KR101582172B1 - Method for identifying of Cordyceps militaris - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PCR 방법을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법, 상기 방법에 사용되는 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 밀리타리스 동충하초 동정용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면, 외관상으로 용이하게 구별되지 않는 밀리타리스 동충하초를 정확하고 신속하게 동정할 수 있으므로, 밀리타리스 동충하초를 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a method for identifying a mallitarian cordyceps using a PCR method, a primer used in the method, and a kit for identification of a mallitarian cordyer including the primer. By using the method of the present invention, it is possible to accurately and rapidly identify Millitaris caterpillar fungus, which is not easily distinguished from the outside, so that it can be widely used in the development of various products including Millitaris caterpillar fungus.
Description
본 발명은 밀리타리스 동충하초의 동정방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 PCR 방법을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법, 상기 방법에 사용되는 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 밀리타리스 동충하초 동정용 키트에 관한 것이다.
More particularly, the present invention relates to a method for identifying a mullitarian caterpillar fungus using a PCR method, a method for identifying a mullitary caterpillar fungus, a method for identifying a mullitary caterpillar fungus, And to an identification kit.
식품의약안정청 식품원재료 데이터 베이스에 따르면, 동충하초는 겨울기간 동안 곤충의 체내에 서식하면서 양분을 흡수하여 숙주를 파괴시킨 후, 여름이 되면 곤충의 몸밖으로 식물체가 자라나는 모습에서 그 명칭이 유래되었다. 즉, 동충하초균의 포자 또는 균사가 곤충 또는 균핵에 침입하여 기주 안에 내생균핵을 만든 다음, 밖으로 자실체를 형성하는 것이 바로 동충하초버섯이다.According to the Food and Drug Administration's Food Ingredient Database, the name comes from the appearance of plants growing outside the body of insects after summer, when they absorbed nutrients and destroyed the host during the winter period. In other words, the spore or mycelium of Cordyceps mushroom bacterium invades insects or sclerotia to make endogenous sclerotia in the host, and then fruiting bodies are formed.
식물 분류체계상 동충하초는 자낭균강(Ascomycota), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipitaceae)에 속하며 코디셉스(Cordyceps), 포도넥트리아(Podonectria), 토루비엘라(Torrubiella)의 세가지 속이 존재하고, 그 중 코디셉스 속이 대표적이다(Kobayasi Y., Trans Mycol. Soc. Japan, 23. pp329-362, 1982).According to the plant classification system, there are three genus of Cordyceps, Ascomycota, Clavicipitales, Clavicipitaceae, Cordyceps, Podonectria and Torrubiella, Among them, the Codiceceps are representative (Kobayasi Y., Trans Mycol. Soc. Japan, 23. pp. 329-362, 1982).
코디셉스 속에 속하는 밀리타리스 동충하초는 한국, 일본, 미국 등에 분포하며 번데기버섯 또는 번데기동충하초라고도 한다. 여름에서 가을에 걸쳐 잡목림의 땅속에 있는 곤충체에서 발생한다. 나비목 곤충의 번데기에 기생하며 자실체는 번데기 시체의 머리부분에서 발생하고 곤봉 모양이고, 자루는 둥근 기둥꼴이고 약간 구부러지며 등황색이나, 머리부분은 방추형으로 선명한 주황색이다. 피자기는 머리부분의 표피 속에 파묻혀 있고 그 속의 자낭 안에 가는 실모양의 포자가 있고, 성숙하면 다시 갈라져서 2차 포자를 형성한다.The mildew caterpillar fungus belonging to the genus Corydopsis is distributed in Korea, Japan, and the United States, and is also called the pupa mushroom or the pupae Cordyceps. It occurs in insects in the ground of the mulberry forest from summer to autumn. Liliaceae are parasitic on the insect pupa. Fruiting body occurs in the head part of the pupa and is in the shape of a club. The sack is rounded, slightly curved and light yellow, and the head part is spindle-shaped and bright orange. The pizza group is buried in the epidermis of the head part, and there is thread-like spore in the inner part of the inner part of the head. When it matures, it divides again and forms a secondary spore.
상기 밀리타리스 동충하초는 액체배양시 만니톨을 생산하며, 항세균, 항진균, 면역증강 및 항암효과가 있다고 알려진 고가의 코디세핀(Cordycepin)을 포함한 인체에 유익한 다수의 물질을 다른 종류의 동충하초에 비해 다량 함유할 뿐만 아니라, 항염증, 항균, 항종양, 면역증강 등 외부물질에 대한 보호작용, 노화방지, 질병 억제 및 완화 작용 등 다양한 효과를 갖는 것으로 알려져 있기 때문에, 상기 밀리타리스 동충하초에 관한 관심이 고조되고, 최근에는 농가에서 고수익 농산물로서 각광을 받으며 대량 재배가 이루어지고 있으며, 여러 가공품으로 제조되어 건강기능성 식품으로 높이 평가되고 있다.The Milliliter Cordyceps sinensis produces mannitol when cultured in liquid form, and a large number of substances beneficial to the human body including expensive Cordycepin, which is known to have anti-bacterial, antifungal, immunosuppressive and anti-cancer effects, But also has various effects such as anti-inflammation, antibacterial, antitumor, immune enhancement, and protection against external substances, anti-aging, disease suppression and mitigation. Therefore, And recently, it has been cultivated in large quantities as a high yield agricultural product in the farmhouse, and it is manufactured as various processed products and is highly evaluated as a health functional food.
그러나, 대부분의 동충하초는 번식기관인 자실체의 형태, 크기 및 색깔이나 기주 곤충의 종류에 따라 식별되나, 그 크기가 매우 작고 분류 체계가 확립되지 않아 고도의 전문 지식을 갖추지 않으면 식별이 용이하지 않다. 또한, 자실체에 비해 약 4배 정도의 영양소를 함유하고 있다고 알려진 영양체인 균사체의 경우 형태적 특성이 없어 식별이 거의 불가능하여 원균 관리에 어려움이 많다.
However, most of the caterpillar fungus is identified by the type, size and color of the breeding organism, or the host insect, but its size is very small and the classification system is not established and it is not easy to identify unless highly specialized knowledge is provided. In addition, the mycelium of nutrient chains known to contain about four times as much nutrients as the fruiting body has no morphological characteristics, making it difficult to identify the fruiting body.
이에, 본 발명자들은 상기 밀리타리스 동충하초를 보다 용이하게 동정할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 밀리타리스 동충하초의 게놈 DNA의 특정부분을 PCR 방법으로 증폭시켜서 수득한 증폭산물이 각 밀리타리스 동충하초별로 구분되므로, 상기 PCR 방법을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
The inventors of the present invention have made extensive efforts to develop a method for identifying the above-mentioned mullitarian caterpillar fungus. As a result, it has been found that the amplified product obtained by amplifying a specific part of genomic DNA of mullitary cordyceps by PCR, The present invention has been completed upon confirming that it is possible to identify M. licheniformis using the above-mentioned PCR method.
본 발명의 하나의 목적은 PCR 방법을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for identifying M. licheniformis using a PCR method.
본 발명의 다른 목적은 상기 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법에 사용되는 프라이머를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a primer for use in a method for identifying the above-mentioned Millitarian Cordyceps.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 포함하는 밀리타리스 동충하초 동정용 키트를 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a kit for identification of a mallitarian caterpillar fungus containing the above primer.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 PCR 방법을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법을 제공한다.
As one embodiment for achieving the above object, the present invention provides a method for identifying a molluscan cordyceps using a PCR method.
구체적으로, 본 발명의 밀리타리스 동충하초의 동정방법은 (i) 목적하는 밀리타리스 동충하초로부터 gDNA를 수득하는 단계; (ii) 상기 수득한 gDNA를 주형으로 하고, 상기 gDNA에 존재하는 마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)를 증폭시킬 수 있는 D2-65(서열번호 1 및 2), D4-6(서열번호 3 및 4), D0-31(서열번호 5 및 6), D2-6(서열번호 7 및 8), D2-23(서열번호 9 및 10), D2-48(서열번호 11 및 12) 및 D2-68(서열번호 13 및 14)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및, (iii) 상기 수득한 PCR 산물을 분석하고, 상기 분석된 PCR 산물을 포함하는 밀리타리스 동충하초를 동정하는 단계를 포함한다.
Specifically, the method for identification of the milliliter caterpillar follicle according to the present invention comprises the steps of: (i) obtaining gDNA from the desired mullitary cordyceps; (ii) D2-65 (SEQ ID NOS: 1 and 2), D4-6 (SEQ ID NOS: 3 and 4) capable of amplifying microsatellite DNA existing in the gDNA, ), D0-31 (SEQ ID NOS: 5 and 6), D2-6 (SEQ ID NOS: 7 and 8), D2-23 (SEQ ID NOS: 9 and 10), D2-48 SEQ ID NOS: 13 and 14) to obtain a PCR product; And (iii) analyzing the obtained PCR product, and identifying the M. lichenw. Containing the analyzed PCR product.
