KR101582188B1 - Method for increasing content of paradol using candida utilis - Google Patents

Abstract

본 발명은 쇼가올이 함유된 기질에 특정 미생물을 배양하여 기질 내 파라돌의 함량을 증가시키는 방법, 및 이에 따라 제조된 파라돌 함량이 증가된 기질에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따를 경우 단시간에 경제적이고도 효율적으로 기질 내 쇼가올을 파라돌로 생물전환시킬 수 있으며, 이에 따라 증대된 파라돌은 인지기능 개선 등 다양한 용도의 뇌질환 개선 소재로 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for increasing the content of paradol in a substrate by culturing a specific microorganism on a substrate containing the sucrose, and a substrate having an increased paradol content thus prepared. According to the method of the present invention, it is possible to economically and efficiently convert biotransformation into paradol in a short time, and thus the increased paradol can be used as a material for improving brain diseases for various purposes such as improvement of cognitive function have.

Description

칸디다 유틸리스를 이용하여 파라돌 함량을 증가시키는 방법{METHOD FOR INCREASING CONTENT OF PARADOL USING CANDIDA UTILIS}METHOD FOR INCREASING CONTENT OF PARADOL USING CANDIDA UTILIS USING CANDIDA UTILIS

본 발명은 쇼가올이 함유된 기질에 특정 미생물을 배양하여 기질 내 파라돌의 함량을 증가시키는 방법, 및 이에 따라 제조된 파라돌 함량이 증가된 기질에 관한 것이다.The present invention relates to a method for increasing the content of paradol in a substrate by culturing a specific microorganism on a substrate containing the sucrose, and a substrate having an increased paradol content thus prepared.

6-쇼가올은 혐기성 곰팡이류에 의해 대사되어 측쇄의 α, β-불포화케톤 부위가 환원되어 6-파라돌 및 관련 대사체로 전환된다. 또한, 흑국균인 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)에 의한 6-쇼가올 생물전환 대사체(6-쇼가올 측쇄의 ω-산화된 대사체와 카르보닐 환원된 대사체) 생성이 알려져 있다(약학회지 제27권 제1호 29~36, 1983).The 6-carbohydrate is metabolized by anaerobic fungi, reducing the alpha, beta -unsaturated ketone moiety of the side chain and converting it into 6-para-stones and related metabolites. It is also known that the production of the 6-sucrose bioconversion metabolite (ω-oxidized metabolite of the 6-show side chain and the carbonyl reduced metabolite) by Aspergillus niger , which is a black germ (Medicine Journal 27, No. 1, 29-36, 1983).

6-파라돌은 생강 속에 있는 매운맛을 가진 미량 성분으로 생강 및 기니 페퍼(Guinea pepper)의 씨로부터 Connell 등(1970)이 분리하였으며, 파라돌이란 이름도 기니 페퍼의 씨가 Grains of paradise로 불린다는 것에서 유래되었다. 6-파라돌의 구조 역시 캡사이신(capsaicin), 쇼가올 및 진저롤과 마찬가지로 바닐릴 핵을 갖고 있으나, 바닐릴 핵에 아실 아미드 결합 대신 케토 알킬 측쇄가 결합되어 있다는 특징이 있다.6-paradol is a spicy, trace element in the ginger, separated from ginger and guinea pepper seeds by Connell et al. (1970), and the name parodoll is also called Grains of paradise . The structure of 6-paradol also has a vanillin nucleus similar to capsaicin, sucrose and gingerol, but it is characterized in that the vanilyl nucleus is bound to a ketoalkyl side chain instead of an acylamide bond.

한편, 6-파라돌의 기능성 및 약리 활성에 대해서는 다양한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 6-파라돌은 HL-60 세포의 세포생존률 및 DNA 합성을 저해하여 잠재적인 세포 독성/세포분열 억제 활성을 지님이 보고된바 있으며(Cancer Letters 134 (1998) 163-168), 6-파라돌의 세포 독성 및 병리학적 연구 결과에 대해 보고되어 있다(Environmental Mutagens & Carcinogens 18-1 : 32-36 (1998)).On the other hand, various studies have been made on the functionality and pharmacological activity of 6-para-ardenes. For example, it has been reported that 6-paradol inhibits cell viability and DNA synthesis of HL-60 cells and has potent cytotoxic / cytostatic activity (Cancer Letters 134 (1998) 163-168) The cytotoxicity and pathological results of 6-para-lone have been reported (Environmental Mutagens & Carcinogens 18-1: 32-36 (1998)).

또한, 6-파라돌은 항균 및 진통 효과가 있으며, 화학적 암예방 기능이 있음이 보고되었고(Mutation Research 496 (2001) 199-206), 카스파아제 3-의존 메커니즘을 통해 아포토시스를 유발함이 보고된바 있다(Cancer Letters 177 (2002) 41-47). 최근에는, 6-파라돌이 COX-2 저해제로 분류될 수 있어 항염증 활성이 있음이 보고된바 있다(International Journal of Chemistry; Vol.5, No.3; 12-18 (2013)), In addition, 6-paradol has been reported to have antimicrobial and analgesic effects, to prevent cancer chemosis (Mutation Research 496 (2001) 199-206), and to induce apoptosis through caspase 3-dependent mechanisms (Cancer Letters 177 (2002) 41-47). In recent years, it has been reported that 6- paradol can be classified as a COX-2 inhibitor and has anti-inflammatory activity (International Journal of Chemistry; Vol. 5, No.3; 12-18 (2013)

본 발명의 목적은 생물전환 기술을 이용하여 쇼가올이 함유된 기질에서 기능성 성분으로 활용할 수 있는 파라돌의 함량을 증폭시키기 위한 것이다.It is an object of the present invention to amplify the content of paradol which can be utilized as a functional ingredient in a substrate containing a sucrose by using a biotransformation technique.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 쇼가올이 함유된 기질에 식품으로 이용 가능한 특정 미생물을 배양할 경우 파라돌의 함량이 현저히 증가됨을 발견하여 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have conducted intensive studies to achieve the above object. As a result, they found that when a specific microorganism that can be used as a food is cultured in a substrate containing sucrose, the content of paradol is remarkably increased, Completed.

