KR101593049B1 - 3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101593049B1
KR101593049B1 KR1020140056973A KR20140056973A KR101593049B1 KR 101593049 B1 KR101593049 B1 KR 101593049B1 KR 1020140056973 A KR1020140056973 A KR 1020140056973A KR 20140056973 A KR20140056973 A KR 20140056973A KR 101593049 B1 KR101593049 B1 KR 101593049B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cell
cancer
krs
expression
cells
Prior art date
Application number
KR1020140056973A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140135634A (ko
Inventor
이정원
김성훈
남서희
김대규
Original Assignee
재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 filed Critical 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority to US14/891,054 priority Critical patent/US20160146815A1/en
Priority to JP2016513871A priority patent/JP2016519318A/ja
Priority to PCT/KR2014/004276 priority patent/WO2014185692A1/ko
Publication of KR20140135634A publication Critical patent/KR20140135634A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101593049B1 publication Critical patent/KR101593049B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/9015—Ligases (6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 암 세포주에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의 작용을 분석하여 암 전이 억제제 스크리닝 및 암 세포의 암세포덩어리로부터의 이탈, 상피-중배엽세포 전이(epithelial- mesenchymal transition), 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 관한 것으로, 구체적으로 HCT116 세포주를 포함하여 다양한 대장암 세포를 이용하여 KRS를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포주나 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주를 제작하여 2차원적 환경에서 배양할 경우, KRS의 발현을 억제하는 세포주에서 불완전한 상피-중간엽세포 전이 표현형(incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype; incomplete ECM phenotype)이 유도되고, 이는 KRS의 발현 억제가 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착 및 세포-ECM 신호전달 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제작된 회전타원체(spheroid) 세포주를 수용성 환경 또는 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 경우, KRS의 발현 억제는 중간엽(mesenchymal) 세포로 세포를 유도하지만, 이는 세포-세포 부착의 와해로 연결되지는 못하며, 세포-ECM 부착 및 이와 관련된 신호활성을 억제함으로써 3차원 콜라겐 겔 배양환경에서 배양한 회전타원체(spheroid) 세포들로부터 이탈(dissemination)의 억제를 초래하고, 세포 미세환경 내에 존재하는 TGFβ1에 의한 세포의 이탈을 유도하지 못함을 확인함으로써 암 전이억제제 스크리닝 및 암 세포의 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 사용할 수 있고, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.

Description

3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법{Screening method for metastasis inhibitor of cancer using cell or spheroid cell mass regulated expression of lysyl-tRNA synthetase in 3-dimensional collagen gels environments}
본 발명은 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase)를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 혹은 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주를 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양하고, 암 세포의 세포-세포간 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM)의 부착, 세포부착의 신호전달 활성 및 세포 이탈(dissemination)의 변화 측정을 이용한 암 전이억제제 스크리닝 방법 및 암 세포의 이동, 침윤, 전이성 모니터링 방법에 관한 것이다.
암으로 인한 사망의 90%는 전이 때문이라고 알려져 있다. 전이는 혈류와 다른 인자들에 의해 암세포가 특정 기관으로 전달되는 것을 시작으로, 그 새로운 장소에서 암세포의 상호작용을 통해 다시 성장하는 것이다. 대부분의 암은 기관(organ)의 벽을 구성하는 상피세포에서 발생한다. 상피세포는 세포의 부착 및 이동에 관여하는 단백질인 FAK, Src, 팍실린(paxillin), ERKs 등을 발현하게 되고 이들의 활성과 발현이 조절됨으로써 세포-세포 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 이동 및 침윤 등의 다양한 기능들이 조절된다(Petrie and Yamada, 2012; WehrleHaller, 2012). 상기 단백질들은 상피세포의 세포-세포간 부착이 와해됨으로써 이동성이 강한 중간엽세포(mesenchymal cells)로의 전환에 관련하여 상피-중간엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; EMT)를 유도한다(Bolos et al., 2010). 이러한 EMT 현상은 배아 발달에 중요한 역할을 수행할 뿐만 아니라 조직을 훼손하여 질병을 일으킬 수 있는데, 대표적 질환으로는 조직섬유화증(fibrosis)과 암의 형성 및 발달이 있다. 조직섬유화증은 정상 기능을 담당하는 실질세포의 감소와 콜라겐의 축적을 일으켜 조직의 기능을 상실케 한다. 이 과정에서 변형된 세포형태, 골격구조, 콜라겐의 생성기능 및 이동성 등이 조직섬유화증의 원인인 것으로 알려져 있다(Kalluri and Neilson, 2003). 이러한 EMT 현상이 암에서도 일어난다. 암 덩어리를 구성하는 세포들로부터 EMT를 겪으며 이동성이 강한 암세포가 떨어져 나와 혈류 또는 림프계로 들어간 다음, 새로운 장소로 이동하여 종양을 새로이 형성할 수 있게 된다. 즉, 분극화된 상피세포(polarized epithelial cell)가 운동성 세포(motile cell)로 전환되는 EMT는 암종(carcinoma)이 분화되고 더욱 악성인 상태로 진행되는데 중요한 역할을 수행한다(Meng and Wu, 2012). 반면, 순환 종양세포(circulating tumor cell; CTC)들 즉, 전이성 세포의 이질성(heterogeneity)이 최근에 보고되어 전이를 위해서는 상피 타입(epithelial type)의 성향을 어느 정도 유지하는 불완전 EMT 표현형(incomplete EMT phenotype)의 세포들이 말단의 전이 장소(distal metastatic site)에서 다시 콜로니화(colonization)에의 이점을 가질 수 있는 것으로 확인되었다(Thiery and Lim, 2013; Yu et al., 2013).
여러 조직의 세포들은 각각 특이적인 미세환경(microenvironment)에 의해 세포의 특성이 유지된다. 따라서, 이러한 미세환경이 세포들을 적절하게 조절하지 못할 경우, 세포로서의 성질을 잃어버리거나(degeneration), 비정상적인 분화, 통제되지 않는 증식 등과 같은 비정상적인 세포 기능을 유발하여 암과 같은 질병이 발생한다(Sansone and Bromberg, 2011). 실제로 환자별로 암의 전이 경향과 치료 효과가 다른 이유는, 암세포 자체의 차이도 있겠지만, 주변의 종양 미세환경에서도 큰 영향을 받음으로써, 서로 다른 치료결과를 가져올 수 있다.
세포의 이동 및 침윤을 포함하는 전이성 암세포의 다양한 기능들은 세포가 전이하는 동안 세포 주위의 미세환경에 큰 영향을 받는다. 상기 미세환경에서 여러 종류의 성장인자나 TGFβ1 및 TNFα와 같은 사이토카인(cytokine)들이 분비되어 종양세포가 자라기 좋고, 이동 및 침윤하기 좋은 환경을 제공한다. 이처럼 종양미세환경이 세포들의 증식, 생존, 이동, 침윤들을 포함하는 다양한 기능유지 및 분화를 조절하기 때문에 미세환경에 대한 충분한 이해 없이 세포에 대한 연구나 임상 치료에 응용하는 것은 한계가 있다(Friedl et al., 2012). 현재 항암제는 암 세포 자체의 증식 또는 세포 신호전달 변화에 집중되어 약이 개발되어 왔기 때문에 종양 주변 미세환경의 변화에 의한 암의 발생과 진행을 조절하지 못하여 근원적인 암 발생 및 전이를 제어할 수 없었다. 그러므로 암세포 및 주변 세포환경의 유기적 네크워킹을 규명 및 분석하는 연구를 수행하여, 세포의 기능 특히, 부착(adhension), EMT, 이동 및 침윤에 대한 분자적 기전을 규명함으로써 새로운 항암전략을 암전이 억제차원에서 제시할 가능성을 갖고 있다(Friedl et al., 2012).
시험관 내 2차원적 환경에서의 세포배양은 전통적인 플라스틱 플라스크(plastic flask) 또는 접시(디쉬) 표면에 세포를 배양하는 것으로, 평평한 모양의 세포를 관찰하게 된다. 그래서 최근에는 생체 내 환경을 모방하기 위하여 인위적인 세포형태를 갖는 2차원의 단점을 보완한 3차원 세포배양 연구가 대두하고 있다(Nyga et al., 2011). 생체 내 환경에선 시험관 내 2차원적 환경에서와는 다른 길쭉한 세포형태를 가지기도 한다. 따라서, 시험관 내 3차원 세포배양이 실제로의 세포 형태 및 기능연구, 그리고 나아가 미세환경과의 상호작용 연구에 있어서 좋은 대안책이 될 수 있다(Aref et al., 2013). 따라서 세포 및 3차원 세포주변의 미세환경과의 상호작용을 통하여 부착, EMT, 이동 및 침윤 등 암세포의 전이 관련 세포기능이 어떻게 조절되는지를 분자적 수준에서 규명이 필요하며, 이는 암 전이제억제제의 개발에 사용될 수 있을 것이다.
아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase)는 세포 내에서 해당 아미노산과 tRNA를 결합시켜주고, 이렇게 형성된 아미노아실-tRNA는 신장인자(elongation factor), 리보솜(ribosome)으로 옮겨져서 단백질 합성에 사용된다. 따라서, 아미노산 및 tRNA에 대한 아미노아실-tRNA 합성효소의 결합특이성은 단백질 합성과정의 정확성을 유지하는데 중요한 결정인자이다. 이런 아미노아실-tRNA 합성효소의 한 구성원인 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)는 몇몇 포유류에서 아미노아실-tRNA 합성효소를 구성하는 단백질의 다양한 기능을 조절하기 위하여 분자 저장소(molecular reservior)로서 작용하는 거대 분자복합체를 형성하고, 인간 라이실-tRNA 합성효소는 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 함유하고 있으며, 또한, 대장암세포의 전이기능을 향상시켜 암 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2012, FASEB J. 26(10):4142-59).
이에 본 발명자들은, 3D 환경에서 배양된 암 세포에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의 작용을 분석하여 암 전이억제제의 스크리닝 방법을 개발하기 위해 노력하던 중, 대장암 세포인 HCT116 세포주를 이용하여 KRS를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주를 준비하여 세포외기질이 코팅된 2차원적 환경이나, 수용성의 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 3차원적 세포 배양 환경에서 배양 관찰하였을 때, KRS의 발현을 억제하는 세포주에서 불완전한 상피-중간엽세포 전이 표현형(incomplete epithelial-to-mesenchymal transition phenotype; incomplete ECM phenotype)이 유도되고, 이는 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착 및 세포-ECM 신호전달 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 상기 제작된 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주를 3D 배양환경에서 배양한 경우, KRS의 발현 억제는 세포 이탈(dissemination)을 억제하고, 중간엽(mesenchymal) 세포로 세포를 유도하지만, 이는 세포-세포 부착의 와해는 초래하지 못하며, 세포-ECM 부착 및 이와 관련된 ERKs의 활성화, 팍실린의 발현 및 인산화 (활성화)등의 신호활성을 억제함으로써 세포 미세환경 내로 이탈 (dissemination)을 억제하는 것을 확인하였고, 이러한 KRS-의존적인 암세포의 이탈이 대장암환자의 암조직의 염색에서 KRS 및 ERKs/팍실린이 암이 침윤하는 가장자리에서의 돋보이는 현상과 연결되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암 전이억제제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 세포의 암덩어리로부터의 이탈(dissemination), 상피-중배엽세포 전이 혹은 분화 (epithelial-mesenchymal transition), 이동, 침윤, 전이 및 그들과 관련한 신호전달 인자들의 발현 및 활성의 모니터링 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 전이억제제 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현 또는 발현하지 않도록 조절된 암 세포주 혹은 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 KRS 작용을 저해하는 피검물질을 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암세포의 암세포주 또는 암세포덩어리로부터의 이탈(dissemination), 상피-중배엽세포 전이 또는 분화(epithelial-mesenchymal transition), 이동, 침윤, 전이 수준 또는 그들과 관련한 신호전달 인자들의 발현 및 활성의 모니터링 방법을 제공한다:
1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현 또는 발현하지 않도록 조절된 암 세포주또는 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 KRS의 작용 수준을 이용하여 상기 암 세포주 또는 암세포덩어리의 전이 수준을 분석하는 단계.
본 발명은 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 배양된 암 세포주에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS) 의존적인 세포-세포간 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포부착의 신호전달 활성 및 세포 이탈을 분석함으로써, 궁극적으로는 이를 통해 암 전이억제제의 스크리닝 방법 및 암 세포의 암덩어리로부터의 이탈 (dissemination), 상피-중배엽세포 전이 혹은 분화 (epithelial-mesenchymal transition), 이동, 침윤, 전이 및 그들과 관련한 신호전달 인자들의 발현 및 활성의 모니터링 방법으로 사용할 수 있으며, 이는 약물 개발에 필요한 전임상 실험 시 저비용 고효율의 부가가치를 창출할 수 있는 스크리닝 방법 중의 하나로 유용하게 사용될 것이다.
도 1A는 현적배양(hanging drop culture) 방법으로 얻은 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포를 3D 환경에서 배양하는 세포 배양 모식도를 나타내는 도이다.
도 1B는 2차원 환경에서 배양한 세포 및 현적배양(hanging drop culture) 방법으로 얻은 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포의 배양 모습을 비교한 도이다.
도 1C는 현적배양 방법으로 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포에서 시간이 경과함에 따라 E-카데린(E-cadherin)의 발현이 증가하는 것을 나타내는 도이다.
도 1D는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포의 모습을 광학현미경하에서 관찰한 도이다.
도 1E는 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 억제하는 shRNA를 형질도입(transfection)시킨 세포주들을 현적배양 방법으로 배양하여 얻은 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주에서 KRS의 발현을 확인한 도이다.
Mock: 대조군, 및
0-3, 2-1, 2-2, 5-3: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들.
도 1F는 현적배양 방법으로 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포에서 상피-중배엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; EMT) 관련 마커의 mRNA 발현을 확인한 도이다.
P: HCT116 모세포주인 대조군,
2-1, 2-2, 2-3, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 1G는 현적배양 방법으로 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포에서 EMT 관련 마커의 단백질 발현을 확인한 도이다.
Mock: 대조군, 및
shKRS: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론.
도 2A는 세럼(serum)을 포함하는 정상적 2차원적 (2D) 세포 배양에서 KRS에 의존적인 EMT 표지자 단백질 발현 변화를 확인한 도이다.
P: 대조군,
2-1, 2-2, 2-3, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
WT: KRS 과발현 세포주.
도 2B는 정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원 환경에서 배양한 세포에 아무것도 처리하지 않거나, TNFα 또는 TGFβ1을 처리하였을 때 EMT 관련 마커의 단백질 발현변화를 나타내는 도이다.
Parental: 대조군,
shKRS 2-1: KRS의 발현이 억제된 세포주 2-1 클론, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 2C는 정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원 환경에서 배양한 세포에서 KRS의 발현을 조절한 경우 E-카데린(E-cadherin) 및 β-카테닌(β-catenin)의 발현이 억제되는 것을 나타내는 도이다.
Parental: 대조군,
shKRS: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 2D는 정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원적 (2D) 환경에서 세포 배양시, 플레이트에 붙어서 콜로니(colony)를 이루며 자라는 세포의 모습을 위상차 현미경으로 관찰한 것을 나타내는 도이다.
KRS-neg : KRS의 발현이 억제된 세포주, 및
KRS-pos : HCT116 모세포주 또는 KRS 과발현 세포주.
도 3은 세포를 정상적인 경우보다 세럼(serum)의 농도를 2%로 낮추어, 세럼속의 성장인자들의 효과를 최소화하고 세포를 라미닌(laminin)이 미리 코팅된 디쉬나 커버글래스상에 2차원적으로 배양하며 분석한 도이며,
도 3A는 KRS의 발현이 억제된 세포주들(shKRS2-1, shKRS5-4) 에서 세포부착에 따른 Src, ERKs, 팍실린(paxillin)의 인산화가 현저히 감소하는 반면 FAK의 인산화 수준에는 차이가 없는 것을 나타내는 도이고,
도 3B는 KRS를 발현하는 모세포주(parental cells) 및 과발현 세포주는 ERKs의 인산화 수준이 높은 반면 KRS의 발현이 억제된 세포주들에서 현저히 낮아져 있는 것을 나타내는 도이며,
도 3C는 KRS를 발현하는 모세포주 및 과발현 세포주는 팍실린(paxillin)의 인산화 수준이 높은 반면 KRS의 발현이 억제된 세포주들에서 현저히 낮아져 있는 것을 나타내는 도이고,
도 3D는 HCT116 세포에 KRS의 suppression에 따른 세포모양이나 퍼짐의 정도에 큰 차이없는 것을 나타내는 도이며,
도 3E는 KRS를 발현하는 모세포주 (parental cells) 및 과발현 세포주는 ERKs의 인산화 (활성화) 수준이 높은 반면 KRS의 억제제인 YH16899 (Kim DG et al., Nat Chem Biol. 2014 Jan;10(1):29-34)를 처리하였을 경우, 그 ERKs의 인산화가 현저히 낮아져 있는 것을 면역형광염색(immunofluorescence)에서 확인한 것을 나타내는 도이고,
도 3F는 KRS를 발현하는 모세포주 (parental cells) 및 과발현 세포주는 팍실린의 Tyr118 인산화 (활성화) 수준이 높은 반면, KRS의 억제제인 YH16899 (Kim DG et al., Nat Chem Biol. 2014 Jan;10(1):29-34)를 처리하였을 경우, 그 ERKs의 인산화가 현저히 낮아져 있는 것을 면역형광염색(immunofluorescence)에서 확인한 것을 나타내는 도이며,
도 3G는 KRS를 발현하는 모세포주 (parental cells) 및 과발현 세포주는 FAK Tyr397 인산화와 관련된 세포모양이나 퍼짐의 정도가 YH16899의 처리에 따라 큰 차이없는 것을 나타내는 도이다.
도 4A는 정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원 환경에서 배양한 세포에서 KRS의 발현을 조절한 경우 FAK 및 ERKs의 인산화가 억제됨을 나타내는 도이다.
P: 대조군,
2-1, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
myc-KRS WT: myc-KRS 과발현 세포주.
도 4B는 정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원 환경에서 배양한 세포에서 KRS의 발현을 조절한 경우 c-Src 및 팍실린(paxillin)의 인산화가 억제됨을 나타내는 도이다.
P: 대조군, 및
2-1, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들.
