KR101593307B1 - Pharmaceutical composition for inhibiting hyper-proliferation of vascular smooth muscle cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SQ22536을 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식 억제용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 혈관평활근세포의 이상 증식을 억제하고, 혈관 손상 시 혈관내막 형성을 억제하여 혈관평활근세포의 이상 증식 또는 이동 질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting vascular smooth muscle cell proliferation comprising SQ22536, wherein the composition inhibits abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells, inhibits angiogenesis upon vascular injury, Can be used to prevent or treat migratory diseases.
Description
본 발명은 혈관평활근 세포의 이상 증식을 억제하는 SQ22536의 약제학적 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to the pharmaceutical use of SQ22536 for inhibiting abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells.
혈관평활근 세포의 이상 증식 및 이동에 성장인자인 PDGF와 PDGF 수용체가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(비특허문헌 1). 또한, 심근세포에서 microRNA-9가 PDGF 수용체 베타의 발현을 조절한다는 것이 밝혀졌다(비특허문헌 2). 최근 질병의 치료 표적으로 microRNA의 중요성이 부각되고 있으며, microRNA의 발현 및 활성을 조절하는 다양한 방법이 제시되고 있다(비특허문헌 3). anti-microRNA 및 siRNA와 같은 올리고뉴클레오타이드는 대량생산에 비용이 많이 들며, 단독적으로 세포 내 전달이 어렵고, 낮은 생체 내 안정성 등과 같은 한계점이 있다(비특허문헌 4). 이러한 단점을 극복하고자 최근 루시퍼레이즈 시스템을 이용한 스크리닝을 통해 microRNA 발현 조절에 관여하는 저분자 화합물을 찾는 연구가 진행 중이다(비특허문헌 5). 상기 저분자 화합물은 올리고뉴클레오타이드와 달리 생산 비용이 저렴하고, 다양한 구조 변형이 가능하며 세포 내로 쉽게 전달되고 작용기전연구가 용이하다는 장점이 있다(비특허문헌 6).
PDGF and PDGF receptors, which are growth factors, play an important role in abnormal proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (Non-Patent Document 1). In addition, it was revealed that microRNA-9 regulates the expression of PDGF receptor beta in myocardial cells (Non-Patent Document 2). Recently, the importance of microRNAs as therapeutic targets for diseases has been highlighted, and various methods for controlling the expression and activity of microRNA have been proposed (Non-Patent Document 3). The oligonucleotides such as anti-microRNA and siRNA are costly in mass production, and have limitations such as difficulty in intracellular delivery alone and low in vivo stability (Non-Patent Document 4). In order to overcome these disadvantages, studies are underway to find low molecular compounds involved in the regulation of microRNA expression through recent screening using the Luciferase system (Non-Patent Document 5). Unlike oligonucleotides, the low-molecular compounds are advantageous in that they are low in production cost, are capable of various structural modifications, are easily transferred into cells, and are easy to study the mechanism of action (Non-Patent Document 6).
따라서, 본 발명의 목적은 혈관평활근세포의 이상 증식 질환을 예방 또는 치료하기 위한 SQ22536의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
It is therefore an object of the present invention to provide a pharmaceutical use of SQ22536 for preventing or treating abnormal proliferative diseases of vascular smooth muscle cells.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SQ22536을 포함하는 혈관평활근세포의 이상 증식 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating abnormal proliferative diseases of vascular smooth muscle cells comprising SQ22536.
혈관평활근세포 이상 증식 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 동맥경화증, 아테롬성동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중 또는 말초혈관협착증일 수 있다.The vascular smooth muscle cell proliferative disorder may be vascular restenosis, vascular stenosis, atherosclerosis, atherosclerosis, heart failure, myocardial infarction, angina pectoris, arrhythmia, hypertensive heart disease, congenital heart disease, stroke or peripheral vascular stenosis .
상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. The composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
또한, 상기 조성물은 SQ22536을 0.5 내지 20 μM 포함할 수 있다.
In addition, the composition may comprise 0.5 to 20 [mu] M of SQ22536.
본 발명의 SQ22536은 혈관평활근세포의 이상 증식을 억제함으로써 재협착을 막을 수 있어, 혈관평활근세포 이상 증식 질환, 예컨대, 죽상동맥경화증의 발병 여부를 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 질환을 예방 및 치료하기 위한 새로운 치료제 개발에 적용 가능하다.
SQ22536 of the present invention can prevent restenosis by inhibiting abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells and thus can diagnose whether or not an abnormal vascular smooth muscle cell proliferative disease such as atherosclerosis is developed, And to develop new therapeutic agents for the treatment of cancer.