본 발명의 용어 "마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)"란, 유전체 상에 수회에서 수백회에 걸쳐 반복되어 존재하는 작은 DNA 단편을 의미하는데, 대체로 염색체의 텔로미어에 대량 분포한다고 알려져 있다. 상기 마이크로새틀라이트 DNA를 이용하여 마커를 분석하는 방법으로는, 바람직하게는 반복서열부위의 변화로 인한 크기의 차이를 분석하는 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 마이크로새틀라이트 DNA는 밀리타리스 동충하초의 동정에 사용되는 마커로서 사용될 수 있고, 이를 위한 마이크로새틀라이트 DNA로는 D0-31(서열번호 15), D2-6(서열번호 16), D2-23(서열번호 17), D2-48(서열번호 18), D2-65(서열번호 19), D2-68(서열번호 20), D4-6(서열번호 21) 등이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
The term " microsatellite DNA " of the present invention means a small DNA fragment which is repeatedly present on the dielectric several to several hundred times, and is generally known to be distributed in large quantities in telomeres of chromosomes. As a method of analyzing a marker using the microsatellite DNA, a method of analyzing a difference in size due to a change in a repeated sequence region can be used. For the purpose of the present invention, the microsatellite DNA can be used as a marker to be used for identification of the mullitary cordyceps, and D0-31 (SEQ ID NO: 15), D2-6 (SEQ ID NO: 16) D2-23 (SEQ ID NO: 17), D2-48 (SEQ ID NO: 18), D2-65 (SEQ ID NO: 19), D2-68 (SEQ ID NO: 20), D4-6 , And is not particularly limited thereto.
본 발명자들은 밀리타리스 동충하초를 용이하게 신속하게 동정하는 방법을 개발하기 위하여, PCR 방법을 이용하고자 하였고, 상기 PCR 방법의 대상으로서 마이크로새틀라이트 DNA에 주목하게 되었다. 상기 마이크로새틀라이트 DNA는 유전체 상에 수회에서 수백회에 걸쳐 반복되어 존재하는 작은 DNA 단편으로서 다양한 대립유전자를 포함할 수 있기 때문에 밀리타리스 동충하초를 식별하기 위한 마커로서 활용할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 밀리타리스 동충하초로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 상기 다양한 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭시킬 수 있는 다양한 종류의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 다양한 크기의 PCR 산물을 수득할 수 있었는데, 이들 각 PCR 산물만으로는 각 밀리타리스 동충하초를 동정하는데 어려움이 있었다.The present inventors tried to use a PCR method in order to develop a method for easily and rapidly identifying a mullitary cordyceps, and the microsatellite DNA was noted as an object of the PCR method. Since the microsatellite DNA can contain various alleles as small DNA fragments that exist repeatedly over a period of several to several hundreds of times on the dielectric, it could be utilized as a marker for identifying Millitarian Cordyceps. PCR was carried out using various types of primers capable of amplifying the various microsatellite DNAs using genomic DNA extracted from Millitaredian Cordyceps as a template. As a result, PCR products of various sizes could be obtained. Each PCR product alone had difficulty in identifying each Millitaredis Cordyceps.
이에, 상기 각 PCR 산물을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 상기 각 PCR 산물을 분석하고, 복합적으로 조합하여 패턴화한 결과, 각 밀리타리스 동충하초가 PCR 산물의 독특한 패턴에 상응함을 알 수 있었다. 이들 패턴은 특별히 이에 제한되지 않으나, PCR 산물의 크기분석, 대립유전자의 조합분석 또는 대립유전자의 숫자분석을 통해 결정될 수 있었다.
As a result of intensive researches to develop a method for identifying mullitarian caterpillars using the PCR products, the respective PCR products were analyzed, and combined and patterned in combination. As a result, each mullitaris caterpillar fungus was analyzed by PCR It was found that it corresponds to a unique pattern of the product. These patterns can be determined through size analysis of PCR products, combination analysis of alleles, or numerical analysis of alleles, although not particularly limited thereto.
본 발명의 용어 "PCR 산물의 크기분석"이란, 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물의 크기를 분석하여 수행하는 분석방법을 의미한다. 예를 들어, D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 155 및 171bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 188bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189bp인 경우 0529 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 125bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171 및 218bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 144bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 161bp인 경우 0540 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 144 및 188bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189bp인 경우 0550 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 104 및 114bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 185bp인 경우 0560 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 148 및 171bp이며, D2-23 프라이머 및 D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않고, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189bp인 경우 2060 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 146bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 230bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171 및 216bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 135 및 165bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 104bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 177 및 189bp인 경우 233 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171 및 185bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 119 및 144bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 150bp인 경우 2960 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 137 및 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 243bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 119bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189bp인 경우 4090 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 100 및 119bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189 및 194bp인 경우 5005 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 246 및 269bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 148 및 171bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 104 및 144bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 194bp인 경우 5020 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171 및 268bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 104 및 119bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 243 및 247bp인 경우 5040 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241 및 260bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 144bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 185 및 189bp인 경우 5050 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 152bp이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 127 및 149bp이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 241bp이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 171bp이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 121 및 125bp이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 119 및 144bp이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 크기가 189 및 194bp인 경우 5060 균주에 해당한다고 동정할 수 있다.
The term "size analysis of PCR product" of the present invention means an analysis method performed by analyzing the sizes of PCR products obtained using the respective primers. For example, the size of the PCR product obtained using the D2-65 primer is 152 bp, the size of the PCR product obtained using the D4-6 primer is 127 and 149 bp, and the PCR obtained using the D0-31 primer The size of the product was 241 bp, the size of the PCR product obtained using the D2-6 primer was 155 and 171 bp, the size of the PCR product obtained using the D2-23 primer was 121 and 125 bp, and the D2-48 primer The size of the obtained PCR product was 188 bp, and when the size of the PCR product obtained using the D2-68 primer was 189 bp, it could be identified as
본 발명의 용어 "대립유전자의 조합분석"이란, 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물이 대립유전자를 갖는 경우, 상기 프라이머와 대립유전자의 조합의 패턴을 분석하여 수행하는 분석방법을 의미한다. 예를 들어, D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 0529 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 0540 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 0550 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 0560 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머 및 D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않고, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 2060 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하는 패턴을 나타내는 경우 233 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 2960 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 4090 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하는 패턴을 나타내는 경우 5005 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않는 패턴을 나타내는 경우 5020 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하는 패턴을 나타내는 경우 5040 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물이 검출되지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하는 패턴을 나타내는 경우 5050 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하지 않으며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물은 대립유전자를 포함하는 패턴을 나타내는 경우 5060 균주에 해당한다고 동정할 수 있다.
The term " combination analysis of alleles "of the present invention means an analysis method in which a pattern of a combination of the primers and alleles is analyzed and performed when a PCR product obtained using the respective primers has an allele. For example, the PCR product obtained using the D2-65 primer does not contain an allele, and the PCR product obtained using the D4-6 primer contains an allele, and the PCR product obtained using the D0-31 primer The PCR product did not contain an allele, and the PCR product obtained using the D2-6 primer contained the allele. The PCR product obtained using the D2-23 primer contained the allele, and the D2-48 primer And the PCR product obtained using the D2-68 primer can be identified as the
본 발명의 용어 "대립유전자의 숫자분석"이란, 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 전기영동할 경우, 상기 PCR 산물의 밴드숫자 패턴을 분석하여 수행하는 분석방법을 의미하는데, 구체적으로 상기 각 프라이머를 이용하여 수득한 PCR 산물을 전기영동할 경우, 상기 PCR 산물이 대립유전자를 갖는 경우에는 두개의 밴드를 나타내고, 상기 PCR 산물이 대립유전자를 갖지 않는 경우에는 하나의 밴드를 나타내므로, 상기 각 프라이머와 이에 상응하는 밴드의 숫자 패턴을 분석하는 방법이 될 수 있다. 예를 들어, D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 0529 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 0540 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 0개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 0550 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 0560 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 0개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 0개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 2060 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개인 경우 233 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 2960 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 0개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 4090 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개인 경우 5005 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개인 경우 5020 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개인 경우 5040 균주에 해당한다고 동정할 수 있고; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 0개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개인 경우 5050 균주에 해당한다고 동정할 수 있으며; D2-65 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D4-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D0-31 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이고, D2-6 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 1개이며, D2-23 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이고, D2-48 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개이며, D2-68 프라이머를 사용하여 수득한 PCR 산물의 전기영동 밴드 수가 2개인 경우 5060 균주에 해당한다고 동정할 수 있다.
The term " number analysis of alleles "of the present invention means an analysis method in which the band number pattern of the PCR product is analyzed and performed when the PCR product obtained using each primer is electrophoresed. Specifically, When the PCR product obtained by using each primer is electrophoresed, the PCR product shows two bands when the allele gene is present and one band when the PCR product does not have the allele gene. Therefore, It may be a method of analyzing the number pattern of each primer and corresponding band. For example, the number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D2-65 primer was 1, the number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D4-6 primer was 2, and the number of electrophoretic bands using the D0-31 primer The number of electrophoretic bands of the obtained PCR product was 1, the number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D2-6 primer was 2, the number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D2-23 primer was 2 , The number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D2-48 primer is 1, and the number of electrophoretic bands of the PCR product obtained using the D2-68 primer is 1, it can be identified as the
다른 실시양태로서, 본 발명은 밀리타리스 동충하초의 동정에 사용되고, 서열번호 1 내지 14로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프라이머를 제공한다.