도 4C는 KRS 발현을 조절한 세포주들을 현탁액(suspension) 상태 또는 2차원적 환경에서 파이브로넥틴(fibronectin)이 미리 코팅된 배양접시에 다시 옮겨 2시간 동안 배양한 후, FAK 및 ERKs의 인산화를 확인한 도이다.
S: 현탁액,
FN: 파이브로넥틴이 미리 코팅된 배양접시에 세포를 배양한 조건,
P: 대조군,
2-1, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
myc-KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 4D는 KRS의 발현을 억제한 세포주들을 2차원 환경에서 파이브로넥틴이 미리 코팅된 2차원 환경의 배양접시에 다시 옮겨 2시간 동안 배양한 후, 타이로신(tyrosine) 397이 인산화된 FAK을 확인함으로써 초점 접착(focal adhesion)의 발달이 억제됨을 나타내는 도이다.
P: 대조군,
2-1, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
myc-KRS WT: myc-KRS 과발현 세포주.
도 5는 콜라겐으로 둘러싸인 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주들을 3시간 또는 24시간동안 배양하였을 때, KRS가 발현하거나 발현하지 않도록 조절한 경우 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착 관련 신호전달의 활성 변화를 나타내는 도이다.
Parental: 대조군,
2-1, 2-2, 2-3, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 6A는 3차원 콜라겐 겔 내에서 배양한 정상적인 KRS를 발현하는 HCT116세포, KRS 발현을 저해한 세포주 (shKRS2-1, shKRS5-4)의 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주들을 p-ERKs 면역염색(immunostaining) 후 공초점 현미경으로 관찰한 p-ERKs의 면역염색(immunostaining), ERKs의 인산화 수준을 나타내는 도이다.
도 6B는 3차원 콜라겐 겔 내에서 정상적인 KRS를 발현하는 HCT116세포, KRS 발현을 저해한 세포주 (shKRS2-1)의 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주들의 팍실린 면역염색(immunostaining) 후 공초점 현미경으로 관찰한 팍실린(paxillin)을 나타내는 도이다.
도 6C는 3차원 콜라겐 겔 내에서 정상적인 KRS를 발현하는 HCT116세포의 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주들에게 대조군으로 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 처리하거나 KRS를 저해하는 YH16899를 처리한 후, p-ERKs 면역염색(immunostaining)하고 공초점 현미경으로 관찰하여 ERKs의 인산화 수준을 나타내는 도이다.
도 6D는 3D 콜라겐 겔 내에서 정상적인 KRS를 발현하는 HCT116세포의 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주들에게 대조군으로 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 처리하거나 MEK/ERK 인산화 효소를 억제하는 선택적 억제제(selective inhibitor)인 U0126를 처리 혹은 KRS를 저해하는 YH16899를 처리한 후, 팍실린을 면역염색(immunostaining)하고 공초점 현미경으로 관찰하여 팍실린의 발현 수준을 나타내는 도이다.
도 7A는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 HCT116 모세포주에서 ERKs 억제제를 처리하였을 때 세포-ECM 부착 관련 신호전달의 활성변화를 나타내는 도이다.
U0126: ERKs 억제제.
도 7B는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 HCT116 모세포주에서 ERKs 억제제를 처리하였을 때 세포-세포 부착 관련 유전자들의 mRNA 발현변화를 나타내는 도이다.
U0126: ERKs 억제제.
도 8A는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포에서 EMT 관련 단백질 변화를 나타내는 도이다.
P: 대조군,
2-1, 2-2: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 8B는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포를 5일 동안 배양하였을 때 snail1의 발현 변화를 나타내는 도이다.
Parental: 대조군, 및
shKRS2-1, shKRS2-2: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들.
도 8C는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들을 3일 동안 배양하였을 때 E-카데린의 발현이 억제됨을 나타내는 도이다.
Parental: 대조군,
shKRS: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 9A는 3차원 콜라겐 겔 내에서 KRS가 발현하는 모세포주 혹은 과다발현하는 세포주에게서는 상피 마커(epithelial marker)인 cytokeratin 14 (CK14)의 발현이 전반적으로 높고 회전타원체(spheroid)의 가장자리에서 이탈하는 세포들에게서 발현이 잘되고 있으나 (하얀화살표 머리), KRS가 발현억제된 세포에서는 CK14의 발현이 전반적으로 낮고 회전타원체(spheroid)로부터 이탈하는 세포들에서 발현되지 않음을 나타내는 도이다.
도 9B는 3차원 골라젠 겔 내에서 KRS가 발현하는 모세포주 혹은 과다발현하는 세포주에게서는 상피 마커(epithelial marker)인 cytokeratin 14 (CK14)의 발현이 전반적으로 높고 회전타원체(spheroid)의 가장자리에서 이탈하는 세포들에게서 발현이 잘되고 있으나 (하얀화살표 머리), KRS가 발현되더라도 MEK/ERK 억제제 U1026 혹은 KRS 억제제 YH16899가 처리된 상황에서는 상피 마커(epithelial marker)인 CK14의 발현이 전반적으로 낮고 회전타원체(spheroid)로부터 이탈하는 세포들에서 발현되지 않음을 나타내는 도이다.
도 10A는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들 모습에서 KRS의 발현을 억제한 경우에 세포의 이탈(dissemination)이 나타나지 않음을 확인한 도이다.
Parental: 대조군,
2-1, 2-2, 2-3, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRSWT: KRS 과발현 세포주.
도 10B는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들에서 TGFβ1 단백질의 발현 수준을 확인한 도이다.
Parental: 대조군,
2-1, 2-2, 2-3, 5-4: KRS의 발현이 억제된 세포주 클론들, 및
KRSWT: KRS 과발현 세포주.
도 11A는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들 모습에서 TNFα를 처리하였을 때 세포의 이탈을 확인한 도이다.
Parental: 대조군,
shKRS: KRS의 발현이 억제된 세포주, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 11B는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들 모습에서 TGFβ1을 처리하였을 때 세포의 이탈을 확인한 도이다.
Parental: 대조군,
shKRS: KRS의 발현이 억제된 세포주, 및
KRS WT: KRS 과발현 세포주.
도 12는 3D 콜라겐 겔 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포들 모습에서 TGFβ 및 ERKs 억제제를 처리하였을 때 세포의 이탈이 억제됨을 나타내는 도이다.
U0126: ERKs 억제제.
도 13A는 HCT116 모세포, KRS발현이 저해된 세포주 그리고 KRS 과발현 세포주에 EKAR(Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)-based ERKs activity indicators, Harvey et al., 2008 PNAS 105:19264-19269)를 형질주입하여 FRET 기법을 이용하여 ERKs 활성을 측정한 것을 나타낸 도이다. ERKs 인산화가 높은 신호는 붉은색, 인산화가 낮은 신호는 푸른색으로 나타낸다.
도 13B는 HCT116 모세포 (parental, P), KRS발현이 저해된 세포주 [shKRS2-1 및 shKRS5-4 ], 그리고 KRS 과발현 세포주(KRS WT)에 EKAR을 형질주입하여 FRET 기법을 이용하여 ERK 활성을 측정한 결과를 통계적으로 나타낸 도이다.
도 14는 HCT116 모세포 (parental, P), KRS발현이 저해된 세포주 [shKRS2-1 및 shKRS5-4] 그리고 KRS 과발현 세포주(KRS WT)에 각각 pCMV-Mock (M), pCMV-팍실린(paxillin) (Px), pCMV-ERK1/2 (Ek)를 일시적 형질주입한 경우, 팍실린(paxillin)의 발현과 Tyr118 인산화를 나타내는 도이다.
도 15A는 myc-KRS이 과다발현된 HCT116세포주를 이용하여, 10% 세럼(serum)이 존재하는 정상적 2D 조건에서 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였을 때, integrin α6, integrin β1 , KRS 및 p67LR(p67 laminin receptor)이 결합하는지 여부와, YH16899 (YH)가 처리된 경우의 변화를 나타내는 도이다.
도 15B는 myc-KRS이 과다발현된 HCT116세포주를 이용하여, laminin (10 mg/ml)이 미리 코팅되고 2% 세럼(serum)이 포함된 2차원 조건에서 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였을 때, integrin α6, integrin β1 , KRS 및 p67LR(p67 laminin receptor)이 결합하는지 여부와, YH16899 (YH)가 처리된 경우의 변화를 나타내는 도이다.
도 16A는 3D 콜라겐 겔에서 배양한 세포의 회전타원체(spheroid)를 이용하여, KRS에 의존적으로 활성화된 ERKs가 그 하위인자(downstream)로 잘 알려진 전사인자 Elk-1 보다는 c-Jun의 인산화와 연계성이 있음을 나타내는 도이다.
도 16B는 팍실린의 프로모터 부위에 존재하는 c-Jun 및 Elk-1의 결합가능 부위와 대조를 위한 비결합 부위를 나타내는 도이다.
도 16C는 3차원 콜라겐 겔에서 회전타원체(spheroid)로 배양한 HCT116 모세포주에 DMSO를 처리한 대조군과 YH16899를 처리한 시료, 그리고 KRS발현이 저해된 세포주 shKRS2-1로부터의 시료에 c-Jun 항체를 이용하여 ChIP(chromatin immmunoprecipitation) 분석을 수행한 결과, 대조군에서 c-Jun 결합 부위를 나타내는 도이다.
도 16D는 3차원 콜라겐 겔에서 회전타원체(spheroid)로 배양한 HCT116 parental 세포주에 DMSO를 처리한 대조군과 U1026 또는 YH16899를 처리한 시료, 그리고 KRS발현이 저해된 세포주 shKRS2-1로부터의 시료에 Elk-1 항체를 이용하여 ChIP 분석을 수행한 결과를 나타내는 도이다.
도 17A는 다른 대장암 세포주 SW620에 KRS의 발현을 억제한 경우, 3차원 콜라겐 겔 내의 회전타원체(spheroid)로부터 이탈(dissemination)이 억제되는 것을 나타내는 도이다.
도 17B는 다른 대장암 세포주 SW620에 KRS 억제제인 YH16899를 처리한 경우, ERKs의 인산화가 줄어들고 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화가 줄어드는 것을 나타내는 도이다.
도 18A는 3차원 콜라겐 겔에서 HCT116 세포주의 ERK inhibitor인 U0126을 처리하였을 때 팍실린과 같은 초점 접착(focal adhesion) 관련 분자의 발현 및 인산화 수준이 낮아지고 상피 마커(epithelial marker)의 발현이 낮아지는 것을 나타내는 도이다.
도 18B는 3차원 콜라겐 겔에서 HCT116 세포주의 KRS inhibitor인 YH16899를 처리하였을 때 ERKs의 인산화 및 팍실린과 같은 초점 접착(focal adhesion) 관련 분자의 발현 및 인산화 수준이 낮아지고 상피 마커(epithelial marker)의 발현이 낮아지는 것을 나타내는 도이다.
도 19A는 integrin α6의 기능억제항체를 미리 처리한 경우에 세포를 라미닌(laminin)이 미리코팅된 2차원 환경에 2시간 동안 배양하고서 신호활성을 확인하였을 경우, FAK의 인산화는 변하지 않고 ERKs의 활성이 낮아짐으로써, FAK과 ERKs 간의 신호활성이 연계되지 않음을 나타내는 도이다.
도 19B는 HCT116 parental 모세포에 Ad-HA 대조군 아데노바이러스 혹은 Ad-HA-R454 FAK 인산화효소 활성이 죽은 형태(dead form)의 아데노바이러스를 감염시키거나, KRS 발현을 저하시킨 세포주에 Ad-HA 대조군 바이러스, Ad-HA ΔN(1-100) FAK, 혹은 Ad-HA-FAK WT 바이러스를 감염시킨 후, FAK의 인산화와 ERKs의 활성의 변화를 확인하여, FAK과 ERKs의 활성이 서로 연계되지 않음을 나타내는 도이다.
도 19C는 HCT116 parental 모세포에 Ad-HA 대조군 바이러스 혹은 Ad-HA-R454 FAK 인산화효소 활성이 죽은 형태(dead form)의 아데노바이러스를 감염시키거나, KRS 발현을 저하시킨 세포주(shKRS2-1)에 Ad-HA 대조군 바이러스, Ad-HA ΔN(1-100) FAK, 혹은 Ad-HA-FAK WT 바이러스를 감염시킨 후, 세포주들의 회전타원체(spheroid)를 3차원 콜라겐 겔에서 지속 촬영(time-lapse) 현미경으로 세포의 이탈(dissemination)을 관찰한 결과, KRS의 발현이 억제된 세포주에게 FAK을 과다발현시키더라도 이탈이 유도되지 않음을 나타내는 도이다.
도 19D는 HCT116 parental 모세포에 Ad-HA 대조군 바이러스 혹은 Ad-HA-R454 FAK 인산화효소 활성이 죽은 형태(dead form)의 아데노바이러스를 감염키거나, KRS 발현을 저하시킨 세포주(shKRS5-4)에 Ad-HA 대조군 바이러스, Ad-HA ΔN(1-100) FAK, 혹은 Ad-HA-FAK WT 바이러스를 감염시킨 후, 세포주들의 회전타원체(spheroid)를 3차원 콜라겐 겔에서 지속 촬영(time-lapse) 현미경으로 세포의 이탈(dissemination)을 관찰한 결과, KRS의 발현이 억제된 세포주에게 FAK을 과다발현시키더라도 이탈이 유도되지 않음을 나타내는 도이다.
도 19E는 Active한 돌연변이 L37A FAK를 발현시킨 세포주에서도 FAK의 활성에 의한 ERKs의 활성이 연계되지 못하는 것을 나타내는 도이다.
도 20A는 KRS 발현을 저하시킨 세포주에 각각 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), pCMV-ERK1/2를 형질주입하여 안정 세포주(stable cell line)을 구축한 후 관련된 인자들의 발현을 나타내는 도이다.
도 20B는 KRS 발현을 저하시킨 세포주에 각각 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), pCMV-ERK1/2를 형질주입하여 안정 세포주(stable cell line)을 구축한 후 회전타원체(spheroid)를 형성하고, 3차원 콜라겐 겔 내에서 회전타원체(spheroid)의 이탈(dissemination) 유무를 지속 촬영(time-lapse) 현미경을 통해 28시간동안 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 21A는 대장암으로 확정 진단받은 임상적 조직들을 포함한 인간 결장 암조직(human colon tumor tissue)들의 추출액으로부터 팍실린(paxillin), p-ERKs, E-cadherin, 및 KRS의 웨스턴 블랏을 통해 발현량의 연관성을 나타낸 도이다.
도 21B는 Grade II 및 III로 확정 진단받은 임상적 조직들을 포함한 인간 결장 암조직(human colon tumor tissue)들로부터 확보한 조직으로부터 팍실린(paxillin), p-ERKs와 KRS의 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 통하여 상기 단백질들의 연관성을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암 전이억제제 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 암세포주 또는 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암세포주 또는 암세포덩어리에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 KRS 작용을 저해하는 피검물질을 선별하는 단계.
상기 단계 1)의 3차원 환경은 수용성 환경 또는 콜라겐(collagen)으로 둘러싸인 환경일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 당업계의 당업자에게 잘 알려진 제 1형 콜라겐, 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin), 메트리겔 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 천연물질의 하이드로겔(hydrogel)은 모두 사용가능하고, 또한 조합적으로 다양한 농도 비율로 섞어 사용가능하기도 하다. 또한, 상기 콜라겐의 농도는 1 내지 5 ㎎/㎖인 것이 바람직하고, 2 내지 4 ㎎/㎖인 것이 더욱 바람직하며, 2 내지 2.5 ㎎/㎖인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 콜라겐은 중성으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 3차원 환경에서 배양되는 암 세포주는 수용액 내 회전타원체 배양이거나 현적배양(hanging drop culture)하여 세포외기질로 둘러싸인채 회전타원체(spheroid)의 덩어리를 형성한 세포주인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 암은 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암인 것이 바람직하고, 이는 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 폐암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 대장암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 항체, 항체의 부분, 비펩티드성 화합물, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 3)의 KRS의 작용은 암 세포의 세포-세포간 부착, 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포의 분산 (scattering), 세포의 상처치유(wound-healing), 세포부착의 신호전달 인자들의 활성 변화, c-Jun의 팍실린 프로모터에의 결합, 및 회전타원체(spheroid) 세포 덩어리로부터 이탈(dissemination)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 세포-세포간 부착은 상피 마커들인 ZO-1, 오클루딘, CK14, β-카테닌(β-catenin), E-카데린(E-cadherin), 또는 중간엽 마커들인 파이브로넥틴, 트위스트 (Twist), 비멘틴, α-SMA (smooth muscle actin), 스네일1 (snail1), 슬러그(Slug), 또는 N-카데린 (N-cadherin)의 발현 또는 발현위치가 변화하는 것이 바람직하고, 상기 세포-세포외기질 부착은 세포가 세포외기질에 부착한 정도와 세포의 퍼짐 (spreading) 정도, 초점 접착(focal adhesion)의 생성과 와해, 액틴의 재구성, 인산화된 FAK, c-Src, ERKs, 혹은 팍실린(paxillin)의 발현, 또는 발현위치가 변하는 것일 수 있으며, 세포부착의 신호전달 활성은 FAK, c-Src, ERKs, c-Jun, 또는 팍실린(paxillin)의 발현이나 인산화가 변화 또는 감소하거나 인테그린α6와의 결합이 변화하는 것 일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 단계 3)의 KRS 작용 분석은 본 발명의 실시예에 의하면 웨스턴 블랏, 실시간 PCR(real time PCR), 면역침강법(co-immunoprecipitation), ChIP(chromatin immunoprecipitation), FRET 분석, 면역형광염색(immunofluorescence), 및 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법이라면 모두 사용가능하다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 암세포의 암세포주 또는 암세포덩어리로부터의 이탈 (dissemination), 상피-중배엽세포 전이 또는 분화 (epithelial-mesenchymal transition), 이동, 침윤, 전이 수준 또는 그들과 관련한 신호전달 인자들의 발현 또는 활성 모니터링 방법을 제공한다:
1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 암세포주 또는 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 KRS의 작용 수준을 이용하여 상기 암세포주 또는 암세포덩어리의 전이수준을 분석하는 단계.