본 발명의 방법에 따를 경우 단시간에 경제적이고도 효율적으로 기질 내 쇼가올을 파라돌로 생물전환시킬 수 있으며, 이에 따라 증대된 파라돌 대사체는 인지기능 개선 등 다양한 용도의 뇌질환 개선 소재로 이용될 수 있다.According to the method of the present invention, it is possible to economically and efficiently convert biotransformation into paradol in a short period of time, and thus the increased paradol metabolism can be used as a material for improving brain diseases for various purposes such as improvement of cognitive function .

도 1은 생물전환을 위한 생강 기질 농도, 반응 시간, 선발균 농도 변화에 따른 6-파라돌 함량 변화의 반응표면 그래프를 나타낸다.
도 2는 중심합성법을 이용하여 6-파라돌 생물전환을 위한 최적 조건을 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the reaction surface graph of the change of 6-para-stol content according to the change of ginger substrate concentration, reaction time, and starting bacteria concentration for bioconversion.
Figure 2 shows the optimal conditions for 6-para-dolbin biotransformation using the central synthesis method.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. However, it should be understood that the present invention may be embodied in many other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof.

일 측면에서, 본 발명은 쇼가올이 함유된 기질에 칸디다 유틸리스(Candida utilis)를 배양하여 기질 내 파라돌의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 쇼가올은 파라돌로 생물전환(bioconversion, biotransformation)되어 기질 내 파라돌의 함량이 증가된다. In one aspect, the present invention relates to a method for increasing the content of paradol in a substrate by culturing Candida utilis on a substrate containing sucrose . Bioconversion (biotransformation) of the pseudo-paradol to the show increases the content of paradol in the substrate.

바람직한 구현예에서, 쇼가올은 6-쇼가올이고, 파라돌은 6-파라돌이다. 6-파라돌의 구조식은 하기 화학식 1과 같다.In a preferred embodiment, the showol is the 6-showol and the paradol is the 6-paradol. The structural formula of 6-para styrene is shown below.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

일 구현예에서, 상기 쇼가올이 함유된 기질은 생강 추출물이다. 바람직한 구현예에서, 상기 생강 추출물은 가열과 같은 전처리를 통해 쇼가올 함량을 증폭시킨 생강의 추출물이다. 즉, 본 발명은 생강 구성 성분 중 α, β-불포화케톤(6-쇼가올)의 환원(지방족 수산화)을 통한 6-파라돌의 대사체 생성에 관한 것이다.In one embodiment, the substrate containing the showol is a ginger extract. In a preferred embodiment, the ginger extract is an extract of ginger which has been amplified in its content by a pretreatment such as heating. That is, the present invention relates to the metabolism of 6-para-ardenes through reduction (aliphatic hydroxylation) of the alpha, beta -unsaturated ketone (6-showol) in the ginger constituents.

생물전환에 이용되는 칸디다 유틸리스는 칸디다 유틸리스 KFRI00911(Candida utilis 00911) 또는 칸디다 유틸리스 KCCM11245(Candida utilis 11245)인 것이 바람직하다.The candida utility used for the biotransformation is Candida utilis KFRI00911 ( Candida utilis 00911) or Candida utiliens KCCM11245 ( Candida utilis 11245).

6-쇼가올은 구조상으로 볼 때 미생물에 의해 대사 가능한 부위가 세 곳(바닐릴 고리 모이어티의 산화, 측쇄 말단의 ω-산화, α, β 불포화 케톤의 환원)이 존재하며, 미생물에 노출 시 이중 결합의 환원이 카르보닐 환원에 우선하는 것으로 알려져 있다.There are three sites that can be metabolized by microorganisms (oxidation of the vanillic ring moiety, ω-oxidation of the side chain terminal, reduction of α, β-unsaturated ketone) Reduction of the double bond at the time is known to give priority to carbonyl reduction.

또한, A. niger에 의한 6-쇼가올의 생물전환 대사체는 33 시간 배양 시 1-(4'-히드록시-3'-메톡시페닐)-데칸-10-올-3-온과 1-(4'-히드록시-3'-메톡시페닐)-데칸-3, 10-디올이 생성되며, 7 일간 배양 시 측쇄의 β-산화를 통해 더 분해되어 6-(4'-히드록시-3'-메톡시페닐)-4-히드록시-헥산산과 호모-바닐린산이 생성되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 생강을 이용한 실험에서 6-쇼가올의 6-파라돌로의 생물전환은 측쇄의 환원(이중 결합 수소 첨가) 반응에 적합한 미생물 선정 및 미생물에 의한 적정 반응 시간을 설정하는 것이 중요하다.In addition, the bioconversion metabolism of 6- sucrose by A. niger resulted in the formation of 1 (4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl) -decan-10- - (4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl) -decane-3,10-diol, which is further degraded through? -Oxidation of the side chain during 7 days of culture to give 6- (4'- 3'-methoxyphenyl) -4-hydroxy-hexanoic acid and homo-vanillic acid are known to be produced. Therefore, in the experiment using ginger, it is important to select the microorganism suitable for the reduction (double bond hydrogenation) reaction of the side chain and set the appropriate reaction time by the microorganism.