도 1은 혈관평활근세포의 이상 증식과 관련된 microRNA를 선별하기 위하여, 혈관평활근세포에서 각각의 microRNA를 형질주입(transfection) 한 뒤 혈관평활근세포의 증식 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 혈관평활근세포 내의 microRNA-9 발현 증가가 PDGF 수용체 베타(PDGFRβ)에 의한 혈관평활근세포의 증식에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 3은 microRNA-9를 혈관평활근세포에 형질주입(transfection)했을 때의 세포주기를 FACS 분석을 통해서 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 증식하는 혈관평활근세포에서 microRNA-9의 발현을 유지시키는 microRNA-9 활성화제를 찾기 위한 스크리닝 결과를 나타내는 그래프 및 microRNA-9 활성화제로 사용 가능한 SQ22536의 화학식이다.
도 5는 SQ22536를 처리한 혈관평활근세포에서 PDGF 수용체 베타의 발현이 감소됨을 나타내는 그래프이다.
도 6은 SQ22536의 농도가 증가함에 따라 혈관평활근세포의 증식이 억제되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 7은 SQ22536에 의한 세포주기 변화를 FACS로 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. FIG. 1 is a graph showing the effect of inhibiting proliferation of vascular smooth muscle cells after transfection of microRNAs in vascular smooth muscle cells to select microRNAs involved in abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells.
FIG. 2 is a graph showing the effect of increased expression of microRNA-9 in vascular smooth muscle cells on vascular smooth muscle cell proliferation by PDGF receptor beta (PDGFRβ).
FIG. 3 is a graph showing the results of FACS analysis of the cell cycle when transfection of microRNA-9 into vascular smooth muscle cells. FIG.
FIG. 4 is a graph showing the results of screening for finding microRNA-9 activator that maintains expression of microRNA-9 in proliferating vascular smooth muscle cells, and a formula of SQ22536 that can be used as a microRNA-9 activator.
FIG. 5 is a graph showing that expression of PDGF receptor beta is reduced in vascular smooth muscle cells treated with SQ22536.
6 is a graph showing that the proliferation of vascular smooth muscle cells is inhibited as the concentration of SQ22536 increases.
FIG. 7 is a graph showing the result of FACS analysis of the cell cycle change by SQ22536. FIG.
본 발명에서는 새로운 분자표적치료(molecular therapy) 방법으로, SQ22536을 사용하여 혈관평활근세포의 이상 증식에 관련된 PDGF 수용체 베타(PDGF receptor-β, platelet derived growth factor receptor-β)의 발현과 활성을 억제시킴으로써, 인 비트로, 엑스 비보, 인 비보 실험을 통해 혈관평활근세포의 리모델링에 긍정적이고 효과적인 치료 효과를 입증하였다. In the present invention, by inhibiting the expression and activity of PDGF receptor-β (platelet-derived growth factor receptor-β) involved in abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells using a novel molecular therapy method, SQ22536 , In Vitro, X-Vibo, and In vivo tests, demonstrating a positive and effective therapeutic effect on vascular smooth muscle cell remodeling.
이와 같이, 본 발명은 SQ22536을 사용하여 혈관평활근세포의 이상 증식을 억제함으로써 재협착을 막을 수 있다. Thus, the present invention can prevent restenosis by inhibiting abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells using SQ22536.
따라서, 본 발명은 SQ22536을 포함하는 혈관평활근세포의 이상 증식 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating abnormal proliferative diseases of vascular smooth muscle cells comprising SQ22536.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 성장 자극이 주어진 혈관평활근세포에서 microRNA-9의 발현이 감소하는데, microRNA-9의 발현 감소를 저해하면 혈관평활근세포의 증식이 억제됨을 확인하였다. 즉, microRNA-9의 발현을 높이면 PDGF 수용체 베타의 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다. According to a specific embodiment of the present invention, the expression of microRNA-9 is decreased in a vascular smooth muscle cell given a growth stimulus, and inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation is inhibited by inhibiting the decrease of microRNA-9 expression. In other words, when the expression of microRNA-9 was increased, the expression of PDGF receptor beta was inhibited.
또한, 세포주기를 분석한 결과, PDGF-BB에 의해 감소된 G0/G1기와 증가된 S기는 microRNA-9에 의해 G0/G1기는 증가하고 S기는 감소하여 정상 상태의 세포주기와 비슷해짐을 확인하였다. 따라서, microRNA-9에 의해 세포주기 진행에서 G1기에서 S기로 이행되는 과정에 중요한 역할을 함을 알 수 있다. In addition, the cell cycle analysis revealed that the G0 / G1 group and the increased S group reduced by PDGF-BB were increased by G0 / G1 and decreased by microRNA-9, and were similar to the normal cell cycle. Thus, it can be seen that microRNA-9 plays an important role in the process of transition from G1 phase to S phase in cell cycle progression.
결론적으로, microRNA-9는 PDGF 수용체 베타의 발현을 억제하여 PDGF-BB에 의한 혈관평활근세포의 증식을 억제하여 혈관 손상 시 혈관내막 형성을 억제하는 역할을 할 수 있다.In conclusion, microRNA-9 inhibits the expression of PDGF receptor beta and inhibits vascular smooth muscle cell proliferation by PDGF-BB, thus inhibiting vascular endothelialization during vascular injury.
