KR101595016B1 - Primer composition for loop-mediated isothermal amplification for determining the sex of chickens and use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 등온증폭반응(loop-mediated isothermal amplification)에 의해 닭의 성별을 감별하기 위한 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 상기 프라이머 조성물을 포함하는 닭의 성별 감별용 키트, 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 닭의 성체, 수정란 및 세포 수준에서 단시간 내에 고가의 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있고 육안으로 증폭 여부를 확인할 수 있으며, 현장에서 실시간으로 적용될 수 있기 때문에, 닭의 유전자원을 보다 안전하게 보존하고 닭 종계에서 원하는 성을 가진 개체를 조기에 선별하는데 유용하게 이용할 수 있다.The present invention relates to a primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and a primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8 for discriminating the sex of a chicken by loop-mediated isothermal amplification , A kit for discriminating the sex of a chicken including the primer composition, and a method for discriminating the sex of a chicken using the kit. According to the present invention, it is possible to amplify a gene without high-priced professional equipment in a short time at the adult, embryo and cell level of a chicken, and to confirm whether amplification can be performed with the naked eye. Can be safely preserved and useful for early selection of individuals with the desired sex in the chicken breed.
Description
본 발명은 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 이를 포함하는 닭의 성별 감별용 키트 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 등온증폭반응(loop-mediated isothermal amplification)에 의해 닭의 성별을 감별하기 위한 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 상기 프라이머 조성물을 포함하는 닭의 성별 감별용 키트, 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a primer composition for isothermal amplification reaction for discriminating the sex of a chicken, a kit for discriminating the sex of a chicken comprising the same, and a method for discriminating the sex of a chicken using the same. More specifically, the present invention relates to a method of amplifying a chicken by means of isothermal amplification comprising a primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and a set of primers of SEQ ID NOS: 5 to 8 for discriminating the sex of a chicken by loop-mediated isothermal amplification A primer composition for reaction, a kit for discriminating the sex of a chicken including the primer composition, and a method for discriminating the sex of a chicken using the same.
닭의 성별은 육종을 위한 암수의 구별을 위하여 빠른 시간에 감별할 필요성이 있으며 그 이유는 원하지 않는 성을 가진 개체의 사육에 필요한 사료비, 유추에 소모되는 재료비, 인건비 등을 절감하기 위함이다. 닭의 성별을 감별하기 위하여 종래에는 전문적인 훈련을 거친 감별사에 의해서 병아리의 외부 생식돌기를 관찰하는 방법이 주로 이용되고 있다. 병아리 감별사에 의한 관찰은 부화 후 특정한 기간 내에 실시해야만 하는 단점을 가지고 있으며, 감별사에 대하여 철저한 위생관리를 실시하더라도 계통 간 또는 개체 간 조류 질병의 간접적인 전파를 야기할 수 있음이 지적되고 있다. The gender of chickens needs to be distinguished quickly for the distinction of male and female for breeding, in order to reduce the feed cost, the material cost, and the labor cost for the breeding of individuals with unwanted sex. In order to discriminate the sex of a chicken, conventionally, a method of observing an external reproductive process of a chick by using a specialist training has been mainly used. It is pointed out that the observation by the chickens differentiator has a disadvantage that it must be carried out within a certain period after hatching, and even if the hygienic management is thoroughly carried out for the genders, it may induce the indirect transmission of the bird diseases between the lines or individuals.
이러한 문제점을 극복하기 위하여 일부 종계에 대해 분자생물학적 기법을 활용한 성감별 방법이 개발되고 있다. 특히, 발생단계의 수정란에서 조직과 혈액을 멸균 생검한 후 DNA를 추출하여 이를 분석하는 방법은 암수를 정확하게 감별할 수 있는데, 그로 인해 원하는 성별을 가진 수정란만을 선택적으로 부화시킬 수 있는 장점을 갖는다. To overcome these problems, gender sensitive methods using molecular biological techniques have been developed for some species. In particular, the method of extracting and analyzing DNA after sterilization biopsy of tissues and blood in the embryo at the developmental stage can accurately distinguish between male and female, thereby selectively hatching embryos having a desired sex.
또한, 원시생식세포를 수집 및 배양하여 닭의 유전자원을 보존하는 방법을 개발하기 위하여 닭 수정란에서 유래한 세포 수준에서 성감별을 단시간 내에 실시할 필요성이 제기되고 있다. In addition, in order to develop a method for preserving the genetic resources of chickens by collecting and culturing primitive germ cells, there is a need to carry out sex sterilization at a cellular level derived from a chicken embryo in a short time.