In another embodiment, the present invention provides a primer comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1-14, which is used in identification of Millitaris Cordyceps.
본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미하는데, 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 프라이머는 밀리타리스 동충하초의 게놈 DNA에 존재하는 마이크로새틀라이트 DNA를 증폭시킴에 의하여 상기 밀리타리스 동충하초의 동정에 사용하기 위한 목적으로 사용되는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 14로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 2-65(서열번호 1 및 2), D4-6(서열번호 3 및 4), D0-31(서열번호 5 및 6), D2-6(서열번호 7 및 8), D2-23(서열번호 9 및 10), D2-48(서열번호 11 및 12), D2-68(서열번호 13 및 14) 등이 될 수 있다.The term "primer" of the present invention refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template and having a starting point for template strand copying Refers to a short nucleic acid sequence that serves to initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization (i. E., DNA polymerase or reverse transcriptase) and a different four nucleoside triphosphate at a suitable buffer solution and temperature . For the purpose of the present invention, the primer is not particularly limited as long as it is used for the purpose of identifying the microorganism Cordyceps sinensis by amplifying the microsatellite DNA present in the genomic DNA of the Millitarian cordyceps, (SEQ ID NOS: 1 and 2), D4-6 (SEQ ID NOS: 3 and 4), and more preferably a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: (SEQ ID NOS: 7 and 8), D2-23 (SEQ ID NOS: 9 and 10), D2-48 (SEQ ID NOS: 11 and 12), D2-68 13 and 14) and the like.
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아울러, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
In addition, the primers of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acid sequences may also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include, but are not limited to, methylation, "capping ", substitution of one or more natural nucleotides with one or more homologues, and modifications between nucleotides such as uncharged linkers (e.g., methylphosphonate, Phosphoamidates, carbamates, etc.) or charged linkages (e.g., phosphorothioates, phosphorodithioates, etc.).
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 밀리타리스 동충하초 동정용 키트를 제공한다.
In another embodiment, the present invention provides a kit for identifying a mallitarian Cordyceps recipient comprising the above primer.
본 발명의 밀리타리스 동충하초 동정용 키트에 포함된 프라이머는 표지용 물질로 표지되어, PCR 산물을 보다 용이하게 검출할 수 있다.The primer contained in the kit for identification of the mullitary caterpillar fungus of the present invention is labeled with a labeling substance so that the PCR product can be detected more easily.
본 발명의 용어 "표지용 물질"이란, 상기 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 존재여부를 가시적으로 확인하도록 보조하는 물질을 의미하는데, 대체로 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 이용 가능한 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 될 수 있고, 이용 가능한 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 될 수 있으며, 이용 가능한 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 될 수 있고, 이용 가능한 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 될 수 있으며, 이용 가능한 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 될 수 있고, 이용 가능한 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 될 수 있으며, 이용 가능한 방사선동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.The term "labeling substance" of the present invention means a substance that assists in visually confirming the presence or absence of a PCR product amplified by using the primer. Generally, an enzyme, a minerals, a ligand, a luminescent material, a microparticle ), Redox molecules, radioactive isotopes, and the like, but are not particularly limited thereto. For example, enzymes that can be used include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase,? -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, Glucosoxidase, hexokinase, GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphoenolpyruvate decarboxylase, beta -lactamase, and the like, and examples of the usable minerals include fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, And examples of ligands that can be used include biotin derivatives and the like, and available luminescent materials include acridinium ester, luciferin, luciferase, etc., and available microparticles Colloidal gold, colored latex, etc. The available redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone and the like number, and a radioactive isotope available will include 3 H, 14 C, 32 P , 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re But is not limited thereto.
상기 키트에 의하여 동정되는 대상인 밀리타리스 동충하초는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 코디셉스 밀리타리스(codyceps militallise)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 코디셉스 밀리타리스(codyceps militallise) 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050, 5060 등이 될 수 있다.
The mollitary cordyceps, which is a subject identified by the above kit, is not particularly limited but may be preferably codyceps militallise , more preferably codyceps militallise ) 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050,
본 발명의 방법을 이용하면, 외관상으로 용이하게 구별되지 않는 밀리타리스 동충하초를 정확하고 신속하게 동정할 수 있으므로, 밀리타리스 동충하초를 포함하는 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
By using the method of the present invention, it is possible to accurately and rapidly identify Millitaris caterpillar fungus, which is not easily distinguished from the outside, so that it can be widely used in the development of various products including Millitaris caterpillar fungus.
도 1은 13종의 밀리타리스 동충하초의 gDNA를 나타내는 전기영동사진이다.
도 2는 D2-65 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 증폭된 PCR 산물을 나타내는 전기영동 사진이다.Fig. 1 is an electrophoresis image showing gDNA of 13 species of Millitaris caterpillar fungus.
2 is an electrophoresis image showing PCR products amplified using D2-65 microsatellite markers.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: 동충하초로부터 1: From Cordyceps
gDNAgDNA
의 추출Extraction of
13종의 밀리타리스 동충하초(codyceps militallise 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050 및 5060)의 조직을 DNA 추출키트(DNeasy mini-prep kit, QIAGEN)에 적용하여 각각의 gDNA를 수득하고(표 1), 수득한 각각의 gDNA를 전기영동하였다(도 1).
Thirteen species of millitary cordyceps ( codyceps The tissues of
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3
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0550
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50600529
0540
0550
0560
2060
233
2960
4090
5005
5020
5040
5050
5060
59.14
66.62
55.66
57.55
97.28
104.9
59.78
66.15
71.8
23.64
34.3
25.5858.07
59.14
66.62
55.66
57.55
97.28
104.9
59.78
66.15
71.8
23.64
34.3
25.58
도 1은 13종의 밀리타리스 동충하초의 gDNA를 나타내는 전기영동사진으로서, M은 100bp DNA ladder를 나타낸다.
Fig. 1 is an electrophoresis image showing gDNA of 13 species of Millitary Cordyceps; M represents a 100 bp DNA ladder.
실시예Example
2: 2:
PCRPCR
증폭 Amplification
실시예Example
2-1: 2-1:
프라이머의Primer
제작 making
자체 마이크로새틀라이트 DNA 라이브러리에서 찾아낸 염기 서열 정보를 이용하여 7종의 프라이머(D2-65, D4-6, D0-31, D2-6, D2-23, D2-48 및 D2-68)를 설계하고(표 2), 이 중에서 정방향 프라이머는 5'-말단을 형광물질인 FAM으로 표지하여 합성하였다. 상기 프라이머의 합성은 detritylation(deblocking) step, activation step, coupling step, oxidation step 및 capping step을 통하여 수행하였는데, Detritylation(deblocking) step에서는 고형지지체(Solid support)에 부착된 단량체(monomer)로부터 DMT를 때어내고, Activation step에서는 Tetrazole을 사용하여 phosphoramidite monomer를 활성화시켰으며, Coupling step에서는 활성화된 phosphoramidite를 solid support에 coupling 시켜 triphosphite ester bond를 형성시키고, Oxidation step에서는 Oxidation 반응을 통해 DNA의 기본 연결 구조인 phosphate bond 형태를 갖추게 하였으며, Capping step에서는 Capping 되지 않은 5’-OH 기를 acetyl로 capping하여 원하지 않는 chain elongation을 방지시켰다.
Seven primers (D2-65, D4-6, D0-31, D2-6, D2-23, D2-48 and D2-68) were designed using the nucleotide sequence information found in the own microsatellite DNA library (Table 2). Of these, the forward primer was synthesized by labeling the 5'-terminal thereof with the fluorescent material FAM. The synthesis of the primer was carried out through a detritylation (deblocking) step, an activation step, a coupling step, an oxidation step and a capping step. In the detritylation (deblocking) step, DMT was removed from the monomer attached to the solid support Tetrazole was used to activate the phosphoramidite monomer in the activation step. In the coupling step, the activated phosphoramidite was coupled to the solid support to form the triphosphite ester bond. In the oxidation step, the phosphate bond Capping step, capping of the 5'-OH groups that were not capped with acetyl prevented unwanted chain elongation.