명세서에서, 용어 “microRNA(또는 miRNA, miR이라 함)”는 21-25 nt의 단일 가닥 RNA 분자로서 mRNA의 3'-UTR에 결합하여 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 물질이다[Bartel DP et al., Cell. 2004.01.23;116(2):281-297]. miRNA의 생성은 Drosha(RNaseⅢ type 효소)에 의해 스템-루프 구조의 전구체 microRNA(premicroRNA)로 만들어지고, 세포질로 이동하여 다이서(Dicer)에 의해 절단되어 성숙한 microRNA로 만들어진다[Kim VN et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 05.;6(5):376-385]. 상술한 바와 같이 제조된 microRNA는 표적단백질의 발현을 조절함으로써 발생, 세포증식 및 사멸, 지방대사, 종양형성 등에 관여한다[WienholdsE et al.,Science, 309(5732): 310-311(2005); Nelson P et al., Trends BiochemSci., 28: 534-540(2003); Lee RC et al., Cell, 75: 843-854(1993); 및 Esquela-Kerscher A et al., Nat Rev Cancer. 6: 259-269(2006)].In the specification, the term "microRNA (or miRNA, miR)" is a 21-25 nt single-stranded RNA molecule that binds to the 3'-UTR of mRNA and controls the expression of eukaryotic genes [Bartel DP et al ., Cell. 2004.01.23; 116 (2): 281-297). The production of miRNA is made by Drosha (RNase III type enzyme), which is made into a stem-loop structure precursor microRNA (premicroRNA), which is transferred to the cytoplasm and cleaved by Dicer to produce mature microRNA [Kim VN et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. 05; 6 (5): 376-385). MicroRNAs prepared as described above are involved in development, cell proliferation and death, lipid metabolism, tumor formation, etc. by controlling the expression of target proteins [Wienholds E et al., Science, 309 (5732): 310-311 (2005); Nelson P et al., Trends Biochem Sci., 28: 534-540 (2003); Lee RC et al., Cell, 75: 843-854 (1993); And Esquela-Kerschera et al., Nat Rev Cancer. 6: 259-269 (2006)).
본 발명의 microRNA-9는 SEQ ID NO.:1에 기재되어 있으며, 단일 가닥 분자인 microRNA-9의 성숙한 형태로써, 이중 가닥 부분을 형성할 수 있는 자가-상보적인 분자 즉 스템-루프 구조일 수 있다. The microRNA-9 of the present invention is described in SEQ ID NO: 1 and is a mature form of microRNA-9, a single-stranded molecule, which can be a self-complementary molecule capable of forming a double- have.
본 발명에서 SQ22536은 microRNA-9를 활성화할 수 있으며, 이에 따라 상기 화합물을 microRNA-9 활성화제라 할 수 있다. In the present invention, SQ22536 can activate microRNA-9, and thus the compound can be referred to as a microRNA-9 activator.
상기 microRNA-9 활성화제, 즉 SQ22536은 혈관평활근세포의 이상 증식 억제 활성을 가지므로, 혈관평활근세포의 과도한 증식이 억제되어야 하는 혈관평활근세포 이상 증식 질환(vascular smooth muscle cell hyper-proliferative disorder)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 사용된다.Since the microRNA-9 activator, i.e., SQ22536, has the activity of inhibiting abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells, prevention of vascular smooth muscle cell hyper-proliferative disorder in which excessive proliferation of vascular smooth muscle cells is to be inhibited Or as a pharmaceutical composition for therapeutic use.
본 명세서에서, 용어 "평활근"은 관 모양의 기관, 방광, 복강, 자궁, 생식도관, 위장관, 호흡기관, 맥관구조, 피부 및 모양체근(ciliary muscle), 눈의 홍채 등의 기관의 벽(wall) 내에서 발견되는 비-줄무늬근(nonstriated muscle)이다. 상기 평활근을 구성하는 세포인 "평활근세포"는 단핵세포로서, 시트(sheet)나 다발(bundle)의 형태로 배열되어 갭 정션(gap junction)에 의해 연결되어 있는 것이 특징이다.As used herein, the term "smooth muscle" refers to the walls of organs such as tubular organs, bladder, abdominal cavity, uterus, gonadal duct, gastrointestinal tract, respiratory tract, vasculature, skin and ciliary muscle, Which is a nonstriated muscle found within the brain. The "smooth muscle cells" which are the cells constituting the smooth muscle are mononuclear cells, which are arranged in the form of sheets or bundles and are connected by a gap junction.
본 명세서에서, 용어 "혈관평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)"는 혈관 벽의 평활근을 구성하는 세포를 의미한다.As used herein, the term " vascular smooth muscle cell (VSMC) "refers to a cell that constitutes the smooth muscle of the vessel wall.
본 명세서에서, 용어 "혈관평활근세포 이상 증식 질환(VSMC hyper-proliferative disorder)"이란 혈관평활근세포의 과도한 증식에 기인하여 발생되는 질환 또는 질병을 의미한다.As used herein, the term " VSMC hyper-proliferative disorder "refers to a disease or disease caused by excessive proliferation of vascular smooth muscle cells.