이에 본 발명에서는 총 15 종의 미생물을 대상으로 균주별 종 배양액에 생강 추출액을 기질로 첨가하여 배양 후 축적되는 6-파라돌 함량을 분석하여 생물전환에 최적인 미생물을 선발하고자 하였다.In the present invention, a total of 15 microorganisms were analyzed for the accumulation of 6-paradol after culturing the ginger extract as a substrate in the seed culture of each strain to select the most suitable microorganisms for bioconversion.

본 발명의 방법에 따라 증폭된 파라돌, 특히 6-파라돌은 기존의 알려져 있거나 혹은 앞으로 알려질 파라돌의 다양한 용도에 적용될 수 있다. 예를 들어, 뇌 인지 기능 개선을 위한 약학 조성물이나 건강기능식품 등으로 이용될 수 있다.The para-stones amplified in accordance with the method of the present invention, especially the 6-para-amides, can be applied to a variety of uses of existing known or promising paradoles. For example, it can be used as a pharmaceutical composition for improving brain cognitive function, a health functional food, and the like.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are for the purpose of illustrating the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

[실시예][Example]

시료 및 시약Samples and reagents

실시예에서 사용된 생강은 2012년 충청남도 서산 지역에서 재배, 생산된 생강을 서울 가락동 농수산물시장에서 구입한 후, 표면의 흙을 수세, 완전히 제거하여 사용하였다.The ginger used in the examples was purchased from the Garak-dong agricultural and marine products market in Seoul, South Gyeongsang Province in 2012, and the surface soil was washed and completely used.

추출 및 분석에 사용된 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며, 표준 물질인 쇼가올과 파라돌은 모두 미국 Chromadex사 제품을 사용하였다.All of the reagents used for extraction and analysis were limited to reagents, and the standard materials, showol and paradol, were all available from Chromadex, USA.

미생물의 선별Selection of microorganisms

이용 균주 및 배양Usage strain and culture

균주는 식품의약품안전처 식품원재료 데이터베이스에 등록된 식용 가능한 균주를 대상으로 총 15 종의 미생물을 선택하여 실험에 사용하였다. 효모는 사카로마이세스 세레비지애 1 종(Saccharomyces cerevisiae KCCM50757)과 칸디다 유틸리스 2 종(Candida utilis KFRI00911, Candida utilis KCCM11245), 곰팡이로는 아스퍼질러스 니거 1 종(Aspergillus niger KCCM60332)과 아스퍼질러스 오리제 1 종(Aspergillus oryzae KCCM12698), 세균은 바실러스 서브틸리스 1 종(Bacillus subtilis KFRI00294)과 바실러스 코아굴란스 1 종(Bacillus coagulans KCCM11715), 유산균은 락토바실러스속 6 종(Lactobacillus plantarum KCCM11322, Lactobacillus casei KCCM12452, Lactobacillus acidophilus KCCM32820, Lactobacillus brevis KCCM35464, Lactobacillus pentosus KCCM40997, Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM41572), 스트렙토코쿠스 서모필루스 1 종(Streptococcus thermophilus KCCM35496) 및 바이셀라 코리엔시스 1 종(Weissella koreensis KCCM41517)이었다. 실험에 사용된 총 15 종의 미생물을 하기 표 1에 정리하였다.A total of 15 microorganisms were selected from the edible strains registered in the food raw material database of the Food and Drug Administration. The yeast is Saccharomyces cerevisiae 1 ( Saccharomyces cerevisiae KCCM50757) and two Candida utilis ( Candida utilis KFRI00911, Candida utilis KCCM11245), Aspergillus niger 1 ( Aspergillus niger KCCM60332) and Aspergillus species 1 ( Aspergillus oryzae KCCM12698), the bacteria Bacillus subtilis 1 kinds (Bacillus subtilis KFRI00294) and Bacillus core oyster lance 1 kinds (Bacillus coagulans KCCM11715), the lactic acid bacteria belong to the genus Lactobacillus ( Lactobacillus plantarum KCCM 11322, Lactobacillus casei KCCM 12452, Lactobacillus acidophilus KCCM32820, Lactobacillus brevis KCCM35464, Lactobacillus pentosus KCCM40997, Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM41572), Streptococcus species 1 ( Streptococcus thermophilus KCCM35496) and one species of Bissella koreensis ( Weissella koreensis KCCM41517). The 15 species of microorganisms used in the experiment are summarized in Table 1 below.

미생물 유형Microorganism type 균주Strain
효모 (3)

Yeast (3)
Saccharomyces cerevisiae KCCM50757 Saccharomyces cerevisiae KCCM50757 Candida utilis KFRI00911 Candida utilis KFRI00911 Candida utilis KCCM11245 Candida utilis KCCM11245 곰팡이 (2)
Mold (2)
Aspergillus niger KCCM60332 Aspergillus niger KCCM60332 Aspergillus oryzae KCCM12698 Aspergillus oryzae KCCM12698 세균 (2)
Bacteria (2)
Bacillus subtilis KFRI00294 Bacillus subtilis KFRI00294 Bacillus coagulans KCCM11715 Bacillus coagulans KCCM11715


유산균 (8)





Lactic acid bacteria (8)