2
3
4
5
6
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One
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3
4
5
6
7
D2-65-R
D4-6-F
D4-6-R
D0-31-F
D0-31-R
D2-6-F
D2-6-R
D2-23-F
D2-23-R
D2-48-F
D2-48-R
D2-68-F
D2-68-RD2-65-F
D2-65-R
D4-6-F
D4-6-R
D0-31-F
D0-31-R
D2-6-F
D2-6-R
D2-23-F
D2-23-R
D2-48-F
D2-48-R
D2-68-F
D2-68-R
TCTAGGCATGCTGCGTATTG
GGGAACAATGCCCAGAATAA
AGTGCAGGAAGGCAAAGAAA
GCATCGACAGTTACCCTTTTG
AGAGGGGATAGGAGGGGTTT
TTCAAGGATCCTGCAACCTG
GCATTCGGTGAATGAGTGAA
GCGAGGTCATATGTGTGCTG
CGAACTACCATGGCTCTCTCT
ATCCATGCAATTTCCACCAT
GCGATAATTTTCCCCCTCTC
GACAATGCCACAAAATGACG
GCGAGGATGCTTGACAAGTTGGGGGCATTTGGCTACTATT
TCTAGGCATGCTGCGTATTG
GGGAACAATGCCCAGAATAA
AGTGCAGGAAGGCAAAGAAA
GCATCGACAGTTACCCTTTTG
AGAGGGGATAGGAGGGGTTT
TTCAAGGATCCTGCAACCTG
GCATTCGGTGAATGAGTGAA
GCGAGGTCATATGTGTGCTG
CGAACTACCATGGCTCTCTCT
ATCCATGCAATTTCCACCAT
GCGATAATTTTCCCCCTCTC
GACAATGCCACAAAATGACG
GCGAGGATGCTTGACAAGTT
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실시예 2-2: PCR 증폭Example 2-2: PCR amplification
상기 실시예 1에서 수득한 13종의 밀리타리스 동충하초(codyceps militallise 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050 및 5060) 각각의 gDNA 50ng, 상기 실시예 2-1 에서 합성된 각 프라이머 1㎕, 2.5mM의 dNTP 혼합용액 4㎕, 2.5 unit의 Super Taq DNA polymerase(ELPIS, KOREA) 0.5㎕, 5㎕의 10X PCR 완충용액(15mM MgC^l2 포함) 및 3차 증류수 33.5㎕을 포함하는 PCR 반응용액 50㎕를 ABI 2720 Thermal cycler(Applied Biosystems)에 적용하여 PCR을 수행하였다. 이때, 상기 PCR 반응은 95℃에서 3분간 열변성, 30 사이클의 PCR 반응(94℃ 30초, 57℃ 또는 56℃ 30초 및 72℃ 1분) 및 72℃에서 5분간 최종 신장 반응을 순차적으로 수행하였다. 반응이 종료된 후, 10㎕의 PCR 반응산물과 2㎕의 6X Gel loading buffer(BIONICS, KOREA)를 혼합하고, 이를 Ethidium Bromide가 첨가된 1.0% Agarose 젤에서 전기영동하고 자외선 조사 하에서 PCR 증폭 산물의 크기를 확인하였다(도 2). 도 2는 증폭된 마이크로새틀라이트 PCR 산물을 나타내는 전기영동 사진으로서, M은 100bp DNA ladder를 나타내고, D2-65 마이크로새틀라이트 마커를 이용하여 1 내지 13번 레인의 각 품종의 산물을 확인하였다.
50 ng of gDNA of each of the 13 species of Millitaris militallise ( codyceps militallise 0529, 0540, 0550, 0560 , 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050 and 5060) obtained in Example 1, 1 μl of each primer synthesized in Example 2-1, 4 μl of 2.5 mM dNTP mixed solution, 0.5 μl of 2.5 units of Super Taq DNA polymerase (ELPIS, KOREA), 5 μl of 10 × PCR buffer solution (containing 15 mM MgCl 2) And 33.5 占 퐇 of tertiary distilled water were applied to an ABI 2720 thermal cycler (Applied Biosystems) to perform PCR. At this time, the PCR reaction was performed by sequentially performing thermal denaturation at 95 ° C for 3 minutes, 30 cycles of PCR (94 ° C for 30 seconds, 57 ° C or 56 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute) and 72 ° C for 5 minutes Respectively. After completion of the reaction, 10 μl of the PCR reaction product and 2 μl of 6 × Gel loading buffer (BIONICS, KOREA) were mixed and electrophoresed on a 1.0% agarose gel containing Ethidium Bromide. (Fig. 2). FIG. 2 is an electrophoresis image showing the amplified microsatellite PCR product, wherein M represents a 100 bp DNA ladder, and products of each strain of lanes 1 to 13 were identified using D2-65 microsatellite markers.
실시예 2-3: 염기서열 분석Example 2-3: Sequence analysis
먼저, 980㎕ Hi-Di formamide(Applied Biosystems)와 40㎕ GeneScanTM 500 LIZ SIZE Standard (Applied Biosystems)를 혼합하여 Genotyping용 gel loading buffer를 제조하였다.First, a gel loading buffer for genotyping was prepared by mixing 980 μl Hi-Di formamide (Applied Biosystems) and 40 μl GeneScan ™ 500 LIZ SIZE Standard (Applied Biosystems).
한편, 상기 실시예 2에서 확인된 PCR 산물을 5㎕씩 새로운 96 well plate의 각 웰에 각각 분주하고, 상기 각 웰에 상기 제조한 genotyping용 gel loading buffer 10㎕를 가하여 혼합하였으며, 상기 혼합물을 spin-down 시킨 후에 Wisetherm heating block(대한과학)에 적용하여 95℃에서 3분간 열변성시키고, 곧바로 얼음에서 5분간 냉각시켰다. 상기 냉각된 각 시료 15㎕를 Microamp optical 96 well plate(Axygen)의 각 웰에 분주하고, spin-down 시켰다. 상기 Microamp optical 96 well plate를 96-well palte base(Applied Biosystems), septa(Applied Biosystems) 및 96-well plate retainer(Applied Biosystems)와 함께 조립하여 조립체를 완성하고, 상기 조립체를 유전자 분석기(ABI 3730xl Genetic analyzer, Applied Biosystems)로 옮기고, 36cm Capillary 및 standard module을 이용하여 1시간동안 전기영동하였다. Meanwhile, 5 μl of the PCR product confirmed in Example 2 was dispensed into each well of a new 96-well plate, 10 μl of the gel loading buffer for genotyping was added to each well, -down, applied to a Wisetherm heating block (Science), thermally denatured at 95 ° C for 3 minutes, and immediately cooled on ice for 5 minutes. 15 μl of each of the cooled samples was dispensed into each well of a Microamp optical 96-well plate (Axygen) and spin-down. The microamp optical 96 well plate was assembled with a 96-well palette base (Applied Biosystems), a septa (Applied Biosystems) and a 96-well plate retainer (Applied Biosystems) to complete an assembly. The assembly was analyzed with a gene analyzer (ABI 3730xl Genetic analyzer, Applied Biosystems) and electrophoresed for 1 h using a 36 cm Capillary and a standard module.
상기 전기영동에 의하여 얻어진 각 유전자형(Genotyping) 결과를 DS-33 Install Standard을 Matrix로 사용한 GeneMapper 소프트웨어 4.0에 적용하여 분석함으로써, 마이크로새틀라이트 DNA 마커의 유전자형을 결정하였다.(표 3 내지 표 9).
Genotyping results obtained by the electrophoresis were analyzed by applying to the GeneMapper software 4.0 using the DS-33 Install Standard as a matrix, and genotypes of microsatellite DNA markers were determined (Tables 3 to 9).
D2-65_0540
D2-65_0550
D2-65_0560
D2-65_2060
D2-65_233
D2-65_2960
D2-65_4090
D2-65_5005
D2-65_5020
D2-65_5040
D2-65_5050
D2-65_5060D2-65_0529
D2-65_0540
D2-65_0550
D2-65_0560
D2-65_2060
D2-65_233
D2-65_2960
D2-65_4090
D2-65_5005
D2-65_5020
D2-65_5040
D2-65_5050
D2-65_5060
A3/A3
A3/A3
A3/A3
A3/A3
A2/A2
A3/A3
A1/A3
A3/A3
A3/A3
A3/A3
A3/A3
A3/A3A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A2 / A2
A3 / A3
A1 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
A3 / A3
152
152
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146
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152152
152
152
152
152
146
152
137
152
152
152
152
152
152
152
상기 표 3에서 보듯이, D2-65 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 3가지(A1, A2 및 A3)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 3가지 조합(A1/A3, A2/A2 및 A3/A3)으로 구성됨을 확인하였다.
As shown in Table 3, the number of alleles of the sample amplified using the D2-65 primer is three (A1, A2, and A3) and the genotype is three combinations (A1 / A3, A2 / A2 and A3 / A3).
D4-6_0540
D4-6_0550
D4-6_0560
D4-6_2060
D4-6_233
D4-6_2960
D4-6_4090
D4-6_5005
D4-6_5020
D4-6_5040
D4-6_5050
D4-6_5060D4-6_0529
D4-6_0540
D4-6_0550
D4-6_0560
D4-6_2060
D4-6_233
D4-6_2960
D4-6_4090
D4-6_5005
D4-6_5020
D4-6_5040
D4-6_5050
D4-6_5060
A1/A2
A1/A2
A1/A2
A1/A2
A1/A1
A1/A1
A1/A1
A1/A1
A1/A2
A1/A2
A1/A2
A1/A2A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A1
A1 / A1
A1 / A1
A1 / A1
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
127
149
149
149
149
149
149
149
149149
149
149
149
149
149
149
149
149
상기 표 4에서 보듯이, D4-6 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 2가지(A1 및 A2)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 2가지 조합(A1/A1 및 A1/A2)으로 구성됨을 확인하였다.
As shown in Table 4, the number of alleles of the sample amplified using the D4-6 primer is two (A1 and A2), and the genotype includes two combinations (A1 / A1 and A1 / A2) of each of the above alleles. As shown in Fig.