본 발명에서의 "혈관평활근세포 이상 증식 질환"은 혈관평활근세포의 이상 증식에 의해 직접적으로 발생되는 혈관재협착증, 혈관협착증, 죽상동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증뿐만 아니라, 혈관협착증, 혈관재협착증 또는 죽상동맥경화증에 의해 이차적으로 유발되는 심혈관계 질환인 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중, 말초혈관협착증 등을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 치료 또는 예방되는 혈관평활근세포 이상 증식 질환은 죽상동맥경화증, 아테롬성 동맥경화증, 혈관재협착증 또는 혈관협착증이다."Vascular smooth muscle cell proliferative disorder" in the present invention refers to a disease caused by abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells such as vascular restenosis, vascular stenosis, atherosclerosis, atherosclerosis, as well as vascular stenosis, vascular restenosis, Myocardial infarction, angina pectoris, arrhythmia, hypertensive heart disease, congenital heart disease, stroke, peripheral vascular stenosis, etc. which are secondary to cardiovascular diseases caused by atherosclerosis. More preferably, the vascular smooth muscle cell proliferative disorder which is treated or prevented by the pharmaceutical composition of the present invention is atherosclerosis, atherosclerosis, vascular restenosis or vascular stenosis.
아테롬성 동맥경화증은 동맥의 내층에 지방 물질이 침착 되거나 섬유화(fibrosis)되어 있는 질환이다. 한편, 혈관의 재협착증(restenosis)은 혈관벽이 손상(traumatization)된 후 혈관 통로가 좁아지는 질환이다. 동맥경화 진행과 스텐트 삽입술 후에 발생하는 혈관 재협착증은 혈관평활근세포의 증식, 이동 그리고 세포외 기질(extracellular matrix)의 분비 등에 기인한다고 알려지고 있다(Circulation, 1997, 95, 1998-2002; J. Clin. Invest. 1997, 99, 2814-2816; Cardiovasc. Res. 2002, 54, 499-502). 이에, 동맥경화의 진행과 혈관 재협착의 방지를 위해 혈관평활근세포의 증식 또는 이동을 억제하는 약물에 대한 연구가 널리 진행되고 있으며, 현재 몇 가지 약물이 환자의 치료에 사용되고 있다(J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 39, 183-193). 따라서, 혈관평활근세포의 증식 및 이동을 효율적으로 억제하는 본 발명의 SQ22536은 혈관평활근세포 이상 증식 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.Atherosclerosis is a disease in which fatty substances are deposited or fibrosis in the inner layers of the arteries. On the other hand, restenosis of the blood vessels is a disease in which the vascular passageway narrows after the vessel wall is damaged (traumatized). It is known that vascular restenosis after arteriosclerosis and stent implantation is caused by vascular smooth muscle cell proliferation, migration and secretion of extracellular matrix (Circulation, 1997, 95, 1998-2002; J. Clin Invest., 1997, 99, 2814-2816; Cardiovasc. Res., 2002, 54, 499-502). In order to prevent progression of arteriosclerosis and prevent vascular restenosis, researches on drugs that inhibit the proliferation or migration of vascular smooth muscle cells have been widely carried out, and some drugs are currently used for treating patients (J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 39, 183-193). Therefore, SQ22536 of the present invention for effectively inhibiting proliferation and migration of vascular smooth muscle cells can be effectively used for the treatment of vascular smooth muscle cell proliferative diseases.
일 구체예에서 상기 SQ22536은 0.5 내지 20 μM의 농도로 포함될 수 있다. In one embodiment, the SQ22536 may be included at a concentration of 0.5 to 20 [mu] M.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제형 제조에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned effective ingredient. The pharmaceutically acceptable carrier to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is one that is commonly used in the production of formulations and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc. in addition to the above-mentioned components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, .
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, muscle injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like. In the pharmaceutical composition of the present invention, the route of administration is preferably determined depending on the type of disease to which it is applied.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 SQ22536의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.The concentration of SQ22536, which is an active ingredient contained in the composition of the present invention, can be determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the period of time required, and the like.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
참조예 1: SQ22536의 물질 정보Reference Example 1: Substance information of SQ22536
CAS No.: 17318-31-9CAS No .: 17318-31-9
분자식: C9H11N5OMolecular formula: C 9 H 11 N 5 O
분자량: 205.2 g/mol
Molecular weight: 205.2 g / mol
실시예Example
<실시예 1> 혈관평활근세포에서 microRNA의 약제학적 용도≪ Example 1 > Pharmaceutical uses of microRNA in vascular smooth muscle cells
(쥐의 대동맥 평활근세포의 분리 및 배양)(Isolation and Culture of Rat Aortic Smooth Muscle Cells)
쥐의 대동맥 평활근 세포(RAoSMCs)는 6-8주 된 Sprague-Dawley rats의 흉부 대동맥으로부터 collagenase type I(Sigma-Aldrich Inc.)과 elastase(USB)를 사용하여 분리하였다(Hwang, KC et al. (2002). J Cardiovasc Pharmacol 39: 271-277)
Rat aortic smooth muscle cells (RAoSMCs) were isolated from the thoracic aorta of Sprague-Dawley rats 6-8 weeks old using collagenase type I (Sigma-Aldrich Inc.) and elastase (USB) (Hwang, KC et al. 2002) J Cardiovasc Pharmacol 39: 271-277)
(microRNA-9 활성화제 스크리닝)(microRNA-9 activator screening)
혈관평활근세포를 6 well에 plating 한 뒤, 24 시간 후 0.5% serum 배양액으로 교체하여 37°C CO2 배양기에서 24시간 배양하였다(starvation 단계). 다시 10% serum 배양액으로 교체하면서 최종 농도 1 μM의 저분자 화합물(카이네이즈 저해제 또는 활성화제)을 처리해준 뒤, 37℃ CO2 배양기에서 48 시간 배양한 뒤 real-time PCR로 microRNA-9의 발현을 확인한다.