닭의 신속한 성감별을 위한 분자생물학적 방법으로서 최근에는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법이 일반적으로 많이 사용되고 있다(British Poultry Science, 2001, 42: 134-138). 그러나, PCR을 이용한 감별 방법은 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열 분석(DNA sequencing)을 실시해야 하는 일련의 과정을 거쳐야 한다. 또한 상기 방법은 열순환기(Thermocycler)와 같은 전문장비 및 이를 운용할 수 있는 전문인력이 요구되며, 최종 확인을 위한 증폭산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 더욱이, 이러한 일련의 과정들을 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. Recently, a PCR method with high detection sensitivity and convenience has been widely used as a molecular biologic method for rapid gestation of chicken (British Poultry Science, 2001, 42: 134-138). However, it is very important to develop a specific primer by PCR, and it is necessary to confirm amplified reaction products by electrophoresis and finally to perform DNA sequencing . In addition, the above-mentioned method requires specialized equipment such as a thermocycler and a professional manpower capable of operating the same, and the sequence analysis of the amplification product for final confirmation is a process requiring high cost and high technology. Furthermore, since it takes a lot of time to perform such a series of processes and is not a visually detectable detection method, the ability to use in the field where analytical equipment is not provided is significantly reduced.
이 외에도, 닭의 성감별을 위해 병아리 W 염색체에 특이적으로 결합하는 프로브를 이용한 DNA 혼성화 방법이 개발되었으나(대한민국 특허공개 제10-2013-0023909호), 이 역시 최종 감별까지 2일 이상의 시간이 소요되고 현장 적용성이 낮다는 단점이 있다.In addition, a DNA hybridization method using a probe that specifically binds to the chick W chromosome has been developed (Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2013-0023909) for the sex sterilization of chicken, but this time also requires more than 2 days And the applicability to the field is low.
이에 기존의 감별법과 병용할 수 있으면서 간편하고 단시간 내에 정확한 결과를 얻을 수 있으며 현장에서도 활용 가능한 닭의 성별을 감별하는 방법의 개발 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
Therefore, it is necessary to develop a method to discriminate the gender of the chicken which can be used in the field, which can be used in combination with the existing differentiation method, and can obtain accurate results in a short time and in a short time.
이에 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 닭의 W 염색체 특이적으로 염기서열을 증폭할 수 있는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발하고 이를 이용하여 등온증폭반응을 수행하면 신속하고 정확하게 닭의 성별을 감별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have made extensive efforts to solve the problems of the prior art, and as a result, they have developed a primer set for isothermal amplification reaction capable of amplifying a base sequence specific to a chicken W chromosome, And that the sex of the chicken can be accurately discriminated.
따라서 본 발명의 목적은 등온증폭반응에 의해 닭의 성별을 감별하기 위한 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer composition comprising a primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and a primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8 for discriminating the sex of a chicken by an isothermal amplification reaction.
본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 조성물은 서열번호: 1의 정방향 외부 프라이머(F3), 서열번호: 2의 역방향 외부 프라이머(B3), 서열번호: 3의 정방향 내부 프라이머(FIP) 및 서열번호: 4의 역방향 내부 프라이머(BIP)로 이루어지는, 닭의 성별 감별을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment, the primer composition comprises a forward external primer (F3) of SEQ ID NO: 1, an inverted external primer (B3) of SEQ ID NO: 2, a forward internal primer (FIP) of SEQ ID NO: : 4 reverse primer (BIP). The primer set for isothermal amplification reaction for distinguishing the sex of a chicken.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 프라이머 조성물은 서열번호: 5의 정방향 외부 프라이머(F3), 서열번호: 6의 역방향 외부 프라이머(B3), 서열번호: 7의 정방향 내부 프라이머(FIP) 및 서열번호: 8의 역방향 내부 프라이머(BIP)로 이루어지는, 닭의 성별 감별을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the primer composition comprises a forward external primer (F3) of SEQ ID NO: 5, an inverted external primer (B3) of SEQ ID NO: 6, a forward internal primer (FIP) of SEQ ID NO: : ≪ / RTI > 8 primers for reverse transcription primers (BIP) for discriminating the sex of a chicken.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 조성물을 포함하는 닭의 성별 감별용 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a kit for discriminating sex of a chicken comprising the primer composition.
본 발명의 일 구현예로, 상기 키트는 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트와, 등온증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, the kit comprises a primer set of SEQ ID NO: 1 to 4, a primer set of SEQ ID NO: 5 to 8, and a reagent for performing an isothermal amplification reaction.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 키트는 등온증폭반응을 수행하기 위한 시약으로서 Bst DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs) 또는 완충액을 포함하는 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the kit is characterized by comprising Bst DNA polymerase, deoxynucleotides (dNTPs) or a buffer as a reagent for performing an isothermal amplification reaction.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 등온증폭반응용 프라이머 조성물 또는 키트를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for discriminating the sex of a chicken using the primer composition or kit for isothermal amplification reaction.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법은In one embodiment of the present invention,
감별하고자 하는 닭의 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;Isolating the genomic DNA from the biological sample isolated from the individual of the chicken to be discriminated;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계; 및Performing the isothermal amplification reaction using the separated genomic DNA as a template and using the primer set of SEQ ID NO: 1 to 4 and the primer set of SEQ ID NO: 5 to 8; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.And detecting the amplification product.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 방법은 생물학적 시료가 닭의 모근, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the method is characterized in that the biological sample is the roots of chicken, blood, various body fluids, isolated tissues, isolated cells or saliva.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 방법은 50 내지 65℃에서 30분 내지 90분간 등온증폭반응을 수행하는 것을 특징으로 한다.
