invention relates to a method for modifying the surface of a pancreatic islet membrane using chitosan and catechol synthetase, which are polysaccharides having a positive charge derived from crustacean, and more specifically, to a method for modifying a surface of a pancreas, , And it is possible to minimize the loss of pancreatic islet at the early stage of transplantation by inhibiting the blood coagulation by inhibiting the inflammatory mediator activation at the time of initial contact with the blood, By using a polymer such as polyethylene glycol as a crosslinking agent on the surface, multi-layer surface modification can be additionally introduced to minimize the host immune response and prolong the survival time of the transplanted pancreatic islets.
Description
본 발명은 카테콜(catechol)구조를 갖는 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid; HCA)을 키토산(Chitosan)에 아미드 결합(amide bond) 형성을 통하여 합성하고 도파(DOPA)가 가지고 있는 흡착력(adhesiveness)을 장점으로 하여 췌장소도 막 표면을 개질하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a process for synthesizing hydrocaffeic acid (HCA) having a catechol structure through the formation of an amide bond in chitosan and improving the adhesiveness of dopa (DOPA) To a method for modifying the surface of a pancreatic isostatic membrane.
전체 당뇨환자 중 5 - 10%가 1형 당뇨병에 해당되며 췌장에서 인슐린을 분비하는 베타세포가 파괴되어 인슐린이 절대적으로 부족하여 생기게 되는 질병으로서, 주로 소아나 청소년들에게 발병하는 특징이 있어 '소아당뇨', 또는 치료에 반드시 인슐린을 사용해야 하므로 '인슐린 의존성 당뇨병'이라고도 불린다. 제1형 당뇨병은 일종의 자가면역질환이기 때문에, 과학자들은 이를 억제하기 위해 면역체계를 조절하는 방법을 통해 제1형 당뇨병을 예방하는 기술을 연구 중에 있으며 현재 제1형 당뇨를 완치하는 방법은 없지만, 초기 진단이 이루어지면 식사의 변화와 혈당 관리 등으로 도움을 받을 수 있다. 5 to 10% of all diabetic patients are type 1 diabetes, and the insulin is deficient due to the destruction of beta cells that secrete insulin from the pancreas. This disease is predominantly found in children and adolescents, Diabetes', or 'insulin-dependent diabetes' because you must use insulin for treatment. Because type 1 diabetes is a kind of autoimmune disease, scientists are studying a technique to prevent type 1 diabetes by modulating the immune system to inhibit it, and currently there is no way to cure type 1 diabetes, Once the initial diagnosis is made, changes in diet and blood glucose management can be helpful.
제1형 당뇨병의 치료방법으로는 평생 동안 인슐린 호르몬을 투여하면서 혈당을 조절하거나, 췌장 이식을 할 수 있으며 이식을 하는 경우 당뇨병으로 인한 합병증의 발생을 억제할 수 있다. 그러나 마취 또는 수술의 위험도와 이식 수술 후 평생 동안 거부반응을 방지하기 위하여 면역억제제를 복용하여야 하는 점을 감안하여야 한다.
As a method of treating type 1 diabetes, insulin hormone can be administered to control blood sugar, pancreas transplantation, and the occurrence of complications due to diabetes in the case of transplantation. However, consideration should be given to the risk of anesthesia or surgery and the need to use immunosuppressive drugs to prevent rejection throughout life after transplantation.
현재까지 제 1형 당뇨병 환자들의 최선의 치료는 췌장소도세포의 이식이다. 췌장소도세포를 이식하는데 필요한 장기는 대부분 뇌사자의 췌장을 활용하는 방법이 보편화하여 있지만, 공급에 많은 어려움에 있는 것이 사실이다. 따라서, 이를 대체할 수 있는 동물로부터 얻은 거부반응이 적은 췌장소도세포이식 방법이 필요한 상항이다.Until now, the best treatment for type 1 diabetes patients is the transplantation of pancreatic islet cells. Most of the organs needed to transplant pancreatic islet cells are used in many ways, but the supply of pancreatic pancreas is a common problem. Therefore, a method of transplantation of pancreatic islet cells with less rejection from animals that can replace them is necessary.
제 1형 당뇨병의 치료를 위한 돼지 췌장소도 이식에 있어서 가장 큰 문제점은 돼지 췌장소도 분리 후 췌장소도 세포의 부서짐 현상이다. 돼지 췌장소도 세포는 다른 종의 췌장소도 세포와 달리 콜라겐(collagen) 층이 세포막 표면에 적게 분포되어 있어서 췌장소도 세포가 단단한 클러스터(cluster)를 형성하지 못하고 쉽게 부서지는 현상을 볼 수 있다. 이러한 쉽게 부서지는 현상을 극복하기 위한 방법이 필요한 상황이다.
The biggest problem in pig pancreatic islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes is the breakdown of pancreatic islet cells after the isolation of pig pancreatic islets. Unlike pancreatic islet cells of other species, the pancreatic islet cells are less distributed on the surface of the cell membrane so that the pancreatic islet cells can not form a hard cluster and can easily break down. This is a situation that needs to be overcome to easily break the phenomenon.
키토산(Chitosan)은 자연계로부터 풍부하게 얻어질 수 있으며, 상품으로 널리 공급될 수 있는 물질이다. 키토산은 자연계에 존재하는 아미노폴리사카라이드(amino polysaccharide)의 일종으로 게, 새우의 껍질과 오징어 뼈, 곰팡이, 버섯류 및 세균 등의 미생물의 세포벽에 함유되어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어지는 천연물질로 독성이 없고 생분해가 가능하여 생체친화성을 가지며, 세포의 결합 및 생체조직배양, 항균성, 지혈작용 등의 생체학적 특성과 콜레스테롤 저하작용, 장내대사작용, 면역증강에 의한 항암작용, 간기능 개선 및 혈당저하작용, 중금속 해독작용 등의 생리작용을 하는 것으로 알려져 있다.
Chitosan (Chitosan) can be obtained abundantly from nature and is widely available as a commodity. Chitosan is a kind of amino polysaccharide present in the natural world. It is a natural substance obtained by deacetylation of chitin contained in the cell walls of crabs, shrimp bark, squid bones, fungi, mushrooms and bacteria. It has biocompatibility without biodegradability. It has biocompatibility with cell biology, biochemical characteristics such as cell binding and biotissue culture, antibacterial and hemostatic action, cholesterol lowering action, intestinal metabolism, anti-cancer effect by immunity enhancement, Hypoglycemic effect, and heavy metal detoxification.
카테콜(catechol)은 클로로페놀(chlorophenol)의 알칼리성 수용액을 약 200℃로 가열하면 얻을 수 있는 사진 현상액의 주성분이고, 산화가 되기 쉬우며 피로카테콜, 브렌츠카테킨 또는 디히드록시벤젠이라고도 불리운다. 합성된 카테콜의 약 50%는 살충제 생산에 사용되며 나머지는 향수 및 약품과 같은 미세 화학품에 전구체로서 사용된다(Fiegel H et al., "Phenol Derivatives" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2002). 대다수의 산업적 향미 및 향기는 카테콜이 시작물질이다. 카테콜의 모노에틸에테르(monoethyl ether)된 구에톨(guethol)은 초콜렛류의 성분인 에틸바닐린(ethylvanillin)으로 전환된다.