Lactobacillus plantarum KCCM11322 Lactobacillus plantarum KCCM11322 Lactobacillus casei KCCM12452 Lactobacillus casei KCCM12452 Lactobacillus acidophilus KCCM32820 Lactobacillus acidophilus KCCM32820 Lactobacillus brevis KCCM35464 Lactobacillus brevis KCCM35464 Lactobacillus pentosus KCCM40997 Lactobacillus pentosus KCCM40997 Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM41572 Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM41572 Streptococcus thermophilus KCCM35496 Streptococcus thermophilus KCCM35496 Weissella koreensis KCCM41517 Weissella koreensis KCCM41517

생육 배지로 효모는 YMA(0.3 % 효모 추출물, 0.3 % 몰트 추출물, 0.5 % 펩톤, 1 % 덱스트로오스, 2 % 아가) 배지에 도말하여 26℃에서 2 일, 곰팡이는 PDA(0.4 % 감자 전분, 2 % 덱스트로오스, 2 % 아가) 배지에서 26℃ 내지 30℃에서 3 내지 5 일, 세균은 TSA(카제인 판크레아틴 소화물 1.7 %, 소이빈 파파인 소화물 0.3 %, 덱스트로오스 0.25 %, 소듐 클로라이드 0.5 %, 디포타슘 포스페이트 0.25 %, 1.5% 아가) 배지에서 30℃, 37℃에서 1 일, 유산균은 MRS(프로테오스 펩톤 No. 3 1 %, 비프 추출물 1 %, 효모 추출물 0.5 %, 덱스트로오스 2 %, 아가 1.5 %) 배지에서 37℃, 2 일간 평판 배양하였다. 모든 균주는 실험에 사용하기 전 3 회 이상 계대 배양하여 활성화시킨 후 사용하였다.Yeast cells were plated on YMA (0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1% dextrose, 2% agar) medium at 26 ℃ for 2 days and molds were treated with PDA (0.4% Bacteria were treated with TSA (1.7% casein pancreatin digest, 1.7% soya bean paraffin, 0.3% dextrose, 0.25% dextrose, 0.5% sodium chloride 0.5%) at 26 ° C to 30 ° C in 2% dextrose, 2% (1% Protease Peptone No. 3, 1% Beef Extract, 0.5% Yeast Extract, 0.5% Dextrose Phosphate, 0.25% Dipotassium Phosphate and 1.5% 2%, agar 1.5%) medium at 37 ° C for 2 days. All of the strains were used after being subcultured for 3 or more times before use in the experiment.

효모 3 종은 YM 배지 5 내지 10 mL에 콜로니 1 개를 접종한 다음 100 rpm 진탕배양기(shaking incubator JSSI-100T; 한국 JSR사 제조)에서 26℃에서 24 시간 진탕배양하여 종 배양액을 제조하였다. 종 배양액 mL 당 10⁷ 개에 해당하도록 희석하여 테스트 튜브에 넣고 26℃에서 24 시간 동안 100 rpm의 속도로 진탕배양하여 본 배양액을 얻었다.Three yeasts were inoculated with one colony in 5 to 10 mL of YM medium and then shake cultured at 26 DEG C for 24 hours in a shaking incubator JSSI-100T (manufactured by JSR Corporation, Japan) at 100 rpm to prepare a seed culture. The culture was diluted to 10 ⁷ per mL of the seed culture, placed in a test tube, and shaken at 26 rpm for 24 hours at a speed of 100 rpm to obtain the culture.

곰팡이 2 종은 0.85 % 멸균 생리 식염수을 이용하여 플레이트 표면에서 포자(spore)를 회수하고, 거즈를 이용하여 여과한 현탁액(5×10⁷ spores/ml) 10 mL를 40 mL PDB 배지가 들어 있는 250 mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 넣고 30℃, 100 rpm 진탕배양기에서 24 시간 전배양(preincubation)시켜 종 배양액을 제조하였다. 종 배양액 10 mL을 피펫으로 취해 PDB 배지 90 mL가 들어 있는 250 mL 삼각 플라스크에 재접종하여 동일 조건으로 24 시간 더 진탕배양시켜 본 배양액을 제조하였다.Spores were recovered from the plate surface using 0.85% sterilized physiological saline and 10 mL of the suspension (5 x 10 ⁷ spores / ml) filtered with gauze was added to 250 mL of 40 mL PDB medium The cells were placed in Erlenmeyer flask and preincubated for 24 hours in a shaking incubator at 30 ° C and 100 rpm to prepare seed culture. 10 mL of the seed culture was pipetted, re-inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 90 mL of PDB medium, and shaken for 24 hours under the same conditions to prepare the culture.

세균 2 종은 10 mL TSB 배지에 콜로니 1 개를 접종하고 37℃에서 100 rpm으로 24 시간 진탕배양한 뒤, 10 mL를 피펫으로 취해 TSB 배지 90 mL에 재접종하여 24 시간 더 진탕배양시켜 본 배양액을 얻었다.Two bacteria were inoculated into 10 mL of TSB medium and incubated at 37 ° C with shaking at 100 rpm for 24 hours. 10 mL of the bacteria was pipetted, re-inoculated into 90 mL of TSB medium, shaken for 24 hours, ≪ / RTI >

유산균 8 종은 MRS 배지 10 mL에 콜로니 1 개를 접종한 뒤 100 rpm 진탕배양기에서 37℃에서 24 시간 진탕배양하여 종 배양액을 제조하였다. 종 배양액 mL 당 10⁶ 개 해당하도록 희석하여 테스트 튜브에 넣고 37℃에서 24 시간 100 rpm 속도로 진탕배양하여 본 배양액을 얻었다. Eight species of lactic acid bacteria were inoculated into 10 mL of MRS medium and then cultured in a shaking incubator at 100 rpm for 24 hours at 37 ° C to prepare seed culture. The cells were diluted to 10 ⁶ per mL of the seed culture, placed in a test tube, and cultured at 37 ° C for 24 hours at 100 rpm with shaking to obtain the culture.