In another embodiment of the present invention, the method is characterized in that an isothermal amplification reaction is performed at 50 to 65 DEG C for 30 to 90 minutes.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a primer composition for isothermal amplification reaction for discriminating the sex of a chicken comprising a primer set of SEQ ID NO: 1 to 4 and a primer set of SEQ ID NO: 5 to 8 do.
본 발명에 있어서, "등온증폭반응(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 기존의 PCR과 유사하지만 기존의 PCR이 변성(denaturation), 접합(annealing) 및 신장(extension)의 3단계를 거치면서 온도 변화가 수반되어야 하는 반면, 등온증폭반응은 이러한 온도 변화 없이 일정한 온도에서 접합 및 신장을 가능케 하여 DNA의 원하는 부분을 복제 및 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 등온증폭반응은 기존의 PCR에 사용되는 Taq DNA 중합효소 대신 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용하기 때문에 열에 의존하지 않고 DNA 이중나선 구조의 변성을 유발하여 Tm 값에 가까운 고정 온도에서 접합 및 신장이 이루어진다. 따라서 등온증폭반응은 PCR과는 달리 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능한 장점을 갖는다. In the present invention, "loop-mediated isothermal amplification (LAMP)" is similar to the conventional PCR, but the conventional PCR has three steps of denaturation, annealing and extension Isothermal amplification reaction is a molecular biologic technique that allows cloning and extension at a constant temperature without such temperature changes, thereby replicating and amplifying the desired part of the DNA. The isothermal amplification reaction uses a Bst DNA polymerase having a 5 '→ 3' exonuclease function instead of the Taq DNA polymerase used in the conventional PCR. Therefore, the isothermal amplification reaction does not depend on heat, And junction and extension are performed at a fixed temperature close to the Tm value. Therefore, the isothermal amplification reaction can amplify the gene without professional equipments unlike PCR and has the advantage of amplifying the gene at a high concentration in a short time.
이러한 등온증폭반응을 수행하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP 및 BIP)가 하나의 세트로 작용해야 하는데, 본 발명에서는 닭의 성별을 감별하기 위해 암컷 특이적 W 염색체의 표적 서열을 증폭할 수 있는 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 제공한다. For this isothermal amplification reaction, four primers (F3, B3, FIP and BIP) should act as one set. In the present invention, the target sequence of the female specific W chromosome is amplified to distinguish the sex of the
구체적으로, 서열번호: 1 및 2와 서열번호 5 및 6의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 외부 프라이머로서, 서열번호: 1 및 서열번호: 5의 프라이머는 정방향 외부 프라이머(F3)이며 서열번호: 2 및 서열번호: 6의 프라이머는 역방향 외부 프라이머(B3)이다. 또한, 서열번호: 3 및 4와 서열번호: 7 및 8의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머로서, 서열번호: 3 및 서열번호: 7의 프라이머는 정방향 프라이머 서열(F2)과 상보적 서열(F1)을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP)이고, 서열번호: 4 및 서열번호: 8의 프라이머는 역방향 프라이머 서열(B2)과 상보적 서열(B1)을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP)이다.Specifically, the primers of SEQ ID NOS: 1 and 2 and SEQ ID NOS: 5 and 6 are external primers corresponding to both ends of the product to be amplified, and the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 5 are forward external primers (F3) And the primers of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 are reverse external primer (B3). The primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 and the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 are located inside the product to be amplified. The primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7 are complementary to the forward primer sequence (F2) Wherein the primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8 comprises a reverse internal primer (BIP) comprising a reverse primer sequence (B2) and a complementary sequence (B1) to be.