Vascular smooth muscle cells were plated in 6 wells and then replaced with 0.5% serum culture medium for 24 hours.2 And cultured in an incubator for 24 hours (starvation step). The cells were treated with a low-molecular-weight compound (kinase inhibitor or activator) at a final concentration of 1 μM while being replaced with 10% serum culture medium.2 After incubation in an incubator for 48 hours, the expression of microRNA-9 is confirmed by real-time PCR.
(면역 블랏 분석)(Immunoblot analysis)
세포를 PBS로 세척하고, 1X 라이시스 버퍼(1X lysis buffer; 20 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 250 mM sucrose, 0.1mM PMSF, 1 mM dithiothreitol, 4 ㎍/ml pepstatin, 4 ㎍/ml leupeptin, 5 ㎍/ml aprotinin)로 suspension시켜 4℃에서 10 분 동안 용해시켰다. 750 g, 4℃에서 10 분간 원심분리 후, 상등액을 10,000 g, 4℃에서 10분간 원심분리 시켰다. 상등액을 분리하여 BCA protein assay reagent(Thermo Scientific)로 정량하며, 동량의 단백질을 크기에 맞게 8~15% SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; Qbiogene)에 로딩(loading) 후 전기영동하였다. 원하는 크기의 겔(gel)을 자른 후, 폴리비닐디플루오라이드(polyvinyldifluoride, PVDF; Millipore) 트랜스퍼 맴브레인(transfer membrane)과 transfer buffer(20 mM Trizma base; Sigma, 190 mM Glycine; Sigma, 20% Methanol; Duksan)를 사용하여 단백질을 이동, 고정시켰다. 전기 이동된 맴브레인은 10% DifcoTM skim milk(BD)와 TBS-t(1X TBS, 0.1% tween-20)를 혼합한 blocking buffer에서 1 시간 반응시키고, 원하는 1차 항체를 넣어 2 시간 또는 오버나이트 동안 반응시켰다. TBS-t로 3번 세척하고 horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체(goat anti-mouse and goat anti-rabbit IgG-peroxidases)를 넣어 1시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 TBS-t로 5번 세척하고 Enhanced chemiluminescence plus western blotitng system(ECL; Amersham Biosciences)을 이용하여 발광시킨 후, 암실에서 HyperfilmTM ECL (Amersham Biosciences)로 밴드를 확인하였다. 밴드 강도는 NIH ImageJ version 1.34 e software로 측정하였다.
Cells were washed with PBS and resuspended in 1X lysis buffer (20 mM HEPES, pH 7.5, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 250 mM sucrose, 0.1 mM PMSF, 1 mM dithiothreitol , 4 ㎍ / ml pepstatin, 4 ㎍ / ml leupeptin, 5 ㎍ / ml aprotinin) and dissolved at 4 ° C for 10 minutes. After centrifugation at 750 g and 4 ° C for 10 minutes, the supernatant was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C. The supernatant was separated and quantitated with a BCA protein assay reagent (Thermo Scientific). The same amount of protein was loaded on 8-15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis; Qbiogene) and electrophoresed. After the desired size of the gel was cut, a polyvinyldifluoride (PVDF) transfer membrane and transfer buffer (20 mM Trizma base; Sigma, 190 mM Glycine; Sigma, 20% Methanol; Duksan) was used to move and immobilize the protein. The electrophoretically transferred membrane was reacted for 1 hour in a blocking buffer consisting of 10% Difco ™ skim milk (BD) and TBS-t (1 × TBS, 0.1% tween-20), and the desired primary antibody was added for 2 hours or overnight Lt; / RTI > After washing three times with TBS-t, secondary antibodies (goat anti-mouse and goat anti-rabbit IgG-peroxidases) with horseradish peroxidase were added and reacted for 1 hour. At the end of the reaction, the cells were washed 5 times with TBS-t and luminesced using an enhanced chemiluminescence plus western blotting system (ECL; Amersham Biosciences), followed by banding with Hyperfilm ™ ECL (Amersham Biosciences) in the dark. Band strength was measured with NIH ImageJ version 1.34 e software.