쇼가올이The show is coming 함유된 기질 제조 Manufacture of contained substrate

신선 생강을 120℃에서 4 시간 가열처리 후 45℃에서 열풍 건조하고 분쇄한 생강 분말 100 g에 중량 대비 20 배(w:v)의 70 % 에탄올(EtOH)을 첨가하였다. 초음파 추출기를 이용하여 20 kHz에서 20 분간 추출한 것을 Whatman No.1로 여과한 뒤 일정량으로 정용하였다. 이들 여과액을 회전식 진공 증발기(rotary vaccum evaporator; 일본 eyela사 제조)를 사용하여 회전 속도를 60 rpm, 37℃에서 용매를 증발, 제거시켜 쇼가올 함량이 140 ppm인 기질용 생강 추출액(7.5 brix)을 제조하였다. The fresh ginger was heat-treated at 120 ° C for 4 hours, then hot-air dried at 45 ° C and 70% ethanol (EtOH) of 20 times (w: v) by weight was added to 100 g of the ground ginger powder. The mixture was extracted with Whatman No. 1, which was extracted at 20 kHz for 20 minutes by using an ultrasonic wave extractor. The filtrate was evaporated using a rotary vacuum evaporator (manufactured by eyela, Japan) at a rotation speed of 60 rpm at 37 ° C to remove ginger extract (7.5 brix) having a showol content of 140 ppm ).

생물전환Biotransformation

곰팡이, 효모, 세균, 유산균 종류별로 각각의 본 배양액 8 mL씩을 삼각 플라스크에 취하여 넣고 앞서 배양 기질로 사용하고자 제조한 생강 추출액 2 mL(6-쇼가올 농도 : 1.40 mg)를 첨가하여 효모는 26℃ 100 rpm, 곰팡이는 30℃ 100 rpm, 세균은 37℃ 100rpm, 유산균은 37℃ 100rpm 속도로 진탕배양기에서 24 시간 진탕배양하여 생강 추출액 내 6-쇼가올로부터 유도되는 6-파라돌 생물전환 대사체를 생성시켜 생성량 및 전환율을 기준으로 미생물을 선발하였다.8 mL of each culture solution was added to the Erlenmeyer flask according to the type of yeast, yeast, bacteria, and lactobacillus, and 2 mL of the ginger extract (1.60 mg of 6-sucrose concentration) 6-pyruvate bioconversion metabolism in the ginger extract was carried out by shaking culture in a shaking incubator at a rate of 100 rpm, a mold at 30 rpm at 100 rpm, a bacterium at 37 캜 at 100 rpm, and a lactic acid bacterium at 37 캜, The microorganisms were selected based on the amount of production and the conversion rate.

총 15 종의 미생물을 대상으로 균주별 종 배양액에 생강 추출액을 기질로 첨가하여 각각 24 시간 배양 후 축적되는 6-파라돌 함량을 HPLC로 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.The total amount of 6-paradol accumulated after culturing for 24 hours was analyzed by HPLC. The results are shown in Table 2 below.

유산균의 경우 8 종의 균주 중 Lactobacillus plantarum KCCM11322와 Lactobacillus pentosus KCCM40997 2 종만이 배양 24 시간 후에 6-파라돌이 각각 19.9 μg/mL, 14.1 μg/mL 생성되었다. 나머지 6 종의 유산균에서는 6-쇼가올이 6-파라돌로 전환되지 않았다. Lactobacillus plantarum KCCM11322와 Lactobacillus pentosus KCCM40997의 경우도 24 시간 시간 배양 후 6-쇼가올 대비 6-파라돌의 비율이 각각 19 %, 13 % 정도로 6-파라돌 생성 유도 균주로서는 적합하지 않은 것으로 판단하였다.Among lactic acid bacteria, 8 strains of Lactobacillus Only two plantarum KCCM11322 and Lactobacillus pentosus KCCM40997 were produced at 19.9 μg / mL and 14.1 μg / mL, respectively, after 24 hours of culture. In the other six lactic acid bacteria, 6-sucrose was not converted to 6- paradol. Lactobacillus For KCCM11322 plantarum and Lactobacillus pentosus KCCM40997 even after 24 hours incubation time was determined to 6 show, it is not suitable as the 6-paradol generate strain induced around 19% compared to the proportion of all-6-p-stone respectively, 13%.

한편, Lactobacillus brevis KCCM35464와 Streptococcus thermophilus KCCM35496 균주의 경우 배양 24 시간 후 6-파라돌이 생성되지 않았음에도 6-쇼가올 함량은 초기 첨가 농도에 비해 크게 감소하는 것으로 나타났다. 캡사이신을 내부 표준(internal standard)으로 이용한 결과에 따르면 각 균주별 EA(에틸 아세테이트) 추출 과정에 따른 생강 유효 성분의 변화는 크지 않았으므로 Lactobacillus brevis KCCM35464와 Streptococcus thermophilus KCCM35496 두 균주에서 6-쇼가올의 감소는 균주 내에 6-쇼가올이 일정 부분 존재하고 있거나 다른 종류의 대사체로 전환되었기 때문으로 생각된다.Meanwhile, Lactobacillus brevis KCCM35464 and Streptococcus In the case of the thermophilus strain KCCM35496, the content of 6-sucrose was significantly decreased compared to the initial concentration even though 6-para-styrene was not produced after 24 hours of culture. According to the results of using capsaicin as an internal standard, the change of active ingredient of ginger according to EA (ethyl acetate) extraction process of each strain was not so large, so that Lactobacillus brevis KCCM35464 and Streptococcus The reduction of 6-sucrose in two strains of thermophilus KCCM35496 may be due to the presence of 6-sucrose in the strain or conversion to other metabolites.