Catechol is the main component of a photographic developing solution which can be obtained by heating an alkaline aqueous solution of chlorophenol to about 200 ° C, is easily oxidized, and is also called pyrocatechol, brent catechin or dihydroxybenzene. About 50% of the synthetic catechol is used for the production of insecticides and the remainder is used as a precursor in fine chemicals such as perfumes and medicines (Fiegel H et al ., " Phenol Derivatives "Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2002). The majority of industrial flavors and fragrances are catechol starting materials. Guethol, a monoethyl ether of catechol, is converted to ethyl vanillin, a component of the chocolate.
이에, 본 발명자들은 췌장소도 분리 후 췌장소도 세포의 부서짐 현상을 극복하기 위하여, 키토산에 췌장소도의 막 표면에 직접 접착성을 띠는 카테콜을 접합시켜 췌장소도 표면을 개질한 결과, 상기 방법은 췌장소도를 견고하게 지지하며 췌장소도의 형태(morphology) 유지기간을 유의적으로 연장시키는 것을 확인함으로써, 상기 키토산-카테콜 합성물질을 췌장소도 막의 표면 개질에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
Thus, in order to overcome the breakage of pancreatic islet cells after pancreatic islet separation, the present inventors modified the surface of the pancreatic islet surface by bonding catechol with direct adhesion to the membrane surface of pancreatic islets to chitosan, It has been confirmed that the chitosan-catechol synthesis material can be usefully used for the surface modification of the pancreatic isodactant membrane by firmly supporting the pancreatic islet and confirming that the morphology maintenance period of the pancreatic islet is significantly extended. Thereby completing the invention.
본 발명의 목적은 키토산(chitosan) 및 카테콜(catechol) 유도체, 또는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체를 췌장소도 세포에 결합시키는 단계를 포함하는 췌장소도 표면 개질 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method of treating cholestasis of a pancreatic islet surface, comprising the step of binding chitosan and catechol derivatives, or a complex of poly-L-lysine and catechol derivatives, And to provide a reforming method.
또한, 본 발명의 목적은 키토산 및 카테콜 유도체, 또는 폴리-L-라이신 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공하는 것이다.
It is also an object of the present invention to provide a surface modified pancreatic islet in which a complex of chitosan and a catechol derivative, or a poly-L-lysine and a catechol derivative, is bound to the surface of the pancreas.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키토산(chitosan) 및 카테콜(catechol) 유도체, 또는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체를 췌장소도 세포에 결합시키는 단계를 포함하는 췌장소도 표면 개질 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a chitosan, a catechol derivative, or a complex of poly-L-lysine and a catechol derivative, A method for modifying a surface of a pancreatic islet.
또한, 본 발명은 키토산 및 카테콜 유도체, 또는 폴리-L-라이신 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공한다.
The present invention also provides a surface modified pancreatic islet in which a complex of chitosan and a catechol derivative, or a poly-L-lysine and a catechol derivative, is bonded to the surface of the pancreas.
본 발명의 표면 개질 방법에 의해 변형된 췌장소도는 기존의 클러스터 형태에서 단일 세포로 쉽게 부서지는 성질이 완화되고 혈액과의 초기 접촉시 나타나는 염증 매개 물질 활성화를 억제하여 혈액응고를 방지하여 이식 초기의 췌장소도 손실을 최소화할 수 있다. 또한, 키토산이 결합된 췌장소도 막 표면에 폴리에틸렌글리콜과 같은 중합체를 가교제로 이용하여 다층성 표면개질을 추가적으로 도입하여 숙주 면역 반응을 최소화하고 이식된 췌장소도의 생존기간을 연장시킬 수 있다.
The pancreatic islets modified by the surface modification method of the present invention can be easily broken into single cells in the form of a cluster and inhibit the activation of inflammatory mediators upon initial contact with the blood to prevent blood coagulation, Pancreatic islet loss can be minimized. In addition, by using a polymer such as polyethylene glycol as a crosslinking agent on the surface of the chitosan-bound pancreatic isoform, the multilayer surface modification can be additionally introduced to minimize the host immune response and prolong the survival time of the transplanted pancreatic islets.
도 1은 키토산-카테콜이 췌장소도 막에 결합하는 매커니즘을 표현한 그림이다.
도 2는 형광물질인 FITC를 도입한 키토산-카테콜을 인슐린 분비 세포인 INS-1 에 처리하여 췌장소도 중간부분에 초점을 맞춰 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 그림이다.
도 3은 라이브데드키트(Live Dead kit)를 이용하여 세포 생존성을 측정한 결과로서, 붉은색 형광은 사멸된 세포를 나타내고 녹색 형광은 살아있는 세포를 나타내며 A는 대조군으로서 키토산-카테콜을 처리하지 않은 췌장소도이고 B는 키토산-카테콜을 처리한 췌장소도이다.
도 4는 락테이트디하이드로제네즈 분석(Lactate Dehydrogenase assay(LDH))을 이용하여 세포독성 및 생존성을 측정한 결과로서, 키토산-카테콜을 처리하지 않은 대조군의 생존률에 대비하여(100%) 실험군 세포의 생존률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 키토산-카테콜을 INS-1 세포에 처리하여 세포간의 응집력(aggregation)을 확인한 그림이다. A는 대조군으로써 아무런 처리도 하지 않은 INS-1 세포의 결합을 1시간 배양 후 본 이미지이고, B는 키토산-카테콜을 처리한 세포를 1시간 배양 후 본 이미지이다. C는 아무 처리도 하지 않은 세포의 결합을 2시간 배양 후 본 이미지이고, D는 2시간 배양 후, 키토산-카테콜을 처리한 세포의 결합 이미지이다. E는 아무 처리도 하지 않은 세포를 4시간 후 관찰한 이미지이고, F는 키토산-카테콜 처리 후 4시간 배양 후 관찰한 세포 결합 이미지이다.
도 6은 현적법(hanging drop)을 이용하여 만든 INS-1 세포 타원체(spheroid)의 생존성을 라이브데드키트를 이용하여 나타낸 이미지이다. A는 대조군으로서 아무 처리도 하지 않은 INS-1 타원체의 생존성을 나타낸 이미지이고, B는 키토산-카테콜을 처리한 후의 INS-1 타원체의 생존성을 나타낸 이미지이다.
도 7은 트립신-EDTA를 사용하여 INS-1 세포 타원체의 안정성을 확인한 그림이다. A는 아무 처리도 하지 않은 INS-1 세포 타원체 이미지이고, B는 키토산-카테콜 0.1%를 처리한 INS-1 세포 타원체 이미지이다.
도 8은 형광물질인 FITC를 도입한 키토산-카테콜을 래트(rat) 췌장소도에 처리하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 이미지이다. A는 췌장소도의 중간부분에 초점을 맞춘 이미지이고, B는 여러 장의 초점이미지를 합쳐 입체적으로 형상화한 이미지이다.
도 9는 라이브 데드 키트를 이용한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인한 그림이다. A는 대조군으로써 아무 처리도 하지 않은 돼지 췌장소도의 이미지이고, B는 키토산-카테콜을 처리한 돼지 췌장소도의 이미지이다.
도 10은 형광물질인 FITC를 도입한 키토산-카테콜을 돼지 췌장소도에 처리하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 촬영한 이미지이다. A는 췌장소도의 중간부분에 초점을 맞춘 이미지이고, B는 여러 장의 초점이미지를 합쳐 입체적으로 형상화한 이미지이다.FIG. 1 is a diagram showing a mechanism of binding of chitosan-catechol to the pancreatic islet membrane.