(real-time PCR)(real-time PCR)
전체 RNA는 TRIzol Reagent(Life technologies)를 사용해서 분리하였다. 10 ng의 정제된 RNA를 특정 microRNA에 작용하는 Taqman 프라이머와 결합하여 역전사(Taqman MicroRNA Reverse Transcriptase Kit, Applied Biosystems)하였고, 대조군으로 U6를 사용하였다. 특정 산물의 증폭과 검출은 Light Cycler 480 II(Roche)를 통해 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 그리고 60℃에서 60초 동안 40 회 사이클을 수행하였다. 각 표적 유전자의 역치 사이클(threshold cycle; Ct)을 정의, PCR의 선형적인 증폭단계에 도달, U6(ΔCt value) 값에 따라 계산하였다. 세포에서 각각의 microRNA의 발현 비율의 상대적인 차이(ΔΔCt)를 계산하여 2^ΔΔCt 값을 제시하였다.
Total RNA was isolated using TRIzol Reagent (Life technologies). 10 ng of purified RNA was reverse transcribed (Taqman MicroRNA Reverse Transcriptase Kit, Applied Biosystems) with Taqman primers acting on specific microRNAs and U6 was used as a control. Amplification and detection of specific products were carried out on Light Cycler 480 II (Roche) for 10 minutes at 95 ° C, 15 seconds at 95 ° C, and 40 cycles at 60 ° C for 60 seconds. The threshold cycle (Ct) of each target gene was defined, calculated according to the value of U6 (ΔCt value), which reached the linear amplification step of the PCR. The relative difference (ΔΔCt) of the expression ratios of the respective microRNAs in the cells was calculated and presented as 2 ^ ΔΔCt.
(microRNA 형질주입(transfection))(microRNA transfection)
MicroRNA의 형질주입은 silentfect reagent(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. Transfection of microRNA was performed using silentfect reagent (Bio-Rad, Hercules, Calif., USA).
microRNA mimic과 음성 대조군의 RNA 올리고머(NC)(Genolution Pharmaceuticals, Inc., Korea)를 100 nM의 최종 농도로 사용하였다. 10% FBS를 함유한 높은 혈당의 DMEM에서 혈관평활근세포에 microRNA-9 모방체를 형질주입한 후, CO2 배양기에서 37℃에 4~6시간 동안 배양한 후에, 배지를 바꿔주었다.
RNA oligomers (NC) (Genolution Pharmaceuticals, Inc., Korea) of microRNA mimic and negative control were used at a final concentration of 100 nM. The microRNA-9 mimetic was transfected into vascular smooth muscle cells in high glucose DMEM containing 10% FBS, and CO 2 After incubation at 37 占 폚 for 4 to 6 hours in an incubator, the medium was changed.
(세포 주기 분석)(Cell cycle analysis)
세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 떼어낸 뒤 PBS로 세척한 후, 700 g 에서 5분간 원심분리 하였다. 상등액을 제거하고 75% 에탄올을 함유하는 PBS로 resuspension하여 4℃에서 12-24시간 고정하였다. 차가운 PBS로 세척한 뒤 300g, 4℃에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거한 후 100 ㎕의 RNse(50 ㎕/ml in PBS)를 넣고 37℃에서 30 분 동안 배양하였다. 500 ㎕의 PBS로 세척한 뒤 700g 에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 제거하였다. Cells were treated with trypsin, washed, and centrifuged at 700 g for 5 minutes. The supernatant was removed and resuspension in PBS containing 75% ethanol was performed for 12-24 hours at 4 ° C. After washing with cold PBS, the cells were centrifuged at 300 g at 4 ° C for 5 minutes, and the supernatant was removed. 100 μl of RNse (50 μl / ml in PBS) was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After washing with 500 μl of PBS, the supernatant was removed by centrifugation at 700 g for 5 minutes.
샘플이 들어있는 튜브를 호일로 감싸고 어두운 벤치에서 다음 단계를 진행하였다. PI를 (50 ㎍/ml in PBS)에 넣고 상온에서 30 분간 반응시키고 PBS로 세척한 뒤, 700g 에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 제거한다. 200-500 ㎕의 PBS를 (세포의 수에 따라 가감, 2x106 cells/ml 이상) 넣고, FACScanTM flow cytophotometer(Becton Dickinson)로 488 nm (BLUE)파장에서 측정하였다.
The tube containing the sample was wrapped with foil and the next step was carried out on a dark bench. PI (50 μg / ml in PBS), reacted at room temperature for 30 minutes, washed with PBS, and centrifuged at 700 g for 5 minutes to remove the supernatant. 200-500 의 of PBS was added (2 × 10 6 cells / ml or higher depending on the number of cells) and measured at 488 nm (BLUE) wavelength using a FACScan ™ flow cytophotometer (Becton Dickinson).