상기와 같이 닭의 성별을 감별하기 위해 W 염색체 특이 서열을 증폭할 수 있도록 고안된 본 발명에 따른 서열번호: 1 내지 4와 서열번호: 5 내지 8의 등온증폭반응용 프라이머 세트에 관한 서열 정보와 위치를 각각 도 1 및 2에 나타내었다.In order to discriminate the sex of the chicken, the sequence information and the sequence information of the primer sets for the isothermal amplification of SEQ ID NOS: 1 to 4 and SEQ ID NOS: 5 to 8 according to the present invention designed to amplify the W chromosome- 1 and 2, respectively.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 프라이머의 길이와 서열은 증폭하고자 하는 유전자의 반복적인 중첩 합성을 개시하도록 조합되며, 이는 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 등온 온도의 유지 조건과 이온 강도에 따라 적절히 조정될 수 있다. In the present invention, "primer" means a short nucleic acid sequence capable of forming a base pair with a complementary template with a short free 3'-terminal hydroxyl group and serving as a starting point for template strand copying do. The length and sequence of the primers according to the present invention are combined to initiate repetitive superposition synthesis of the gene to be amplified, which is dependent not only on the complexity of the desired DNA or RNA target but also on the conditions of isothermal temperature maintenance and ionic strength Can be appropriately adjusted.
본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 한 추가의 특징을 가질 수 있다.The primers of the present invention can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization and different four nucleoside triphosphates at appropriate buffer solutions and temperatures. The primers of the present invention may have additional features as long as they do not alter the basic properties of the primer acting as a starting point for DNA synthesis.
본 발명에 있어서, 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphrothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있다. In the present invention, an oligonucleotide used as a primer may include a nucleotide analogue, for example, phosphochthioate, alkylphosphorothioate, or peptide nucleic acid.
이러한 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열Such primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. This nucleic acid sequence
은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(intercalating agent)(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(chelating agent)(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 또는 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.
Can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides with one or more homologues, and modification between nucleotides, such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, phosphotriester, (E.g., dodecanedioic acid, dodecanedioic acid, dodecanedioic acid, tartaric acid, tartaric acid, tartaric acid, The nucleic acid can be in the form of one or more additional covalently linked residues such as proteins (e.g., nuclease, toxin, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc.), intercalating agents , Psoralen, etc.), chelating agents (e.g. metals, radioactive metals, iron, oxidative metals, etc.), or alkylating agents. In addition, the nucleic acid sequences of the present invention can be modified using labels that can directly or indirectly provide a detectable signal. Examples of labels include radioactive isotopes, fluorescent molecules, and biotin.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 프라이머 조성물을 포함하는 닭의 성별 감별용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for discriminating the sex of a chicken comprising the above-described primer composition.
상기 프라이머 조성물 및 등온증폭반응에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The above primer composition and isothermal amplification reaction are as described above.
구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머 키트는 닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 키트의 형태일 수 있으며, 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트와 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트, 등온증폭반응을 수행하기 위한 시약, 테스트 튜브, 적절한 컨테이너, 최적의 반응 조건을 기재한 사용자 설명서 등을 포함할 수 있다. 이때 등온증폭반응을 수행하기 위한 시약으로는 Bst DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 완충액, DEPC-수(DEPC-water) 등을 포함할 수 있다.
Specifically, the primer kit according to the present invention may be in the form of a kit for isothermal amplification reaction for discriminating the sex of a chicken, and may comprise a primer set of SEQ ID NO: 1 to 4, a primer set of SEQ ID NO: 5 to 8, A reagent for carrying out the reaction, a test tube, a suitable container, a user's manual describing the optimum reaction conditions, and the like. The reagent for performing the isothermal amplification reaction may include Bst DNA polymerase, deoxynucleotides (dNTPs), buffers, DEPC-water, and the like.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 조성물을 이용하여 등온증폭반응에 의해 닭의 성별을 감별하는 방법을 제공한다.In another embodiment, the present invention provides a method for distinguishing the sex of a chicken by an isothermal amplification reaction using the primer composition.
상기 프라이머 조성물 및 등온증폭반응에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.The above primer composition and isothermal amplification reaction are as described above.
구체적으로, 본 발명에 따른 감별 방법은,Specifically, in the discrimination method according to the present invention,
감별하고자 하는 닭의 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;Isolating the genomic DNA from the biological sample separated from the individual of the chicken to be discriminated;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.Performing the isothermal amplification reaction using the separated genomic DNA as a template and using the primer set of SEQ ID NO: 1 to 4 and the primer set of SEQ ID NO: 5 to 8; And detecting the amplification product.
본 발명에 있어서, "생물학적 시료"는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응에 의해 증폭할 수 있는 닭의 DNA를 포함하는 시료를 의미한다. 상기 생물학적 시료는 닭의 모근, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the term "biological sample" means a sample containing chicken DNA that can be amplified by an isothermal amplification reaction using a primer set according to the present invention. Such biological samples include, but are not limited to, roots of chicken, blood, various body fluids, isolated tissues, samples such as isolated cells or saliva, and the like.
상기한 바와 같은 생물학적 시료로부터 게놈 DNA를 분리하기 위해 당업계에 공지된 방법 또는 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수 있으며, 예를 들면 위자드 프렙 키트(Wizard prep kit, Promega), 퀴아앰프 DNA 미니 키트(QIAamp DNA Mini kit, QIAGEN) 등을 이용할 수 있다. Methods known in the art or commercially available kits can be used to isolate genomic DNA from biological samples as described above, such as Wizard prep kit (Promega), Quail Ampl DNA mini kit QIAamp DNA Mini kit, QIAGEN).