효모의 경우 테스트한 3 종의 균주 중 Saccharomyces cerevisiae KCCM50757을 제외한 2 종의 균주에서 6-쇼가올 함량은 감소하고 6-파라돌 함량은 크게 증가하는 경향을 보였다. Candida utilis KCCM11245와 Candida utilis KFRI00911 균주는 24 시간 배양 후 각각 71.5, 85.0 μg/mL의 6-파라돌을 생성하였다. 특히, Candida utilis KFRI00911의 경우 배양 24 시간 시점에서 6-쇼가올 대비 6-파라돌 비율이 약 99 %로서 6-쇼가올 환원능이 매우 우수한 균주로 판단되었다.Among the three strains tested for yeast, Saccharomyces The content of 6-showol decreased and the content of 6-paraol increased significantly in two strains except cerevisiae KCCM50757. Candida utilis KCCM11245 and Candida The utilis KFRI00911 strain, after culturing for 24 hours, produced 71.5 and 85.0 μg / mL of 6- paradol, respectively. In particular, Candida utilis KFRI00911 was found to have a very high 6-sucrose reducing ability at a 24 hour incubation time with a 6-para-tocopherol ratio of about 99%.

세균은 2 종 중 Bacillus subtilis KFRI00294만이 24 시간 배양 후에 25.1 μg/mL의 6-파라돌을 생성하였다.Among the bacteria, Bacillus Only subtilis KFRI00294 produced 25.1 μg / mL of the 6-para after 24 hours of incubation.

곰팡이의 경우 Aspergillus oryzae KCCM12698과 Aspergillus niger KCCM60332 2 종의 균주 중 Aspergillus niger KCCM60332에서만 6-파라돌 전환이 확인되었다. Aspergillus niger KCCM60332는 24 시간 배양 후 19.2 μg/mL의 6-파라돌이 생성되었다.In case of mold Aspergillus oryzae KCCM12698 and Aspergillus niger KCCM60332 Among two strains, Aspergillus Only niger KCCM60332 was found to have 6-para-tolconversion. Aspergillus niger KCCM60332 produced 19.2 μg / mL of 6-paradox after 24 hours of incubation.

이상의 결과를 토대로 식품에 이용 가능한 미생물 15 종 중 Candida utilis KFRI00911을 6-파라돌 생물전환 유도 우수 균주로 최종 선발하였다.Based on the above results, among the 15 microorganisms available for food, Candida utilis KFRI00911 was finally selected as an excellent strain for inducing 6-paravaline biotransformation.

최적 생물전환 조건 설정Optimal Biotransformation Condition Setting

선발된 효모 칸디다 유틸리스 KFRI00911를 이용한 생강 유래 생물전환 대사체 6-파라돌의 최적 생성 조건을 설정하고자 반응표면분석법(Response surface methodology, RSM)을 적용하였다. RSM은 효율적으로 최적 조건을 산출하기 위하여 설계변수(design variables)로부터 실험적으로 얻어낸 반응변수에서 근사적 반응표면 모델을 만들어 내는 분석법이다. 기질 농도(μg/mL, X₁), 반응 시간(min, X₂), 균 농도(CFU/g, X₃)를 독립변수로 설정하여 이를 각각 5 단계(-1.68, -1, 0, 1, 1.68)로 부호화하여 중심합성계획(central composite design, CCD)에 따라 실험을 진행하였다. 실험군의 수는 3 개의 요인변수가 5 수준을 갖도록 중심합성계획에 의해 17 구간으로 설정하였고 종속변수는 6-쇼가올(Y₁)과 6-파라돌(Y₂)로 설정하였다.Response surface methodology (RSM) was applied to determine the optimum conditions for the production of ginger bioconversion metabolite 6-para-arthon using the selected yeast Candida virulent KFRI00911. RSM is an analytical method that produces an approximate reaction surface model from response variables experimentally obtained from design variables in order to efficiently calculate optimum conditions. The concentration of the substrate (μg / mL, X ₁ ), the reaction time (min, X ₂ ) and the bacterial concentration (CFU / g, X ₃ ) , 1.68), and the experiment was performed according to the central composite design (CCD). The number of experimental groups was set to 17 intervals by the central synthesis plan so that the three factor variables had 5 levels and the dependent variables were set as 6-show value (Y ₁ ) and 6-parameter (Y ₂ ).