DO-31_0540
DO-31_0550
DO-31_0560
DO-31_2060
DO-31_233
DO-31_2960
DO-31_4090
DO-31_5005
DO-31_5020
DO-31_5040
DO-31_5050
DO-31_5060DO-31_0529
DO-31_0540
DO-31_0550
DO-31_0560
DO-31_2060
DO-31_233
DO-31_2960
DO-31_4090
DO-31_5005
DO-31_5020
DO-31_5040
DO-31_5050
DO-31_5060
A2/A5
A2/A5
A2/A5
A2/A2
A1/A1
A2/A2
A3/A3
A2/A5
A4/A6
A2/A5
A2/A5
A2/A2A2 / A2
A2 / A5
A2 / A5
A2 / A5
A2 / A2
A1 / A1
A2 / A2
A3 / A3
A2 / A5
A4 / A6
A2 / A5
A2 / A5
A2 / A2
241
241
241
241
230
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246
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241241
241
241
241
241
230
241
243
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246
241
241
241
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260
260
260
260
260
269
260
260
상기 표 5에서 보듯이, D0-31 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 6가지(A1, A2, A3, A4, A5 및 A6)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 5가지 조합(A1/A1, A2/A2, A2/A5, A3/A3 및 A4/A6)으로 구성됨을 확인하였다.
As shown in Table 5, the number of alleles of the amplified samples using the D0-31 primer was 6 (A1, A2, A3, A4, A5 and A6) and the genotype was 5 combinations of alleles A1 / A1, A2 / A2, A2 / A5, A3 / A3 and A4 / A6).
D2-6_0540
D2-6_0550
D2-6_0560
D2-6_2060
D2-6_233
D2-6_2960
D2-6_4090
D2-6_5005
D2-6_5020
D2-6_5040
D2-6_5050
D2-6_5060D2-6_0529
D2-6_0540
D2-6_0550
D2-6_0560
D2-6_2060
D2-6_233
D2-6_2960
D2-6_4090
D2-6_5005
D2-6_5020
D2-6_5040
D2-6_5050
D2-6_5060
A3/A6
x
A3/A3
A1/A3
A3/A5
A3/A4
x
A3/A3
A1/A3
A3/A7
x
A3/A3A2 / A3
A3 / A6
x
A3 / A3
A1 / A3
A3 / A5
A3 / A4
x
A3 / A3
A1 / A3
A3 / A7
x
A3 / A3
171
171
148
171
171
171
148
171
171155
171
171
148
171
171
171
148
171
171
218
171
216
185
171
268
171
218
171
216
185
171
268
상기 표 6에서 보듯이, D2-6 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 7가지(A1, A2, A3, A4, A5, A6 및 A7)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 7가지 조합(A1/A3, A2/A3, A3/A3, A3/A4, A3/A5, A3/A6 및 A3/A7)으로 구성됨을 확인하였다. 아울러, 상기 표 6에서 x로 표시된 것은 DNA 단편이 증폭되지 않은 경우를 나타낸다.
As shown in Table 6, the number of alleles of the amplified samples using the D2-6 primer was 7 (A1, A2, A3, A4, A5, A6 and A7) (A1 / A3, A2 / A3, A3 / A3, A3 / A4, A3 / A5, A3 / A6 and A3 / A7). In addition, in Table 6, x indicates that the DNA fragment is not amplified.
D2-23_0540
D2-23_0550
D2-23_0560
D2-23_2060
D2-23_233
D2-23_2960
D2-23_4090
D2-23_5005
D2-23_5020
D2-23_5040
D2-23_5050
D2-23_5060D2-23_0529
D2-23_0540
D2-23_0550
D2-23_0560
D2-23_2060
D2-23_233
D2-23_2960
D2-23_4090
D2-23_5005
D2-23_5020
D2-23_5040
D2-23_5050
D2-23_5060
A2/A2
A1/A2
A1/A2
x
A3/A4
A1/A2
A2/A2
A1/A2
A1/A2
A1/A2
A2/A2
A1/A2A1 / A2
A2 / A2
A1 / A2
A1 / A2
x
A3 / A4
A1 / A2
A2 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A1 / A2
A2 / A2
A1 / A2
125
121
121
135
121
125
121
121
121
125
121121
125
121
121
135
121
125
121
121
121
125
121
125
125
165
125
125
125
125
125125
125
125
165
125
125
125
125
125
상기 표 7에서 보듯이, D2-23 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 4가지(A1, A2, A3 및 A4)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 3가지 조합(A1/A2, A2/A2 및 A3/A4)으로 구성됨을 확인하였다. 아울러, 상기 표 7에서 x로 표시된 것은 DNA 단편이 증폭되지 않은 경우를 나타낸다.
As shown in Table 7, the number of alleles of the sample amplified using the D2-23 primer was four (A1, A2, A3 and A4) and the genotype was three combinations of alleles (A1 / A2, A2 / A2 and A3 / A4). In addition, in Table 7, x indicates that the DNA fragment is not amplified.
D2-48_0540
D2-48_0550
D2-48_0560
D2-48_2060
D2-48_233
D2-48_2960
D2-48_4090
D2-48_5005
D2-48_5020
D2-48_5040
D2-48_5050
D2-48_5060D2-48_0529
D2-48_0540
D2-48_0550
D2-48_0560
D2-48_2060
D2-48_233
D2-48_2960
D2-48_4090
D2-48_5005
D2-48_5020
D2-48_5040
D2-48_5050
D2-48_5060
A5/A5
A5/A6
A2/A3
x
A2/A2
A4/A5
A4/A4
A1/A4
A2/A5
A2/A4
A5/A5
A4/A5A6 / A6
A5 / A5
A5 / A6
A2 / A3
x
A2 / A2
A4 / A5
A4 / A4
A1 / A4
A2 / A5
A2 / A4
A5 / A5
A4 / A5
144
144
104
104
119
119
100
104
104
144
119188
144
144
104
104
119
119
100
104
104
144
119
188
114
144
119
144
119
144
188
114
144
119
144
119
144
상기 표 8에서 보듯이, D2-48 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 6가지(A1, A2, A3, A4, A5 및 A6)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 10가지 조합(A1/A4, A2/A2, A2/A3, A2/A4, A2/A5, A4/A4, A4/A5, A5/A5, A5/A6 및 A6/A6)으로 구성됨을 확인하였다. 아울러, 상기 표 8에서 x로 표시된 것은 DNA 단편이 증폭되지 않은 경우를 나타낸다.
As shown in Table 8, the number of alleles of the sample amplified using the D2-48 primer was 6 (A1, A2, A3, A4, A5 and A6) and the genotype was 10 combinations A4, A4 / A5, A5 / A5, A5 / A6 and A6 / A6). In addition, in Table 8, x indicates that the DNA fragment is not amplified.
D2-68_0540
D2-68_0550
D2-68_0560
D2-68_2060
D2-68_233
D2-68_2960
D2-68_4090
D2-68_5005
D2-68_5020
D2-68_5040
D2-68_5050
D2-68_5060D2-68_0529
D2-68_0540
D2-68_0550
D2-68_0560
D2-68_2060
D2-68_233
D2-68_2960
D2-68_4090
D2-68_5005
D2-68_5020
D2-68_5040
D2-68_5050
D2-68_5060
A2/A2
A5/A5
A4/A4
A5/A5
A3/A5
A1/A1
A5/A5
A5/A6
A6/A6
A7/A8
A4/A5
A5/A6A5 / A5
A2 / A2
A5 / A5
A4 / A4
A5 / A5
A3 / A5
A1 / A1
A5 / A5
A5 / A6
A6 / A6
A7 / A8
A4 / A5
A5 / A6
161
189
185
189
177
150
189
189
194
243
185
189189
161
189
185
189
177
150
189
189
194
243
185
189
189
194
247
189
194
189
194
247
189
194
상기 표 9에서 보듯이, D2-68 프라이머를 이용해 증폭된 시료의 대립유전자의 수는 8가지(A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 및 A8)이고, 유전자형은 상기 각 대립유전자의 9가지 조합(A1/A1, A2/A2, A3/A5, A4/A4, A4/A5, A5/A5, A5/A6, A6/A6 및 A7/A8)으로 구성됨을 확인하였다.
As shown in Table 9, the number of alleles of the sample amplified using the D2-68 primer was 8 (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 and A8) A5, A5 / A6, A6 / A6, and A7 / A8), and the combination of nine combinations (A1 / A1, A2 / A2, A3 / A5, A4 / A4, A4 / A5, A5 /
상기 표 3 내지 표 9의 결과로부터, 상기 13종의 밀리타리스 동충하초로부터 수득한 gDNA를 주형으로 하고, 7종의 프라이머(서열번호 1 내지 14)를 이용한 PCR을 수행하여 수득한 각 PCR 산물을 전기영동할 경우 전기영동 밴드의 수를 비교하였다(표 10)
From the results of Tables 3 to 9, it was confirmed that each PCR product obtained by carrying out PCR using 7 types of primers (SEQ ID NOS: 1 to 14) using gDNA obtained from 13 kinds of Millitaredian Cordyceps as a template The number of electrophoretic bands was compared when electrophoresis was performed (Table 10)
0540
0550
0560
2060
233
2960
4090
5005
5020
5040
5050
50600529
0540
0550
0560
2060
233
2960
4090
5005
5020
5040
5050
5060
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1One
One
One
One
One
One
One
2
One
One
One
One
One
2
2
2
2
1
1
1
1
2
2
2
22
2
2
2
2
One
One
One
One
2
2
2
2
2
2
2
1
1
1
1
2
2
2
2
1One
2
2
2
One
One
One
One
2
2
2
2
One
2
0
1
2
2
2
0
1
2
2
0
12
2
0
One
2
2
2
0
One
2
2
0
One
1
2
2
0
2
2
1
2
2
2
1
22
One
2
2
0
2
2
One
2
2
2
One
2
1
2
2
0
1
2
1
2
2
2
1
2One
One
2
2
0
One
2
One
2
2
2
One
2
1
1
1
1
2
1
1
2
1
2
2
2One
One
One
One
One
2
One
One
2
One
2
2
2
상기 표 10에서 보듯이, 상기 13종의 밀리타리스 동충하초는 서로 다른 패턴의 대립유전자 수를 나타내었으므로, 상기 대립유전자 수의 패턴을 이용하여 밀리타리스 동충하초를 동정할 수 있음을 알 수 있었다.