(통계학적 분석)(Statistical analysis)
모든 실험은 세 번의 반복으로 수행하였다. 데이터는 평균 평균±표준오차로 표현하였다. 두 가지 군의 통계적 분석은 t-test에 의해 추정되었다. 두 가지 군 이상의 경우는 Bonferroni test를 사용하여 one-way ANOVA로 완성하였다. P<0.05을 유의한 것으로 간주하였다
All experiments were performed in triplicate. Data are expressed as mean ± standard error. Statistical analysis of the two groups was estimated by t-test. Two-group cases were completed with one-way ANOVA using the Bonferroni test. P < 0.05 was considered significant
혈관평활근세포에 관련 있는 microRNA를 선별하기 위해, 혈관평활근세포의 증식에 관여하는 PDGF 수용체 베타를 선정하였고, 상기 PDGF 수용체 베타를 타겟으로 하는 microRNAs를 선별하였다. 상기 microRNAs를 혈관평활근세포에 형질주입(transfection)한 뒤, 10% serum 조건에서 증식 자극을 주었다. 이때, microRNA-9를 혈관평활근세포에 형질주입(transfection)한 군에서 혈관평활근세포의 증식이 억제되었다(도 1). In order to select microRNAs involved in vascular smooth muscle cells, PDGF receptor beta involved in vascular smooth muscle cell proliferation was selected and microRNAs targeting the PDGF receptor beta were selected. The microRNAs were transfected into vascular smooth muscle cells and proliferated at 10% serum condition. At this time, proliferation of vascular smooth muscle cells was inhibited in the group transfected with microRNA-9 into vascular smooth muscle cells (Fig. 1).
추후 진행된 실험은 혈관평활근세포 내의 microRNA-9 발현 증가가 PDGF 수용체 베타(PDGFRβ)에 의한 혈관평활근세포의 이상 증식에 미치는 영향에 관한 것이다. 상기 PDGF 수용체 베타의 3?TR에는 microRNA-9가 결합하는 서열이 존재함을 확인하였다(도 2). Subsequent experiments involved the effect of increased expression of microRNA-9 in vascular smooth muscle cells on abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells by PDGF receptor beta (PDGFRβ). In the 3? TR of PDGF receptor beta, it was confirmed that a sequence binding to microRNA-9 was present (FIG. 2).
또한, 세포주기를 FACS 분석을 통해서 확인한 결과, microRNA-9를 transfection한 군에서 10% serum 조건과 비교하였을 때, GO/G1 기(phase)가 증가하고, S기 및 G2/M 기가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 microRNA-9는 PDGF 수용체 베타의 발현을 조절하여 혈관평활근세포의 증식에 관여한다는 것을 확인할 수 있었다(도 3).In addition, when the cell cycle was analyzed by FACS analysis, the GO / G1 phase increased and the S and G2 / M groups decreased when compared with the 10% serum condition in the microRNA-9 transfection group I could confirm. Thus, it was confirmed that microRNA-9 is involved in the proliferation of vascular smooth muscle cells by regulating the expression of PDGF receptor beta (FIG. 3).
성장 자극이 주어진 혈관평활근세포에서 microRNA-9의 발현이 감소하는데, microRNA-9의 발현 감소를 저해하면 혈관평활근세포의 증식이 억제되게 된다. 증식하는 혈관평활근세포에서 microRNA-9의 발현을 유지시키는 microRNA-9 활성화제를 찾기 위해 다양한 카이네이즈 활성화제와 저해제를 가지고 스크리닝을 진행하였다. 혈관평활근세포에 저분자 화합물을 최종 1 uM의 농도로 3일 처리한 뒤 실시간 중합효소연쇄반응(real-time-PCR)을 통해 microRNA-9의 발현을 확인하였다. 스크리닝 결과 혈관평활근세포가 증식하는 조건에서 감소되는 microRNA-9의 발현을 정상 상태로 회복시키는데 SQ22536의 효과가 우수함을 알 수 있었다(도 4).The expression of microRNA-9 is decreased in smooth muscle-stimulated vascular smooth muscle cells. Inhibition of the decrease of microRNA-9 expression inhibits vascular smooth muscle cell proliferation. Screening was performed with various kinase activators and inhibitors to find microRNA-9 activators that maintain the expression of microRNA-9 in proliferating vascular smooth muscle cells. The expression of microRNA-9 was confirmed by real-time-PCR using a low-molecular-weight compound in vascular smooth muscle cells for 3 days at a final concentration of 1 uM. Screening revealed that the effect of SQ22536 was excellent in restoring the expression of microRNA-9, which is reduced under conditions of vascular smooth muscle cell proliferation, to a normal state (FIG. 4).