상기 단계 1)의 3차원 환경은 수용성 환경 또는 콜라겐(collagen)으로 둘러싸인 환경일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 당업계의 당업자에게 잘 알려진 제 1형 콜라겐, 라미닌(laminin), 파이브로넥틴(fibronectin), 메트리겔 또는 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 천연물질의 하이드로겔(hydrogel)은 모두 사용가능하고, 또한 조합적으로 다양한 농도 비율로 섞어 사용가능하기도 하다. 또한, 상기 콜라겐의 농도는 1 내지 5 ㎎/㎖인 것이 바람직하고, 2 내지 4 ㎎/㎖인 것이 더욱 바람직하며, 2 내지 2.5 ㎎/㎖인 것이 가장 바람직하다. 또한, 상기 콜라겐은 중성으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 3차원 환경에서 배양되는 암 세포주는 수용액 내 회전타원체 배양이거나 현적배양(hanging drop culture)하여 세포외기질로 둘러싸인채 회전타원체(spheroid)의 덩어리를 형성한 세포주인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 1)의 암은 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암인 것이 바람직하고, 이는 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 폐암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 대장암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 KRS의 작용은 암 세포의 세포-세포간 부착, 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포의 분산 (scattering), 세포의 상처치유(wound-healing), 세포부착의 신호전달 인자들의 활성 변화, c-Jun의 팍실린 프로모터에의 결합, 및 회전타원체(spheroid) 세포 덩어리로부터 이탈(dissemination)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 세포-세포간 부착은 상피 마커들인 ZO-1, 오클루딘, CK14, β-카테닌(β-catenin), E-카데린(E-cadherin), 또는 중간엽 마커들인 파이브로넥틴, 트위스트 (Twist), 비멘틴, α-SMA (smooth muscle actin), 스네일1 (snail1), 슬러그(Slug), 또는 N-카데린 (N-cadherin)의 발현 또는 발현위치가 변화하는 것이 바람직하고, 상기 세포-세포외기질 부착은 세포가 세포외기질에 부착한 정도와 세포의 퍼짐 (spreading) 정도, 초점 접착(focal adhesion)의 생성과 와해, 액틴의 재구성, 인산화된 FAK, c-Src, ERKs, 혹은 팍실린(paxillin)의 발현, 또는 발현위치가 변하는 것일 수 있으며, 세포부착의 신호전달 활성은 FAK, c-Src, ERKs, c-Jun, 또는 팍실린(paxillin)의 발현이나 인산화가 변화 또는 감소하거나 인테그린α6와의 결합이 변화하는 것 일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 단계 2)의 KRS 작용 분석은 본 발명의 실시예에 의하면 웨스턴 블랏, 실시간 PCR(real time PCR), 면역침강법(co-immunoprecipitation), ChIP(chromatin immunoprecipitation), FRET 분석, 면역형광염색(immunofluorescence), 및 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법이라면 모두 사용가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 2차원 환경에서 배양한 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포(도 1B 참조)에서 E-카데린의 발현이 배양시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였고(도 1C 참조), 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)에 의한 영향을 확인하기 위하여 KRS 녹아웃 또는 과발현 세포주를 제작하여 이를 확인하였다(도 1E 참조). 상기 제조된 KRS 녹아웃 세포주에서 상피-중간엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; ETM)관련 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 3차원적 배양환경에서도 배양한 후 확인한 결과, 상피 마커인 E-카데린의 발현이 감소했지만, 중간엽세포 마커인 비멘틴(Vimentin), N-카데린(N-cadherin) 및 트위스트(Twist) mRNA의 수준은 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 1E 참조).
또한, 세럼(serum) 10%를 포함하는 정상적 2차원적 (2D) 환경에서 배양한 HCT116 (parental cell) 모세포와 KRS 과발현 세포주(WT)에서 상피 마커(epithelial marker)의 발현이 중간엽세포 마커(mesenchymal marker)보다 증가되어있는 반면, KRS 발현이 저해된 세포주(2-1, 2-1, 2-3, 5-4)들에서는 상피 마커(epithelial marker)의 발현이 중간엽세포 마커(mesenchymal marker)보다 감소되어있는 것을 확인하였다. (도 2A 참조).
또한, KRS의 발현이 억제된 세포주에서 주변 미세환경인자들의 영향을 확인하기 위해 TNFα 또는 TGFβ1를 처리한 결과, TGFβ1를 처리하였을 때 상피 마커 단백질인 오클루딘(occludin)의 발현량이 증가하고, 중간엽세포 마커인 파이브로넥틴의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 2B 참조).
또한, KRS의 발현이 억제된 세포주에서 E-카데린 및 β-카테닌의 발현이 억제되었으나(도 2C 참조), 세포-세포간의 부착에는 현저한 변화가 없음을 확인하였다(도 2D 참조). 따라서, KRS가 발현이 되지 않도록 조절하면 상피세포 마커들의 발현이 억제되고, 중간엽 세포 마커들의 발현이 증가하지만, 여전히 세포가 콜로니(colony)를 형성하며 자라고, 흩어지지 않음으로써(도 2C 및 2D 참조), 부분적인 상피-중배엽세포 전이 혹은 분화 (epithelial-mesenchymal transitin, EMT) 현상이 유도되는 것으로 나타난다.
또한, HCT116 (parental) 모세포, KRS 과발현 (Myc-KRS-WT), KRS 발현이 저해된 세포주 (shKRS2-1, shKRS5-4) 세포들을 라미닌(laminin)으로 pre-coated된 배양 접시와 커버 글래스에 리플레이팅(replating)을 하고서 아무처리를 하지 않거나 (도 3A, 3B, 3C, 및 3D 참조), YH16899 처리하는 (도 3A, 3E, 3F, 및 3G 참조) 검정을 수행하여 KRS의 발현이 FAK의 인산화는 달리 pERKs 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화와 연계성이 있고 (도 3A 참조), pERKs (도 3B 및 3E 참조) 및 Tyr118이 인산화된 팍실린(paxillin)이 위치하는 focal adhesion에 관련하여 영향을 주지만 (도 3C 및 3F 참조), FAK Tyr397의 인산화 및 세포 형태(도 3D 및 도 3G)는 큰 차이가 없다는 사실을 확인하였다.
또한, KRS의 발현이 억제된 세포주에서 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착관련 신호전달의 활성을 확인한 결과, FAK, ERKs, c-Src 및 팍실린(paxillin)의 활성이 현저히 감소하고(도 4A 및 4B 참조), 이에 따른 초점 접착(focal adhesion) 형성이 억제되는 것을 확인하였다(도 4D 참조).
또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid)인 덩어리로 배양된 세포주(도 1D 참조)에서 KRS의 발현을 억제하는 경우, ERK 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성이 억제됨을 확인하였고(도 5 참조), 3차원 콜라겐 겔 내에서 하루 동안 배양한 HCT116 parental 모세포, 발현을 저해한 세포주 (shKRS2-1, shKRS5-4) 그리고 U0126과 YH16899를 처리한 HCT116 parental 모세포에서 ERKs의 인산화와 팍실린(paxillin)의 발현을 면역염색을 수행한 결과, 모세포와 비교해서 KRS발현을 저해한 세포주 또는 저해제를 처리한 시료에서 확연히 ERKs의 인산화(도 6A, 6C)와 팍실린(paxillin)의 발현(도 6B, 6D)이 감소되어 있는 것을 확인하였다.
KRS를 발현하는 HCT116 모세포에 ERKs 억제제를 처리하였을 때, FAK, 팍실린(paxillin), E-카데린의 발현 및 활성이 현저히 감소함을 확인하였다(도 7A 참조). 또한, 상기 조건에서 신호활성인자의 mRNA 수준을 확인한 결과, ERKs 억제제에 의해서 E-카데린의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 7B 참조).
또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid)인 덩어리로 배양된 KRS 발현 세포주에서 회전타원체(spheroid) 세포들에서 상피세포마커 단백질들은 감소하고 중간엽 세포 마커 단백질은 증가하나 (도 8A 및 B 참조), 세포간의 부착이 흩어지지 않는 결과를 확인하였으며(도 8C 참조), 3차원 콜라겐 겔 내에서 하루 동안 배양한 HCT116 parental 모세포, 발현을 저해한 세포주 (shKRS2-1), myc-KRS WT을 과다발현하는 세포주, 그리고 U0126과 YH16899를 처리한 세포에서 상피세포주의 마커인 cytokeratin 14 (CK14)의 발현을 측정하기 위해 면역염색(immunostaining)을 수행한 결과, KRS를 발현하는 회전타원체(spheroid)들 중 밖으로 이탈하여 움직이는 세포들에서는 CK14의 발현이 돋보이게 높았으며 (화살표 표시), 모세포나 myc-KRS WT 발현 세포주와 비교해서 KRS발현을 저해한 세포주 또는 저해제를 처리한 시료에서 확연히 CK14의 발현이 낮아져 있는 것을 확인하였다 (도 9). 동일 조건에서 배양된 세포주에서 KRS가 발현하는 경우 시간의존적으로 세포덩어리로부터 이탈하여 세포가 다른 공간으로 이동 및 침윤하는 것을 확인하였다(도 10A 참조).
또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid)인 덩어리로 배양된 KRS 발현 세포주에서 TFGβ1의 발현이 시간의존적으로 증가하고(도 10B 참조), 상기 조건에서 배양된 세포주에 TNFα를 처리하는 경우 KRS의 발현 여부와 관계없이 세포의 이동 및 침윤 돌기 형성이 관찰되었고(도 11A 참조), 그러나 TGFβ1을 처리하는 경우에는 KRS가 발현되는 세포에서는 세포의 덩어리로부터 이탈 현상이 관찰되었으나, KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우 이탈 현상이 관찰되지 않았다(도 11B 참조). 또한, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid)인 덩어리로 배양된 KRS 발현 세포주에서 ERKs 억제제를 처리하였을 경우, 세포의 이동 및 이탈현상이 관찰되지 않았다(도 12 참조).
또한, HCT116 세포내에서 ERK 바이오센서(biosensor)를 형질주입하여 세포 내의 ERKs 활성을 FRET 분석을 통하여 측정한 결과, KRS의 발현이 저해된 세포주에서 보이는 ERKs의 인산화가 모세포보다 감소되어 있는 반면, 과발현된 세포주는 모세포의 ERKs 인산화보다 높은 수준을 갖는 것을 확인하였다 (도 13A, 13B).
또한, HCT116 KRS 발현을 저하시킨 (shKRS2-1 및 shKRS5-4) 세포주에 각각 pCMV-Mock (M), pCMV-팍실린(paxillin) (Px), pCMV-ERK1/2 (Ek)를 48시간동안 일시적 형질주입하고, 웨스턴 블랏하였을 때, KRS 발현이 저해된 세포주들에서 ERK1/2를 인위적으로 발현케함으로써 팍실린(paxillin)의 발현과 Tyr118 인산화가 증가됨을 확인하였다. 즉, KRS가 발현 억제된 세포에서의 팍실린(paxillin)의 저하된 발현과 인산화는 역시 저하된 ERKs 활성에 기인함을 확인하였다 (도 14).
또한, myc-KRS이 과다발현된 HCT116세포주를 이용하여, 10% 세럼(serum)이 존재하는 정상적 2D 조건 (도 15A) 혹은 라미닌 (laminin, 10 mg/ml)이 미리 코팅되고 2% 세럼(serum)이 포함된 조건에서 (도 15B), 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였을 때, integrin α6, integrin β1 그리고 p67LR이 서로 결합하고 있음을 확인하였다, 한편, integrin α6과 integrin β1는 세포가 부착된 조건에서만 결합하고, 부착과 더불어 YH16899 (YH)가 처리된 경우엔 그 결합이 감소하였으며, KRS와 p67LR의 결합은 세포부착 신호(adhesion signal)가 존재하지 않는 현탁액(suspension) 상황에서도 확인되었으며, YH16899 처리에 의해 저하되었다.
또한, 3차원 콜라겐 겔에서 배양한 세포의 회전타원체(spheroid)를 이용하여, ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)을 수행한 결과, JNKs나 p38보다는 KRS에 의존적으로 활성화된 ERKs가 그 하위인자(downstream)으로 잘 알려진 전사인자 c-Jun을 통해 팍실린(paxillin)의 전사를 조절하는 것을 확인하였다 (도 16A, 16B, 16C, 16D).
또한, 다양한 대장암 세포주에 KRS의 발현을 억제하거나 (도 17A) KRS 억제제인 YH16899를 처리하였을 때 (도 17B), HCT116 세포주에서 보여지는 현상들, 즉 3차원 콜라겐 겔 내의 회전타원체(spheroid)로부터 이탈(dissemination)이 억제되고 (도 17A), ERK의 인산화가 줄어들고 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화가 줄어드는 것(도 17B)이 재현되는 것을 확인하였다.
또한, HCT116 세포주에서 ERK 억제제인 U0126과 KRS inhibitor인 YH16899를 처리하였을 때, 초점 접착(focal adhesion) 관련 molecule과 상피 마커(epithelial marker)인 E-cadherin, β-catenin의 발현이 감소되는 것을 확인함과 동시에, ERKs의 인산화와 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화에 억제적 효과를 확인하였다 (도 18A, 18B).
또한, 3차원 콜라겐 겔에서 KRS가 발현하는 모세포의 회전타원체(spheroid)에서 이탈(dissemination) 되는 것은 FAK의 활성 그리고 FAK의 Tyr925의 인산화를 통한 ERKs의 활성화 기전으로 유도되는 것이 아님이 확인되었다 (도 19A, 19B, 19C, 19D, 19E).
또한, HCT116 KRS 발현을 저하시킨 세포주에 각각 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), pCMV-ERK1/2를 형질주입하여 안정 세포주(stable cell line)을 구축한 후, 웨스턴 블랏으로 상기된 분자들에 대한 발현 및 인산화정도를 확인하였다 (도 20A). 그 후 세포주들의 회전타원체(spheroid)를 확보하여 3차원 콜라겐 겔에 분주한 후, 지속 촬영(time-lapse) 현미경으로 관찰한 결과, 3차원 콜라겐 겔에서 KRS 발현을 저하시킨 HCT116 세포주가 팍실린(paxillin)과 ERK1/2의 활성과 팍실린(paxillin)을 얻음으로써 이탈(dissemination)에 중요한 신호활성이 회복 된 듯, 이탈(dissemination)되는 현상을 관찰할 수 있었다 (도 20B).
또한, Grade II 및 III로 확정 진단받은 임상적 조직들을 포함한 인간 결장 암조직(human colon tumor tissue)들의 추출액 혹은 조직으로부터 팍실린(paxillin), p-ERKs와 KRS의 웨스턴 블랏 (도 21A) 혹은 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색 (도 21B)을 통하여 그들이 침습성 암세포 변연(margin)에서 긍정적인 연관성을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 배양된 대장암 세포주에서 KRS의 발현 여부에 따라 세포-세포간 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포부착의 신호전달 활성 및 세포 이탈(dissemination)과 관련된 활성 인자들의 발현 및 활성 변화를 분석함으로써 암 전이억제제 스크리닝 방법 및 암 세포의 이동, 침윤 및 전이 모니터링 방법에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 회전타원체(spheroid) 세포에서 E-카데린(E-cadherin)의 발현 증가 확인
<1-1> 회전타원체(spheroid) 세포의 배양
인간 대장암 세포주인 HT116 세포(American Type Culture Collection, 미국)를 37℃의 세포 배양기 안에서 이틀 동안 배양한 후, 트립신/EDTA를 처리하여 세포를 떼어냈다. 상기 떼어낸 세포를 원심분리기를 사용하여 가라앉힌 후, FBS를 첨가한 RPMI-1640 배양액 10 ㎖를 첨가하여 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였다. FBS가 첨가된 RPMI-1640 배양액을 접시(디쉬)에 10 ㎖ 넣어주고, 상기 세포가 3 x 105개가 되도록 넣어주었다. 그리고나서, 이를 37℃의 세포 배양기에서 Perfecta3D Hanging Drop Plates(3D Biomatrix, 미국)을 이용하여 현적배양(hanging drop culture) 방법으로 회전타원체(spheroid)의 덩어리인 세포를 수득하였다.
그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 2차원적 환경에서 배양한 세포는 바닥에 붙은 평평한 모양을 하고 있었으나, 현적배양한 경우 회전타원체(spheroid)인 덩어리를 형성하는 것을 확인하였다(도 1B).
<1-2> 회전타원체(spheroid) 세포덩어리에서 E-카데린(E-cadherin)의 발현 증가 확인
상기 실시예 <1-1>의 방법으로 수득한 회전타원체(spheroid) 세포덩어리에서 E-카데린의 발현량 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하였다.
구체적으로, 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주를 1000 rpm에서 스핀다운(spin down)시켜 취합한 후, 100 ㎕ 용해완충액(용해 버퍼)[50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA]에 1% SDS, Na3O4V, 단백질 가수분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails, GenDepot, 미국)을 넣고 4℃에서 1시간 이상 처리하였다. 상기 세포를 모은 후, 4℃, 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리하고, 새 원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 상층액을 옮겼으며, 이를 BCA 시약(BCA reagent, Thermo Scientifics, 미국)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 정량한 시료에 4 x 샘플 완충액(시료 버퍼)[100% 글리세롤 4 ㎖, Tris-HCl, pH 6.8, 2.4 ㎖, SDS 0.8 g, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 4 ㎎, β-머르캅토메탄올(β-mercaptoethanol) 0.4 ㎖, H2O 3.1 ㎖(총 10 ㎖기준)]을 첨가하고 5분 동안 100℃에서 끓여주었다. 상기 시료를 12% SDS-PAGE 전기영동을 수행한 뒤, Nitrocellulose Membranes Protran™ 니트로셀룰로오스 막(Whatman)에 이동시킨 후, 5% 탈지 우유(skim milk)로 1시간 동안 전처리하였고, 전처리 후, PBS(130 mM NaCl, 13 mM Na2HPO4, 3.5 mM NaH2PO4, pH 7.4)로 2번 세척하였으며, E-카데린(Santa Cruz Biotech, 미국) 및 α-튜블린 1차 항체(Sigma, 미국)를 이용하여 4℃에서 15 시간 동안 반응시킨 후, 다음날 2차 항체를 반응시키고, ECL(Pierce, 미국)을 이용하여 엑스레이 필름에 현상하였다.
그 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포주에서 배양 시간이 경과함에 따라 E-카데린의 발현이 점점 증가하는 것을 확인하였다(도 1C).
<실시예 2> 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)의 발현이 억제된 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주에서 상피-중간엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; EMT)현상 확인
<2-1> KRS가 발현억제 및 과발현된 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주의 수립
상기 실시예 <1-1>의 방법으로 수득된 회전타원체(spheroid)의 덩어리진 세포를 이용하여 KRS가 과발현 또는 발현억제된 세포주를 수립하였다.