FIG. 2 is a photograph of a chitosan-catechol incorporating a fluorescent substance, FITC, into insulin-secreting cell INS-1, focusing on the middle part of the pancreas and photographing it with a confocal laser scanning microscope.
FIG. 3 shows results of measurement of cell viability using a live dead kit. Red fluorescence represents dead cells, green fluorescence represents living cells, and A represents chitosan-catechol as a control And B is a pancreatic islet treated with chitosan-catechol.
Figure 4 shows the results of cytotoxicity and viability measurement using lactate dehydrogenase assay (LDH). As a result, the survival rate (100%) of the control group without chitosan- Lt; / RTI > cells.
FIG. 5 is a graph showing the aggregation of cells treated with INS-1 cells by chitosan-catechol. A is the control image of the INS-1 cells after 1 hour of incubation without any treatment, and B is the image of the cells after 1 hour incubation of the cells treated with chitosan-catechol. C is the image obtained after 2 hours of incubation of untreated cells, and D is the combined image of cells treated with chitosan-catechol after 2 hours of incubation. E is the image observed after 4 hours for cells that did not undergo any treatment, and F is the cell binding image observed after 4 hours of incubation after the chitosan-catechol treatment.
FIG. 6 is an image showing the survivability of an INS-1 cell spheroid prepared using a hanging drop using a live dead kit. A is an image showing the survivability of the INS-1 ellipsoid without any treatment as a control, and B is an image showing the survivability of the INS-1 ellipsoid after treatment with chitosan-catechol.
FIG. 7 shows the stability of INS-1 cell ellipsoid using trypsin-EDTA. FIG. A is an INS-1 cell ellipsoid image without any treatment, and B is an INS-1 cell ellipsoid image treated with 0.1% chitosan-catechol.
Fig. 8 is an image obtained by processing a chitosan-catechol with a fluorescent substance, FITC, into a rat pancreatic islet and photographing it with a confocal laser scanning microscope. A is an image focused on the middle part of the pancreas, and B is a three-dimensional image composed of a plurality of focused images.
FIG. 9 is a graph showing the viability of a pig pancreas sperm using a live dead kit. A is an image of a pig pancreas sow without any treatment as a control and B is an image of a pig pancreas sow treated with chitosan-catechol.
Fig. 10 is an image obtained by treating chitosan-catechol with a fluorescent substance, FITC, in a porcine pancreatic islet and photographing it with a confocal laser scanning microscope. A is an image focused on the middle part of the pancreas, and B is a three-dimensional image composed of a plurality of focused images.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 하기 [화학식 2]로 기재되는 키토산(chitosan) 및 [화학식 4]로 기재되는 카테콜(catechol) 유도체, 또는 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 카테콜 유도체의 복합체가 췌장소도 표면에 결합된 표면개질된 췌장소도를 제공한다.
The present invention relates to a chitosan represented by the following formula (2) and a catechol derivative represented by the formula (4), or a composite of poly-L-lysine and a catechol derivative Thereby providing a surface modified pancreatic islet that is bound to the surface of the pancreatic islet.
[화학식 1] 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid; HCA)Hydrocaffeic acid (HCA)
[화학식 2] 키토산
여기서, m은 양의 정수이다.
[화학식 3] 키토산-도파(Dopa)
Here, m is a positive integer.
Chitosan-Dopa < RTI ID = 0.0 >
여기서, m은 양의 정수이고, n은 1 내지 20의 정수이다.Here, m is a positive integer, and n is an integer of 1 to 20.
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[화학식 4] 카테콜 유도체[Formula 4] Catechol derivative
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다.
Here, n is an integer of 1 to 20.
상기 표면개질된 췌장소도는 하기와 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The surface-modified pancreatic islets are preferably prepared by the following method, but are not limited thereto.
1) 키토산 또는 폴리-L-라이신의 1차 아민기와 카테콜 유도체의 카르복실기를 아미드(amide)와 반응시키는 복합체를 제조하는 단계; 및1) preparing a complex which reacts a primary amine group of chitosan or poly-L-lysine and a carboxyl group of a catechol derivative with an amide; And
2) 상기 단계 1)의 복합체를 췌장소도 막에 결합시키는 단계.
2) binding the complex of step 1) to the pancreatic islet membrane.
이하, 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by step.
상기 단계 1)은 키토산 또는 폴리-L-라이신의 1차 아민기와 상기 [화학식 4]로 기재되는 카테콜 유도체의 카르복실기를 아미드(amide)와 반응시키는 복합체를 형성하는 것이 바람직하고, 상기 카테콜 유도체는 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid(HCA))인 것이 보다 바람직하고, 상기 [화학식 1]의 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid(HCA))의 -COOH기를 활성화시킨 후, 약산성 조건하에서 상기 [화학식 2]와 같은 키토산의 아민(amine)기와 반응시켜 최종적으로 키토산에 도파(DOPA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]과 같은 키토산-도파를 생성시키는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The above step 1) preferably forms a complex in which the primary amine group of chitosan or poly-L-lysine and the carboxyl group of the catechol derivative described above are reacted with an amide, and the catechol derivative (HCA) of hydrocaffeic acid (HCA) of the above formula (1) is activated and then reacted with a compound represented by the above formulas (2) and It is most preferable to react with an amine group of the same chitosan and ultimately to bind chitosan with a DOPA structure to form a chitosan-dopa as in the above formula (3).
상기 키토산-도파 합성에서 반응비를 조절하여 한 분자의 키토산에 결합하는 카테콜(catechol) 구조의 수를 조절할 수 있다.In the chitosan-dopa synthesis, the number of catechol structures bound to one molecule of chitosan can be controlled by adjusting the reaction ratio.
상기 단계 1)은 트리스완충액(Tris buffer), 인산완충식염수(phosphate buffered saline), 헤페스완충액(HEPES buffer), MOPS 완충액(MOPS buffer), 비신완충액(bicine buffer), 트리신완충액(tricine buffer) 또는 TES 완충액(TES buffer)인 염기성 완충액을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The above step 1) may be carried out in a buffer such as a Tris buffer, a phosphate buffered saline, a HEPES buffer, a MOPS buffer, a bicine buffer, a tricine buffer, Or TES buffer (TES buffer) is preferably used, but not limited thereto.
상기 단계 2)는 상기 단계 1)에서 생성된 복합체를 췌장소도에 결합시키는 것이 바람직하고, 키토산-카테콜을 췌장소도 막에 결합시키는 것이 보다 바람직하다.The step 2) preferably binds the complex produced in the step 1) to the pancreatic islet, and more preferably, the chitosan-catechol is bound to the pancreatic ischemic membrane.
상기 단계 2)에서는 본 발명에 따른 상기 [화학식 3]의 키토산-카테콜에 포함된 카테콜 구조의 접착성을 이용하여 췌장소도 막 표면에 키토산을 고정시키는 것이 바람직하다.In the step 2), it is preferable to fix the chitosan on the surface of the pancreatic tissue using the adhesiveness of the catechol structure contained in the chitosan-catechol of the formula 3 according to the present invention.
상기 단계 2)에서 췌장소도의 콜라겐 막에 존재하는 아민(amine)기, 췌장소도 자체의 막 표면에 존재하는 아미노산과 키토산에 결합된 카테콜 구조가 공유결합을 형성하여 도 1과 같은 형태로 키토산을 췌장소도 막 표면에 결합시키는 것이 바람직하다. In step 2), the catechol structure bound to the chitosan and the amino acid present on the membrane surface of the amine group and the pancreatic islet itself present in the collagen membrane of the pancreatic islets forms a covalent bond, To the surface of the pancreatic isostatic membrane.