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행함으로써 닭의 암컷 특이적 W 염색체의 표적 서열을 증폭할 수 있다.Using the separated genomic DNA as a template, the isomerism amplification reaction is carried out using the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and the primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8, thereby amplifying the target sequence of the chicken-specific W chromosome .
상기 등온증폭반응은 50 내지 65℃에서, 바람직하게는 60 내지 61℃에서 30분 내지 90분, 바람직하게는 45분 내지 1시간 동안 수행될 수 있다. 상기 온도 범위를 벗어나는 경우에는 증폭이 느리게 진행되거나 증폭이 아예 진행되지 않는 문제점이 있기 때문에, 이 범위 내에서 등온증폭반응을 수행하는 것이 바람직하다. The isothermal amplification reaction may be performed at 50 to 65 ° C, preferably 60 to 61 ° C for 30 minutes to 90 minutes, preferably 45 minutes to 1 hour. If the temperature is out of the above range, the amplification may proceed slowly or the amplification may not proceed at all. Therefore, it is preferable to perform the isothermal amplification reaction within this range.
등온증폭반응에 의해 증폭된 산물은 다양한 방법에 의해 검출될 수 있는데, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아마이드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 증폭 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.The product amplified by the isothermal amplification reaction can be detected by various methods, including, but not limited to, DNA chip, gel electrophoresis, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement. As one method of detecting the amplification product, gel electrophoresis can be performed. Gel electrophoresis can utilize agarose gel electrophoresis or acryl amide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In the fluorescence measurement method, when Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer and amplification is performed, the target is labeled with a fluorescent label capable of detecting the target sequence. The labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter can do. In the radioactive measurement method, a radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the amplification reaction solution to amplify the product, and then a radioactive measurement device such as a Geiger counter or liquid scintillation The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
바람직하게는, DNA 이중가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 육안으로 결과 여부를 판독할 수 있는 형광 물질을 사용하는 것이 좋다. 이러한 형광 물질로서 Red Safe는 DNA 이중 가닥에 삽입되어 자외선 조사 시 적색의 형광을 발현하는 물질이기 때문에, 시료 DNA를 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응에 의해 증폭시킨 후 증폭 산물에 Red Safe를 첨가하고 자외선을 조사하게 되면 적색 형광을 나타내게 된다. 그 결과, 전기영동 등 별도의 추가적 실험을 하지 않고도 육안으로 증폭 여부를 간단히 확인할 수 있다.Preferably, it is preferable to use a fluorescent substance capable of reading the result with the naked eye by using the property of binding to the double strand of DNA without requiring additional experimentation. As such a fluorescent substance, Red Safe is a substance that is inserted into a double strand of DNA and expresses red fluorescence upon irradiation with ultraviolet light. Therefore, after amplifying the sample DNA by isothermal amplification using the primer set according to the present invention, And ultraviolet light is irradiated to produce red fluorescence. As a result, amplification can be easily confirmed with the naked eye without performing additional experiments such as electrophoresis.
본 발명에 따른 감별 방법을 수행한 결과, 증폭 산물이 검출되는 경우에는 대상 개체가 암컷인 것으로 판정하고, 증폭 산물이 검출되지 않는 경우에는 대상 개체가 수컷인 것으로 판정할 수 있다.
As a result of performing the discrimination method according to the present invention, when the amplification product is detected, it is determined that the subject is a female, and when the amplification product is not detected, it can be determined that the subject is male.
본 발명에 따른 닭의 성별을 감별하기 위한 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트 및 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 포함하는 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 상기 프라이머 조성물을 포함하는 닭의 성별 감별용 키트, 및 이를 이용하여 닭의 성별을 감별하는 방법으로 인하여, 닭의 성체, 수정란 및 세포 수준에서 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 닭의 성별을 감별할 수 있다. 특히 본 발명에 따른 감별 방법은 등온증폭반응을 이용하여 고가의 전문장비 없이 항온수조만으로도 유전자를 증폭할 수 있고 육안으로 증폭 여부를 확인할 수 있으며 현장에서 실시간으로 적용될 수 있기 때문에 닭의 유전자원을 보다 안전하게 보존하고 닭 종계에서 원하는 성을 가진 개체를 선별하는데 유용하게 이용할 수 있다.
A primer set for the isothermal amplification reaction comprising the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and the primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8 for discriminating the sex of the chicken according to the present invention, the sex differentiation of the chicken comprising the primer composition And the method for discriminating the sex of a chicken using the kit, it is possible to effectively discriminate the sex of the chicken without special equipment within a short time at the adult, embryo, and cell level of the chicken. In particular, the method according to the present invention can amplify a gene using a constant temperature bath without expensive professional equipments using an isothermal amplification reaction, and can confirm whether amplification is carried out by the naked eye. Can be safely preserved and useful for screening individuals with a desired sex in a chicken breed.