As shown in Table 10 above, the 13 species of Millitaris caterpillar females showed different patterns of alleles, and thus it was found that the pattern of allelic numbers can be used to identify Millitaris caterpillar fungus .
실시예Example
2-4: 통계분석 2-4: Statistical Analysis
상기 실시예 2-3에서 얻어진 표 3 내지 표 9의 결과를 PowerMarker 프로그램에 적용하여 통계학적으로 분석하였다(표 11).
The results of Tables 3 to 9 obtained in Example 2-3 were applied to the PowerMarker program and statistically analyzed (Table 11).
Genotype No
Sample Size
No. of obs.
Allele No.
Availability
Gene Diversity
Hetero zygosity
dPICMajor.Allele.Frquency
Genotype No
Sample Size
No. of obs.
Allele No.
Availability
Gene Diversity
Hetero zygosity
dPIC
3
13
13
3
1.00
0.21
0.08
0.200.88
3
13
13
3
1.00
0.21
0.08
0.20
2
13
13
2
1.00
0.45
0.69
0.350.65
2
13
13
2
1.00
0.45
0.69
0.35
5
13
13
6
1.00
0.64
0.54
0.600.54
5
13
13
6
1.00
0.64
0.54
0.60
7
13
10
7
0.77
0.56
0.70
0.540.65
7
13
10
7
0.77
0.56
0.70
0.54
3
13
12
4
0.92
0.55
0.75
0.470.58
3
13
12
4
0.92
0.55
0.75
0.47
10
13
12
6
0.92
0.76
0.58
0.730.33
10
13
12
6
0.92
0.76
0.58
0.73
9
13
13
8
1.00
0.73
0.38
0.710.46
9
13
13
8
1.00
0.73
0.38
0.71
4.5
13
12.3
4.2
0.95
0.46
0.37
0.420.65
4.5
13
12.3
4.2
0.95
0.46
0.37
0.42
Major.Allele.Frquency : 가장 빈도수가 높은 대립 유전자형의 비율Major.Allele.Frquency: Percentage of the most frequent alleles
Genotype No. : 유전자형의 개수Genotype No. Number of genotypes
Sample Size : 분석한 품종의 개수Sample Size: Number of varieties analyzed
No. of obs. : Null allele을 제외하고 마커로 분석되어진 품종의 개수No. of obs. : Number of varieties analyzed as markers except for null allele
Allele No. : 대립유전자의 개수Allele No. Number of alleles
Availability: 1-Obs/n(Obs: No. of obs. 및 n: 샘플의 개수)Availability: 1-Obs / n (Obs: No. of obs. And n: Number of samples)
Gene diversity: 모집단으로부터 무작위적으로 선택한 대립유전자가 서로 상이한 것인 확률Gene diversity: The probability that random alleles selected from the population are different from each other
Heterozygosity: 모집단 중의 이형접합개체(heterozygous individual)의 비율Heterozygosity: the proportion of heterozygous individuals in the population
PIC(Polymorphism information content): 밀접하게 연관된 다양성 측정값
Polymorphism information content (PIC): closely related diversity measures
상기 표 11에서 보듯이, D2-65 프라이머를 이용하면 변별력에 기준이 되는 PIC(Polymorphic in contents) 값은 0.20이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; D4-6 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.35이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; D0-31 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.60이고, 이용도는 100%를 나타내었으며; D2-6 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.54이고, 이용도는 70%를 나타내었으며; D2-23 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.47이고, 이용도는 92%를 나타내었으며; D2-48 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.73이고, 이용도는 92%를 나타내었으며; D2-68 프라이머를 이용하면, PIC 값은 0.71이고, 이용도는 100%를 나타내었다.
As shown in Table 11, when the D2-65 primer was used, the polymorphic in contents (PIC) value, which is a standard for discriminating power, was 0.20 and the utilization was 100%; Using the D4-6 primer, the PIC value was 0.35 and the utilization was 100%; Using the D0-31 primer, the PIC value was 0.60 and the utilization was 100%; Using the D2-6 primer, the PIC value was 0.54 and the utilization was 70%; Using the D2-23 primer, the PIC value was 0.47 and the utilization was 92%; Using the D2-48 primer, the PIC value was 0.73 and the utilization was 92%; Using the D2-68 primer, the PIC value was 0.71 and the utilization was 100%.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for identifying of Cordyceps militaris <130> PA120668/KR <160> 21 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-65-F <400> 1 gggggcattt ggctactatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-65-R <400> 2 tctaggcatg ctgcgtattg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D4-6-F <400> 3 gggaacaatg cccagaataa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D4-6-R <400> 4 agtgcaggaa ggcaaagaaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D0-31-F <400> 5 gcatcgacag ttaccctttt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D0-31-R <400> 6 agaggggata ggaggggttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-6-F <400> 7 ttcaaggatc ctgcaacctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-6-R <400> 8 gcattcggtg aatgagtgaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-23-F <400> 9 gcgaggtcat atgtgtgctg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-23-R <400> 10 cgaactacca tggctctctc t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-48-F <400> 11 atccatgcaa tttccaccat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-48-R <400> 12 gcgataattt tccccctctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-68-F <400> 13 gacaatgcca caaaatgacg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-68-R <400> 14 gcgaggatgc ttgacaagtt 20 <210> 15 <211> 673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D0-31 <400> 15 atcagggaat caattgtcta ctttggaatt gttgaaagaa agccctgcct gccatacatt 60 ggcacaccac catcgagcca cctaccttat catttactgg cccttggggg tgcaataacg 120 gagaataaaa atcttgagag ttggagaaga gatgtgcatc gacagttacc cttttggaga 180 gaataaaagt aattcattga ttcgaggaat taccatcatt tcatatctat acaacatacg 240 agtacatcca tacatccata catccataca tctatacata catccataca tccatccata 300 catccatcca tacatccatc catacataca gtaacattca ttacttgtca tatccaatct 360 atctatactc tatactcatc ccaaacccct cctatcccct cttctctagc acatctccct 420 tcattattgc ttcccgatca tcacaacaaa ctaaacaacg aagcaaaaaa aaagagaaaa 480 caaaaaaaac aaaacggttt ctaaattaat tcaccaccat tcaattacaa gctatcttgg 540 ccgccaattt catcgacaag cacatagtgt tactgcactg ttcaactagg tactcaatcc 600 catacagatt ctctcggaat ttccgcccgc taccaaataa caagcaactc ttccccttcg 660 ctgaagattg gct 673 <210> 16 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-6 <400> 16 cgtattgtgg cttcggtagc cagcctcggt caatttgtac gaccagagag tacccatatc 60 aggctttact tatgtgtcgc taccattttt cctgtagatt aattgtggag tgtgatgtgc 120 tttttggctg cactgagcag catgtttctt gaggaatata gatggaagtt cttgcgactc 180 tgtagatagc tataaaaagc gaagatggaa cttttggtcg tcttttaagc tttaacgtta 240 tataatggag agaactgttg acgaaagggg attcttgtta gtttgggcta ttataatacg 300 attttatact ttatttatag atgaagtcac gattctctct tatacctttg agaaagtaaa 360 ataataaaaa gtataataat aatgattcat tcgctgcgac acagttacac tacctcaaac 420 ctcttagggt ctagattggt cgaaatatta aggtagccat taacaaactc accctgttaa 480 tcatgagaaa gctaaacaaa tcctttgagg aaagatctaa cagatccaaa agatccacgg 540 cggggaagtt tttaattttg aaaattcagc atatgattgt gatcgaaatc aattcttgct 600 cactcgacag agagagaaaa gtggtatgac ttgatattgt tatctattta tacagaatac 660 actcttacaa taacaacaaa agaggatcga aatacatcaa accatctttg acagcagaag 720 agaaaagaga aaaagtctca agaagcaatt caaggatcct gcaacctgca ttcaattcat 780 tcaattcatt caattcattc aattcattca attcattcaa ttcattcaat tcattcatcc 840 attcacccca tccatccatc catccatcca tccatccatc catccatcca tccatccatc 900 catccatcca tccattcact cattcaccga atgcattttc tttccattca taccacctac 960 tcgagtacgt acagtgaaga cacaagcttc aagtctactc gaatc 1005 <210> 17 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-23 <400> 17 ggttgagctg gaccggggtg ggtgatttaa aaattgcttg