본 발명에 따른 키토산과 췌장소도의 반응은 pH 8 정도의 약염기 조건에서 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The reaction between chitosan and pancreatic islets according to the present invention is preferably performed under weak base conditions of about pH 8, but is not limited thereto.
또한, 상기 방법은 3) 췌장소도 표면 아민기와 결합되지 않은 카테콜 유도체의 하이드록시(hydroxy)기에 표면개질용 물질을 결합시키는 것을 추가적으로 도입하는 단계.를 추가적으로 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.In addition, the method may further include (3) additionally introducing the surface modifying substance to the hydroxy group of the catechol derivative not bound to the pancreatic isoform surface amine group, but the present invention is not limited thereto.
상기 표면개질용 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체인 것이 바람직하고, 상기 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체는 양쪽 말단에 같거나 또는 서로 다른 관능기가 부착된 것이 바람직하다.The surface modifying material is preferably a polyethylene glycol (PEG) or a polyethylene glycol derivative, and the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative preferably has the same or different functional groups attached to both ends thereof.
상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 유체역학적 용량이 매우 크고 물분자를 포집하고 있는 능력이 매우 높기 때문에 췌장소도 표면에 결합된 폴리에틸렌글리콜은 물분자막을 형성하여 면역세포가 항원으로 인식되지 못하도록 하는 역할을 하게 된다.Since the polyethylene glycol (PEG) has a very high hydrodynamic capacity and has a very high ability to collect water molecules, polyethylene glycol bound to the surface of the pancreatic islet forms a water molecule to prevent immune cells from being recognized as an antigen do.
상기 관능기는 카테콜기, 아민기, 히드록실기, 카르복실기, 티올기 및 설폰기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. The functional group is preferably any one selected from the group consisting of a catechol group, an amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a thiol group and a sulfone group.
상기 관능기가 부착된 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 관능기에 생체활성 물질이 추가적으로 도입된 것이 바람직하고, 상기 생체활성 물질은 헤파린인 것이 보다 바람직하다.It is preferable that a bioactive substance is additionally introduced into the functional group of the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative to which the functional group is attached, and it is more preferable that the bioactive substance is heparin.
상기 PEG 유도체로는 PEG-도파(PEG-DOPA), 모노메톡시 PEG(monomethoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지달린 PEG-HNS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEG-oxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEG-aldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester), PEG 숙시니미딜 에스테르(PEG succinimidyl ester) 등을 사용할 수 있다.
Examples of the PEG derivatives include PEG-DOPA, monomethoxy polyethylene glycol (PEG), succinimide of PEG propionic acid, succinimide of PEG butanoic acid butanoic acid, branched PEG-NHS, PEG succinimidyl succinate, succinimide of carboxymethylated PEG, benzotriazole of PEG, benzotriazole, carbonate of PEG, PEG-glycidyl ether, PEG-oxycarbonylimidazole, PEG nitrophenyl carbonates, PEG-aldehyde, , PEG succinimidyl carboxymethyl ester, PEG succinimidyl ester, and the like can be used.
또한, 본 발명의 췌장소도의 표면 개질 방법은 제 1형 당뇨병치료를 위한 췌장소도세포의 이식을 필요로 하는 질환에 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The method for surface modification of pancreatic islets of the present invention is preferably used for diseases requiring transplantation of pancreatic islet cells for the treatment of type 1 diabetes, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 키토산과 카테콜을 결합시키기 위하여, 상기 [화학식 1]의 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid(HCA))의 -COOH기를 활성화시킨 후, 약산성 조건하에서 상기 [화학식 2]와 같은 키토산의 아민(amine)기와 반응시켜 최종적으로 키토산에 도파(DOPA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]과 같은 키토산-도파를 생성시켰다(도 1 참조).In a specific embodiment of the present invention, the present inventors have found that, in order to bind catechol with chitosan, the -COOH group of hydrocaffeic acid (HCA) of the above formula (1) is activated, (DOPA) structure was finally coupled to chitosan to produce chitosan-dopa as shown in the above formula (3) (see FIG. 1).
또한, 상기 형광물질(FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 INS-1 세포에 결합시키고 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과, 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다(도 2 참조). In addition, the chitosan-catechol labeled with the fluorescent substance (FITC) was used to bind to INS-1 cells, and images were confirmed by a confocal laser scanning microscope. As a result, binding to the surface of pancreatic islets was observed (see FIG. 2 ).
나아가, 키토산-카테콜이 결합된 INS-1 세포의 생존성 확인한 결과, 살아있는 세포기 녹색으로 염색됨으로써 키토산-카테콜 처리가 세포의 생존성에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3 참조). Furthermore, the viability of the chitosan-catechol-bound INS-1 cells was confirmed to be viable, and it was confirmed that the chitosan-catechol treatment did not significantly affect the viability of the cells, .
또한, INS-1 세포 생존성을 구체적인 분포도로 확인하기 위하여, 락테이트탈수소효소(LDH)분석을 이용하여 합성물질 처리로 인해 죽은 세포를 제거한 후, 살아있는 세포를 용해하여 분비되는 락테이트의 양을 측정한 결과, 키토산-카테콜을 처리한 세포는 높은 락테이트 분비양을 나탄냄으로써 키토산-카테콜이 INS-1 세포에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(도 4 참조). In addition, in order to confirm the INS-1 cell viability by a specific distribution chart, the dead cells were removed by the treatment with synthetic material using lactate dehydrogenase (LDH) analysis, and the amount of lactate secreted by living cells was dissolved As a result, it was confirmed that chitosan-catechol-treated cells did not affect the viability of chitosan-catechol binding to INS-1 cells by dissolving high lactate secretion amount (see FIG. 4).
나아가, 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용한 INS-1 세포 구상체(spheroid)의 응집력을 확인한 결과, 키토산-카테콜이 처리된 INS-1 세포에서 강한 응집력을 나타냈다(도 5 참조). Furthermore, the cohesion of the INS-1 cell spheroids using the live dead survival rate / toxicity kit was confirmed, indicating strong cohesion in chitosan-catechol-treated INS-1 cells (see FIG. 5).
또한, 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용하여 INS-1 세포 구상체(spheroid)의 생존성 확인한 결과, 키토산-카테콜이 INS-1 세포 구상체에 결합하는 것이 생존성에 대해 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 6 참조). In addition, the viability of the INS-1 cell spheroid was confirmed by using live dead survival rate / toxicity kit. As a result, it was confirmed that the binding of chitosan-catechol to the INS-1 cell spheroid did not affect survival (See FIG. 6).
나아가, INS-1 세포 구상체의 안정성을 확인하기 위하여, 트립신(Trypsin-EDTA)를 이용하여 단백질을 분해실험을 수행한 결과, 키토산-카테콜이 처리된 INS-1 세포 구상체가 트립신에 의해 대조군보다 더욱 쉽게 단세포로 분리되는 것을 확인하였다(도 7 참조). Furthermore, in order to confirm the stability of the INS-1 cell spheroid, trypsin-EDTA was used to analyze the protein. As a result, the chitosan-catechol-treated INS-1 cell somatosensor was inhibited by trypsin (Fig. 7). ≪ tb > < TABLE >
나아가, 췌장소도 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위해서, 형광물질(FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과, 키토산-카테콜은 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다(도 8 참조). Furthermore, in order to confirm whether chitosan was immobilized on the surface of the pancreatic islet, the image was confirmed by a confocal laser scanning microscope using chitosan-catechol labeled with fluorescent material (FITC). As a result, chitosan- (See Fig. 8).