구체적으로, KRS의 발현이 억제된 세포주는 lysyl-tRNA synthetase MISSION® shRNA plasmid DNA(Sigma, 미국)를 형질감염(형질주입)하여 제작하였고, 이때 KRS는 호모사피엔스(homo sapiens) 라이실-tRNA 합성효소, 전사체 이형(variant) 1, mRNA 서열(NM_001130089.1)을 기준으로 사용하였다. 상기 KRS는 총 1219 bp의 길이에 엑손(exon) 1 내지 15를 포함한다. 상기 구입한 KRS shRNA 플라스미드 DNA들 중, shKRS-0(서열번호 1)은 KRS의 1581 - 1604 bp(엑손 12), shKRS-1(서열번호 2)은 437 - 459 bp(엑손 3 내지 4), shKRS-2(서열번호 3)는 911 - 933 bp(엑손 7) 및 shKRS-5(서열번호 4)는 1071 - 1092 bp(엑손 8)을 각각 표적으로 하고, 사용된 shRNA의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 발현벡터는 TRC1.5-pLK0.1-puro를 사용하였으며, 퓨로마이신(puromycin)으로 선별하여 안정화된 세포주를 확립하였다. 이때, KRS의 발현을 억제하는 효과를 보이는 shKRS-0, shKRS-2 및 shKRS-5는 KRS 제 2형 중심 도메인(class II core domain)을 표적으로 하는데, 상기 KRS 제 2형 중심 도메인은 이량체(dimer)를 형성하여 적당한 tRNA 리보스(ribose)의 3'OH 기에 리신(lysine)을 이어주는 역할로 단백질 합성이 원활히 진행되도록 도와준다.
shKRS 서열(5'→3') 서열번호
shKRS-0 CCGGCCTGGAAGTGACTTGCATCAACTCGAGTTGATGCAAGTCACTTCCAGGTTTTTG 1
shKRS-1 CCGGCGTGGACCCAAATCAATACTACTCGAGTAGTATTGATTTGGGTCCACGTTTTTG 2
shKRS-2 CCGGCCAGAGATACTTGGACTTGATCTCGAGATCAAGTCCAAGTATCTCTGGTTTTTG 3
shKRS-5 CCGGGCCTTTCATCACTTATCACAACTCGAGTTGTGATAAGTGATGAAAGGCTTTTTG 4
또한, KRS 과발현 세포주는 myc으로 표지된 KRS 서열을 클로닝(cloning)하였고(Kim et al., FASEB J. 2012 Oct;26(10):4142-59), 상기 클로닝된 pcDNA-Myc-KRS 발현벡터를 세포에 주입하고 250 ㎍/㎖ G418을 처리하여 myc으로 표지된 KRS 과다발현 세포주를 수립하였다.
그 결과, KRS의 발현이 억제되는 세포주로는 shKRS-2 및 shKRS-5 shRNA를 이용하여 확립한 세포주로, shKRS-2에 의해 수득된 3개의 클론을 각각 2-1, 2-2, 2-3으로 명명하였고, shKRS-5에 의해 수득된 클론을 5-4로 명명하였다.
<2-2> 수립된 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주에서 KRS의 발현억제 확인
상기 실시예 <2-1>의 방법으로 제조된 KRS가 발현억제된 세포주들의 회전타원체(spheroid)의 덩어리에서 KRS의 발현이 억제되는지 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였고, 구체적으로, 웨스턴 블랏은 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 수행되었고, KRS(Abcam, 영국) 및 α-튜블린 1차 항체(Sigma, 미국)를 이용하여 수행되었다.
그 결과, 도 1E에 나타난 바와 같이, shKRS를 처리한 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주에서 KRS의 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
<2-3> KRS가 발현억제된 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주에서 상피-중간엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; EMT)관련 마커유전자의 mRNA 발현 수준 확인
상기 실시예 <2-2>의 방법으로 확인된 KRS 발현억제된 세포주에서 EMT 관련 마커유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위하여 역전사 PCR(reverse transcription PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 수립된 세포주를 TRIzol(invitrogen, 미국) 용액을 이용하여 mRNA를 추출한 후, 나노드롭(nano drop, Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 정량하였다. 상기 정량한 mRNA는 Amfirivert cDNA Synthesis Master Mix(GenDePot, 미국)를 사용하여 cDNA로 합성하였고, ThermoScientific DreamTaq Green PCR Master Mix(Thermo Scientific, 미국) 및 β-액틴을 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하였다. 각각 샘플들의 정량은 β-액틴으로 확인한 후, 하기 표 2에 나타난 프라이머를 이용하여 EMT 마커들의 mRNA 양을 확인하였다.
프라이머 서열(5'→3') 서열번호
hEcad-5 TGCCCAGAAAATGAAAAAGG 5
hEcad-3 GTGTATGTGGCAATGCGTTC 6
hNcad-5 ACAGTGGCCACCTACAAAGG 7
hNcad-3 CCGAGATGGGGTTGATAATG 8
hVim-5 GAGAACTTTGCCGTTGAAGC 9
hVim-3 GCTTCCTGTAGGTGGCAATC 10
hTwist-5 GGAGTCCGCAGTCTTACGAG 11
hTwist-3 TCTGGAGGACCTGGTAGAGG 12
그 결과, 도 1F에 나타난 바와 같이 KRS 발현이 억제된 세포주의 경우, 상피 마커인 E-카데린 mRNA 수준이 정상적인 HCT116 세포주 및 KRS 과발현 세포주보다 현저히 감소하였고, 반면에 중간엽(mesenchymal) 마커인 비멘틴(Vimentin), N-카데린(N-cadherin) 및 트위스트(Twist) mRNA의 수준은 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 1E).
<2-4> KRS가 발현억제된 회전타원체(spheroid) 덩어리 세포주에서 상피-중간엽세포 전이(epithelial-to-mesenchymal transition; EMT)관련 마커유전자의 단백질 발현 수준 확인
상기 실시예 <2-2>의 방법으로 확인된 KRS 발현억제된 세포주에서 EMT 관련 마커유전자의 단백질 발현 수준을 확인하기 위하여 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 이때 E-카데린(Santa Cruz Biotech, 미국), 비멘틴(Sigma, 미국), KRS(Abcam, 영국) 및 α-튜블린 1차 항체(Sigma, 미국)를 이용하여 수행되었다.
그 결과, 도 1G에 나타난 바와 같이, KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우, E-카데린의 발현량이 현저히 감소하고 비멘틴의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1G). 따라서, KRS의 발현이 억제되는 경우, EMT 현상이 일부 유도되어 세포-세포간의 부착성이 감소하고, 이는 세포이동 및 침윤에 영향을 줄 것이라고 예상되었다.
<실시예 3> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 불완전 EMT 표현형(incomplate EMT phenotype) 현상 유도
<3-1> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 세포-세포 부착성 혹은 EMT 관련 단백질들의 발현 감소 확인
정상적으로 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원적 (2D) 환경에서 세포를 배양할 때, 세포-세포 부착 혹은 상피-중배엽세포 전이 혹은 분화 (EMT) 관련 단백질 발현양을 확인하기 위하여,100 mm 세포 배양 디쉬에서 배양한 HCT116 세포들의 세포-세포 부착 관련 단백질들의 발현을 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 세럼(serum) 10%를 포함하는 2차원적 환경에서 배양한 세포주를 PBS로 2번 세척하고, 200 ㎕ 용해완충액(용해 버퍼)[50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% 소듐 디옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA]에 SDS, Na3O4V, 단백질 가수분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktails, GenDepot, 미국)을 넣고 4℃에서 15분간 처리하였다. 상기 세포를 모은 후, 4℃, 13000 x g로 30분 동안 원심분리하고, 새 원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 상층액을 옮겼으며, 이를 BCA 시약(BCA reagent, Thermo Scientifics, 미국)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 정량한 시료에 4 x 샘플 완충액(시료 버퍼)[100% 글리세롤 4 ㎖, Tris-HCl, pH 6.8, 2.4 ㎖, SDS 0.8 g, 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 4 ㎎, β-머르캅토메탄올(β-mercaptoethanol) 0.4 ㎖, H2O 3.1 ㎖(총 10 ㎖기준)]을 첨가하고 5분 동안 100℃에서 끓여주어 샘플을 준비하고, ZO-1(Zymed, 미국), β-카테닌(Santa Cruz, 미국) 및 E-카데린의 1차 항체를 사용하여 이후의 과정은 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 수행되었다.
그 결과, 세포-세포간의 부착성향을 알아볼 수 있는 상피 마커(epithelial marker) 단백질들인 ZO-1 (Zymed), β-catenin (Santa Cruz), E-cadherin(Santa Cruz) 발현양이, 정상적인 HCT116세포와 KRS를 과발현시킨 세포주들에 대비하여, KRS 발현이 억제된 세포주들에서 감소하는 것을 확인하였다. 반대로 KRS 발현이 저해된 세포주들에서 중간엽세포 마커(mesenchymal marker) 단백질들인 Vimentin(sigma), N-cadherin(BD Scieneces), twist1(Abcam), snail1(Cell signaling), Fibronectin(DAKO)의 발현이 증가되어 있는 것을 확인하였다. Integrin α6(Chemicon), Integrin β1(Santa Cruz), Integrin β4(Santa Cruz), p67 라미닌(laminin) 수용체(Abcam), 라미닌(laminin)(Abcam)의 단백질 발현양은 KRS의 발현유무와는 상관없이 동일하게 발현하고 있는 것을 확인하였다 (도 2A).
<3-2> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 주변 미세환경인자들의 영향 확인
2차원적 배양환경에서 배양한 경우 시간 경과에 따른 세포 주변의 미세환경인자들의 영향을 확인하기 위하여 TNFα 및 TGFβ1과 같은 사이토카인을 10% FBS가 포함된 배양액에 추가적으로 처리하여, 세포-세포 간의 부착성을 확인할 수 있는 상피 마커 단백질의 발현을 상기 실시예 <3-1>의 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이 정상적인 HCT116 세포주 및 KRS 과발현 세포주의 경우, TNFα를 처리하였을 때 단백질 발현에 차이를 보이지 않았으나, TGFβ1을 처리하였을 때 세포-세포 사이의 부착성에 관련된 오클루딘 또는 ZO-1이 각각 감소하고, 파이브로넥틴(fibronectin)과 같은 중간엽 마커 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 반면에, KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우 TGFβ1을 처리하였을 때 오클루딘과 같은 상피 마커 단백질의 발현량이 증가하고, 파이브로넥틴의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 2B).
따라서, KRS 발현 여부가 세포의 EMT 현상에 관련이 있음을 확인하고, TGFβ1과 같은 세포 미세환경인자의 영향으로 KRS가 세포이동 및 침윤에 중요한 역할을 긍정적으로 수행할 것으로 확인되었다.
<3-3> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 E-카데린의 발현 억제 및 세포-세포 부착성의 유지 확인
상기 실시예 <3-1>과 동일한 맥락에서, KRS의 발현을 억제하는 경우 E-카데린의 발현이 억제됨을 면역형광염색(immunofluorescence)법을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 이틀 동안 37℃의 CO2 세포배양기 안에서 배양한 HCT116 세포를 트립신/EDTA 처리하여 세포를 세어낸 후, 혈구계산기(hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였고, 이를 커버글라스(커버 글래스)가 들어간 6-웰 플레이트에 1 x 106개가 되도록 넣어주었다. 하루 동안 37℃의 CO2 세포배양기 안에서 배양한 후, 4% 포름알데히드(포름알데하이드)로 30분 동안 고정하였고, 30 mM 글라이신을 10분 동안 처리하였다. 0.5% 트리톤(triton) X-100을 이용하여 5분 동안 투과화(투과화(permeabilization))시키고, 2% BSA 용액으로 1시간 동안 전처리한 후, FITC로 표지된 E-카데린 1차 항체(Bio Legend, 미국)를 16 내지 18시간 동안 4℃에서 처리하였다. 마지막으로 핵 염색을 위한 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, 청색) 용액을 처리하여 DAPI 염색을 수행하였다. 그리고나서, 염색을 마친 세포들이 붙어있는 커버글라스를 슬라이드 글라스(slide glass)에 올려 마운팅(mounting)한 뒤, 염색된 세포를 형광현미경(Olympus, 일본)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이 정상적인 HCT116 세포 및 KRS를 과발현시킨 세포주의 경우, 세포 사이의 부착부위에서 E-카데린의 발현이 정상적으로 관찰되는 반면, KRS의 발현을 억제하는 경우 E-카데린이 발현이 억제되어 세포 사이의 부착부위에서 E-카데린의 발현이 감소하였으나, 세포 간의 결합 혹은 부착성에는 변화가 없음을 확인하였다. 또한, 이는 세포-세포 간의 부착성향을 확인할 수 있는 또 다른 마커인 β-카테닌의 경우에도 같은 결과를 나타냄을 확인하였다(도 2C). 또한, 도 2D에 나타난 바와 같이 KRS발현이 저해된 세포주(shKRS2-1, shKRS5-4)들은 KRS를 발현하는 HCT116 모세포(parental)와 KRS를 과발현하는 세포주(Myc-KRS-WT)와 비교하여 볼 때, EMT (상피-중배엽세포 전이, epithelial-mesenchymal Transition) 표지자 단백질의 발현에서 보여지는 현상과는 달리, shKRS2-1 및 shKRS5-4에서 세포-세포 간의 접촉이 변하지 않고 원만하게 집단적인 콜로니(colony)를 이루는 것을 확인하였다(도 2D). 2D 상황에서 EMT 표지자 단백질의 발현이 차이가 있음에도 불구하고 플레이트상에서 자라는 세포의 모양과 형태에는 차이가 없는 것으로 보아 KRS의 발현이 완전한 EMT를 유발하는 것이 아니라, 부분적인 EMT (incomplete EMT)를 유발함을 알 수 있다.
<실시예 4> 라미닌(laminin)(10 μg/ml)이 미리 코팅된 2차원적 배양 환경에서 KRS를 발현 또는 발현하지 않는 세포주의 세포부착과 관련된 신호전달 인자들의 확인
KRS 발현과 세포-ECM 부착과의 관계에 대해서 알아보기 위하여, KRS가 세포질에서 원형질막으로 이동한 후, 라미닌(laminin)에 의존적으로 세포이동에 관련하여 신호전달 활성에 영향을 주는 것이 이미 보고되었기 때문에 (Kim DG et al., FASEB J. 2012 Oct;26(10):4142-59), 현탁액(suspension) 상태로 1시간을 섞고난후, 라미닌(laminin)을 코팅을 한 배양접시에 재분주함으로써 라미닌(laminin)이라는 특수한 ECM에의 부착이 될 경우, KRS의 발현에 따른 세포부착 관련 신호전달 양상을 초점 접착(focal adhesion)에 관련한 FAK, Src, 팍실린(paxillin), ERKs와 같은 단백질들의 발현 및 인산화 정도의 측정을 통해 확인하였다.
구체적으로, 준비된 HCT116 모세포, KRS 발현 저해된 세포주, KRS 과발현 세포주를 배양접시에서 떼어낸 뒤, 원심 분리하여 세포와 용액을 분리하였다. 이때부터 배지는 세럼(serum) free RPMI1640 배지에 1% BSA와 (세포가 healthy하면서 세럼(serum)의 영향을 최소화하고자) 2% FBS가 들어있는 리플레이팅(replating) 버퍼를 이용하였다. 혈구계수기(Hemacytometer)를 이용하여 세포수를 측정한 후, 리플레이팅(replating) 버퍼를 추가하여 세포가 각각 0.2 × 106 cells, 2 X 106 cells이 되도록 세포를 e-tube에 넣고, 총 부피가 1 ml이 되도록 리플레이팅(replating) 버퍼를 채웠다. HCT116 모세포에 YH16899처리한 시료은 리플레이팅(replating) 버퍼에 10μM이 되도록 처리하여 준비하였다. 37°C에서 1시간동안 현탁액(suspension)상태로 rolling(60 rpm) 시켜준다. 그 동안 전날 밤에 라미닌(laminin) (10μg/ml)을 미리 코팅한 배양접시 및 커버 글래스를 PBS로 2번 세척해준 뒤, 리플레이팅(replating) 버퍼를 넣고 37°C에 놓아둔다. 1시간 섞어준 세포들을 면역형광염색(immunofluorescence)를 하기 위해, 준비해 둔 라미닌(laminin) 코팅된 커버글래스가 들어있는 6-well에 0.2X 106세포를 분주 하고, 웨스턴 블랏을 하기 위해 준비해 둔 라미닌(laminin) 코팅된 60 mm 디쉬에는 2 X 106 cells이 되도록 세포를 분주하고 2 시간동안 37°C 세포배양기에서 배양하였다. 면역형광염색(immunofluorescence)를 하기 위한 시료은 PBS로 2번 세척 후, 4% 포름알데하이드로 15분 동안 고정하고 30 mM 글라이신을 10분 처리해준 후, 0.5% triton X-100을 이용하여 5분 동안 투과화(permeabilization)하고, 3% BSA 용액으로 1시간 동안 차단하였다. 표지가 되어있지 않은 p-ERKs(Cell signaling), p-Tyr118-팍실린(paxillin)(Santa Cruz Biotech. Inc.), 혹은 p-Tyr397-FAK (Abcam) 항체를 16~18 시간이상 4℃에서 처리 후에, 2차 항체를 상온에서 2시간 처리하고, 팔로이딘(phalloidin) 처리를 통한 액틴(actin) 염색 후, 마지막으로 핵 염색을 위한 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; blue) 용액을 처리하였다. 그리고 웨스턴 블랏을 하기 위한 시료은 PBS로 2번 세척 후, 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)를 처리하여 단백질을 추출하고 정량하여, 만들어진 시료을 가지고 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, KRS를 발현하는 모세포주(Parental) 및 과발현 세포주(Myc-KRS-WT)와 비교하여 볼 때, KRS의 발현이 억제된 세포주들(shKRS2-1, shKRS5-4)에서 세포부착에 따른 Src, ERKs, 팍실린(paxillin)의 인산화가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 하지만 FAK의 인산화 수준에는 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 3A). KRS에 의존적으로 보여지는 ERKs, 팍실린(paxillin)의 인산화 수준은 FAK을 통하지 않은 KRS의 신호전달활성에 의해서 이루어진 다는 것을 보여준다. 초점 접착(focal adhesion)에 관련한 단백질인 p-ERKs와 p-팍실린(paxillin)으로 면역염색을 수행한 결과, 웨스턴 블랏과 동일하게 KRS를 발현하는 모세포주 및 과발현 세포주는 ERKs와 팍실린(paxillin)의 인산화 수준이 높은데 반해 KRS의 발현이 억제된 세포주들에서 현저히 낮아져 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 3B와 3C). KRS와 라미닌(laminin) 수용체와의 결합을 저해하는 저해제 YH16899 (Kim DG et al., Nat Chem Biol. 2014 Jan;10(1):29-34.)를 10 μM로 처리하자, KRS를 발현하는 모세포주 및 과발현 세포주에 처리한 시료에서 처리하지 않은 대조군과 비교하여 보았을 때, Src, ERKs, 팍실린(paxillin)의 인산화가 감소하는 것을 확인하였으며 (도 3A), 같은 결과를 p-ERKs 및 팍실린(paxillin) 염색한 면역형광염색(immunofluorescence)에서 볼 수 있었다 (도 3E 및 도3F). 이과 같은 결과는 KRS가 세포-ECM 부착과 관련된 신호전달 인자들의 활성에 중요한 작용을 할 수 있음을 나타낸다. 하지만, HCT116 세포에 KRS의 억제나 YH16899의 처리는 Tyr397의 인산화 정도가 큰 차이가 없었듯이 (도 3A), 세포모양이나 퍼짐의 정도가 큰 차이없는 것(도 3D 및 도 3G)으로 확인되었다.