도 1은 닭의 성별을 감별하기 위해 암컷 특이적 W 염색체 표적 서열을 증폭할 수 있는 본 발명에 따른 등온증폭반응용 프라이머 세트에 관한 서열 정보와 위치를 나타낸 것으로, 패널 A는 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트에 관한 것이고, 패널 B는 서열번호: 5 내지 8의 등온증폭반응용 프라이머 세트에 관한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호: 1 내지 4와 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트로 등온증폭반응을 수행한 결과를 전기영동으로 확인한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 서열번호: 1 내지 4와 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트로 등온증폭반응을 수행한 결과를 Red Safe 염색으로 확인한 것이다.FIG. 1 shows the sequence information and position of a primer set for isothermal amplification reaction according to the present invention, which can amplify a female-specific W chromosome target sequence in order to discriminate the sex of a chicken. Panel A shows SEQ ID NOs: 4, and Panel B relates to a set of primers for isothermal amplification reaction of SEQ ID NOS: 5 to 8.
FIG. 2 is a graph showing the results of isothermal amplification with primers set forth in SEQ ID NOS: 1 to 4 and SEQ ID NOS: 5 to 8 according to the present invention by electrophoresis.
FIG. 3 is a result of performing isothermal amplification with the primer sets of SEQ ID NOs: 1 to 4 and SEQ ID NOs: 5 to 8 according to the present invention by Red Safe staining.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention, and it is to be understood by those skilled in the art that the present invention is not limited thereto It will be self-evident.
실시예 1: 공시 동물 및 게놈 DNA 추출Example 1: Extracted animal and genomic DNA
등온증폭반응에 의한 닭의 성별 감별을 수행하고자 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 부화한 10일령 된 한국재래 닭, 레그혼 각 10수씩을 분석 대상으로 하였고, 각 개체의 혈액을 채취하여 본 시험을 실시하였다. 또한 공시된 닭의 암수 확인을 위하여 모든 개체를 해부하여 암수 생식기의 유무를 검정하였다.In order to discriminate the sex of chickens by isothermal amplification, 10 Korean chickens and 10 legged hatchlings hatched at the National Livestock Breeding and Research Institute were analyzed. The blood samples were collected from each animal and tested. Respectively. In order to confirm the male and female sex of all the animals,
병아리 혈액에서의 DNA 추출은 퀴아앰프 DNA 미니 키트(QIAGEN, Germany)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였으며 추출된 DNA는 등온증폭반응에 이용할 때까지 -20℃에 보관하였다.
DNA extraction from chick blood was performed according to the manufacturer's instructions using QuiAmp DNA mini kit (QIAGEN, Germany) and the extracted DNA was stored at -20 ° C until used for isothermal amplification.
실시예 2: 등온증폭반응용 프라이머 세트의 제작Example 2: Preparation of a primer set for isothermal amplification reaction
닭의 성별을 감별하기 위한 등온증폭반응용 프라이머를 고안하기 위하여 미국국립생물정보센터(NCBI)로부터 입수한 닭의 암컷 특이적인 W 염색체의 염기 서열을 입수한 후 이에 대한 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트와 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 Applied Biosystems사(USA)에 주문하여 제작하였다. In order to devise a primer for isothermal amplification reaction for discriminating the sex of a chicken, a nucleotide sequence of a chicken-specific W chromosome obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) was obtained and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: Primer set and the primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8 were ordered from Applied Biosystems, USA.
제작된 프라이머 세트의 염기 서열은 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
The nucleotide sequences of the prepared primer sets are shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 서열번호: 1 및 2와 서열번호 5 및 6의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 외부 프라이머로서, 서열번호: 1 및 서열번호: 5의 프라이머는 정방향 외부 프라이머(F3)이며 서열번호: 2 및 서열번호: 6의 프라이머는 역방향 외부 프라이머(B3)이다. 또한, 서열번호: 3 및 4와 서열번호: 7 및 8의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머로서, 서열번호: 3 및 서열번호: 7의 프라이머는 정방향 프라이머 서열(F2)과 상보적 서열(F1)을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP)이고, 서열번호: 4 및 서열번호: 8의 프라이머는 역방향 프라이머 서열(B2)과 상보적 서열(B1)을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP)이다.As shown in Table 1, the primers of SEQ ID NOs: 1 and 2 and SEQ ID NOs: 5 and 6 are external primers corresponding to both ends of the product to be amplified, and the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: And the primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 6 is the reverse external primer (B3). The primers of SEQ ID NOS: 3 and 4 and the primers of SEQ ID NOS: 7 and 8 are located inside the product to be amplified. The primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 7 are complementary to the forward primer sequence (F2) Wherein the primer of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8 comprises a reverse internal primer (BIP) comprising a reverse primer sequence (B2) and a complementary sequence (B1) to be.