aggatgtagc atattctact 60 attttggatg gaataatgta cacsygatgg atgaaacgtc gcatgcagtg ctgggcgagg 120 tcatatgtgt gctgactggc ctgttacatg ttgagggcac tgatgacgaa agtaagttgg 180 cttgtaaaga ttcctgcggt gactgttaat acaatgatga gagagagaga gagagagagc 240 cataagaggt agagagagag agagagccat ggtagttcg 279 <210> 18 <211> 298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-48 <400> 18 ggcgtttcgg catgcgacaa cttcacagtt tcagacgatc tccaaagaag ccgtgcagcc 60 atgggagtgc attacctcat ccatgcaatt tccaccatca ataatttaat ctatttgctc 120 caaagctgaa gagatatcct gaagcttgtc gggagagtac acagagagag ggagagagag 180 agagagagaa agagaaacag agagagagag agagagacag agagggggaa aattatcgcc 240 taagtaaatt tactcaggga gttgtccaaa acatcccaga tgacactact gtcctgtt 298 <210> 19 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-65 <400> 19 accccgtcgc ccgggacctc tttgagcgag ggctgatcaa cattgacggt ccttacaagt 60 tcaacaccga tgaatgacct ttgctctatt gaacagccat acaaggagaa cggagccata 120 cgactaatta cctttgctct attggaacgc gatatagaag gacaatggac gaaatgtatc 180 attacacaaa ctaaaagagg caagatgttg tcagcgaaac agtcttgagc atattgcatg 240 gggttacgca ctctcagccc attttctttc tttttttatt ctctttattt ttctcttctt 300 tgtttgcttt ccttttctct ttcttttaca tcatcacttg gcgggggcat ttggctacta 360 tttttctttt tcttcttcct cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 420 ttcttcttct tcattcgctt caacctgtat acatattcat catgatagat tctagacaaa 480 aatcctactt cttatccaca tccacgccga caatacgcag catgcctaga tccgtgt 537 <210> 20 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-68 <400> 20 atttcttaat tgagcgctta agttatgtat gcatctaaat tctaagtatt ttttgtatcc 60 ccatccccat catgacagta tttaaattca tgaaacgaga aattagttgt gttcatcata 120 cattcccatt ccgttctatc atccatgcat tcgttgtaca atgtttttat tccgagagag 180 aaatggaaaa gatagatagt aaaggaaagg aaggaaaaga gatatgatta cagcagatag 240 agacatagca tgatggtaca gagccgactc agtcttccta gcccaaaggg atacttcaag 300 tgcgagacaa tttggtgaat gacacactga gaggcatcaa ggagaaggaa agagggaaga 360 agaggaaaag tagacaaaca aaaaaagaaa tgtttttgac aactacagta ttgacaagca 420 actggttagt cagaccttat tatcccatgt caccgccatc caatccagac ctcgctgaaa 480 aatccaaaaa tgaattccgt accaattttc tttttccaac acttgattcc caatgcttga 540 ttatgacaat gccacaaaat gacgcccaaa aaaattccat aaacgatgca gcgaagcggc 600 ctaactcctt ttgaaaaaac ccaaaacccc agaaaaaccc caaagccaat gagtcatgac 660 gcttttcatt tcataaaggc ataattataa ctccatgttg tgtttgcgta acactcttcg 720 atatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgcgtgt aaaaatgtgt gtactccgta aacttgtcaa 780 gcatcctcgc atcgatgatg tcattaaagg ggattgtgtc tcatgaaccc ggagctgtgt 840 tcacatctcg aaatgtgaca agtggataaa ttgtgctagt ccgtgcttcc gaacattgac 900 tacgtaggta gtgagtgtgc agctcccagt acagst 936 <210> 21 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D4-6 <400> 21 acttctgctt atattgtctc ttatctgtgc actagttaat atatcactta atattgtaat 60 agaggaaatg agtctcttgt gttttcaagt ctgtgataag actgaggatg ctattatgca 120 atcaggtgca ggtatcaaag accattgtgt ttattactct ctttaagtta atagcctttt 180 tagtaagtgc tgatatgaga gcatcagtgt caagttacag ttcttatgag aagcatggga 240 acaatgccca gaataaaaat gttcctcata ccccttccct gtctctctgt ctgtctgtct 300 gtgtgtgtgt ctgcccgtct gcctctgtct gtctgtctgt ttcaggtata atgctccttc 360 tgctgtgttt ctttgccttc ctgcactgct ggctcaatct cttcggggag ctgctgcgtt 420 ttgctgacag gatgttttat aaggtgcgtt gtatggttta ttctgtgtgg catcatctct 480 ccagtgaaca cattattttc agatatgcat gattttccag atgggaaaac atttgattaa 540 tgacaagtga aattacagtc aagtggcctg atgagcccaa aacagttt 588 <110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for identifying of Cordyceps militaris <130> PA120668 / KR <160> 21 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-65-F <400> 1 gggggcattt ggctactatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-65-R <400> 2 tctaggcatg ctgcgtattg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D4-6-F <400> 3 gggaacaatg cccagaataa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D4-6-R <400> 4 agtgcaggaa ggcaaagaaa 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D0-31-F <400> 5 gcatcgacag ttaccctttt g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D0-31-R <400> 6 agaggggata ggaggggttt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-6-F <400> 7 ttcaaggatc ctgcaacctg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-6-R <400> 8 gcattcggtg aatgagtgaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-23-F <400> 9 gcgaggtcat atgtgtgctg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-23-R <400> 10 cgaactacca tggctctctc t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-48-F <400> 11 atccatgcaa tttccaccat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-48-R <400> 12 gcgataattt tccccctctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-68-F <400> 13 gacaatgcca caaaatgacg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer D2-68-R <400> 14 gcgaggatgc ttgacaagtt 20 <210> 15 <211> 673 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D0-31 <400> 15 atcagggaat caattgtcta ctttggaatt gttgaaagaa agccctgcct gccatacatt 60 ggcacaccac catcgagcca cctaccttat catttactgg cccttggggg tgcaataacg 120 gagaataaaa atcttgagag ttggagaaga gatgtgcatc gacagttacc cttttggaga 180 gaataaaagt aattcattga ttcgaggaat taccatcatt tcatatctat acaacatacg 240 agtacatcca tacatccata catccataca tctatacata catccataca tccatccata 300 catccatcca tacatccatc catacataca gtaacattca ttacttgtca tatccaatct 360 atctatactc tatactcatc ccaaacccct cctatcccct cttctctagc acatctccct 420 tcattattgc ttcccgatca tcacaacaaa ctaaacaacg aagcaaaaaa aaagagaaaa 480 caaaaaaaac aaaacggttt ctaaattaat tcaccaccat tcaattacaa gctatcttgg 540 ccgccaattt catcgacaag cacatagtgt tactgcactg ttcaactagg tactcaatcc 600 catacagatt ctctcggaat ttccgcccgc taccaaataa caagcaactc ttccccttcg 660 ctgaagattg gct 673 <210> 16 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-6 <400> 16 cgtattgtgg cttcggtagc cagcctcggt caatttgtac gaccagagag tacccatatc 60 aggctttact tatgtgtcgc taccattttt cctgtagatt aattgtggag tgtgatgtgc 120 tttttggctg cactgagcag catgtttctt gaggaatata gatggaagtt cttgcgactc 180 tgtagatagc tataaaaagc gaagatggaa cttttggtcg tcttttaagc tttaacgtta 240 tataatggag agaactgttg acgaaagggg attcttgtta gtttgggcta ttataatacg 300 attttatact ttatttatag atgaagtcac gattctctct tatacctttg agaaagtaaa 360 ataataaaaa gtatataat aatgattcat tcgctgcgac acagttacac tacctcaaac 420 ctcttagggt ctagattggt cgaaatatta aggtagccat taacaaactc accctgttaa 480 tcatgagaaa gctaaacaaa tcctttgagg aaagatctaa cagatccaaa agatccacgg 540 cggggaagtt tttaattttg aaaattcagc atatgattgt gatcgaaatc aattcttgct 600 cactcgacag agagagaaaa gtggtatgac ttgatattgt tatctattta tacagaatac 660 actcttacaa taacaacaaa agaggatcga aatacatcaa accatctttg acagcagaag 720 agaaaagaga aaaagtctca agaagcaatt caaggatcct gcaacctgca ttcaattcat 780 tcaattcatt caattcattc aattcattca attcattcaa ttcattcaat tcattcatcc 840 attcacccca tccatccatc catccatcca tccatccatc catccatcca tccatccatc 900 catccatcca tccattcact cattcaccga atgcattttc tttccattca taccacctac 960 tcgagtacgt acagtgaaga cacaagcttc aagtctactc gaatc 1005 <210> 17 <211> 279 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-23 <400> 17 ggttgagctg gaccggggtg ggtgatttaa aaattgcttg aggatgtagc atattctact 60 attttggatg