또한, 키토산-카테콜 결합에 의한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인하기 위하여, 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용하여 실험한 결과, 키토산-카테콜이 췌장소도에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 9 참조). In addition, in order to confirm the viability of pig pancreatic islets by chitosan-catechol binding, the results of the live dead survival rate / toxicity kit showed that binding of chitosan-catechol to pancreatic islets did not affect survival (See Fig. 9).
나아가, 돼지 췌장소도 표면에 키토산이 고정되어 있는지를 확인하기 위해서, 형광물질(FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인한 결과, 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도 표면에 결합하는 것을 확인하였다(도 10 참조). Furthermore, in order to confirm whether chitosan is immobilized on the surface of the pancreatic islet of pig, chitosan-catechol labeled with a fluorescent substance (FITC) was used to examine the image with a confocal laser scanning microscope. As a result, (See Fig. 10).
따라서, 본 발명의 접착성을 가지는 키토산-카테콜 합성체를 사용하여 췌장소도 막 표면을 쉽게 코팅하고 키토산의 1차 아민(amine)기에 다른 물질이나 PEG화(PEGlation) 방법을 사용하여 췌장소도 막 표면을 다층 구조로 개질하는 표면 개질 방법에 의해 변형된 췌장소도는 기존의 클러스터 형태에서 단일 세포로 쉽게 부서지는 성질을 완화시키고 혈액과의 초기 접촉시 나타나는 염증 매개 물질 활성화를 억제 및 혈액응고를 방지하여 이식 초기의 췌장소도 손실을 최소화함으로써 숙주 면역 반응을 최소화하고 이식된 췌장소도의 생존기간을 연장시킬 수 있다.
Therefore, the surface of the pancreatic isoacetate membrane can be easily coated with the adhesive chitosan-catechol complex of the present invention, and the pancreatic islet membrane can be coated with other substances or PEGylation method in the primary amine group of chitosan. The pancreatic islets modified by the surface modifying method of surface modification to a multi-layered structure can alleviate the easily breakable nature of single cells in the existing cluster form and inhibit the inflammatory mediator activation and blood coagulation caused by the initial contact with blood Minimizing the loss of pancreatic islets at the beginning of transplantation minimizes host immune response and prolongs the survival time of transplanted pancreatic islets.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
It should be noted, however, that the following examples and experimental examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 키토산과 카테콜의 결합 확인 1> Confirmation of binding of chitosan and catechol
키토산과 카테콜을 결합시키기 위하여, 하기 [화학식 1]의 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid(HCA))의 -COOH기를 활성화시킨 후, 약산성 조건하에서(pH=8) 상기 [화학식 2]의 키토산의 아민(amine)기와 반응시켜 최종적으로 키토산에 도파(DOPA) 구조가 결합되어 상기 [화학식 3]의 키토산-도파를 생성시켰다.
In order to bind chitosan and catechol, the -COOH group of hydrocaffeic acid (HCA) of the following formula (1) is activated, (DOPA) structure was finally bonded to the chitosan under an acidic condition (pH = 8) with an amine group of the chitosan of the formula (2) to produce the chitosan-dopa of the formula (3).
[화학식 1] 하이드로카페인산(hydrocaffeic acid; HCA)Hydrocaffeic acid (HCA)
[화학식 2] 키토산
여기서, m은 양의 정수이다.
[화학식 3] 키토산-도파(Dopa)
여기서, m은 양의 정수이고, n은 1 내지 20의 정수이다.[Chemical Formula 2] Chitosan
Here, m is a positive integer.
Chitosan-Dopa < RTI ID = 0.0 >
Here, m is a positive integer, and n is an integer of 1 to 20.
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<< 실시예Example 2> 2> INSINS -1 세포막에 키토산-카테콜 결합 확인-1 cell membrane with chitosan-catechol binding
인슐린 분비 세포(insulin-secreting cell(INS-1)) 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여, 상기 화학식 3의 10 ㎎의 키토산-카테콜을 1 ㎖의 생리식염 인산완충액(Hank's Balanced Salt Solution(HBSS))(pH 8)에 녹였다. 상기 혼합액을 INS-1 세포에 첨가하여 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 1시간 동안 반응시킨 후 HBSS 완충액으로 INS-1 세포를 세척하여 반응을 정지시키고 사용 전까지 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
To bind chitosan-catechol to the insulin-secreting cell (INS-1) membrane surface, 10 mg of chitosan-catechol of the above formula (3) was dissolved in 1 ml of Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)) (pH 8). The mixture was added to INS-1 cells and incubated in a cell incubator (37 ° C, 5% CO 2 ) for 1 hour. The INS-1 cells were washed with HBSS buffer to stop the reaction and cultured in RPMI-1640 medium Respectively.
<< 실시예Example 3> 3> 래트Rat (( ratrat ) ) 췌장소도Pancreatic islet 막에 키토산-카테콜 결합 Chitosan-catechol binding to membranes
래트에서 분리한 췌장소도 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여, 상기 화학식 3의 10 mg의 키토산-카테콜을 1 ㎖의 HBSS(pH 8)에 녹인 완충액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 1시간 동안 반응시킨 후 추가적으로 HBSS(pH 7) 완충액으로 췌장소도를 세척하여 반응을 중지하고 사용 전까지 M199에서 배양하였다.
To bind the chitosan-catechol to the surface of the pancreatic islet membrane separated from the rat, 10 mg of the chitosan-catechol of the above formula (3) dissolved in 1 ml of HBSS (pH 8) was added to the pancreatic islets and cultured in a cell incubator After incubation for 1 hour at 37 ° C and 5% CO 2 , the pancreatic islets were washed with HBSS (pH 7) buffer to stop the reaction and cultured at M199 before use.
<< 실시예Example 4> 돼지 4> Pig 췌장소도Pancreatic islet 막에 키토산-카테콜 결합 확인 Confirm chitosan-catechol binding to membranes
돼지에서 분리한 췌장소도 막 표면에 키토산-카테콜을 결합시키기 위하여, 1 ㎖의 HBSS(pH 8)에 상기 화학식 3의 5 mg의 키토산-카테콜을 녹인 완충액을 췌장소도에 첨가하여 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 1시간 동안 반응시킨 후 HBSS(pH 7) 완충액으로 췌장소도를 세척하여 반응을 중지하고 사용 전까지 M199 배지에서 배양하였다.