<실시예 5> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 세포-세포외기질(extracellular matrix; ECM) 부착관련 신호전달 활성 저해 확인
2차원적 배양환경에서 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 수립된 세포주의 세포 및 ECM 사이의 부착 및 상기 부착과 관련된 신호전달 활성을 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 또한, 세포-ECM 부착 관련 신호전달 활성을 확인하기 위해서 세포주들은 특정 ECM이 미리 코팅된 배양용기에 혈청이 없는 상태에서 재분주(재분주)한 뒤, 2시간 내에 세포 부착에 따른 신호전달 인자들의 신호활성을 확인하였고, 상기 신호활성의 확인 방법은 공지된 방법으로 수행하였다(Juliano et al., 2001).
구체적으로, KRS를 발현하는 HCT116 모세포주, KRS 발현 억제 세포주인 shKRS2-1 및 shKRS5-4, 및 KRS 과발현 세포주를 라미닌 10 ㎍/㎖이 미리 코팅된 배양용기에 1% BSA가 포함된 무혈청 배양 배지로 재분주한 뒤, 2시간 만에 세포 추출액을 확보하여 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 이때, pY397FAK(Abcam, 영국), pY577FAK(Santa Cruz, 미국), pY861FAK(Santa Cruz, 미국), pY925FAK(Santa Cruz, 미국), FAK(Santa Cruz, 미국), p-ERKs(cell signaling, 미국), ERKs(cell signaling, 미국), KRS(Abcam, 영국), pY416c-Src(cell signaling, 미국), c-Src(Santa Cruz, 미국), pY118팍실린(pY118paxillin, santa Cruz, 미국), 팍실린(paxillin, BD Transduction Laboratories, 미국) 및 α-튜블린(Sigma, 미국)의 1차 항체를 사용하였다.
또한, 상기 KRS를 발현하는 HCT116 모세포주, KRS 발현 억제 세포주인 shKRS2-1 및 shKRS5-4, 및 KRS 과발현 세포주를 파이브로넥틴 10 ㎍/㎖이 미리 코팅된 배양용기에 1% BSA가 포함된 무혈청 배양 배지로 재분주 한 뒤, 2시간 만에 세포 추출액을 확보하여 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이 KRS를 발현하는 HCT116 모세포주 및 KRS를 과발현하는 세포주에서는 FAK 및 EKRs의 인산화가 일어나는 것을 확인하였으나, KRS의 발현이 억제된 세포주에서는 FAK 및 ERKs의 인산화가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4A). 또한, 도 4B에 나타난 바와 같이 HCT116 모세포주와 비교하여 KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우 c-Src 및 팍실린(paxillin)의 인산화가 유의적으로 억제되었고, 특히 팍실린(paxillin)의 발현이 현저히 감소함을 확인하였다(도 4B). 또한, 도 4C에 나타난 바와 같이 KRS를 발현하는 모세포주 및 과발현 세포주와 비교하여 KRS의 발현이 억제된 세포주들에서 FAK의 인산화는 미약하게 감소하였으나, ERKs의 인산화가 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4C). 이는 KRS가 세포-ECM 부착과 관련된 신호전달 인자들의 활성에 중요한 작용을 할 수 있음을 나타낸다.
<실시예 6> 2차원적 배양 환경에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 초점 접착(focal adhesion) 형성 저해 확인
세포-ECM 부착에 따른 초점 접착의 형성이 KRS 발현에 의존적인지 확인하기 위하여 면역형광염색(immunofluorescence)법을 수행하였다.
구체적으로, KRS를 발현하는 HCT116 모세포주, KRS 발현 억제 세포주인 shKRS2-1 및 shKRS5-4, 및 KRS 과발현 세포주를 라미닌 혹은 파이브로넥틴 10 ㎍/㎖이 미리 코팅된 커버글라스(커버 글래스)에 1% BSA가 포함된 무혈청 배양 배지로 재분주한 뒤, 2시간 만에 상기 실시예 <3-3>의 방법으로 면역형광염색(immunofluorescence)법을 수행하였고, 이때, Tyr397이 인산화된 FAK 1차 항체(pY397FAK) 및 핵을 나타내기 위해 DAPI를 사용하였다.
그 결과, 도 3D에서 나타난 바와 같이 파이브로넥틴이 코팅된 2차원 환경에서 HCT116 모세포주 및 KRS를 과발현하는 세포주에서는 pY397FAK가 풍부한 초점 접착이 잘 발달하였으나, KRS의 발현이 억제된 세포주에서는 pY397FAK가 스팟(spots) 형태로 염색되지 않아, 초점 접착의 발달이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다(도 4D). 상기 결과는 KRS가 세포-ECM 부착에도 중요한 역할을 하고 있음을 나타낸다. 그러나, KRS의 기능에 필요한 라미닌이 미리 코팅된 2차원 환경에서는 KRS의 발현이 억제되거나 KRS 억제제를 처리한 경우에, pERKs 및 p-Tyr118 팍실린의 스팟(spot)들이 세포 내에 감소하였으나, Tyr397이 인산화된 FAK의 위치 및 그와 관련된 세포형태는 KRS를 발현하거나 KRS 억제제를 처리하지 않은 경우와 차이가 없었다. 따라서 KRS의 발현은 ERKs 및 팍실린등을 포함하는 세포-세포외기질(ECM)부착 신호전달 과정에 중요함을 나타낸다.
<실시예 7> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS의 발현을 억제하는 경우 ERK 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성 억제 확인
<7-1> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 HCT116 세포의 배양
회전타원체(spheroid)의 덩어리인 세포들을 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서 배양하기 위하여 10 x 재형성 완충액[2.2 g 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 4.8 g HEPES, 100㎖ 기준], 10 x RPMI 배양액, 콜라겐(collagen type I, BD Bioscience, 미국), 2N NaOH 및 무혈청 RPMI-1640 배양용액을 잘 혼합하여 콜라겐 I의 최종농도가 2.0 내지 2.5 ㎎/㎖이 되도록 용액을 준비하였다. 모든 과정은 얼음 위에서 진행하여 콜라겐이 굳는 것을 방지하였다. 상기 용액을 지름 10 ㎜의 구멍이 있는 PDMS(polydimethylsiloxane) 또는 공초점 현미경의 배양기 시스템에 맞는 자성의 4-웰 챔버(magnetic 4-well chamber, Live Cell instrument, 대한민국)에 넣어주었다. 이때, 구멍 바닥에 세포를 포함하지 않은 콜라겐 용액을 얇게 깔아주어 콜라겐 바닥 막(bottom layer)을 만들어 준 뒤, 여기에 세포 및 콜라겐 용액 혼합액을 첨가하고, 37℃ 세포배양기 안에서 30분 동안 굳혔다. 이틀 동안 회전타원체(spheroid)의 덩어리로 배양된 HCT116 세포를 세포 여과기(cell strainer, SPL, 대한민국)를 이용하여 회전타원체(spheroid)의 크기가 70 ㎛를 넘는 응집(aggregation)된 세포들을 제거하고, 70 ㎛ 구멍을 통과한 회전타원체(spheroid) 세포 덩어리들만을 모아서, 무혈청 RPMI-1640 배양액으로 2번 세척하였다. 그리고나서, 세포를 원심분리기로 가라앉힌 후, 배양액은 모두 제거하고 남아있는 세포에 상기 콜라겐 용액을 첨가하여 잘 섞어주고, PDMS, 현미경 관찰 시 사용할 배양용기 또는 48-웰 플레이트의 각각의 구멍에 80 내지 150 ㎕씩 넣어주었으며 37℃ 세포배양기에서 30분 동안 굳혔다. 충분히 굳은 것을 확인한 후, FBS가 첨가된 RPMI-1640 배양용액을 첨가하였다.
그 결과, 도 1D에 나타난 바와 같이 회전타원체(spheroid) 형태의 세포주가 시간이 지나면서 점차 크기가 커져 광학현미경하에서 어둡게 보이도록 증식할 수 있음을 확인하였다(도 1D).
<7-2> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 KRS의 발현을 억제한 경우 ERKs 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성 억제 확인
2차원적 환경에서 배양된 HCT116 세포주에서, 세포-세포외기질 부착에 있어 KRS의 중요성을 확인하였고, 이때, FAK, ERKs, 팍실린(paxillin) 및 c-Src의 인산화, 및 팍실린(paxillin)의 발현이 KRS의 발현 억제에 의해 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과가 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서도 동일한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 <2-1>의 방법으로 수립된 세포주를 사용하였고, KRS를 발현하는 HCT116 모세포주, KRS 발현 억제 세포주인 shKRS2-1, shKRS2-2, shKRS2-3 및 shKRS5-4, 및 KRS 과발현 세포주를 상기 <7-1>의 방법으로 배양하였고, 이때 상기 세포주들을 3차원 콜라겐 겔 환경에 끼워넣고 3 또는 24시간 후의 시료를 수득하였다. 이를 위해, 끝을 자른 노란 팁(yellow tip)을 이용하여 48-웰 플레이트 안에 세포가 들어있는 콜라겐 겔 및 배지를 1.7 ㎖ 원심분리용-튜브(microcentrifuge-tube)에 모았다. 상기 세포를 4℃, 5,000 x g로 1분 동안 원심분리한 후, 상층액(배양액)을 제거하였고, 남은 펠렛(pellet)은 차가운 PBS로 2번 세척하고, 동일한 속도 및 시간으로 원심분리하였다. 상기 펠렛에 1% SDS, Na3O4V, 단백질 분해효소 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, GenDepot, 미국)이 들어있는 100 ㎕ 용해 완충액을 첨가하여 4℃에서 1시간 이상 처리한 뒤, 4℃, 13,000 x g로 30분 동안 원심분리하여 새 원심분리용-튜브에 상층액만 취하였다. 상기 상층액에 4 x 샘플 완충액(시료 버퍼)을 넣어준 후, 5분 동안 100℃에서 끓여주어 샘플을 준비하고, 이후 과정은 상기 실시예 <1-2>의 방법으로 수행되었다. 이때, pY397FAK, pY577FAK, FAK, pY416c-Src, p-ERKs, ERKs, 팍실린(paxillin), KRS 및 α-튜블린의 1차 항체를 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양되고, KRS의 발현이 억제된 세포주에서, KRS가 발현되는 세포주들과 비교하여 특이적으로 FAK의 인산화가 낮게 유지되는 것은 아니고, 3차원 콜라겐 환경에서의 배양시간에 따라서 증가함으로써, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 KRS의 발현유무와 FAK 인산화 변화와는 상관관계가 없음이 확인되었다. 그러나, ERKs의 인산화 및 팍실린(paxillin)의 발현은 KRS의 발현이 억제된 세포주에서 현저히 낮음을 3차원 콜라겐 겔 환경에서도 확인할 수 있었다. 또한, 2차원 환경에서 KRS를 과발현한 세포주의 경우 현탁액(suspension) 상태에서도 ERKs의 인산화가 현저하게 증가함으로써 KRS의 발현과 ERKs의 인산화 및 활성화, 그리고 나아가 팍실린(paxillin)의 발현이 긴밀한 상관관계를 가짐을 확인하였다.
<실시예 8> 콜라겐 겔로 둘러싸인 3차원 (3D) 환경에서 KRS의 발현 억제, ETK의 활성 억제 혹은 KRS의 기능 억제에 따른 ERKs 활성 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성에 대한 부정적 영향 확인
KRS에 의존적인 초점 접착(focal adhesion)과 관련된 단백질 발현 변화가 3차원 콜라겐 겔 내에서의 세포 배양에서도 일어나는 지를 확인하기 위하여, 3차원 콜라겐 겔 내에서 하루 동안 배양한 정상적인 HCT116세포, 발현을 저해한 세포주 (shKRS2-1, shKRS5-4) 그리고 MEK/ERK 인산화효소를 억제하는 선택적 억제제(selective inhibitor)인 U0126과 KRS를 저해하는 YH16899를 처리한 세포에서 ERKs의 인산화와 팍실린(paxillin)의 발현을 면역염색을 수행하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
구체적으로, PDMS에 Collagen type I을 분주하고 하루 동안 아무것도 처리하지 않거나 (도 6A 및 6B) U0126 (50 mM) 혹은 YH16899(50 mM)를 처리하고서(도 6C 및 6D) 배양한 세포가 들어있는 콜라겐 겔을 4% 포름알데하이드로 30분 동안 고정한 후, 30 mM 글라이신을 30분 처리하였다. 0.5% triton X-100을 이용하여 30분 동안 투과화(permeabilization)하고, 3% BSA 용액으로 2시간 동안 차단하였다. 표지가 되어있지 않은 p-ERKs(cell signaling)와 팍실린(paxillin)(BD bioscience) 항체를 16~18 시간 이상 4℃에서 처리한 후, 2차 항체를 4시간 이상 실온에서 처리하고, 마지막으로 핵 염색을 위한 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; blue) 용액을 처리하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 정상적인 HCT116 회전타원체(spheroid) 세포들에선 p-ERKs의 면역염색(immunostaining) 또한 핵 안과 핵의 주변에서 보여지는 것을 확인(도 6A 및 6C)하였고, 초점 접착(focal adhesion)으로 보여지는 부분에 팍실린(paxillin)이 강하게 점(spot)으로 염색이 된 것을 확인하였다 (도 6B 및 6D). 하지만 KRS 발현을 저해한 세포주 그리고 U0126과 YH16899를 처리한 세포의 회전타원체(spheroid)에선 ERKs의 인산화 수준 또한 매우 낮아져 있는 것(도 6A 및 6C)을 확인할 수 있었고, 팍실린(paxillin)의 면역염색이 현저히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 6B 및 6D). 이러한 결과는 3차원 콜라겐 겔내에서 HCT116 회전타원체(spheroid)가 KRS에 의존적으로 보여지는 이탈(dissemination)현상이 ERK의 활성과 팍실린(paxillin) 발현과 밀접한 관련이 있음을 나타낸다.
<실시예 9> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현하는 경우 신호활성인자의 발현 변화 확인
<9-1> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현하는 경우 신호활성인자의 단백질 수준 변화 확인
2차원적 환경에서 HCT116 모세포의 세포-ECM 부착에 있어 KRS에 의한 ERKs 인산화, 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성화가 중요한 것으로 확인되었기에, 3차원 콜라겐 겔 환경 내에서도 KRS를 발현하는 HCT116 모세포에서 세포-ECM 부착에 있어서 ERKs 활성을 확인하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 HCT115 모세포에 ERKs 특이적 억제제인 U0126을 50 또는 100 μM를 처리하여 24시간 동안 배양하였고, 전체 세포 추출물(whole cell extract)을 모아서 상기 실시예 <7-2>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였고, 이때, pY397FAK, FAK, p-ERKs, ERKs, pY118팍실린(paxillin), 팍실린(paxillin), E-카데린, β-카테닌, KRS, α-튜블린, pAkt1/2/3 및 카스파아제3에 대한 1차 항체를 사용하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 HCT116 모세포에서 ERKs를 저해하였을 경우, 세포-ECM 부착 관련 신호전달 인자인 FAK 및 팍실린(paxillin)의 인산화가 동시에 감소하였고, 특히 팍실린(paxillin)의 발현도 유의적으로 감소함을 확인하였다. 또한, E-카데린의 발현 수준도 감소함을 확인하였다(도 7A). 상기 결과는 KRS의 발현 억제로 유도되는 현상과 일치하는 동일한 맥락에서, HCT116 모세포의 ERKs 인산화는 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화와 밀접한 관계에 있으며, KRS에 의한 세포-ECM 부착에 중요한 역할을 수행함을 나타낸다.
<9-2> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현하는 경우 신호활성인자의 mRNA 수준 변화 확인
상기 실시예 <9-1>과 동일한 맥락에서, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현하는 경우 신호활성인자 중 하나인 E-카데린의 mRNA 수준을 확인하기 위하여 실시간 PCR을 수행하였다.
구체적으로, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 배양된 HCT116 모세포에 ERKs 억제제인 U0126을 처리하지 않거나, 50 및 100 μM로 처리하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 <2-3>의 방법으로 실시간 PCR을 수행하였고, 이때, 프라이머는 상기 표 2의 hEcad-5(서열번호 5) 및 hEcad-3(서열번호 6)를 사용하였다.
그 결과, 도 7B에 나타난 바와 같이 E-카데린의 mRNA 발현수준이 ERKs 억제제를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 7B).
따라서, 3차원 환경에서 배양된 HCT116 모세포의 세포-ECM 부착 및 세포-세포 부착에 있어서, KRS에 의한 ERKs 및 팍실린(paxillin)의 인산화 및, 팍실린(paxillin)의 발현 사이에 유의적인 상관관계가 있는 것을 확인하였다.
<실시예 10> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현하는 경우 세포-ECM 부착형성 억제 확인
3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS를 발현하는 HCT116 모세포를 오랫동안 배양함으로써, 상기 HCT116 모세포로부터 분비된 사이토카인들이 세포 배양의 미세환경에 포함되어 상기 배양된 세포의 형태 및 침윤에 미치는 영향을 확인하기 위하여 면역형광염색(immunofluorescence)법을 수행하였다.