KFRI00911을 YM 배지 20 mL에 콜로니 2 개를 접종한 다음 100 rpm 진탕배양기에서 26℃에서 24 시간 진탕배양하여 종 배양액을 제조하였다. 이를 각각 생리식염수를 이용하여 농도별로 희석하여 효모 수를 측정하고, 새로운 YM 배지에 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸ CFU/g이 되게 본 배양액을 만들어 24 시간 배양하였다. 이를 테스트 튜브에 4 mL씩 분주하고 생강 추출액을 각각 72.8, 100, 140, 180, 207.2 μg/mL 농도로 첨가하여 배양시간 60, 400, 900, 1400, 1740 분에 각각 시료를 채취하였다.KFRI00911 was inoculated into 20 mL of YM medium and 2 colonies were inoculated, followed by shaking culture at 26 DEG C for 24 hours in a shaking incubator at 100 rpm to prepare a seed culture. The culture was diluted with physiological saline, and the number of yeast cells was measured. The culture broth was cultured for 24 hours in a fresh YM medium at 10 ⁴ , 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 ⁷ , and 10 ⁸ CFU / g. The extracts were added at a concentration of 72.8, 100, 140, 180, and 207.2 μg / mL, respectively, and the samples were collected at the incubation times of 60, 400, 900, 1400 and 1740 min, respectively.

통계 분석은 기질 농도, 반응 시간, 균 농도에 따른 6-쇼가올, 6-파라돌의 특성은 MINITAB 프로그램을 사용하여 반응 표면 회귀분석으로 통계 처리하였다. 실험 설계와 도출된 결과의 그래픽 제작을 위하여 MINITAB^® Release 14(Minitab사 제조)와 Maple 7.00(Waterloo Maple사 제조) 소프트웨어를 각각 이용하였다.Statistical analysis was performed using 6-spectral and 6-para-stol based on the substrate concentration, reaction time, and bacterial concentration and response surface regression analysis using the MINITAB program. MINITAB ^® Release 14 (manufactured by Minitab) and Maple 7.00 (manufactured by Waterloo Maple) software were used for the experimental design and the graphic production of the obtained results.

생물전환 Biotransformation 대사체Metabolism 분석 analysis

전체 배양액 10 mL에 동일한 양의 에틸 아세테이트를 넣고 강렬히 vortexing하고 8,000 rpm에서 15 분 원심분리시킨 후 상등액은 취하고, 침전부에는 다시 10 mL 에틸 아세테이트를 넣고 동일 조작으로 재추출하여 모은 상등액을 원심농축기(ScanSpeed 32; 미국 Alex Red Ltd. 제조)를 이용하여 감압, 농축하였다.The same amount of ethyl acetate was added to 10 mL of the whole culture, vortexed vigorously, and centrifuged at 8,000 rpm for 15 minutes. Then, the supernatant was taken, and 10 mL of ethyl acetate was again added to the precipitate. The supernatant was collected by centrifugation (Trade name: ScanSpeed 32, manufactured by Alex Red Ltd., USA).

상기 추출물에 3 mL 메탄올을 첨가, 완전히 용해시킨 다음 마이크로필터 키트(0.45 μm Whatman)를 이용, 여과하여 바이알에 담아 검액으로 사용하였다. HPLC 분석은 검액 20 μL를 주입하여 실시하였다. 표준 물질인 6-쇼가올은 각각 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL 농도, 6-파라돌은 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도로 표준 곡선을 작성하였으며 상관계수(r²)는 모두 0.99 이상의 수준이었다.3 mL of methanol was added to the extract to completely dissolve it, and then the microfilter kit (0.45 μm Whatman) was used for filtration and used as a sample solution. HPLC analysis was performed by injecting 20 μL of the sample solution. The standard 6-sucrose concentration was 1 μg / mL, 5 μg / mL, 10 μg / mL and 100 μg / mL, respectively. , And 100 μg / mL, respectively. The correlation coefficients (r ² ) were all above 0.99.

미생물에 의한 α, β-불포화 케톤의 환원과 ω-산화는 배양 시간과 밀접한 연관이 있다. 따라서, 생강 내 6-쇼가올 성분의 6-파라돌 전환을 위해서는 미생물 종류별 최적 균 농도, 기질 농도, 배양 시간 설정이 중요한 요소로 생각되어 6-파라돌 생성능이 우수한 최종 선발 균주(Candida utilis KFRI00911)을 대상으로 기질 농도(μg/mL, X₁)와 반응 시간(분, X₂), 균 농도(CFU/g)를 변수로 하여 상기 언급한 반응표면 분석법을 통해 6-파라돌 전환을 위한 적정 반응조건 설정 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.Reduction and omega-oxidation of α, β-unsaturated ketones by microorganisms are closely related to the incubation time. Therefore, for the 6-para-stone conversion of 6-para-gal components in ginger, the optimum concentration, substrate concentration, and incubation time of each microorganism were considered to be important factors. Thus, the final selection strain ( Candida utilis KFRI00911 ) Was used for the 6-para-stonoconversion via the above-mentioned reaction surface method using the substrate concentration (μg / mL, X ₁ ), reaction time (minute, X ₂ ) and bacterial concentration (CFU / g) The results of the experiment were shown in Table 4 below.