In order to bind chitosan-catechol to the surface of the pancreatic islet membrane isolated from pigs, a buffer solution in which 5 mg of chitosan-catechol of the above formula (3) was dissolved in 1 ml of HBSS (pH 8) was added to pancreatic islets and cultured in a cell incubator After incubation for 1 hour at 37 ° C and 5% CO 2 , the pancreatic islets were washed with HBSS (pH 7) buffer to stop the reaction and cultured in M199 medium until use.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 공초점Confocal 레이저 주사 현미경( Laser scanning microscope ( ConfocalConfocal LaserLaser ScanningScanning MicroscopyMicroscopy )을 이용한 ) INSINS -1 -One 세포 막에의Cell membrane 키토산-카테콜 결합 확인 Confirmation of chitosan-catechol binding
INS-1 세포 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위하여, 형광물질(FITC)로 표지된 키토산-카테콜을 사용하여 상기 [실시예 2]와 같은 방식으로 반응시키고 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인하였다. INS-1세포를 96 웰 배양 플레이트에 5 X 103 세포를 넣고 하루 이상 배양한 후 안정화 시키고 이 후 배지를 완전히 제거하고 앞에서 합성한 FITC 로 표지된 키토한-카테콜을 1.0%로 처리하여 1시간 반응시키고 나서 HBSS를 이용하여 2차례 워싱한 후 공초점 레이저 주사 현미경으로 이미지를 확인하였다.In order to confirm whether chitosan was immobilized on the surface of INS-1 cells, chitosan-catechol labeled with a fluorescent substance (FITC) was used to react in the same manner as in [Example 2], and images were observed with a confocal laser scanning microscope Respectively. Stabilizing the INS-1 cell into a 5 X 10 3 cells on 96-well culture plate and incubated for more than one day and removed the medium and then completely and labeled with a synthetic FITC Quito a front-treated catechol 1.0% 1 After reacting for a time, the sample was washed twice using HBSS and images were confirmed with a confocal laser scanning microscope.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, INS-1 세포의 중심구획을 기준으로 형광 이미지를 측정한 결과, 키토산-카테콜이 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것이 관찰되었다(도 2).
As a result, as shown in Fig. 2, fluorescence images were measured on the basis of the central segment of INS-1 cells. As a result, it was observed that chitosan-catechol bound well to the surface of pancreatic islets (Fig. 2).
<< 실험예Experimental Example 2> 라이브 2> Live 데드Dead 생존률Survival rate /독성 키트(/ Toxicity Kits ( LIVELIVE // DEADDEAD Viability/Cytotoxicity Viability / Cytotoxicity KitKit ) 및 ) And 락테이트탈수소효소Lactate dehydrogenase 분석( analysis( LactateLactate DehydrogenaseDehydrogenase (( LDHLDH ) ) AssayAssay )을 이용한 ) INSINS -1 세포 -1 cell 생존성Survivability 확인 Confirm
INS-1 세포 생존성 확인하기 위하여, 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용하여 세포의 상태를 관찰하였다. To confirm INS-1 cell viability, the status of the cells was monitored using live dead survival rate / toxicity kit.
상기 라이브 데드 생존률/독성 키트(invitrogen, Grand Island, NY))는 죽은 세포를 붉은색으로 염색시키고 살아있는 세포를 녹색으로 염색시킨다. 세포 내 에스터라제(esterase)의 활성은 비형광 세포 투과 칼세인(calcein) AM을 강한 형광이 되도록 하기 때문에, 살아있는 소도세포는 강한 균등한 녹색 형광을 생성한다. 에티디윰 동종이합체(Ethidium homodimer)(EthD-1)은 손상된 소도 멤브린으로 들어간 후, 핵산과 결합하여 죽은 소도에서 붉은색 형광을 생성시킨다.The live dead survival / toxicity kit (Invitrogen, Grand Island, NY) stains dead cells in red and stains live cells in green. Since the activity of the intracellular esterase makes the non-fluorescent cell-permeable calcein AM strong fluorescence, living goat cells produce strong equal green fluorescence. Ethidium homodimer (EthD-1) enters the damaged sodomembrane and then combines with the nucleic acid to produce red fluorescence in the dead sod.
그 결과, 도 3A의 아무런 처리도 하지 않은 INS-1(대조군)에서는 녹색을 띠는 많은 세포를 관찰할 수 있었고, 도 3B의 키토산-카테콜을 처리한 INS-1 세포에서는 대조군보다 많은 붉은 색을 띠는 다수의 세포를 발견할 수 있었으나 여전히 많은 세포들이 녹색을 나타냄으로써 키토산-카테콜 처리가 세포의 생존성에는 큰 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 3). As a result, a large number of green-colored cells were observed in INS-1 (control group) without any treatment in Fig. 3A. In INS-1 cells treated with chitosan-catechol of Fig. 3B, (Fig. 3). However, it was confirmed that the chitosan-catechol treatment did not significantly affect the viability of the cells because many cells showed green color (Fig. 3).
또한, INS-1 세포 생존성을 구체적인 분포도로 확인하기 위하여, 락테이트탈수소효소(LDH)분석을 이용하여 합성물질 처리로 인해 죽은 세포를 제거한 후, 살아있는 세포를 용해하여 분비되는 락테이트의 양을 측정한 후, 본 발명의 키토산-카토콜을 처리한 INS-1 세포의 상대적인 생존성 정도를 백분율(%)로 나타내었다. In addition, in order to confirm the INS-1 cell viability by a specific distribution chart, the dead cells were removed by the treatment with synthetic material using lactate dehydrogenase (LDH) analysis, and the amount of lactate secreted by living cells was dissolved After measurement, the relative survival rate of INS-1 cells treated with the chitosan-catogol of the present invention was expressed as a percentage (%).
INS-1 세포를 10% FBS가 포함된 10 ㎖의 RPMI-1640이 있는 배양 플레이트에 5x105 세포로 깔고 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 2일 동안 배양하여 안정화시킨 후, INS-1 세포(1x103 cell/㎖ HBSS) 및 키토산-카테콜(0.01%, 0.125%, 0.25% 및 0.5%)이 처리된 INS-1 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 200 ㎕씩 4시간 동안 배양하였다. INS-1 세포의 생존률은 락테이트 디하이드로제네즈(Lactate Dehydrogenase) 세포독성 키트(LDH; Promega, Madison, WI)에 의해 정량적으로 분석되었다. 락테이트 디하이드로제네즈는 세포에 있는 수용성 세포질 효소로서, 세포의 플라즈마 멤브린에 손상에 의해 죽은 세포에 따라 배양중인 배지로 방출된다. 배지내의 락테이트 활성의 증가는 용해된 세포에 비례한다. 상층액에 있는 방출된 LDH는 효소 분석으로 측정되고, 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)의 전환으로 인해 붉은색 포르마잔(formazan) 생성을 초래한다.INS-1 cells were plated on 5x10 5 cells in 10 ml of RPMI-1640 containing 10% FBS and incubated at 37 ° C in 5% CO 2 . INS-1 cells treated with INS-1 cells (1 x 10 3 cells / ml HBSS) and chitosan-catechol (0.01%, 0.125%, 0.25% and 0.5% 200 [mu] l / well of the plate was incubated for 4 hours. Survival rates of INS-1 cells were quantitatively analyzed by Lactate Dehydrogenase Cytotoxicity Kit (LDH; Promega, Madison, Wis.). Lactate dihydrogenes is a water-soluble cytoplasmic enzyme in cells that is released into the medium under culture depending on the cells that have died by damage to the plasma membrane of the cell. The increase in lactate activity in the medium is proportional to the dissolved cells. The released LDH in the supernatant is measured by enzyme analysis and results in red formazan production due to the conversion of the tetrazolium salt.
그 결과, 도 4는 아무런 처리도 하지 않은 INS-1 세포(대조군)와 비교하여 키토산-카테콜을 처리한 세포는 유사한 락테이트 분비양을 나타내고, DMSO를 처리한 비교군과 비교하여 현저한 세포 생존률을 나타냄을 확인하였다(도 4).As a result, Fig. 4 shows that the cells treated with chitosan-catechol showed a similar lactate secretion amount as compared with the INS-1 cells (control group) which had no treatment, and the cell survival rate (Fig. 4).