도 1의 패널 A 및 B는 각각 상기와 같이 닭의 성별을 감별하기 위해 암컷 특이적 W 염색체 표적 서열을 증폭할 수 있도록 고안된 서열번호: 1 내지 4와 서열번호: 5 내지 8의 등온증폭반응용 프라이머 세트에 관한 서열 정보와 위치를 나타낸 것이다.
The panels A and B of FIG. 1 respectively correspond to SEQ ID NOS: 1 to 4 and SEQ ID NOS: 5 to 8, respectively, designed to amplify a female specific W chromosome target sequence in order to discriminate the sex of a chicken, Sequence information and position of the primer set.
실시예Example 3: 등온증폭반응 수행 3: Perform isothermal amplification reaction
상기 실시예 1에서 준비된 닭의 게놈 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 실시예 2에서 제작된 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트와 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하였다. 구체적으로, 하기 표 2의 조성으로 반응용액을 제조한 후 65℃에서 45분 동안 동일한 온도로 반응하여 증폭반응을 수행하였다.
Isothermal amplification reaction was performed using the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4 and the primer sets of SEQ ID NOS: 5 to 8 prepared in Example 2 using the genomic DNA sample of chicken prepared in Example 1 as a template Respectively. Specifically, the reaction solution was prepared in the composition shown in Table 2 below, and then reacted at the same temperature for 45 minutes at 65 ° C to carry out an amplification reaction.
반응이 완료된 후에는 총 20 ㎕의 반응물 중 5 ㎕를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 2에서 패널 A는 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 결과이고, 패널 B는 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 결과이며, 여기서 레인 1 내지 4 및 9 내지 12는 암컷 게놈 DNA를 주형으로, 레인 5 내지 7 및 13 내지 15는 수컷 게놈 DNA를 주형으로 등온증폭반응을 수행한 결과이고, 레인 8 및 16은 프라이머 부재 하에서 등온증폭반응을 수행한 결과이다. After the reaction was completed, 5 μl of the total 20 μl of the reaction solution was subjected to electrophoresis to confirm whether the gene was amplified. The results are shown in Fig. 2, panel A shows the result of isothermal amplification reaction using the primer set of SEQ ID NOS: 1 to 4, panel B shows the result of isothermal amplification reaction using the primer set of SEQ ID NOS: 5 to 8, wherein
도 2에 나타난 바와 같이, 프라이머 부재 하에서 수행된 등온증폭반응(레인 8 및 16), 및 수컷 게놈 DNA를 주형으로 한 등온증폭반응(레인 5 내지 7 및 13 내지 15)에서는 증폭 산물이 검출되지 않은 반면, 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응(레인 1 내지 4)과, 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응(레인 9 내지 12)에서는 증폭 산물이 검출되었다. 이로부터 본 발명에 따른 프라이머 세트가 높은 특이성으로 등온증폭반응에 의해 닭의 성별을 감별할 수 있음을 확인하였다.As shown in Fig. 2, in the isothermal amplification reactions (
상기에서 전기영동에 의해 확인된 본 발명에 따른 프라이머 세트의 유의성을 검증하기 위하여, 동일한 반응물로 등온증폭반응(65℃, 1시간)을 수행한 후 반응이 종결된 튜브 상에서 10,000배로 농축된 Red SafeTM(iNtRON biotechnology)를 반응물 20 ㎕당 1 ㎕씩 첨가하여 발색 반응을 유도하였다. 유도된 발색 반응을 UV 조사 하에서 육안으로 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. In order to verify the significance of the primer set according to the present invention confirmed by electrophoresis in the above, isothermal amplification reaction (65 ° C, 1 hour) was performed with the same reaction product, TM (iNtRON biotechnology) was added at a rate of 1 μl per 20 μl of the reaction to induce a color development reaction. The induced color reaction was visually observed under UV irradiation, and the results are shown in FIG.
도 3에서 패널 A는 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 결과이고, 패널 B는 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 결과이며, 여기서 튜브 1 내지 4 및 9 내지 12는 암컷 게놈 DNA를 주형으로, 튜브 5 내지 7 및 13 내지 15는 수컷 게놈 DNA를 주형으로 등온증폭반응을 수행한 결과이고, 튜브 8 및 16은 프라이머 부재 하에서 등온증폭반응을 수행한 결과이다. In FIG. 3, Panel A shows results of isothermal amplification using primers set forth in SEQ ID NOS: 1 to 4, Panel B shows results of isothermal amplification using primers set forth in SEQ ID NOS: 5 to 8, Tables 5 to 7 and 13 to 15 show the result of performing isothermal amplification with male genomic DNA as a template and Tables 8 and 16 as results of performing isothermal amplification reaction in the absence of a primer .