초기 균농도 10⁶ CFU/g, 기질 농도 140 μg/mL 배양액의 6-파라돌 생성량을 살펴보면 배양 시간 60 분에서는 생성되지 않았으나, 900 분에서는 68.8 μg/mL, 1740 분일 때는 92.8 μg/mL이 생성되어, 배양 시간이 길어질수록 6-파라돌 생성량이 증가하였다. 반면 기질 농도(140 μg/mL)와 배양 시간(900 분)을 고정하고 균 농도를 달리하여 배양할 경우 6-파라돌 생성량은 10⁴ CFU/g일 때 29.8 μg/mL, 10⁶ CFU/g일 때 92.8 μg/mL으로 균 농도가 높을수록 생성량이 높았다. 초기 균 농도를 10⁶ CFU/g으로 동일하게 적용하고 기질 농도를 72.8, 140, 207.2 μg/mL로 달리하여 900 분 배양할 경우 생성 6-파라돌 함량은 각각 54.9, 68.8, 16.9 μg/mL로 나타났다.When the initial bacterial concentration was 10 ⁶ CFU / g and the substrate concentration was 140 μg / mL, the production of 6-para-arginine was not produced at the 60 min incubation time but was 68.8 μg / mL at 900 min and 92.8 μg / mL at 1740 min The longer the incubation time, the greater the amount of 6-para-arginine produced. While the substrate concentration (140 μg / mL) and incubated for a fixed time (900 minutes), and if the culture with different bacteria concentrations 6- paradol amount is ^{10 4 CFU / g 29.8 μg /} mL, 10 6 CFU / g when And 92.8 μg / mL, respectively. When the initial bacterial concentration was 10 ⁶ CFU / g and the substrate concentration was changed to 72.8, 140, and 207.2 μg / mL for 900 min, the resulting 6-paradol contents were 54.9, 68.8, and 16.9 μg / mL, respectively appear.

또한, 하기 표 5는 Y₁(6-쇼가올 함량)와 Y₂(6-파라돌 함량)에 대한 반응표면 모델식(response surface model equation)을 나타낸 것으로서, 결정계수(R²)가 각각 0.996, 0.998으로 유의성은 1 % 이내에서 인정되었다.Table 5 below shows the response surface model equation for Y ₁ (6-showol content) and Y ₂ (6-paradol content), where the coefficient of determination (R ² ) is 0.996, and 0.998, respectively. Significance was recognized within 1%.

기질 농도(μg/mL, X₁), 반응 시간(min, X₂), 균 농도(CFU/g)에 따른 6-파라돌 생성량을 도 1의 그래프로 나타내었다. 기질 농도(X₁)와 반응 시간(X₂)의 상관 관계를 살펴보면 기질 농도가 높고 반응 시간이 길어질수록 6-파라돌 함량은 증가하나 기질 농도 207 μg/mL 이상에서는 감소하는 경향을 보였다. 기질 농도(X₁)와 균 농도(X₃)의 상관 관계에서는 동일 기질 농도에서 균 농도가 증가할수록 6-파라돌이 증가하였다. 반응 시간(X₂)과 균 농도(X₃)의 상관 관계를 살펴보면 균 농도가 증가하고 반응 시간이 길어질수록 6-파라돌 생성량은 증가되었다.The graph of FIG. 1 shows the amount of 6-para-arginine produced by substrate concentration (μg / mL, X ₁ ), reaction time (min, X ₂ ) and bacterial concentration (CFU / g). The correlation between the substrate concentration (X ₁ ) and the reaction time (X ₂ ) shows that the higher the substrate concentration and the longer the reaction time, the greater the 6-paradol content but the greater the substrate concentration than 207 μg / mL. In the correlation between substrate concentration (X ₁ ) and bacterial concentration (X ₃ ), 6 - paradol increased with increasing bacterial concentration at the same substrate concentration. The correlation between the reaction time (X ₂ ) and the bacterial concentration (X ₃ ) was increased as the bacterial concentration increased and the reaction time increased.

상기 표의 결과 값을 기준으로 중심합성법을 실시하여 도 2에 나타내었다. 6-파라돌로의 생물전환을 위한 반응변수 최적 값의 경우 기질 농도(X₁)는 204 μg/mL, 반응시간(X₂) 1653 분, 균농도(X₃) 10^7.4 CFU/g 일 때 종속변수 Y₂(6-파라돌 μg/mL)의 값은 124.77 μg/mL을 나타내었으며, 만족도는 0.99이었다.FIG. 2 shows the result of the central synthesis based on the results of the above table. 6-p-stone for the response variables optimized values for the bioconversion of a substrate concentration (X ₁₎ is 204 μg / mL, and the reaction time (X ₂₎ 1653 minutes, when the bacteria concentration ^{_{(X 3) 10 7.4 CFU /}} g The dependent variable Y ₂ (6-paradol μg / mL) was 124.77 μg / mL, and the satisfaction was 0.99.

Claims (5)

쇼가올(shogaol)이 함유된 기질에 칸디다 유틸리스(Candida utilis)를 배양하여 기질 내 파라돌(paradol) 함량을 증가시키는 방법.A method of increasing the paradol content in a substrate by culturing Candida utilis on a substrate containing shogaol. 제 1 항에 있어서,
쇼가올이 파라돌로 생물전환(bioconversion)되어 기질 내 파라돌의 함량이 증가되는 것을 특징으로 하는, 기질 내 파라돌 함량을 증가시키는 방법.The method according to claim 1,
A method for increasing the paradol content in a substrate, characterized in that the show is bioconverted to para-stones to increase the content of paradol in the substrate. 제 2 항에 있어서,
쇼가올이 6-쇼가올이고, 파라돌이 6-파라돌인 것을 특징으로 하는, 기질 내 파라돌 함량을 증가시키는 방법.3. The method of claim 2,
A method for increasing the paradol content in a substrate, characterized in that the showol is 6-showol and the paradol is 6-paradol. 제 1 항에 있어서,
칸디다 유틸리스가 칸디다 유틸리스 KFRI00911(Candida utilis 00911) 또는 칸디다 유틸리스 KCCM11245(Candida utilis 11245)인 것을 특징으로 하는, 기질 내 파라돌 함량을 증가시키는 방법.The method according to claim 1,
Candida Utilizes Candida Utilis KFRI00911 ( Candida utilis 00911) or Candida Utilis KCCM11245 ( Candida utilis 11245). < / RTI > 삭제delete

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