따라서, 키토산-카테콜이 INS-1 세포에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
Therefore, it was confirmed that binding of chitosan-catechol to INS-1 cells did not affect survival.
<< 실험예Experimental Example 3> 3> INSINS -1 -One 세포사이의Intercellular 응집력( cohesion( aggregationaggregation ) 확인) Confirm
INS-1 세포사이의 응집력을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 실행하였다.In order to confirm the cohesion between INS-1 cells, the following experiment was carried out.
INS-1 세포를 고농도로 실험용 튜브에 ?고, 1 ㎖ HBSS(pH 8)에 5 mg의 키토산-카테콜을 녹인 용액을 상기 INS-1 세포가 있는 튜브에 넣은 후, 세포배양기(37℃, 5% CO2)에서 1 내지 4 시간 동안 반응시킨 후 세포끼리의 응집력을 관찰하였다. 1시간 동안 반응 후 아무 처리 하지 않은 세포 A와 키토산-카테콜 처리한 세포 B의 응집력을 광학현미경으로 관찰하여 이미지를 나타냈고(도 5A 및 5B), 2시간 동안 반응 후 아무 처리도 하지 않은 세포(C)와 키토산-카테콜 처리한 세포의 이미지(D)(도 5C 및 5D), 4시간 동안 반응 후 아무 처리도 하지 않은 세포(E)와 키토산-카테콜을 처리한 세포(F)를 관찰한 이미지이다(도 5E 및 5F). A solution of INS-1 cells in a high-concentration test tube and dissolving 5 mg of chitosan-catechol in 1 ml of HBSS (pH 8) was placed in a tube containing the INS-1 cells and cultured in a cell incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 1 to 4 hours, and then cohesion of the cells was observed. After 1 hour, the cohesion of the untreated cell A and chitosan-catechol-treated cell B was observed under an optical microscope (Figs. 5A and 5B) (C) and chitosan-catecholized cells (D) (FIGS. 5C and 5D), and cells (E) and chitosan-catechol treated cells (F) (Fig. 5E and 5F).
그 결과로서, 도 5에 나타낸 바와 같이, 키토산-카테콜 처리한 세포는 갈색을 띠는 뭉친 세포들이 많이 나타남으로써, 키토산-카테콜 처리시간 의존적으로 강한 응집력을 나타내는 것을 확인하였다(도 5).
As a result, as shown in FIG. 5, the cells treated with chitosan-catechol showed a strong cohesive force depending on the treatment time of chitosan-catechol (FIG. 5).
<< 실험예Experimental Example 4> 라이브 4> Live 데드Dead 생존률Survival rate /독성 /toxicity 키트를Kit 이용한 Used INSINS -1 세포 구상체(-1 cell spheroid ( spheroidspheroid )의 )of 생존성Survivability 확인 Confirm
췌장이식에 있어서, 이식되는 세포와 이식받는 세포 사이의 유사한 환경을 만들기 위하여, 췌도세포의 클러스터와 유사한 모양의 세포 클러스터를 만드는 하기 실험을 수행하였다. In pancreatic transplantation, the following experiment was performed to create a cell cluster similar in shape to a cluster of islet cells, in order to create a similar environment between the transplanted cells and the transplanted cells.
INS-1 세포 구상체를 만드는 방법은 현적법(hanging drop)을 이용하여 INS-1 세포를 일정한 크기로 뭉쳐서 균일한 크기의 클러스터를 만들 수 있다. INS-1 세포(1000 소도세포)로 구성된 세포 현탁액의 30 ㎕ 방울(drop)을 PBS가 있는 페트리디쉬 뚜껑 안쪽에 적용시킨다. 세포 배양기에서 배양한 후 72시간에 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HSs 및 ICCs를 제거하였다. 상기 방법을 이용하여 INS-1 세포로 췌도세포의 클러스터와 유사한 모양의 세포 클러스터를 만들고, 세포 클러스트의 생존률을 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용하여 상기 [실험예 2]와 같이 실행하였다.The INS-1 cell spheroids can be cloned into a uniform size clusters of INS-1 cells using a hanging drop. 30 μl drops of the cell suspension consisting of INS-1 cells (1000 islets) are applied inside a petri dish lid with PBS. HSs and ICCs were removed using a Pasteur pipette at 72 h after incubation in a cell incubator. Cell clusters similar in shape to clusters of pancreatic islets were prepared from INS-1 cells using the above method, and the survival rate of the cell clusters was performed as in Experimental Example 2 above using a live dead survival rate / toxicity kit.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 도 6A는 아무런 처리도 하지 않은 인슐린 분비 세포(INS-1) 구상체로 실험한 결과로서, 녹색을 띠는 세포를 관찰할 수 있었고, 도 6B는 키토산-카테콜을 처리한 INS-1 세포 구상체로 실험한 결과로서 6A와 같이 녹색을 띠는 세포가 관찰됨을 확인하였다(도 6). As a result, as shown in FIG. 6, FIG. 6A shows a green colored cell as a result of an experiment with an insulin-secreting cell (INS-1) sphere without any treatment, and FIG. 6B shows a chitosan- As a result of the experiment with INS-1 cell spheres treated with callose, green-like cells were observed as in 6A (Fig. 6).
상기 결과로부터 키토산-카테콜이 INS-1 세포 구상체에 결합하는 것이 생존성에 대해 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
From the above results, it was confirmed that the binding of chitosan-catechol to the INS-1 cell spheroid did not affect survival.
<< 실험예Experimental Example 5> 트립신( 5> Trypsin ( TrypsinTrypsin -- EDTAEDTA ) 처리를 통한 ) Processing INSINS -1 세포 -1 cell 구상체의Spherical 안정성( stability( stabilitystability ) 확인) Confirm
INS-1 세포 구상체의 안정성을 확인하기 위하여, 단백질을 분해실험을 수행하였다.In order to confirm the stability of INS-1 cell spheroid, protein degradation experiments were performed.
트립신(Trypsin-EDTA)를 이용하여 세포와 세포를 연결시키는 단백질을 분해시키고 결합되어 있던 세포 클러스터가 단세포로 분리되어 콜라겐등에 의해 결합되어 있던 세포를 떨어져 나오게 하였다. 트립신의 농도를 조절하여 아무 처리 하지 않은 INS-1 세포로 만든 구상체와 키토산-카테콜 코팅된 INS-1 세포 구상체가 단세포로 분리되는 정도를 관찰함으로써 구상체의 응집력 및 안정성을 확인하였다.Trypsin (EDTA) was used to break down the proteins that connect the cells to the cells, and the bound cell clusters were separated into single cells, which allowed the cells bound by collagen to come off. The cohesiveness and stability of the spherical bodies were checked by controlling the concentration of trypsin and observing the degree of separation of the untreated INS-1 cell spheres and chitosan-catechol-coated INS-1 cell spheres into single cells.
구체적으로, INS-1 세포 구상체에 0.025% 트립신을 10분 동안 처리했을 때의 이미지(대조군)(도 7A) 및 키토산-카테콜 0.1%이 처리된 INS-1 세포 구상체에 0.025% 트립신을 10분간 처리했을 때의 구상체 이미지를 분석하였다. Specifically, 0.025% trypsin was added to INS-1 cell spheres treated with 0.025% trypsin for 10 minutes (control) (Fig. 7A) and 0.1% chitosan-catechol treated with INS-1 cell spheres The image of the spherical body when treated for 10 minutes was analyzed.