gaataatgta cacsygatgg atgaaacgtc gcatgcagtg ctgggcgagg 120 tcatatgtgt gctgactggc ctgttacatg ttgagggcac tgatgacgaa agtaagttgg 180 cttgtaaaga ttcctgcggt gactgttaat acaatgatga gagagagaga gagagagagc 240 cataagaggt agagagagag agagagccat ggtagttcg 279 <210> 18 <211> 298 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-48 <400> 18 ggcgtttcgg catgcgacaa cttcacagtt tcagacgatc tccaaagaag ccgtgcagcc 60 atgggagtgc attacctcat ccatgcaatt tccaccatca ataatttaat ctatttgctc 120 caaagctgaa gagatatcct gaagcttgtc gggagagtac acagagagag ggagagagag 180 agagagagaa agagaaacag agagagagag agagagacag agagggggaa aattatcgcc 240 taagtaaatt tactcaggga gttgtccaaa acatcccaga tgacactact gtcctgtt 298 <210> 19 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-65 <400> 19 accccgtcgc ccgggacctc tttgagcgag ggctgatcaa cattgacggt ccttacaagt 60 tcaacaccga tgaatgacct ttgctctatt gaacagccat acaaggagaa cggagccata 120 cgactaatta cctttgctct attggaacgc gatatagaag gacaatggac gaaatgtatc 180 attacacaaa ctaaaagagg caagatgttg tcagcgaaac agtcttgagc atattgcatg 240 gggttacgca ctctcagccc attttctttc tttttttatt ctctttattt ttctcttctt 300 tgtttgcttt ccttttctct ttcttttaca tcatcacttg gcgggggcat ttggctacta 360 tttttctttt tcttcttcct cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc 420 ttcttcttct tcattcgctt caacctgtat acatattcat catgatagat tctagacaaa 480 aatcctactt cttatccaca tccacgccga caatacgcag catgcctaga tccgtgt 537 <210> 20 <211> 936 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D2-68 <400> 20 atttcttaat tgagcgctta agttatgtat gcatctaaat tctaagtatt ttttgtatcc 60 ccatccccat catgacagta tttaaattca tgaaacgaga aattagttgt gttcatcata 120 cattcccatt ccgttctatc atccatgcat tcgttgtaca atgtttttat tccgagagag 180 aaatggaaaa gatagatagt aaaggaaagg aaggaaaaga gatatgatta cagcagatag 240 agacatagca tgatggtaca gagccgactc agtcttccta gcccaaaggg atacttcaag 300 tgcgagacaa tttggtgaat gacacactga gaggcatcaa ggagaaggaa agagggaaga 360 agaggaaaag tagacaaaca aaaaaagaaa tgtttttgac aactacagta ttgacaagca 420 actggttagt cagaccttat tatcccatgt caccgccatc caatccagac ctcgctgaaa 480 aatccaaaaa tgaattccgt accaattttc tttttccaac acttgattcc caatgcttga 540 ttatgacaat gccacaaaat gacgcccaaa aaaattccat aaacgatgca gcgaagcggc 600 ctaactcctt ttgaaaaaac ccaaaacccc agaaaaaccc caaagccaat gagtcatgac 660 gcttttcatt tcataaaggc ataattataa ctccatgttg tgtttgcgta acactcttcg 720 atatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgcgtgt aaaaatgtgt gtactccgta aacttgtcaa 780 gcatcctcgc atcgatgatg tcattaaagg ggattgtgtc tcatgaaccc ggagctgtgt 840 tcacatctcg aaatgtgaca agtggataaa ttgtgctagt ccgtgcttcc gaacattgac 900 tacgtaggta gtgagtgtgc agctcccagt acagst 936 <210> 21 <211> 588 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Microsatellite DNA D4-6 <400> 21 acttctgctt atattgtctc ttatctgtgc actagttaat atatcactta atattgtaat 60 agaggaaatg agtctcttgt gttttcaagt ctgtgataag actgaggatg ctattatgca 120 atcaggtgca ggtatcaaag accattgtgt ttattactct ctttaagtta atagcctttt 180 tagtaagtgc tgatatgaga gcatcagtgt caagttacaga ttcttatgag aagcatggga 240 acaatgccca gaataaaaat gttcctcata ccccttccct gtctctctgt ctgtctgtct 300 gtgtgtgtgt ctgcccgtct gcctctgtct gtctgtctgt ttcaggtata atgctccttc 360 tgctgtgttt ctttgccttc ctgcactgct ggctcaatct cttcggggag ctgctgcgtt 420 ttgctgacag gatgttttat aaggtgcgtt gtatggttta ttctgtgtgg catcatctct 480 ccagtgaaca cattattttc agatatgcat gattttccag atgggaaaac atttgattaa 540 tgacaagtga aattacagtc aagtggcctg atgagcccaa aacagttt 588
Claims (10)
(ii) 상기 수득한 gDNA를 주형으로 하고, 상기 gDNA에 존재하는 마이크로새틀라이트 DNA(Microsatellite DNA)를 증폭시킬 수 있는 서열번호 1(D2-65-F)과 서열번호 2(D2-65-R), 서열번호 3(D4-6-F)과 서열번호 4(D4-6-R), 서열번호 5(D0-31-F)와 서열번호 6(D0-31-R), 서열번호 7(D2-6-F)과 서열번호 8(D2-6-R), 서열번호 9(D2-23-F)와 서열번호 10(D2-23-R), 서열번호 11(D2-48-F)과 서열번호 12(D2-48-R), 및 서열번호 13(D2-68-F)과 서열번호 14(D2-68-R)로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 수행하여 PCR 산물을 수득하는 단계; 및,
(iii) 상기 수득한 PCR 산물을 분석하고, 상기 분석된 PCR 산물을 포함하는 밀리타리스 동충하초를 동정하는 단계를 포함하는, 밀리타리스 동충하초의 동정방법.
(i) obtaining gDNA from the desired Millitaredian Cordyceps;
(D2-65-F) and SEQ ID NO: 2 (D2-65-R) capable of amplifying microsatellite DNA present in the gDNA, and (ii) using the obtained gDNA as a template, (D4-6-R), SEQ ID NO: 5 (D0-31-F), SEQ ID NO: 6 (D0-31-R), SEQ ID NO: 7 (D2-6-R), SEQ ID NO: 9 (D2-23-F) and SEQ ID NO: 10 (D2-23- PCR using at least one primer pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 (D2-48-R), SEQ ID NO: 13 (D2-68-F) and SEQ ID NO: 14 (D2-68-R) To obtain a PCR product; And
(iii) analyzing the obtained PCR product, and identifying the Millitaris caterpillar follicle containing the analyzed PCR product.
상기 PCR 산물의 분석은 PCR 산물의 크기분석, 대립유전자의 조합분석 또는 대립유전자의 숫자분석을 통해 수행되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the analysis of the PCR product is carried out by size analysis of PCR products, combination analysis of alleles or numerical analysis of alleles.
상기 PCR 산물의 크기분석은 상기 각 프라이머 쌍을 이용하여 수득한 PCR 산물의 크기를 분석하여 수행되는 것인 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the size analysis of the PCR product is performed by analyzing the size of the PCR product obtained using each primer pair.
상기 대립유전자의 조합분석은 상기 각 프라이머 쌍을 이용하여 수득한 PCR 산물이 대립유전자를 갖는 경우, 상기 대립유전자의 조합을 분석하여 수행되는 것인 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the combination analysis of the alleles is performed by analyzing the combination of alleles when the PCR product obtained using each of the primer pairs has an allele.
상기 대립유전자의 숫자분석은 상기 각 프라이머 쌍을 이용하여 수득한 PCR 산물이 대립유전자를 갖는 경우, 상기 각 프라이머 쌍과 이에 상응하는 대립유전자의 숫자 패턴을 분석하여 수행되는 것인 방법.
3. The method of claim 2,
Wherein the numerical analysis of the allele is performed by analyzing the number pattern of each primer pair and the corresponding allele when the PCR product obtained using the respective primer pairs has an allele.
상기 마이크로새틀라이트 DNA는 서열번호 15(D0-31), 서열번호 16(D2-6), 서열번호 17(D2-23), 서열번호 18(D2-48), 서열번호 19(D2-65), 서열번호 20(D2-68) 및 서열번호 21(D4-6)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
The microsatellite DNA may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 15 (D0-31), SEQ ID NO: 16 (D2-6), SEQ ID NO: 17 (D2-23), SEQ ID NO: 18 (D2-48) , SEQ ID NO: 20 (D2-68) and SEQ ID NO: 21 (D4-6).
1 (D2-65-F) and 2 (D2-65-F) which are used in the method for identification of the Millitaris caterpillar fungus of claim 1 and capable of amplifying microsatellite DNA present in the genomic DNA of Millitaredian Cordyceps; R), SEQ ID NOS: 3 (D4-6-F) and 4 (D4-6-R), SEQ ID NOS: 5 (D0-31- (D2-24-R), SEQ ID NO: 11 (D2-48-F) and 12 (D2-48-F) R), and a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 13 (D2-68-F) and 14 (D2-68-R).
상기 밀리타리스 동충하초는 코디셉스 밀리타리스(codyceps militallise) 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050 및 5060로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 프라이머 쌍.
8. The method of claim 7,
Wherein said Millitarian Cordyceps is selected from the group consisting of codyceps militallise 0529, 0540, 0550, 0560, 2060, 233, 2960, 4090, 5005, 5020, 5040, 5050 and 5060 .
A kit for identifying a molluscan cordyer, comprising the primer pair of claim 7.
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