구체적으로, PDMS에 콜라겐을 첨가하고 하루 동안 HCT116 모세포주에 아무것도 처리하지 않거나, ERKs 억제제인 U0126 50 μM를 처리, 또는 KRS의 발현이 억제된 세포주를 배양한 경우, 세포가 들어있는 콜라겐 겔을 4% 파라포름알데히드로 상온에서 30분 동안 고정하고, 30 mM 글라이신을 15분 처리하였다. 그리고나서 1% 트라이톤 X-100을 이용하여 상온에서 30분 동안 투과화시키고, 3% BSA 용액으로 2시간 동안 전처리하였다. FITC로 표지된 E-카데린 항체를 16 내지 18시간 동안 4℃에서 처리하고, 마지막으로 핵 염색을 위해 DAPI 용액을 처리하고, 염색된 세포를 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 8C에 나타난 바와 같이 HCT116 모세포 및 KRS 과발현 세포주와 비교하여, KRS의 발현이 억제된 세포주에서 E-카데린의 발현이 유의적으로 감소하여 세포-세포간의 경계면에 E-카데린의 발현이 확인되지 않았다. 그러나, HCT116 및 KRS 과발현 세포주에서 견고한 구형을 이루던 회전타원체(spheroid) 세포들간의 부착이 변함없이 회전타원체(spheroid)의 덩어리인 세포 형태는 흩어지지않고 유지하는 것을 확인하였다(도 8C). 상기 결과는 3차원 콜라겐 겔 환경에서도 KRS의 발현이 세포-세포간의 부착을 조절하고, 비록 부분적이지만 EMT 현상에 영향을 미치며, 상피 및 상피중간엽 세포 형태의 이중적 성향을 조절하게 될 것으로 나타났다.
<실시예 11> 콜라겐 겔로 둘러싸인 3차원 (3D) 환경에서 KRS 발현하는 세포의 이탈(dissemination)과 상피 마커(epithelial marker)인 cytokeratin 14 (CK14)의 관련성 확인.
3차원 콜라겐 겔 내에서 세포 이탈(dissemination)이 KRS의 발현에 의존적이고, KRS의 발현을 억제한 세포주들은 세포-세포 접촉에 관련한 상피 마커(epithelial marker)들의 발현이 낮아진다. 하지만 KRS의 발현이 억제된 세포주들은 2D 배양환경에서 분산(scattering)이 되지 않고 3차원 콜라겐 겔 환경에서 이탈(dissemination)되지 않았기에, 3차원 콜라겐 겔 내에서 KRS의 발현이 억제된 세포주들의 세포 덩어리(회전타원체)로부터의 이탈(dissemination)은 상피 마커(epithelial marker)의 발현이 필요한 것인지 알고자, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 24시간 배양하여, 이탈(dissemination)이 일어났을 경우에 CK14에 대하여 염색을 하고 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
구체적으로, PDMS에 콜라겐 겔 내에 세포들을 분주하고 하루 동안 아무것도 처리하지 않거나 (도 9A) U0126 (50 mM) 혹은 YH16899(50 mM)를 처리하고서(도 9B) 배양한 세포가 들어있는 콜라겐 겔을 4% 포름알데하이드로 30분 동안 고정한 후, 30 mM 글라이신을 30분 처리하였다. 0.5% triton X-100을 이용하여 30분 동안 투과화(permeabilization)하고, 3% BSA 용액으로 2시간 동안 차단하였다. 표지가 되어있지 않은 CK14 (Abcam)) 항체를 16~18 시간 이상 4℃에서 처리한 후, 2차 항체를 4시간 이상 실온에서 처리하고, 팔로이딘(phalloidin) 염색을 통해 F-액틴 그리고 핵 염색을 위한 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; blue) 용액을 처리하였다. 염색된 세포를 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 세포이탈이 일어났던 KRS가 발현하는 세포들의 경우에는 이탈하는 세포들에게서 CK14의 발현이 돋보였으나 (도 9A, 9B), 이탈(dissemination)이 일어나지 않았던 조건들, 즉 KRS가 발현억제되었거나, KRS가 발현되더라도 U1026 혹은 YH16899가 처리된 상황에서는 CK14의 발현이 전반적으로 낮고 회전타원체(spheroid)로부터 이탈하는 세포들에서 발현되지 않음을 확인하였다 (도 9A, 9B). 즉, 이로써, KRS가 발현억제 되었을 경우, 상피 마커(epithelial marker)가 발현 저하되었으나 분산이 일어나지 않아, 불완전 EMT (epithelial-mesenchymal transition)이 유도된 것으로 파악되고, 이는 KRS가 발현억제된 세포주들에서 효과적인 이탈(dissemination)의 현상이 일어나지 않은 사실은, 즉 KRS에 의존적인 이탈(dissemination)은 상피 마커(epithelial marker)가 없이는 일어날 수 없음을 시사한다.
<실시예 12> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현되는 경우 세포의 형태변화, 이동 및 침윤에의 영향 확인
3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS에 의존적인 EMT 관련 단백질 발현 변화가 세포의 형태변화, 이동 및 침윤에 영향을 주는지 확인하기 위하여 시간차 현미경(지속 촬영(time-lapse) 현미경)을 이용하여 관찰하였다.
구체적으로, 시간차 현미경의 배양기 시스템을 사용하기 위하여 자성의 4-웰 챔버(magnetic 4-well chamber, Live Cell Instrument, 대한민국)에 세포가 들어 있는 콜라겐 2.5 ㎎/㎖을 첨가하고 37℃ 세포배양기에서 30분 동안 굳혀주었다. 상기 콜라겐이 충분히 굳은 것을 확인한 후, 10% FBS가 들어있는 RPMI-1640 배양 배지를 넣어주었다. 그리고나서 3차원 콜라겐 겔이 들어있는 자성의 챔버 및 그에 맞는 어댑터(adaptor)를 시간차 현미경에 장착하고, 다중-위치(multi-position)을 지정한 뒤 약 36시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 관찰하였다. 콜라겐 겔이 마르지 않도록 배양액을 6시간마다 첨가해 주었으며, 이때 초점에 변동이 생기지 않도록 유의하였다.
그 결과, 도 10A에 나타난 바와 같이 HCT116 모세포 및 KRS 과발현 세포주에서는 시간이 지남에 따라 일부 세포들이 주요 세포 덩어리(main cell mass)로부터 이탈하여 주변공간으로의 이동 및 침윤의 기능을 보이는 반면, KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우에는 세포의 덩어리가 증대되어갈 뿐, 세포들의 이탈은 확인되지 않았다. 상기 도 10A는 세포의 형태변화, 이동 및 침윤의 관찰을 6시간마다 24시간(1:00:00) 및 28시간째(1:04:00)를 나타내고 있다(도 10A).
<실시예 13> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 KRS가 발현되는 경우 TGFβ1의 발현 증가 확인
상기 <실시예 12>의 결과가 세포 미세환경에서 존재하는 사이토카인들의 오토크라인(autocrine) 효과에 의한 것임을 확인하기 위하여 대표적인 다기능적인 사이토카인(multifunctional cytokine)이면서 EMT 유발 사이토카인인 TGFβ1(Katsuno et al., 2013, Curr Opin Oncol, 25:76-84)의 발현을 확인하기 위하여 상기 실시예 <6-2>의 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 10B에 나타난 바와 같이 HCT116 모세포 및 KRS 과발현 세포주는 TGFβ1의 발현 수준이 시간이 지날수록 현저히 증가하나, 반면 KRS의 발현을 억제시킨 세포주는 초기부터 TGFβ1의 발현 수준이 높았으며, 시간에 따른 증가 추세가 적음을 확인하였다(도 10B).
따라서, KRS의 발현이 억제되는 세포주의 경우, TGFβ1의 효과가 나타나지 않고, 이는 상기 결과와 같은 맥락에서, 비록 세포가 와해되지 않는 불완전한 현상이지만 KRS의 억제로 EMT관련 인자들의 발현 조절 차원에서 중간엽 세포의 성질을 갖는 세포이기 때문에 TGFβ1에 의한 추가적인 세포 이탈이 유도되지 않을 수도 있음을 나타낸다.
<실시예 14> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 세포의 이탈이 KRS 발현 의존적임을 확인
세포를 둘러싼 미세환경이 세포의 기능에 영향을 주는 것이 2차원 및 3차원 배양환경에서 배양된 세포주에서 확인되었고(도 2 및 도 10), 따라서 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에 TNFα 및 TGFβ1과 같은 사이토카인을 처리하는 경우, 회전타원체(spheroid)에서 이탈이 KRS 발현 의존적인지 확인하기 위하여 TNFα 및 TGFβ1를 처리하고 36시간 동안 시간차 현미경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 11A에 나타난 바와 같이 TNFα를 처리하였을 때, HCT116 모세포, KRS 과발현 세포주 및 KRS 발현이 억제된 세포주 모두에서 침윤적 돌기(invasive protrusion)의 형성이 증가하고, 회전타원체(spheroid) 덩어리를 이루던 세포들이 각각 떨어져 이동하는 것이 확인되었다(도 11A). 즉, TNFα에 의한 세포의 침윤적 돌기 형성 및 이탈은 KRS에 비의존적임을 확인하였다. 그러나, TGFβ1 사이토카인이 세포의 이탈에 중요한 역할을 하는 것으로 추정되어(도 10B) TGFβ1을 처리하였고, 그 결과, 도 11B에 나타난 바와 같이 HCT116 모세포 및 KRS 과발현 세포주에 TGFβ1을 처리하였을 때 침윤적 돌기가 형성되는 것이 관찰되지 않았지만, 회전타원체(spheroid) 덩어리로부터 세포가 이탈하여 이동하는 현상을 확인하였다. 반면, KRS의 발현이 억제된 세포주의 경우, TGFβ1을 처리하더라도 세포의 이동이 현저히 감소하는 것을 확인하였고, 세포들의 이탈현상이 나타나지 않았음을 확인하였다(도 11B).
이는 KRS의 발현 억제로 감소하였던 상피세포 마커들을 포함하여 EMT관련 단백질 발현량을 확인한 경우, TGFβ1 처리에 의해 ZO1 및 오클루딘(occludin)과 같은 세포-세포 연결지점(cell-cell junction)에 존재하는 상피세포 마커들의 단백질 수준이 증가하고 파이브로넥틴(fibronectin)의 발현이 다시 감소하는 것으로 보아, 2차원 환경이었으나, 세포 미세환경 내의 TGFβ1에 의해 KRS의 발현이 저하된 세포에서는 EMT 현상이 억제되는 것을 나타낸다. 즉, KRS 발현이 억제되면서 중간엽세포 형태로 일부 어느정도 변환되었기에(도 2 및 도 8) EMT 유발 사이토카인인 TGFβ1(Katsuno et al., 2013, Curr Opin Oncol, 25:76-84)과 같은 미세환경인자들에 의한 효과가 더 이상 세포의 이탈, 이동 및 침윤에 영향을 미치지 못하는 것을 나타낸다.
<실시예 15> 3차원 콜라겐 겔 환경에서 회전타원체(spheroid) 덩어리로 배양된 세포에서 ERKs를 억제하는 경우 세포의 이탈 억제 확인
상기 <실시예 14>의 결과에 있어서, HCT116 모세포에 TGFβ1을 처리하였을 때 회전타원체(spheroid) 덩어리로부터 세포가 이탈 및 이동하는 현상이 확인되었고, KRS의 발현이 억제된 세포들은 TGFβ1을 처리하더라도 이탈하지 못하였으며, 반면 KRS의 발현이 억제된 세포들은 KRS를 발현하는 세포와 비교하여 ERKs의 활성이 현저히 저하된 것으로 확인되었다(도 5 참조). 따라서, 세포외 신호-조절 키나아제(extracellular signal-regulated kinase, ERKs) 억제제인 U0126를 HCT116 모세포주에 처리하였을 때 세포의 이탈 및 이동에 부정적인 영향을 줄 것으로 예상되었다. 이를 확인하기 위하여 ERKs 억제제인 50 μM U0126을 세포주에 처리하고, 회전타원체(spheroid) 덩어리를 실시간 영상화(live imaging)하여 세포의 이탈 및 이동현상을 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 ERKs 억제제를 처리하였을 경우에 세포의 이탈 및 이동현상은 나타나지 않았다(도 12). 이는 HCT116의 회전타원체(spheroid)로부터의 이탈은 ERKs 활성화에 의존적임을 나타낸다.
따라서, 3차원 콜라겐 겔 환경에서 HCT116 모세포의 암 세포 이탈은 KRS에 의한 ERKs의 활성, 및 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
<실시예 16> FRET 실험기법을 이용한 KRS-의존적 ERK 활성 측정
기존의 ERK의 신호 및 활성을 알아보기 위하여 수행되어 졌던 방법은 웨스턴 블랏 또는 면역염색이었고, 이러한 방법들은 세포의 이벤트의 일시적인 한부분을 스냅 사진으로 관찰한다는 단점을 가지고 있다. 따라서 본 실험에서는 ERK 활성를 측정할 수 있는 FRET-기초 센서를 통하여 살아있는 세포내에서의 ERK 신호을 관찰하기 위하여, ERK 활성 센서인 EKAR (extracellular signal-regulated kinase activity reporter)는 ERK의 인산화에 의해서 입체구조 변화를 일으키게 되어 FRET 신호가 증가되는 원리로, 세포내 EKAR의 CFP-YFP 비율을 관찰함(Harvey et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Dec 9;105(49):19264-9)으로써 ERK 활성을 측정하였다.
구체적으로, HCT116 모세포, KRS발현이 저해된 세포주 그리고 KRS 과발현 세포주에 EKAR(the extracellular signal-regulated kinase activity reporter, Harvey et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Dec 9;105(49):19264-9)를 48 시간동안 형질주입하였다. 2D 상에서 관찰한 경우, 세포를 분주하고 일반 배양 디쉬상에선 24시간 후에, 라미닌(laminin)-코팅 디쉬 상에 재분주(2% 세럼(serum)을 포함한 상태에서) 하고 2시간 후에 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 현미경으로 ERK 활성을 측정하였다. FRET 이미지는 Nikon Ti-E inverted microscope (equipped with PFS, CoolSNAP HQ camera (Roper Scientific, Trenton, NJ), excitation and emission filter wheels) 을 사용하여 이미지(4X4 binning mode, 200-ms exposure )를 얻었다. 모든 시스템은 MetaMorph software를 통해 작업하였다. 세포내 FRET 프로브의 이중 방출 비(dual-emission ratio, CFP/FRET)에 의해 얻어진 이미지는 MetaMorph software에서 제공하는 display(IMD) mode를 이용하여 FRET/CFP 비율을 8단계로 나누어 의색(pseudo-color) 이미지로 나타내었다.
그 결과, KRS 의존적으로 ERK의 인산화 정도가 달라져 있음을 확인하였고, 이를 ERKs 인산화가 높은 신호를 붉은색으로, 인산화가 낮은 신호를 푸른색으로 의색(pseudo-color)을 통하여 비교 분석하였다 (도 13A). 분석한 결과를 통계 처리한 결과, KRS 과발현 세포주에서 가장 높은 ERK의 활성을 보였으며, 그 아래로 모세포, 그리고 KRS 발현이 저해된 세포주에서 ERK 의 활성이 낮게 나타남을 확인하였다 (도 13B). 이러한 FRET 신호 강도 결과를 토대로 KRS의 발현은 ERK의 활성에 밀접하게 관여하고 있음을 나타낸다.
<실시예 17> KRS 발현 억제 세포주에 대한 ERKs 의 형질주입에 따른 팍실린(paxillin)의 발현 및 신호활성 변화 확인
KRS가 발현되는 모세포 및 과다발현 세포주에서는 ERKs 및 팍실린의 활성화 및 3차원 환경에서 세포덩어리로부터 이탈의 현상이 유도되었으나, KRS의 발현이 억제된 세포에서는 ERKs 및 팍실린의 활성화와 세포이탈이 일어나지 않았다. 따라서 KRS의 발현이 억제된 세포주에 인위적으로 ERKs 혹은 팍실린을 과다발현시켰을 경우, 3차원 환경에서 세포덩어리로부터 이탈의 현상이 유도되는 지 확인하였다.
구체적으로, KRS 발현 억제 세포주에 대한 ERKs 혹은 팍실린의 유전자를 lipofectamine 2000 (Life Technology, Grand Island, 뉴욕, 미국)을 이용하여, 생산자의 프로토콜에 따라 형질주입을 하고 48 시간 후, 그 세포들을 3차원 콜라젠 겔에서 하루동안 배양한 후 추출액을 확보하여, 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
그 결과, KRS의 발현이 억제된 세포주 shKRS2-1 및 shKRS5-4에 ERK(Ek)을 발현시켰을 경우, 각각 ERK의 활성화가 일어나고 팍실린의 발현 및 Tyr118의 인산화가 향상되었다. 하지만, FAK의 활성은 변함이 없음을 확인하였다 (도 14).
<실시예 18> KRS과 p67 라미닌(laminin) 수용체 (p67LR) 및 integrin α6β1의 결합체 형성 확인
Integrin α6β1은 세포 외부에 존재하는 ECM 분자인 라미닌(laminin)과 상호작용하며, 막에 존재하는 라미닌(laminin) 수용체와도 결합한다는 사실이 보고되어진 바 (Canfield, S. M., and Khakoo, A. Y. 1999, J Immunol 163, 3430-3440) 있으며, integrin은 세포 내 유착 신호(adhesion signal)에 직접적으로 관여하는 단백질로써 ERK의 활성을 조절한다고 잘 알려져 있다 (Lee, J. W., and Juliano, R, 2004, Mol Cells 17, 188-202). 따라서 세포 내 ERK의 활성을 유도하는 KRS, integrin α6β1, p67LR의 상호작용을 알아보고자, Myc으로 표지된 KRS를 발현하는 세포주를 이용하여 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였고, 특히 라미닌(laminin)의 영향을 알아보고자 라미닌(laminin) 코팅된 디쉬에 리플레이팅(replating)되어 배양된 세포로부터 확보한 세포추출액를 이용하여 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였다.
구체적으로, 정상적으로 10% 세럼(serum)을 포함하는 배지에서 키운 세포에서 얻은 총 세포추출물과 (세포가 healthy하면서 세럼(serum)의 영향을 최소화하고자) 2% 세럼(serum) 존재하는 조건에서 라미닌(laminin) 코팅 (10μg/ml)을 한 배양접시에 다시 재분주하여 리플레이팅(replating) 과정을 2시간동안 수행하여 얻은 총 세포 추출물에 각각 항-Myc 항체를 넣고 4℃ 에서 18 시간 이상 반응시켰다. 4°C에서 tube를 꺼낸 후, protein A와 G(부피 비율 1:1)가 코팅된 세파로즈 비드(sepharose bead)를 넣고 4°C에서 4 시간 반응시킨다. RIPA 버퍼로 비드를 세척 한 후, 2 × SDS-PAGE 시료 버퍼 로 5분 끓인다. 이러하게 준비된 공동면역침전 샘플을 웨스턴 블랏을 통하여 표기된 인자들과의 결합을 확인하였다.