대조군의 경우 구상체에서 단일 세포로 떨어지는 현상이 좀더 강하게 관찰이 되었지만 키토산-카테콜 0.1%가 처리된 INS-1세포 구상체의 경우는 단일 세포로 떨어지는 현상이 약하게 나타나고 있는 것을 확인하였다. 즉, 키토산-카테콜이 세포의 분리를 어느 정도 막아주고 있음을 확인하였다.
In the control group, the drop to spherical bodies was more strongly observed, but in the case of INS-1 cells treated with chitosan-catechol 0.1%, it was confirmed that the decrease to single cells was weak. In other words, it was confirmed that chitosan-catechol inhibited cell separation to some extent.
<< 실험예Experimental Example 6> 6> 공초점Confocal 레이저 주사 현미경을 이용한 Using a laser scanning microscope 랫트Rat 췌장소도Pancreatic islet 막의 키토산-카테콜 결합 확인 Confirmation of membrane chitosan-catechol binding
랫트 췌장소도 표면에 키토산이 고정되었는지를 확인하기 위해서, 랫트 췌장소도를 이용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로, 랫트 췌장소도 막의 키토산-카테콜 결합을 확인하였다. In order to confirm whether chitosan was immobilized on the surface of the rat pancreatic islet, the chitosan-catechol binding of the rat pancreatic islet membrane was confirmed in the same manner as in <Experiment Example 1> using the rat pancreatic islet.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 키토산-카테콜은 랫트 췌장소도 표면에 잘 결합하는 것을 확인하였다(도 8).
As a result, as shown in Fig. 8, it was confirmed that chitosan-catechol bound well to the surface of the rat pancreatic islet (Fig. 8).
<< 실험예Experimental Example 7> 키토산-카테콜 결합에 의한 돼지 7> pigs by chitosan-catechol binding 췌장소도의Pancreatic 생존성Survivability 확인 Confirm
키토산-카테콜 결합에 의한 돼지 췌장소도의 생존성을 확인하기 위하여, 라이브 데드 생존률/독성 키트를 이용하여 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 생존성을 확인하였다.In order to confirm the viability of pig pancreatic islets by chitosan-catechol binding, viability was confirmed in the same manner as in <Experimental Example 2> using the live dead survival rate / toxicity kit.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 아무런 처리도 하지 않은 돼지 췌장소도(도 9a) 및 키토산-카테콜을 처리한 돼지 췌장소도(도 9b)는 다수의 세포들이 녹색을 나타냄으로써, 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도에 결합하는 것이 생존성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 9).
As a result, as shown in FIG. 9, pig pancreatic islets (FIG. 9A) and chitosan-catechol-treated pig pancreatic islets (FIG. 9B) It was confirmed that the binding of Cole to pig pancreatic islets did not affect survival (Fig. 9).
<< 실험예Experimental Example 8> 돼지 8> Pigs 췌장소도Pancreatic islet 막에 키토산-카테콜 결합 확인 Confirm chitosan-catechol binding to membranes
돼지 췌장소도 표면에 키토산이 고정되어 있는지를 확인하기 위해서, 돼지 췌장소도를 이용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로, 돼지 췌장소도 막의 키토산-카테콜 결합을 확인하였다. In order to confirm whether chitosan was immobilized on the surface of the pancreatic islet, the chitosan-catechol binding of the porcine pancreatic ischemic membrane was confirmed in the same manner as in <Experimental Example 1> using a porcine pancreatic islet.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 키토산-카테콜이 돼지 췌장소도 표면에 결합하는 것이 관찰되었다(도 10). As a result, as shown in Fig. 10, it was observed that chitosan-catechol bound to the surface of the pig pancreatic islet (Fig. 10).
Claims (12)
[화학식 2]
여기서, m은 양의 정수이고,
[화학식 3]
여기서, m은 양의 정수이고, n은 1 내지 20의 정수이며,
[화학식 4]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이고,
[화학식 5]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다.
A complex of chitosan represented by the following formula (2) and a catechol derivative represented by the following formula (4), or poly-L-lysine and catechol (5) with an ex vivo ex vivo pancreatic islet cell, comprising the steps of: (a)
(2)
Here, m is a positive integer,
(3)
Here, m is a positive integer, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 4]
Here, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 5]
Here, n is an integer of 1 to 20.
The method of claim 1, wherein the complex is prepared by reacting a primary amine group of chitosan or poly-L-lysine with a carboxyl group of a catechol derivative with an amide.
The method of claim 1, wherein the catechol derivative is hydrocaffeic acid (HCA).
The method of claim 1, wherein the complex is bound to a catechol of the complex and a pancreatic islet surface amine group.
The method of claim 1, wherein the polyethylene glycol (PEG) or the polyethylene glycol derivative PEG-DOPA, monomethoxy polyethylene glycol (PEG), succinimide of PEG propylic acid propionic acid, succinimide of PEG butanoic acid, branched PEG-NHS, PEG succinimidyl succinate, succinimide of carboxymethylated PEG, succinimide of carboxymethylated PEG, PEG of benzotriazole carbonate of PEG, PEG-glycidyl ether, PEG-oxycarbonylimidazole, PEG nitrophenyl Wherein the solvent is selected from the group consisting of PEG nitrophenyl carbonates, PEG-aldehyde, PEG succinimidyl carboxymethyl ester, and PEG succinimidyl ester. Wherein the method further comprises the step of binding one of the two groups to the hydroxy group of the catechol derivative not associated with the pancreatic islet surface amine group.
The in vitro pancreatic islet surface modification method according to claim 5, wherein the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative has the same or different functional groups attached to both ends thereof.
7. The method of claim 6, wherein the functional group is any one selected from the group consisting of a catechol group, an amine group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a thiol group and a sulfone group.
The in vitro pancreatic islet surface modification method according to claim 6, wherein a bioactive substance is further introduced into the functional group of the polyethylene glycol or polyethylene glycol derivative to which the functional group is attached.
9. The method of claim 8, wherein the bioactive substance is heparin.
[화학식 2]
여기서, m은 양의 정수이고,
[화학식 3]
여기서, m은 양의 정수이고, n은 1 내지 20의 정수이며,
[화학식 4]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이고,
[화학식 5]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다.
A complex of chitosan represented by the following formula (2) and a catechol derivative represented by the following formula (4), or poly-L-lysine and catechol (5) is bound ex vivo to the surface of the pancreas canal Surface modified ex vivo pancreatic islet:
(2)
Here, m is a positive integer,
(3)
Here, m is a positive integer, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 4]
Here, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 5]
Here, n is an integer of 1 to 20.
[화학식 2]
여기서, m은 양의 정수이고,
[화학식 3]
여기서, m은 양의 정수이고, n은 1 내지 20의 정수이며,
[화학식 4]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이고,
[화학식 5]
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다.
A complex of chitosan represented by the following formula (2) and a catechol derivative represented by the following formula (4), or poly-L-lysine and catechol ( Ex vivo ) pancreatic islet surface modifier comprising a complex of the formula:
(2)
Here, m is a positive integer,
(3)
Here, m is a positive integer, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 4]
Here, n is an integer of 1 to 20,
[Chemical Formula 5]
Here, n is an integer of 1 to 20.
12. The in vitro pancreatic islet surface modifying agent according to claim 11, wherein the complex is produced by reacting a primary amine group of chitosan or poly-L-lysine with a carboxyl group of a catechol derivative with an amide.
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