상기 SQ22536이 microRNA-9의 발현을 높이면, 발현된 microRNA-9는 PDGF 수용체 베타의 발현을 억제하는데, 실험 결과 SQ22536를 처리한 혈관평활근세포에서 PDGF 수용체 베타의 발현이 감소됨을 확인하였다. Imatinib는 PDGF 수용체 베타의 활성을 저해하는 저해제로 양성 대조군으로 사용하였다(도 5).As the SQ22536 increases the expression of microRNA-9, the expressed microRNA-9 inhibits the expression of PDGF receptor beta. As a result, the expression of PDGF receptor beta is reduced in SQ22536-treated vascular smooth muscle cells. Imatinib was used as a positive control for inhibiting the activity of PDGF receptor beta (Fig. 5).
또한, SQ22536에 의한 혈관평활근세포의 증식억제 효과를 농도별로 확인하였는데, SQ22536의 농도가 증가함에 따라 혈관평활근세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 6).In addition, the inhibitory effect of SQ22536 on vascular smooth muscle cell proliferation was examined by concentration, and it was confirmed that the proliferation of vascular smooth muscle cells was inhibited as the concentration of SQ22536 was increased (Fig. 6).
SQ22536에 의한 세포주기 변화를 FACS로 확인하였다. Imatinib는 PDGF 수용체 베타의 활성을 저해하는 저해제로 양성 대조군으로 사용하였다. 혈관평활근세포가 증식하는 조건인 10% FBS와 달리 SQ22536를 처리한 혈관평활근세포에서 GO/G1 기가 증가하고, S기 및 G2/M 기가 감소함을 확인하였다. 이는 microRNA-9를 형질주입(transfection)한 뒤 확인한 세포주기변화와 일치함을 확인하였다(도 7).Cell cycle changes by SQ22536 were confirmed by FACS. Imatinib was used as a positive control for inhibiting the activity of PDGF receptor beta. In contrast to 10% FBS, which is a condition for vascular smooth muscle cell proliferation, GO / G1 and S / G2 / M groups were decreased in SQ22536 treated vascular smooth muscle cells. It was confirmed that this was consistent with the confirmed cell cycle change after transfection of microRNA-9 (Fig. 7).
결과적으로, microRNA-9는 혈관평활근세포가 증식할 때 감소하는 microRNA로 혈관평활근세포의 증식에 관여한다. microRNA-9는 혈관평활근세포의 증식에 중요한 PDGF 수용체 베타를 타겟으로 하며, microRNA-9의 발현이 높은 혈관평활근세포는 PDGF 수용체 베타의 발현 억제로 혈관평활근세포의 증식이 저해된다. 또한, microRNA-9의 발현을 증가시키는 microRNA-9 활성화제 SQ22536은 증식하는 혈관평활근세포에서 감소되는 microRNA-9의 발현을 회복시켜 PDGF 수용체 베타의 발현을 저해하고, 그 결과 혈관평활근세포의 증식을 억제하는 효과를 보인다. 따라서, SQ22536는 혈관 재협착과 같은 혈관평활근세포의 이상 증식으로 발생하는 질병의 새로운 치료제로서의 가능성을 가지고 있다.
As a result, microRNA-9 is involved in the proliferation of vascular smooth muscle cells as a microRNA that decreases when vascular smooth muscle cells proliferate. The microRNA-9 targets the PDGF receptor beta, which is important for vascular smooth muscle cell proliferation. Vascular smooth muscle cells with high expression of microRNA-9 inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells by inhibiting the expression of PDGF receptor beta. In addition, the microRNA-9 activator SQ22536, which increases the expression of microRNA-9, restores the expression of microRNA-9, which is reduced in proliferating vascular smooth muscle cells, and inhibits the expression of PDGF receptor beta, resulting in the proliferation of vascular smooth muscle cells . Thus, SQ22536 has potential as a new therapeutic agent for diseases caused by abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells such as vascular restenosis.
<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for inhibiting hyper-proliferation of vascular smooth muscle cell <130> P131633 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Pharmaceutical composition for inhibiting hyper-proliferation of 비ascular smooth muscle cell <130> P131633 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Rattus norvegicus <400> 1 ucuuugguua ucuagcugua uga 23
Claims (4)
[화학식 1]
A pharmaceutical composition for preventing or treating abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells, comprising SQ22536 represented by the following formula (1).
[Chemical Formula 1]
혈관평활근세포 이상 증식 질환은 혈관재협착증, 혈관협착증, 죽상동맥경화증, 아테롬성동맥경화증, 심부전증, 심근경색증, 협심증, 부정맥증, 고혈압성 심장질환증, 선천성 심장질환증, 뇌졸중 또는 말초혈관협착증인 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the vascular smooth muscle cell proliferative disorder is selected from the group consisting of vascular restenosis, vascular stenosis, atherosclerosis, atherosclerosis, heart failure, myocardial infarction, angina, arrhythmia, hypertensive heart disease, congenital heart disease, stroke or peripheral vascular stenosis .
화학식 1로 표시되는 SQ22536을 0.5 내지 20 μM 포함하는 조성물.
The method according to claim 1,
A composition comprising 0.5 to 20 [mu] M of SQ22536 represented by the formula (1).
약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 조성물. The method according to claim 1,
0.0 > pharmaceutically < / RTI > acceptable carrier.
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