그 결과, myc-KRS와 integrin α6, integrin β1 그리고 p67LR이 서로 결합하고 있음을 확인할 수 있었다. 하지만 KRS 억제제인 YH16899(Kim DG et al., Nat Chem Biol. 2014 Jan;10(1):29-34.)를 처리하였을 때, 그 결합이 저해됨을 알 수 있었다. 이 단백질들 간의 상호작용에서 라미닌(laminin)의 영향을 알아보고자 라미닌(laminin)-코팅 디쉬에 2% FBS만 첨가한 배지를 이용하여 재분주하여 동일한 공동면역침전(coimmunoprecipitation)을 수행하였을 때, 마찬가지로 myc-KRS와 integrin α6, integrin β1 그리고 p67LR이 서로 결합하고 있음을 확인하였고, 더불어 유착 신호(adhesion signal)가 억제된 현탁액(suspension) 상황에서도 KRS와 p67LR의 결합을 확인할 수 있었다 (도 15A, 15B). 그러나, integrin α6, integrin β1와 KRS의 결합은 세포가 부착되지 못한 현탁액의 경우에는 일어나지 않고 부착되었을 경우에만 결합이 가능한 것으로 확인되었다 (도 15A, 15B). 결론적으로 세포부착 신호(adhesion signal)에 관여하는 integrin α6β1과 KRS의 결합이 추가적인 YH16899 화합물의 처리에 의해서 억제될 수 있음을 확인함으로써, 세포 내 adhesion에 관련한 신호전달활성에 KRS/p67LR/integrin α6β1 의 결합체 형성이 중요하고 그 결합체 형성에 YH16899가 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
<실시예 19> 3차원 콜라겐 겔에서 배양된 세포를 이용한 ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) 분석을 통하여, 활성화된 ERKs가 팍실린(paxillin)의 발현을 조절할 수 있음을 확인
상기 <실시예 17>에서 확인한 바와 같이, KRS 발현을 저하시킨 shKRS2-1 세포주에 각각 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), pCMV-ERK1/2를 일시적 형질주입 하였을 때, KRS 발현이 저해된 세포주에 ERK1/2를 넣어주었을 때, 팍실린(paxillin)의 발현이 증가됨을 확인하였다. 따라서 HCT116세포주에서 ERKs의 활성에 의해 팍실린(paxillin)의 발현이 조절 받을 것이라는 예측 하에, ERKs의 하위인자(downstream)로 잘 알려진 전사인자 ELK-1, c-Jun을 통해 팍실린(paxillin)의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 ChIP(Chromatin Immunoprecipitation)을 수행하였다.
구체적으로, 3차원 콜라겐 겔 내에서 배양된 KRS가 발현 조절된 세포들에서 JNKs나 p38의 인산화 그리고 ERKs의 하위 전사인자로 Elk-1 혹은 c-Jun의 인산화(활성화)를 웨스턴 블랏으로 확인하였을 경우, KRS에 의한 ERKs의 활성화는 c-Jun의 활성화로 연계됨을 확인되었다. 3차원 콜라겐 겔에서 회전타원체(spheroid)로 배양한 HCT116 모세포주에 DMSO를 처리한 대조군, YH16899를 처리한 시료, 및 KRS발현이 저해된 세포주 shKRS2-1로부터의 시료을 ChIP-IT Express Enzymatic (Active motif) kit(BMS)를 이용하여 초음파분석(sonication)을 통해서 염색질 세분화(Chromatin fragmentation)를 한 후, 일부는 입력(input)으로 남기고, 나머지 잘라진 염색질은 c-Jun (cell signaling Technology), 혹은 Elk-1 (Santa Cruz Biotech. Inc.) 항체와 키트에서 제공하는 protein G magnetic beads를 넣고 4℃ 에서 18 시간이상 반응시켰다. 항체와 반응 후, 마그네틱 비드(magnetic bead)를 키트에 포함된 ChIP 버퍼 1, 2로 세척 하였다. 염색질을 용출한 후, 역 크로스-링킹(reverse cross-linking) 반응을 수행하였다. 이때 입력(input) DNA를 ChIP 버퍼 2와 5 M NaCl을 처리하였다. 그 후, 동시에 ChIP 과 input DNA 시료을 95°C에서 15분 반응시켰다. Proteinase K로 소화한 후, proteinase K Stop Solution을 이용해서 소화반응을 정지시켰다. 이렇게 얻어진 DNA는 하기 <표 3>에 기술된 해당 프라이머를 이용해서 PCR 분석을 수행하였다.
c-Jun 프라이머 1 F 5'-GAG GAC GAC CCC AGG AAA GG-3'
c-Jun 프라이머 1 R 5'-GTC AGC CAC TGG GTC ATC AC-3'
c-Jun 프라이머 2 F 5'-GCT GTA CTT GCA GAG CAG-3'
c-Jun 프라이머 2 R 5'-CAA CTA CCA TTT ATT GAG TGT C-3'
Elk-1 프라이머 1 F 5'-GGA AGT AAT ATT AAG AGA GAT GG-3'
Elk-1 프라이머 1 R 5'-CCA GGA GGA CCA TAA ATC AG-3'
Elk-1 프라이머 2 F 5'-GTG ATG ACC CAG TGG CTG AC-3'
Elk-1 프라이머 2 R 5'-CTC CCA GGC CTC CAG CCA C-3'
그 결과, 도 16A에서 보듯이 KRS의 발현과 JNKs 및 p38의 활성화는 연계되지 않고, 나아가 ERKs의 하위 전사인자인 Elk-1 이나 c-Jun 중에 KRS 의존적인 ERKs의 활성은 c-Jun의 활성 및 발현양과 상관관계가 있음을 확인하였다. 따라서, KRS 발현 세포주에서 ERKs의 활성화는 c-Jun의 활성으로 이어질 수 있음을 확인하였다.
또한, 3차원 콜라겐 겔에서 회전타원체(spheroid)로 배양한 세포들에 c-Jun 항체를 이용하여 ChIP 분석을 수행하였을 때, 대조군에서는 c-Jun이 비특이적인 부위에는 결합하지 않지만, 특이적으로 결합 가능한 서열부위의 팍실린(paxillin) 프로모터(도 16B)에 결합한다는 사실을 확인할 수 있었다. 하지만 YH16899 처리에 의해 c-Jun이 팍실린(paxillin) 프로모터에 결합하는 것이 저해되는 것을 확인하였다 (도 16C). 이러한 현상으로부터 ERKs의 하위인자인 인산화된 c-Jun이 팍실린(paxillin)의 프로모터에 결합함으로써 팍실린(paxillin)의 전사에 영향을 끼친다는 것을 알 수 있다. 그리고 YH16899 처리시에는 c-Jun이 팍실린(paxillin) 프로모터에 결합하지 못하게 된다는 사실을 통해, YH16899 처리시 팍실린(paxillin)의 발현이 줄어들고 팍실린(paxillin)의 인산화 수준이 줄어든 원인임을 알 수 있었다. 또한 ERKs의 하위인자(downstream)로 잘 알려진 Elk-1에 의해서도 팍실린(paxillin)의 전사단계를 조절할 것이라 예상하였지만, Elk-1 항체를 이용해서 ChIP 분석을 한 결과 Elk-1 항체는 팍실린(paxillin) 프로모터에 결합하지 않고 있음을 확인하였다 (도 16D).
결국, 3차원 콜라겐 겔 내에서 회전타원체 덩어리로 배양된 HCT116세포에서는 ERKs에 의해 조절받는 전사인자 c-Jun을 통해 팍실린(paxillin)의 전사를 조절함을 알 수 있으며, KRS와 라미닌(laminin) 수용체와의 결합을 저해하는 YH16899를 처리하였을 때 나타나는 총 팍실린(paxillin) 발현과 인산화 수준의 감소는, KRS/integrin α6β1/p67LR의 결합이 불가능하여 ERKs의 활성이 이루어지지 않음으로써 c-Jun이 팍실린(paxillin) 프로모터에 결합되지 못하여 발현이 억제되기 때문이라는 것을 확인하였다. 그리고 3차원 콜라겐 겔 내에서 회전타원체(spheroid)로 배양된 HCT116세포의 ERKs에 의한 팍실린(paxillin)의 발현 조절은 Elk-1이 아닌 c-Jun이 관여한다는 사실을 나타낸다.
<실시예 20> 다른 대장암 세포주에서 KRS 발현 의존적인 이탈(dissemination) 및 YH16899 화합물 처리에 의한 ERKs의 인산화와 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화에 억제적 효과 확인
HCT116 세포주에서 KRS의 발현 의존적으로 3차원 콜라겐 겔 내의 회전타원체(spheroid)로부터 이탈(dissemination)되거나, YH16899를 처리하였을 때 보여지는 ERKs 인산화 및 팍실린(paxillin) 단백질의 발현과 인산화의 감소가, 보편적으로 다른 대장암세포주들에서도 나타날 수 있는 현상인지 알아보기 위하여, 다양한 대장암 세포주(SW620, HCT15, SNU977, KM12SM, SNU-C5)들에 shKRS를 안정화한 형질주입(stable transfection)하고 KRS를 발현억제 (clone #2 및 #5)하여 이탈(dissemination)을 지속 촬영(time-lapse) 현미경으로 관찰하거나 (도 17A), YH16899를 처리하여 신호전달활성 (도 17B)을 확인하였다.
구체적으로, 대장암 세포로 잘 알려진 SW620, HCT15, SNU977, KM12SM, SNU-C5 (한국세포주은행, 서울대학교 암연구소)를 3차원 콜라겐 겔 내에 회전타원체(spheroid) 덩어리로 분주 하여 6시간 후에 지속 촬영(time-lapse)로 이미징을 하거나, 혹은 정상적으로 10% 세럼(serum)이 포함된 2D 배양조건에서 2일간 배양한 후, 용해 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)에 SDS, Na3O4V, protease inhibitor cocktails (GenDepot)를 넣고 용해과정을 거쳐서 세포 용해물(cell lysate)를 얻어 단백질 정량한 후, 웨스턴 블랏을 표기된 인자들에 대하여 수행하였다.
그 결과, HCT116 세포주와 마찬가지로 다른 대장암세포주 SW620의 경우, 모세포는 3차원 회전타원체(spheroid) 덩어리로부터 이탈 (dissemination) 현상이 일어났으나, KRS를 발현 억제한 세포주 (#2, #5) 및 SW620 모세포에 U016 혹은 YH16899를 처리한 경우에는 그 이탈현상이 생기지 않았다 (그림 17A). 뿐만 아니라, 다양한 대장암 세포주들에서 YH16899를 처리하였을 때, 세포사멸을 유도하지 않고서 FAK, ERKs, 팍실린(paxillin)의 인산화 감소와 더불어 E-카데린(E-cadherin) 및 팍실린(paxillin)의 발현양 감소가 생기는 결과를 얻을 수 있었다 (도 17B). 따라서 대장암 세포주에서 YH16899의 처리에 의한 억제효과는 일부 세포주에서만 나타나는 특수한 현상이라기 보다는 여러 대장암 세포주들에서 보편적으로 나타나는 현상이므로, YH16899가 여러 대장암 세포주들의 저해효과를 초래할 수 있는 보편적인 저해제임을 확인하였다.
<실시예 21> HCT116 세포주에서 YH16899 화합물 처리에 의하여, ERKs의 인산화와 팍실린(paxillin)의 발현 및 인산화에 대한 억제적 효과 확인
HCT116 세포주에서 보여지는 이탈(dissemination) 현상이 ERKs의 활성, 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성이 중요 요인으로 작용하므로, 3차원 콜라겐 겔에서 ERKs 억제제인 U0126과 (도 18A) KRS 억제제인 YH16899를 처리하였을 때(도 18B)의 초점 접착(focal adhesion) 관련 분자와 상피 마커(epithelial marker)의 발현을 확인해보았다.
구체적으로, 콜라겐으로 둘러싸인 3차원 겔에서 배양한 HCT116 모세포에 U0126를 50, 100 μM 혹은 YH16899를 50, 100 μM으로 하루 처리한 후, 용해 버퍼에 SDS, Na3O4V, protease inhibitor cocktails (GenDepot) 를 넣고 4℃에서 1시간 이상 처리해주었다. 4℃, 13000 rpm으로 30분 동안 원심분리 한 후, 새로운 마이크로원심분리기 튜브에 상층액(세포추출액)만을 옮겨주었다. 4 x SDS-PAGE 시료 버퍼를 넣어준 후, 5 분동안 100℃에서 끓였다. 이 추출액을 α-tubulin 항체 (Sigma)를 이용한 웨스턴 블랏을 통해서 정량하여 다른 단백질의 발현양 및 인산화 정도의 변화를 웨스턴 블랏을 통하여 측정하였다.
그 결과, 초점 접착(focal adhesion)관련 분자인 FAK, ERKs, 팍실린(paxillin), 의 인산화 수준이 낮아졌으며, 상피 마커(epithelial marker)인 E-카데린(cadherin), β-카테닌(catenin)의 발현이 감소되는 것을 확인하였다 (도 18A, 18B). 따라서 U0126 또는 YH16899 처리 되었을 경우, ERKs와 팍실린(paxillin) 발현 및 활성억제에 의해 3차원 콜라겐 내에서 HCT116 친세포의 이탈(dissemination)이 방해된다는 것을 확인하였다.
<실시예 22> KRS 발현하는 HCT116 모세포에 있어 세포부착에 의존적인 ERKs의 활성화에 인테그린 α6의 중요성 확인
상기 실시예들에서, HCT116 모세포의 ERKs의 활성화는 KRS, p67LR, integrin α6β1의 결합과 연계되고 (도 15), ERKs의 활성은 FAK과 연계되지 않는 경우도 확인되었다 (도 5). 이에, 세포가 부착됨에 따른 FAK의 활성화 (Tyr397의 인산화 후, c-Src에 의한 Tyr925의 인산화를 통한 ERKs 활성화: Lee JW and Juliano R. Molecules and Cells. 2004 Apr 30;17(2):188-202)가 ERKs의 활성화로 연결되는지 확인하고자 하였다. 즉, integrin α6의 세포외기질과의 결합 기능을 항체로 미리 결합시킴으로써 ERK의 활성이 억제될 경우, FAK의 Tyr397 및 Tyr925의 인산화가 연계되는 지 확인하였다.
구체적으로, HCT116 모세포를 2%의 세럼 (serum)이 존재하는 경우 하에 현탁액 (suspension) 상태로 혹은 laminin이 미리 코팅된 배양디쉬에 리플레이팅(replating)하였다. 이때, 세포를 미리 정상적인 IgG(Immunoglobulin, 항체 대조군)나 integrin α6 항체를 미리 1시간동안 섞어 반응시킨 후 리플레이팅하였다. 리플레이팅 2시간 또는 24시간 후 세포추출액을 각각 확보하여 상기 단백질들에 대하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
그 결과, 라미닌이 코팅된 2D 상태의 HCT116 세포는 24시간 정도 되었을 경우, ERKs의 활성화 및 팍실린의 인산화가 세포가 부착한 경우에 유도되었으나, 이들은 integrin α6 전처리에 의해 억제됨을 확인하였다. 하지만, FAK의 인산화들은 영향받지 않고 유지됨을 확인하였다 (도 19A). 이는 integrin α6는 KRS에 의한 ERKs 활성화에 중요하나, FAK의 인산화를 매개로 하지는 않음을 나타낸다. 따라서, KRS발현 의존적인 세포의 3차원 콜라겐 겔 내에서의 ERKs의 활성화, 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성화, 나아가 회전타원체(spheroid)로부터의 이탈(dissemination)은 FAK의 활성화 및 Tyr925 인산화와 무관함을 확인하였다.
<실시예 23> KRS가 발현 억제된 세포주에게 활성화된 형태의 FAK나 WT FAK을 과발현 시킨 경우, ERKs, 팍실린(paxillin)의 발현과 신호 활성으로 연계되지 않고, 3차원 콜라겐 겔에서 이탈(dissemination) 여부 확인
상기 실시예들을 통해 알 수 있듯이, HCT116 세포주에서 보여지는 이탈(dissemination) 현상은 ERKs의 활성, 그리고 ERKs의 활성화에 따른 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성과 밀접한 관련이 있다. 이에, 세포가 부착됨에 따른 FAK의 활성화 (Tyr397의 인산화 후, c-Src에 의한 Tyr925의 인산화를 통한 ERKs 활성화: Lee JW and Juliano R. Molecules and Cells. 2004 Apr 30;17(2):188-202)가 ERKs의 활성화로 연결되어 KRS 발현 의존적 이탈(dissemination)을 유도하는 지 확인하고자 하였다.
구체적으로, HCT116 parental 모세포에 Ad-HA 대조군 바이러스 혹은 Ad-HA-R454 FAK 인산화효소 활성이 죽은 형태(dead form)의 아데노바이러스를 감염시키거나, KRS의 발현을 저하시킨 세포주에 Ad-HA 대조군 바이러스, Ad-HA ΔN(1-100) FAK (활성화된 FAK; Lim ST et al., Molecular Cell 2008 Jan 18;29(1):9-22), 혹은 Ad-HA-FAK WT(야생형) 바이러스를 12시간동안 감염시킨 후, 웨스턴 블랏으로 상기된 분자들에 대한 발현 및 인산화정도를 확인하였다 (도 19B). 그 후 세포주들의 회전타원체(spheroid)를 확보하여 3차원 콜라겐 겔에 분주한 후, 지속 촬영(time-lapse) 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 3차원 콜라겐 겔에서 KRS가 발현하는 모세포에게 비활성화 (인산화효소 활성이 죽은) R454 FAK 돌연변이체가 발현되더라도 대조군 바이러스를 감염시킨 모세포처럼 회전타원체(spheroid) 세포의 이탈(dissemination)이 원할하게 일어나는 것을 확인하였다. 반면, KRS 발현을 저하시킨 HCT116 세포주들에 활성화 형태의 FAK이나 야생형 FAK을 과다발현시키더라도 KRS가 발현억제된 세포들의 이탈(dissemination) 억제 현상을 복구할 수 없었음을 확인하였다 (도 19C 및 19D). 활성화한 돌연변이 L37A FAK(Jung et al., J Cell Sci. 2012 Dec 15;125(Pt 24):5960-73)를 발현시킨 HCT116 shKRS 세포주에서도 FAK의 활성에 의한 ERKs의 활성이 연계되지 못하였던 것으로 확인되었다 (도 19E).