도 3에 나타난 바와 같이, 프라이머 부재 하에서 수행된 등온증폭반응(튜브 8 및 16), 및 수컷 게놈 DNA를 주형으로 한 등온증폭반응(튜브 5 내지 7 및 13 내지 15)에서는 적색 형광이 관찰되지 않은 반면, 서열번호: 1 내지 4의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응(튜브 1 내지 4)과, 서열번호: 5 내지 8의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응(튜브 9 내지 12)에서는 적색 형광이 관찰되었다. As shown in Fig. 3, in the isothermal amplification reaction (
이러한 결과는 상기 전기영동에 의한 증폭산물의 검출 결과와 일치하는 것으로, 본 발명에 따른 방법이 실험실 환경에서뿐만 아니라 종계 육종 농장의 현장에서도 닭의 성별을 손쉽게 감별할 수 있음을 나타내는 것이다.
These results are consistent with the detection results of the amplification products by the electrophoresis, indicating that the method according to the invention can easily discriminate the gender of chickens not only in the laboratory environment but also in the field of breeding seed breeding farms.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification for determining the sex of chickens and use thereof <130> PA131201KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward external primer F3 <400> 1 cgaattgggg ctggatgtg 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse external primer B3 <400> 2 gggagccagc ttgagaga 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward internal primer FIP <400> 3 ttgtccccta gcccttccct gagctgatct tagcactgcg 40 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse internal primer BIP <400> 4 ttcgttaagt ggaaggctgc tgccaggcac aacttcg 37 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward external primer F3 <400> 5 cggactggtg agtgaacct 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recerse external primer B3 <400> 6 cccgcagtgc taagatcag 19 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Froward internal primer FIP <400> 7 atcaccacgg cccccaagat tcatgtagca ggcgggtc 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse internal primer BIP <400> 8 ctgtgctggg ctggccatac gcacatccag ccccaatt 38 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification for determining the sex of chickens and use thereof <130> PA131201KR <160> 8 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward external primer F3 <400> 1 cgaattgggg ctggatgtg 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse external primer B3 <400> 2 gggagccagc ttgagaga 18 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward internal primer FIP <400> 3 ttgtccccta gcccttccct gagctgatct tagcactgcg 40 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse internal primer BIP <400> 4 ttcgttaagt ggaaggctgc tgccaggcac aacttcg 37 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward external primer F3 <400> 5 cggactggtg agtgaacct 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recerse external primer B3 <400> 6 cccgcagtgc taagatcag 19 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foward internal primer FIP <400> 7 atcaccacgg cccccaagat tcatgtagca ggcgggtc 38 <210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse internal primer BIP <400> 8 ctgtgctggg ctggccatac gcacatccag ccccaatt 38
Claims (8)
A reverse primer (B3) of SEQ ID NO: 2, a forward primer (FIP) of SEQ ID NO: 3 and a primer set of reverse primer (BIP) of SEQ ID NO: ; (F3) of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer (BIP) of SEQ ID NO: 5, and a primer of the reverse internal primer (BIP) of SEQ ID NO: A primer composition for isothermal amplification reaction.
A reverse primer (B3) of SEQ ID NO: 2, a forward primer (FIP) of SEQ ID NO: 3 and a primer set of reverse primer (BIP) of SEQ ID NO: ; (F3) of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer (BIP) of SEQ ID NO: 5, and a primer of the reverse internal primer (BIP) of SEQ ID NO: Kit for identifying the sex of a chicken, comprising a reagent for performing an isothermal amplification reaction.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 1의 정방향 외부 프라이머(F3), 서열번호: 2의 역방향 외부 프라이머(B3), 서열번호: 3의 정방향 내부 프라이머(FIP) 및 서열번호: 4의 역방향 내부 프라이머(BIP)의 프라이머 세트; 및 서열번호: 5의 정방향 외부 프라이머(F3), 서열번호: 6의 역방향 외부 프라이머(B3), 서열번호: 7의 정방향 내부 프라이머(FIP) 및 서열번호: 8의 역방향 내부 프라이머(BIP)의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는,
닭의 성별을 감별하는 방법.
Isolating the genomic DNA from the biological sample isolated from the individual of the chicken to be discriminated;
(F3) of SEQ ID NO: 1, reverse external primer (B3) of SEQ ID NO: 2, forward internal primer (FIP) of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: A primer set of a reverse internal primer (BIP); (F3) of SEQ ID NO: 7 and a reverse primer (BIP) of SEQ ID NO: 5, and a primer of the reverse internal primer (BIP) of SEQ ID NO: Performing an isothermal amplification reaction using the set; And
And detecting the amplification product.
How to distinguish the sex of a chicken.
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| Theriogenology. 2012,78:1329-1338..* |
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