<실시예 24> KRS가 발현 억제된 세포주에게 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), 또는 pCMV-ERK1/2 혹은 팍실린과 ERK를 공동으로 인위적으로 발현하도록 형질주입 한 경우, ERKS, 팍실린(paxillin)의 발현과 신호활성이 부분적으로 향상되고 3차원 콜라겐 겔에서 이탈(dissemination)됨을 확인
상기 실시예들을 통해 알 수 있듯이, HCT116 세포주에서 보여지는 이탈(dissemination) 현상은 ERKs의 활성, 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성과 밀접한 관련이 있다. 따라서, KRS 발현이 저해된 세포주들에 ERKs의 활성과 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성을 회복시키면 3차원 콜라겐 겔 내에서 회전타원체(spheroid)의 이탈(dissemination)이 일어나는지 여부를 확인하기 위해, KRS 발현이 저해된 세포주에 팍실린(paxillin) (Pax 클론들)혹은 ERKs (ERK 클론들)를 단독으로, 그리고 팍실린(paxillin)과 ERKs 함께 넣은(PEE 클론들) 안정화된 세포주들(stable cell lines)을 제작하였고, 그 중에서 웨스턴 블랏을 통해 ERKs 및 팍실린(paxillin) 활성이 뛰어난 클론들을 선택하였다 (도 20A). 선택된 클론들은 회전타원체(spheroid)로 형성되도록 한 후, 분주 하여 3차원 콜라겐 겔 내에서 이탈(dissemination)이 유도되는지 지속 촬영(time-lapse) 현미경을 통해 28 시간동안 관찰하였다.
구체적으로, KRS 발현을 저하시킨 세포주에 각각 pCMV-Mock, pCMV-팍실린(paxillin), pCMV-ERK1/2를 형질주입하여 안정화된 세포주들(stable cell lines)을 구축한 후 웨스턴 블랏으로 표기된 인자들에 대하여 확인하였다 (도 20A). 그 중에서 각각의 분자이 형질주입이 잘 되어 발현을 잘하는 세포주를 선택하여 회전타원체(spheroid) 형성시켰다. 만들어진 회전타원체(spheroid)를 분주 하여 3차원 콜라겐 겔 내에서 회전타원체(spheroid)의 이탈(dissemination) 유무를 지속 촬영(time-lapse) 현미경을 통해 28시간동안 관찰하였다 (도 20B).
그 결과, 3차원 콜라겐 겔에서 HCT116 KRS 발현을 저하시킨 세포주가 팍실린(paxillin) 혹은 ERK1/2의 활성을 얻거나, 두 단백질 모두의 활성을 얻음으로써 이탈(dissemination)되는 현상을 관찰할 수 있었다 (도 20B). 또한 특이하게도 KRS 발현이 저해된 세포주에 ERK1/2를 넣어주었을 때, 팍실린(paxillin)의 발현이 증가됨을 확인하였다 (도 20A). 그래서 HCT116 세포주에서 ERKs에 의해 팍실린(paxillin)의 발현이 조절 받을 것이라는 예상을 확인할 수 있었다. 따라서 KRS 발현이 저해됨에 따라 나타난 이탈(dissemination) 현상의 억제는 ERKs와 팍실린(paxillin)의 활성이 저해에 의한 현상임을 재확인하였다.
<실시예 25> 인간 결장 암세포(human colon tumor tissue)에서 KRS, 팍실린(paxillin), ERKs 발현의 비례적 상관관계 확인
한국인 대장암 환자의 암조직 및 대응되는 정상조직에서 KRS, 팍실린(paxillin), ERKs 발현의 상관관계 확인을 위해 웨스턴 블랏 및 면역조직화학(immunohistochemistry)를 수행하였다.
구체적으로, Grade II 및 III로 확정 진단받은 임상적 조직들을 포함한 인간 결장 암세포(human colon tumor tissue)들로부터 확보된 조직의 추출액 혹은 조직을 이용하여 팍실린(paxillin), p-ERKs와 KRS의 웨스턴 블랏 (도 21A) 혹은 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색(도 21B)을 통하여 그들이 침습성 암세포 변연(margin)에서 긍정적인 연관성을 확인하였다. 면역조직화학(immunohistochemistry)은 세포나 조직 내의 항원을 가시화하는 방법이다. 실제 암조직 내의 다양한 세포의 종류가 존재하므로, 특정 세포종류 및 조직부위에 대하여 면역조직화학(immunohistochemistry)을 통해 여러 항원의 발현의 부위 및 정도를 상호적으로 검사함으로써 동시에 여러 단백질의 발현의 부위 및 정도의 연관성에 대해 밝힐 수 있다.
그 결과, 인간 결장 암세포(human colon tumor tissue)에서 팍실린(paxillin) 과 p-ERKs, KRS 의 발현을 DAB staining을 통해 각 단백질의 양성부위와 양성반응의 강도를 관찰하였다. 결과적으로 grade II 또는 III의 대장암 환자 샘플에서 KRS와 팍실린(paxillin)이 동일한 부위에서 높게 발현되는 것을 관찰하였고, 또한 p-ERKs의 양성반응의 부위와 KRS, 팍실린(paxillin)의 양성반응 부위가 일치하는 것 또한 확인할 수 있었다 (도 21A, 도 21B). 따라서, 임상적 결장 암 세포(Clinical colon cancer tissues)에서 KRS, pERKs 및 팍실린(paxillin)의 발현부위가 침습성 암세포의 변연(margin)에서 긍정적인 연관성을 보이므로, KRS에 의해 매개되는 전이에 있어서 KRS에 의한 ERKs의 활성 조절 그리고 다시 팍실린(paxillin)의 발현 및 활성의 조절이 중요하며, 암의 초기 전이단계에서 상기 인자들의 억제 제어를 통한 암전이 억제가 가능할 것으로 사려지며, 이들의 3차원 콜라겐 겔에서 암세포 이탈(dissemination) 분석시스템은 항 암전이 억제제 개발에 도움이 될것이다.
<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Screening method for metastasis inhibitor of cancer using spheroid cell mass regulated expression of lysyl-tRNA synthetase in 3-dimensional collagen gels environments <130> 13P-04-43 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shKRS-0 <400> 1 ccggcctgga agtgacttgc atcaactcga gttgatgcaa gtcacttcca ggtttttg 58 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shKRS-1 <400> 2 ccggcgtgga cccaaatcaa tactactcga gtagtattga tttgggtcca cgtttttg 58 <210> 3 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shKRS-2 <400> 3 ccggccagag atacttggac ttgatctcga gatcaagtcc aagtatctct ggtttttg 58 <210> 4 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shKRS-5 <400> 4 ccgggccttt catcacttat cacaactcga gttgtgataa gtgatgaaag gctttttg 58 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEcad-5 <400> 5 tgcccagaaa atgaaaaagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hEcad-3 <400> 6 gtgtatgtgg caatgcgttc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNcad-5 <400> 7 acagtggcca cctacaaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hNcad-3 <400> 8 ccgagatggg gttgataatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVim-5 <400> 9 gagaactttg ccgttgaagc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVim-3 <400> 10 gcttcctgta ggtggcaatc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTwist-5 <400> 11 ggagtccgca gtcttacgag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTwist-3 <400> 12 tctggaggac ctggtagagg 20

Claims (17)

1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 세포배양 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현 또는 발현하지 않도록 조절된 암 세포주 또는 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에 피검물질을 처리하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 KRS 작용을 저해하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 3차원 환경은 수용성 환경 또는 콜라겐(collagen)으로 둘러싸인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리는 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 3항에 있어서, 상기 전이성 암은 대장암, 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 폐암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 항체, 항체의 부분, 활성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액, 동물조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 KRS의 작용은 암 세포의 세포-세포간 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포의 분산 (scattering), 세포의 상처치유(wound-healing), 세포부착의 신호전달 인자들의 활성 변화, c-Jun의 팍실린 프로모터에의 결합, 및 회전타원체(spheroid) 세포 덩어리로부터 이탈(dissemination)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 암 전이억제제의 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 세포-세포간 부착은 ZO-1, 오클루딘, CK14, β-카테닌(β-catenin), 또는 E-카데린(E-cadherin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 상피 마커의 발현 또는 발현위치 변화, 또는 파이브로넥틴, 트위스트 (Twist), 비멘틴, α-SMA (smooth muscle actin), 스네일1 (snail1), 슬러그(Slug), 또는 N-카데린 (N-cadherin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 중간엽 마커의 발현 또는 발현위치 변화, 또는 세포의 분산 (scattering)인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 세포-세포외기질 부착은 세포가 세포외기질에 부착한 정도와 세포의 퍼짐 (spreading) 정도, 초점 접착(focal adhesion)의 생성과 와해, 액틴의 재구성, 인산화된 FAK, c-Src, ERKs, 또는 팍실린(paxillin)의 발현, 또는 발현위치의 변화인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 상기 세포부착의 신호전달 활성은 FAK, c-Src, ERKs, c-Jun, 및 팍실린(paxillin)의 발현 또는 인산화의 변화 또는 감소, 또는 인테그린α6와의 결합의 변화인 것을 특징으로 하는 암 전이억제제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 KRS의 작용 분석은 웨스턴 블랏, 실시간 PCR(real time PCR), 면역침강법(co-immunoprecipitation), ChIP(chromatin immunoprecipitation), FRET 분석, 면역형광염색(immunofluorescence), 및 면역조직화학(immunohistochemistry)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 암전이 억제제의 스크리닝 방법.
1) 3차원 혹은 세포외기질로 둘러싸인 환경에서 라이실-tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase; KRS)를 발현 또는 발현하지 않도록 조절된 암 세포주 또는 암세포덩어리를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리에서 KRS의 작용을 분석하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 KRS의 작용 수준을 이용하여 상기 암세포주 또는 암세포덩어리의 전이수준을 분석하는 단계를 포함하는 암세포의 암세포주 또는 암세포덩어리로부터의 이탈(dissemination), 상피-중배엽세포 전이 또는 분화(epithelial-mesenchymal transition), 이동, 침윤, 전이 수준 또는 그들과 관련한 신호전달 인자들의 발현 및 활성의 모니터링 방법.
제 11항에 있어서, 상기 단계 1)의 3차원 환경은 수용성 환경 또는 콜라겐으로 둘러싸인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 단계 1)의 암 세포주 또는 암세포덩어리는 전이성 암 또는 전이성 유발 가능한 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 단계 2)의 KRS의 작용은 암 세포의 세포-세포간 부착, 세포-세포외 기질(extracellular matrix; ECM) 부착, 세포의 분산 (scattering), 세포의 상처치유(wound-healing), 세포부착의 신호전달 인자들의 활성 변화, c-Jun의 팍실린 프로모터에의 결합, 및 회전타원체(spheroid) 세포 덩어리로부터 이탈(dissemination)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 세포-세포간 부착은 ZO-1, 오클루딘, CK14, β-카테닌(β-catenin), 또는 E-카데린(E-cadherin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 상피 마커의 발현 또는 발현위치 변화, 또는 파이브로넥틴, 트위스트 (Twist), 비멘틴, α-SMA (smooth muscle actin), 스네일1 (snail1), 슬러그(Slug), 또는 N-카데린 (N-cadherin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 중간엽 마커의 발현 또는 발현위치 변화, 또는 세포의 분산 (scattering)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 세포-세포외 기질 부착은 세포가 세포외기질에 부착한 정도와 세포의 퍼짐 (spreading) 정도, 초점 접착(focal adhesion)의 생성과 와해, 액틴의 재구성, 인산화된 FAK, c-Src, ERKs, 또는 팍실린(paxillin)의 발현 또는 발현위치의 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 세포부착의 신호전달 활성은 FAK, c-Src, ERKs, c-Jun, 또는 팍실린(paxillin)의 발현 또는 인산화의 변화 또는 감소, 또는 인테그린α6와의 결합의 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020140056973A 2013-05-15 2014-05-13 3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법 KR101593049B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/891,054 US20160146815A1 (en) 2013-05-15 2014-05-13 Method for screeing cancer metastasis inhibitor using culture of cells or spheroidically aggregated cells in which lysyl-trna synthetase is regulated to be expressed or unexpressed
JP2016513871A JP2016519318A (ja) 2013-05-15 2014-05-13 ３次元コラーゲンゲル環境で、リジル−ｔＲＮＡ合成酵素が発現したり発現しないように調節された細胞または回転楕円体で塊になった細胞培養を用いた癌転移抑制剤のスクリーニング方法
PCT/KR2014/004276 WO2014185692A1 (ko) 2013-05-15 2014-05-13 3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130055211 2013-05-15
KR20130055211 2013-05-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140135634A KR20140135634A (ko) 2014-11-26
KR101593049B1 true KR101593049B1 (ko) 2016-02-12

Family

ID=52456320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140056973A KR101593049B1 (ko) 2013-05-15 2014-05-13 3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20160146815A1 (ko)
EP (1) EP3006941A1 (ko)
JP (1) JP2016519318A (ko)
KR (1) KR101593049B1 (ko)
CN (1) CN105431739A (ko)
WO (1) WO2014185692A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180085251A (ko) 2017-01-18 2018-07-26 서강대학교산학협력단 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101851003B1 (ko) 2016-02-25 2018-04-20 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
US10613088B2 (en) 2016-06-12 2020-04-07 Mohammad Abdolahad Method and system for metastasis diagnosis and prognosis
US10761081B2 (en) 2016-06-12 2020-09-01 Mohammad Abdolahad Method and system for metastasis diagnosis and prognosis
CN111239353A (zh) * 2020-01-19 2020-06-05 辉源生物科技（上海）有限公司 一种人源柠檬酸转运蛋白抑制剂化合物的筛选方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110189195A1 (en) 2008-08-18 2011-08-04 Snu R&Db Foundation Method for controlling cancer metastasis or cancer cell migration by modulating the cellular level of lysyl trna synthetase
WO2011153277A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases
US20130052177A1 (en) 2010-02-04 2013-02-28 The Scripps Research Institute MONOMERIC FORMS OF HUMAN AMINOACYL-t-RNA SYNTHETASES HAVING NON-CANONICAL BIOLOGICAL ACTIVITIES

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2939689B1 (en) * 2009-12-11 2017-09-13 aTyr Pharma, Inc. Glutaminyl tRNA synthetases for use in the treatment of inflammatory disorders
CN102952279A (zh) * 2012-05-10 2013-03-06 东南大学 用于肿瘤细胞三维培养的水凝胶及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110189195A1 (en) 2008-08-18 2011-08-04 Snu R&Db Foundation Method for controlling cancer metastasis or cancer cell migration by modulating the cellular level of lysyl trna synthetase
US20130052177A1 (en) 2010-02-04 2013-02-28 The Scripps Research Institute MONOMERIC FORMS OF HUMAN AMINOACYL-t-RNA SYNTHETASES HAVING NON-CANONICAL BIOLOGICAL ACTIVITIES
WO2011153277A2 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related to protein fragments of lysyl-trna synthetases

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180085251A (ko) 2017-01-18 2018-07-26 서강대학교산학협력단 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20160146815A1 (en) 2016-05-26
CN105431739A (zh) 2016-03-23
KR20140135634A (ko) 2014-11-26
EP3006941A1 (en) 2016-04-13
JP2016519318A (ja) 2016-06-30
WO2014185692A1 (ko) 2014-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bahmad et al. Sphere-formation assay: three-dimensional in vitro culturing of prostate cancer stem/progenitor sphere-forming cells
Ponti et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties
Li et al. A dominant-negative form of mouse SOX2 induces trophectoderm differentiation and progressive polyploidy in mouse embryonic stem cells
WO2021208129A1 (zh) 一种用于乳腺上皮干细胞的培养基和培养方法
US9151744B2 (en) Lung tissue model
KR101593049B1 (ko) 3차원 콜라겐 겔 환경에서 라이실-ｔＲＮＡ 합성효소가 발현하거나 발현하지 않도록 조절된 세포 또는 회전타원체로 덩어리진 세포 배양을 이용한 암 전이 억제제의 스크리닝 방법
JP6076258B2 (ja) 上皮細胞の不死化および使用法
Liu et al. Collagen-based three-dimensional culture microenvironment promotes epithelial to mesenchymal transition and drug resistance of human ovarian cancer in vitro
Holen et al. Loss of plakoglobin promotes decreased cell-cell contact, increased invasion, and breast cancer cell dissemination in vivo
Matsumura et al. Oncogenic property of acrogranin in human uterine leiomyosarcoma: direct evidence of genetic contribution in in vivo tumorigenesis
EP3289072B1 (en) Means and methods for generation of breast stem cells
Melotti et al. In vitro and in vivo characterization of highly purified human mesothelioma derived cells
Ruan et al. Nac1 promotes self-renewal of embryonic stem cells through direct transcriptional regulation of c-Myc
Zheng et al. Fibronectin regulates the self-renewal of rabbit limbal epithelial stem cells by stimulating the Wnt11/Fzd7/ROCK non-canonical Wnt pathway
Zhang et al. Mechanical transmission enables EMT cancer cells to drive epithelial cancer cell migration to guide tumor spheroid disaggregation
WO2014007402A1 (ja) 眼細胞の分化マーカーおよび分化制御
US20230152325A1 (en) Active Alpha-5-Beta-1 Integrin As A Biomarker For Enhancing Tumor Treatment Efficacy
Begum et al. Interaction of delta-like 1 homolog (Drosophila) with prohibitins and its impact on tumor cell clonogenicity
Strobel et al. Isolation and culture of primary human pancreatic stellate cells that reflect the context of their tissue of origin
Tian et al. s-SHIP promoter expression identifies mouse mammary cancer stem cells
Daum et al. ITIH5 shows tumor suppressive properties in cervical cancer cells grown as multicellular tumor spheroids
Doberstein et al. Fallopian tube precursor lesions of serous ovarian carcinoma require L1CAM for dissemination and metastasis
Suesskind et al. Characterisation of novel uveal melanoma cell lines under serum-free conditions
WO2019031781A2 (ko) 효모 이중 혼성 스크리닝을 위한 벡터 라이브러리 및 이를 이용한 표적 단백질에 결합하는 탈유비퀴틴화 효소의 동정방법
Kosach et al. Alterations in expression of S6K1 isoforms in MCF7 cells have a strong impact on the locomotor activity as well as on S6K1 and Akt signaling

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee