KR101581497B1 - 인삼열매 추출물을 포함하는 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus Extract)을 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 파킨슨의 동물모델에서 도파민성 신경세포를 유의하게 보호하고 도파민 수치와 tyrosine hydroxylase의 발현을 증가시키며, 따라서 파킨슨병의 증상인 운동실조도 유의하게 감소하였다. 또한, 알츠하이머병의 동물모델에서 인지기억능과 콜린성 신경계 기능을 유의하게 항진시켰다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 조성물에 포함된 인삼열매 추출물에 의해 파킨슨병과 알츠하이머병의 치료 및 예방 효과를 나타낼 수 있다.

Description

인삼열매 추출물을 포함하는 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE AND ALZHEIMER'S DISEASE CONTAINING GINSENG FRUCTUS EXTRACT}

본 발명은 파킨슨병 또는 알츠하이머병을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 약제학적 조성물을 제공함을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물의 제공을 목적으로 한다.

파킨슨병 (Parkinson's disease, PD)은 뇌퇴행성질환 중에서 유병율이 알츠하이머 질환에 이어 2위에 해당하는 질환으로서, 50세 이상의 인구 중에서 약 1% 정도가 이 질환으로 고통을 받는 것으로 보고되어져 있다(참조: Science, 274, 1197-1199). 파킨슨병은 흑질로부터 선조체에 분포하는 dopamine 분비 신경세포의 점진적인 퇴행을 수반하는 퇴행성신경질환으로서, 임상적으로 선조체의 신경세포 말단의 경우 70-80%가 감소하고 흑질의 신경세포는 50-60% 정도가 감소한다고 알려져 있다 (참조: J. Neurol. Sci., 20, 415-455; Lancet, 337, 1321-1354). 파킨슨병의 주요 증상으로는 1) 운동완만 (bradykinesia), 2) 안정시 진전 (tremor-at-rest), 3) 근육경직 (muscle rigidity), 4) 자세 반사 이상 (loss of postural reflexes), 5) 비정상적으로 구부정한 자세 (flexed posture), 6) 동작동결 (freezing) 등이 있으며, 이 중 2개 이상의 증상이 발현하며, 그 중 하나가 운동완만 혹은 안정시 진전 증상일 때 파킨슨병으로 진단하게 된다(참조: Nature, 392, 605-608).

가족성 파킨슨병 (Familial Parkinson's disease)은 조기에 발병하는 (50세 전후) 경우가 많으며, parkin, DJ-1, PINK1, α-synuclein, LRRK2 등의 유전자 이상에 그 병인인 반면 (참조: Nature, 392, 605-608; Neurol. Sci. 24, 15-160; Ann. Neurol. 56, 336-341; ), 특발성 파킨슨병 (idiopathic Parkinson's disease)은 다양한 유전적 특징, 환경독소 및 고령의 나이가 그 주요한 병인이다 (참조: Cell. Mol. Neurobiol., 26, 781-802). 파킨슨병의 postmortem 조직 연구는 dopamine성 신경세포의 소실과 병변의 진행에 신경염증과정 (참조: Exp. Neurol., 208, 1-25), 산화적인 스트레스 (J. Neurochem., 69, 1326-1329; J. Neurosci. Res., 26, 5256-5264; Biochem. Biophys. Res. Commun., 345, 967-972; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 2696-2701), 및 단백질 분해 이상 (참조: Exp. Neurol., 179, 38-46)이 관여됨을 제시하였다. 또한, 파킨슨 질환 혹은 동물모델의 뇌조직에는 microglia의 활성화 (참조: Neurobiol. Dis., 21, 404-412), cytokine 류의 증가 (참조: Ann. Neurol., 44, S115-S120), cyclooxygenase의 활성화 (참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 5473-5478) 등이 관찰되며 항염증제가 동물모델에서 신경세포 보효효과를 보이는 등 (참조: Ann. N.Y. Acad. Sci., 991, 214-228; Brain Res., 909, 187-193), 염증반응이 파킨슨 질환에서의 신경세포사에 병인 중 하나이다.

파킨슨 질환의 기전 연구 및 항파킨슨 화합물의 약리효능 평가를 위해 주로 사용되는 설치류 모델은 가족성 파킨슨병의 경우 해당하는 유전자를 변형시킨 DJ-1 유전자 결핍 생쥐, PINK1 유전자 결핍 생쥐, parkin 유전자 결핍 생쥐, α-synuclein 유전자 과발현 생쥐 등이 적용되며, 특발성 파킨슨병의 경우 1-methyl-4-phenyl-tetrahydropyridine (MPTP), 6-hydroxydopamine, paraquat, rotenone 등을 투여하여 성립한다 (참조: FEBS J., 257, 1384-1391).

경제발전에 따라 의약학의 눈부신 발전으로 기대수명이 늘어나면서, 전 세계적으로 노령화가 가속화되고 있다. 통계청의 장래 인구추계 자료에 의하면 우리나라는 2026년에 초고령사회로 진입할 것으로 예상되고 있다. 한편, 치매는 노령인구의 증가와 더불어 그 유병율이 증가하고 있는 질환으로서, 알츠하이머병이 가장 흔한 원인(60%)이며, 혈관성 치매(20%), Lewy body를 가지는 치매(파킨슨성 치매, 15%), 그 외의 원인 (5%)에 의한다 (참조: J. Psychopharmacol., 20, 732-755). 또한 다른 분야에서의 의학적인 약진은 젊은 세대들은 더 장수하게 될 것이므로 다음 세대에서 노인성 신경퇴행성질환의 비율이 증가할 것을 의미한다. 알츠하이머병의 경우 전 세계적으로 2006년 2,600만명 정도인 환자 수가 2050년에는 1억 6백만명으로 4배 가량 증가할 것으로 추정되고 있으며 (세계 알츠하이머 협회, 2006), 파킨슨병의 경우 2015년까지 3,600만명 정도로 증가할 것으로 추정된다 (Global Information Inc.).

알츠하이머병은 해마 및 피질부위에 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 신경섬유의 꼬임(neurofibrillay tangle)을 가지는 것을 조직학적 특징으로 하는 질환으로 (참조: Neuron, 6, 487-498), 알츠하이머병의 병인론에서 가장 중요한 과정은 비수용성의 베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ) 펩타이드의 축적과정이다. 비수용성의 베타아밀로이드 펩타이드에는 Aβ (1-40)와 Aβ (1-42)가 가장 많은데, Aβ (1-42)가 Aβ (1-40)에 비하여 아밀로이드 플라크로 응집되기 쉽기 때문에 더욱 독성이 높은 것으로 증명되었다 (참조: Acta Biolchm. Pol., 52, 417-423). 이 외에도, 아밀로이드 전구체 단백질(APP), 프레세닐린(PS)-1, PS-2, 아포리포프로틴등의 유전자의 차이 및 산화적인 독성이 알츠하이머병의 병인론에 관여한다고 생각되어지는데 (참조: BBA, 2007, 285-297), 이는 각종 유전자 조작 동물, 예를들면 APP 발현생쥐를 이용하거나 독성의 Aβ peptide를 중추 투여하여 알츠하이머병의 동물모델을 확립함으로서 확인된다.

비수용성의 Aβ의 축적에 따른 산화적인 손상 (15-18)은 알츠하이머병의 주요한 병인론 중의 하나로 알려져 있으며, 알츠하이머병 환자의 뇌조직에서 산화적인 손상지표의 증가 (참조: Neurochem. Res. 33, 450-458; Neurotox. Rex. 2, 167-168) 및 내인성 항산화계의 이상 (참조: Neurotox. Rex. 2, 167-168)이 보고되었고, 이러한 현상은 알츠하이머병의 동물모델 (참조: Behav. Brain Res., 155, 185-196; J. Neurosci., 27, 5394-5404)에서도 보고되었다. 더불어, 이에 따른 해마 및 피질부위의 cholinergic system의 손상 및 기능저하가 알츠하이머병의 특징적 증상인 인지기억능 저하에 기여한다 (참조: Neurology 51, S18-S29; Curr. Alzheimer Res. 1, 241-248).

한편, 알츠하이머병의 예방 또는 치료를 위한 종래 기술로서는, 한국공개특허공보 10-2005-0101537호에 알츠하이어병을 비롯한 아밀로이드β 관련질환의 치료를 위해서 3-아미노-1-프로판술폰산과 신경보호제 또는 신경영양제와의 병용투여가 개시되어 있으며, 한국공개특허공보 제 10-2012-48105호에는 우르소데옥시콜린산 및 은행잎 추출물을 배합함으로서 상승적인 알츠하이머병의 치료효과를 갖는 약제학적 조성물이 개시되어 있다. 이 외에도 알츠하이머병 치료용 조성물 또는 의약용도에 관한 다양한 발명이 행해져 왔으나, 여전히 알츠하이머병 치료에 유용한 다양한 약물의 개발이 요구되고 있다.

한편, 인삼열매는 인삼 (Panax ginseng C.A. Meyer)의 열매를 의미한다. 인삼뿌리의 추출물과 활성성분이 알츠하이머병의 in vivo 및 in vitro 모델과 파킨슨병 모델에서 약리효과를 나타내는 것은 보고된 바가 있다 (참조: Biochim Biophys Acta., 1820, 453-460; Eur J Pharmacol., 675, 15-21; Biochim Biophys Acta., 1822, 286-292; J Ethnopharmacol., 133, 1109-1116; Neurosci Lett., 487, 70-72; J Asian Nat Prod Res., 11, 604-612; Alzheimer Dis Assoc Disord., 22, 222-226; Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1992, 12, 622-623; Exp Neurol., 184, :521-529). 인삼열매 추출물은 인삼뿌리와 같은 성분뿐만 아니라, 인삼뿌리에는 없고 인삼열매에만 존재하는 lupane 구조의 triterpene들 (참조: Arch Pharm Res., 35, 647-651), Isoconiferoside (참조: Molecules, 16, 6577-6581), panaxadione [참조: Chem Pharm Bull (Tokyo), 57, 283-287], ginsenine (참조: J Asian Nat Prod Res., 8, 605-608), Isoginsenoside-Rh3 (참조: J Asian Nat Prod Res., 6, 289-293), 25-hydroxyprotopanaxadiol (참조: Eur J Drug Metab Pharmacokinet., 35, 109-113) 등의 성분들이 보고되어져 있고, 인삼뿌리에 비하여 ginsenoside Re가 현저히 많이 포함되어 있는 것으로 보고되어져 있어 (참조: Nat Prod Commun., 4, 903-906; Diabetes, 51, 1851-1858), 인삼뿌리와는 약리작용 기전이 다를 가능성이 있지만, 현재까지는 in vitro상에서의 항암효과 (참조: Eur J Drug Metab Pharmacokinet., 35, 109-113; Cancer Chemother Pharmacol., 59, 589-601), in vitro상에서의 혈관내피세포 증식효과 (참조: Chin J Integr Med., 14, 37-41)와 in vivo상에서의 혈당강하 및 항당뇨효과 (참조: Phytomedicine, 10, 600-605; Phytomedicine, 9, 254-258; Diabetes, 51, 1851-1858)가 보고된 이외에는 중추신경계에서 뇌퇴행성 질환에 적용된 어떠한 개시나 교시도 없다.

한국공개특허공보 10-2005-0101537호

현재 파킨슨병의 치료는 L-DOPA와 같은 dopamine 대체요법 및 dopamine 수용체 작용약들이 쓰이고 있으나, 장기간 투여시 이상운동증 (dyskinesia) 등의 심각한 부작용이 나타나기 때문에, 증상의 개선과 더불어 안전성이 확보된 신경보호효과가 있는 약물의 개발이 시급한 실정이다. 또한, 알츠하이머병의 경우도 마찬가지로 아직 근본적인 치료제가 개발되지 않아 증상을 완화시키는 도네페질 (donepezil) 등의 약물에 의존되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 파킨슨병과 알츠하이머병에 대해 효능을 나타내는 약제를 개발하고자 하였다. 본 발명자는 예의 연구한 결과 인삼열매 추출물이 파킨슨병의 동물모델에서 흑질과 선조체에서의 tyrosine hydroxylase의 발현과 도파민 수치를 증가시키고, 따라서 파킨슨병에서 나타나는 운동실조 증상을 개선시키는 것을 발견하였으며, 알츠하이머병의 동물모델에서 인지기억능을 항진시키고, 해마 조직의 콜린성 시스템 (cholinergic system)의 기능저하를 억제시키는 것을 발견함으로써, 인삼열매 추출물을 포함하는 약제학적 조성물이 파킨슨병과 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 제제로서 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 지금까지는 인삼뿌리의 상품화만 활발히 이루어지는 반면에 인삼열매는 폐기되고 있는 실정이기 때문에, 새로운 수요를 창출하고 버려지는 자원을 활용할 수 있다는 것에 본 발명의 가치가 있다.

본 발명자들은 인삼열매 추출물이 파킨슨병을 억제하는 효과를 이해하기 위해, 생쥐에 1-methyl-4-phenyl-tetrahydropyridine (MPTP)를 반복투여한 in vivo 동물모델을 적용하였다. 파킨슨 질환 모델에서는 운동실조 증상을 평가하기 위하여 자발운동량의 변화 및 로타-로드 평가 (rota-rod test)를 수행하였고, 선조체 및 흑질 부위의 tyrosine hydroxylase 효소의 발현, 선조체의 도파민 농도를 측정하여 dopaminergic system의 기능저하 및 손상여부를 평가하였다.

상기의 동물모델에서 인삼열매 추출물은 운동실조 증상을 개선시켰으며, 선조체 및 흑질 부위의 티로신 히드록실라제 효소의 발현과 도파민 농도를 증가시켰다. 또한, 본 발명자들은 인삼열매 추출물이 알츠하이머병을 억제하는 효과를 이해하기 위해, 생쥐에 베타-아밀로이드(β-amyloid, Aβ) (1-42) [Aβ (1-42)]를 중추투여한 in vivo 동물모델을 적용하였다. 상기의 동물모델에서 인삼열매 추출물은 인지기억능 저하와 해마조직에서의 콜린성 시스템의 기능저하를 차단했다.

결론적으로, 본 발명자들은 인삼열매 추출물이 MPTP에 의해 유도된 파킨슨병 모델에서 운동실조 증상을 완화시키고 도파민성 신경세포독성을 유의하게 억제함을 관찰했으며, Aβ (1-42)의 중추투여에 의한 인지기억능저하를 억제하며, 콜린성 시스템 기능저하를 유의하게 억제함을 관찰하여, 이들 결과는 인삼열매 추출물이 파킨슨병 및 알츠하이머병 치료제로서 유력한 후보임을 시사하는 것이다.

본 발명자들의 연구 결과, 인삼열매 추출물이 파킨슨병의 동물모델에서 흑질과 선조체에서의 도파민성 신경독성과 기능저하를 억제하였으며, 따라서 파킨슨병에서 나타나는 운동실조 증상을 개선시켰다. 또한, 인삼열매 추출물은 알츠하이머병의 동물모델에서 인지기억능을 항진시키고 해마 조직의 콜린성 시스템 (cholinergic system)의 기능저하를 억제시켰다. 이것은 인삼열매 추출물을 포함하는 약제학적 조성물이 파킨슨병과 알츠하이머병을 예방 또는 치료하는 제제로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

또한, 지금까지는 인삼뿌리의 상품화만 활발히 이루어지는 반면에 인삼열매는 폐기되고 있는 실정이기 때문에, 새로운 수요를 창출하고 버려지는 자원을 활용할 수 있다는 것이 본 발명의 중요한 효과 중 하나이다.

도 1은, MPTP의 투여로 성립하는 파킨슨병 모델에서 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus Extract)의 약리효능을 평가하기 위한 실험일정을 나타내는 도이다.
도 2는, MPTP의 투여로 유도된 운동실조 증상 [rota-rod에서 균형을 유지하는 시간의 감소 (A)와 자발운동량의 저하 (B)]에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 3은, MPTP의 투여로 유도된 선조체 조직에서의 dopamine (A)과 그 대사물인 DOPAC (B), HVA (C)의 농도 감소 및 dopamine turnover rate의 증가 (D)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 4는, MPTP의 투여로 유도된 선조체 (A)와 흑질 (B) 조직에서의 tyrosine hydroxylase 발현의 감소에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 5는, β-Amyloid (Aβ)의 투여로 성립하는 알츠하이머병 모델에서 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus Extract)의 약리효능을 평가하기 위한 실험일정을 나타내는 도이다.
도 6은, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 [hidden platform test (A), probe test (B), working memory test (C)로 구성된 Morris water maze로 평가]에 대한 인삼열매 추출물 (Gingsene Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 7은, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (Y-maze test로 평가)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 8은, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (Novel object recognition test로 평가)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 9는, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (Passive avoidance test로 평가)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 10은, Aβ (1-42)의 중추투여로 인해 저하된 인지기억능 감소 (Water finding test로 평가)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.
도 11은, Aβ (1-42)의 중추투여로 유도된 해마의 acetylcholine level 저하 (A), acetylcholinesterase activity 증가 (B) 및 choline acetyltransferase activity 감소 (C)에 대한 인삼열매 추출물 (Ginseng Fructus)의 약리효과를 나타내는 도이다.

인삼열매의 추출을 위한 용매는 물, C1 내지 C5의 저급알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 예를 들면, 인삼열매를 물로 씻어 이물질 및 염분을 제거하고 건조한 후, 인삼열매 시료 중량의 약 5 내지 50 배, 바람직하게는 10 내지 30 배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C5의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 30 내지 95 중량%의 에탄올 수용액으로 50 내지 95 ℃에서 1 시간 내지 7 일 동안 추출하는 과정을 2 내지 5 회 반복 수행한다. 또는, 이러한 물 또는 저급알콜 수용액으로 추출한 후 부탄올로 재추출할 수 있다.. 이어서 상기 추출물을 감압농축 및/또는 동결건조하여 인삼열매 조추출물을 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물 중 비극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 이를 현탁액의 약 0.1 내지 100 배, 바람직하게는 약 1 내지 5 배 부피의 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 가하여 1 회 내지 10 회, 바람직하게는 2 회 내지 5 회 비극성용매로 추출, 분리함으로써 수득할 수 있다. 또한 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있다.

또는, 상기 공정으로 수득된 인삼열매 조추출물, 바람직하게는 인삼열매 에탄올 수용액 추출물에 n-부탄올, 헥산, 에틸아세테이트 등의 유기용매를 극성이 낮은 용매부터 극성이 높은 용매 순으로, 바람직하게는 헥산, 에틸아세테이트, 및 n-부탄올의 순으로 순차적으로 용매분획, 감압농축하여 인삼열매 헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 분획물을 수득할 수 있다. 본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 인삼열매 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 0.1 내지 99 중량%를 포함할 수 있다.

본 발명의 인삼열매 추출물을 포함하는 조성물에는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 및 희석제등이 포함될 수 있으며, 예를들면, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에이스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유등이 포함될 수 있다.

또한, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

또한, 상기 조성물은 약효에 악영향을 미치지 아니하는 범위 내에서 약제학적으로 통상 사용되는 물질, 예를 들면 인삼열매 추출물의 용해도 및 위장관내 흡수를 증가시키고 경구 투여시에 물과 함께 분산 및 유화됨으로써 용출을 증가시키고 생체 이용율 향상에 널리 활용될 수 있는 지방산 또는 지방산 알코올과 같은 첨가제, 백당, 맥아, 정백당, 젤라틴, 설탕 및 물엿과 같은 당류, 스테아린산 마그네슘, 탈크와 같은 활택제, 미세결정셀롤로우스, 인산일수소칼슘, 전분, 만니톨과 같은 부형제, 제제가 산화되는 것을 방지하는 항산화제, 착향제, 방부제, 방향제, 감미료, 색소, pH 조절제 및 점도 조절제를 추가로 포함할 수 있으며, 이들은 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 사용량으로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 지방산 또는 지방산 알코올로는 구연산(citric acid), 올레인산(oleicacid), 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 미리스틱산(myristic acid), 리놀레산(linoleic acid) 또는 라우릭산(lauric acid), 카프릭산(capric acid), 카프릴릭산(caprylic acid), 카프로익산(caproic acid) 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite), α-토코페롤(α-tocopherol), 비타민C(ascorbic acid), β-카로틴(β-carotin), 토코페롤 아세테이트(tocopherol acetate), 푸마릭산(fumaric acid), 날릭산(nalic acid), 부틸화된 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 프로필 갈레이트(propyl galate) 및 소듐 아스코베이트(sodium ascorbate) 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 착향제는 혼합 과일향, 사과향, 딸기향, 체리향, 박하향, 바닐라향, 요쿠르트향 또는 드링크향 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 방부제는 안식향산, 안식향산 나트륨, 에틸파라벤, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 방향제는 박하뇌, 박하유, 오렌지 오일, 정향 오일, 시나몬 오일, 딸기 에센스 및 기타 통상의 과일향 또는 식물 에센스등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 감미제는 정백당, 포도당, 과당, 아스파탐, 스테비오사이드, 솔비톨, 만니톨, 올리고당, 물엿 또는 맥아이온 엿등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 색소는 녹색 3호, 적색 2호, 적색 3호, 청색 1호, 청색 2호, 황색 4호, 황색 5호, 수용성 만니톨, 캐러멜, 산화티타늄 또는 산화제 이철 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 pH 조절제는 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민 또는 모노에탄올 아민 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 점도 조절제는 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(hydroxypropylmethyl cellulose, HPMC), 히드록시에틸 셀룰로오스 (hydroxyethyl cellulose), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellullose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 아카시아(acacia), 벤토나이트(bentonite), 알긴산(alginic acid), 프로필렌글리콜알지네이트(propylene glycol alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrolidon), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 카보풀(carbopol), 폴리카르보필(polycarbopil), (tragacanth) 또는 (xanthan gum)등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 인삼열매 추출물을 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 경구용 제제를 제공한다. 상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 경질 캅셀제, 젤라틴 밴딩한 경질캅셀제 및 연질 캅셀제, 카라멜 또는 젤리 타입의 츄정 및 수용액을 함유하는 경구용 액제이다.

한편, 본 발명은, 인삼열매 추출물을 함유하는 비경구투여용 약학적 조성물로 제조될 수 있으며, 예를들면, 비경구 투여를 위한 제제로서는, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 추출물은 1 일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여할 수 있으며, 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여가능하다.

본 발명은 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 효과를 나타내는 상기 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 인삼열매 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는 예를 들어, 각종 일반식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

또한, 상기 인삼열매 추출물은 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 g을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 함유할 수 있다. 상술한 천연탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다. 상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이때, 첨가제의 비율은 그다지 중요하지는 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명자들은 인삼열매 추출물이 가지고 있는 파킨슨병의 예방 또는 치료효과와 그 작용기전을 검토하였다. 약리효과를 검증하는 동물모델로서는 생쥐에 1-methyl-4-phenyl-tetrahydropyridine (MPTP)를 반복투여한 in vivo 동물모델을 적용하였다. 각 동물모델에 대해서 운동실조 증상을 평가하기 위하여 자발운동량의 변화 및 로타-로드 평가 (rota-rod test)를 수행하였고, 선조체 및 흑질 부위의 tyrosine hydroxylase 효소의 발현, 선조체의 도파민 농도를 측정하여 dopaminergic system의 기능저하 및 손상여부를 평가하였다. 또한, 본 발명자들은 인삼열매 추출물이 가지고 있는 알츠하이머병의 예방 또는 치료효과와 그 작용기전을 검토하였다. 약리효과를 검증하는 동물모델로서는 생쥐에 Aβ를 중추에 투여한 in vivo 동물모델을 적용하였으며, Morris water maze, Y-maze, Novel object recognition test, Passive avoidance test, Water finding test를 통해서 인지기억능을 평가하고, 이어서, 해마조직에서의 아세틸콜린의 수치 및 아세틸콜린 에스터라제의 활성과 콜린 아세틸트란스페라제의 활성을 측정함으로서 약리효과를 측정하였다. 군간 통계학적인 유의성은 일원분산분석 (one-way ANOVA) 혹은 중복측정 일원분산분석 (one-way ANOVA for repeated measures)을 사용하였으며, 사후검정으로서 Fisher's PLSD 평가 혹은 Bonferroni's 평가를 수행하였다. 구체적인 실시예 및 시험예는 다음과 같다.

실시예

실시예 1_인삼열매 추출물의 제조

인삼열매를 물로 씻어 이물질을 제거한 후 건조하여 분쇄하고 추출용기에 인삼열매 30 g과 70 중량%의 에탄올 수용액 총 500 ㎖를 가하여 환류 냉각하면서 70 ℃에서 3 시간씩 3 회 반복하여 가열추출한 다음, 거름종이로 여과하고, 그 여액을 40 ℃의 수욕 상에서 감압 농축 및 동결건조하여 인삼열매 에탄올 조추출물 4.5 g 을 수득하였다. 이 인삼열매 에탄올 조추출물을 가지고 이하의 실험을 진행하였다.

실시예 2_MPTP의 반복투여로 성립하는 파킨슨병 모델에서의 약물투여 및 실험일정

MPTP의 반복투여는 12주령의 C57BL/6 생쥐에 실시되었다. C57BL/6 생쥐는 나라바이오텍 (평택, 경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 약물투여 및 행동평가는 도 1과 같은 일정으로 실시하였다. 요약하면, MPTP (Sigma, St. Louis, MO, USA)는 생리식염수에 녹여서 25 mg/kg의 용량으로 1회 1회씩 7일간 피하주사하였다. 인삼열매 추출물 (500 mg/kg)을 MPTP의 투여개시 5일전부터 MPTP의 마지막 투여일까지 12시간 간격으로 1일 2회씩 12일간 경구투여 하였다. 마지막 MPTP 투여 1일 후에 행동평가를 수행하였으며, 행동평가 투여 30분 후에 생쥐를 희생하여 선조체와 흑질조직을 취하였다. Reference 약물로 ropinirole을 10 mg/kg의 용량으로 경구투여하였음.

실시예 3_자발운동량 측정 (Locomotor activity)

자동 비디오-추적 시스템(Noldus Information Technology, Wagenin, 네덜란드)을 이용하여 30분 동안 자발운동량을 측정했다. IBM 컴퓨터로 4개 시험 상자(40x40x30cm 높이)를 동시에 조작했다. 각 시험 상자에서 생쥐들의 자발운동량을 개별적으로 연구하였으며, 이들은 실험을 시작하기 전에 5분간 장치에 적응시켰다. 30 분간 동물들이 움직인 거리를 센티미터로 나타냈다. 데이터를 수집과 분석은 오전 9시와 오후 5시 사이에 이루어졌다 (참조: Curr. Neuropharmacol., 9, 118-121).

실시예 4_로타-로드 시험 (Rota-rod test)

로타-로드 장치 (Ugo Basile 모델 7650, Comerio, VA, Italy)는 베이스 플랫폼 및 표면이 미끄럽지 않은 회전 막대로 구성되었다. 이 막대는 바닥로부터 15cm 높이에 위치했다. 막대의 길이는 30cm이고, 6개의 불투명 원반에 의해서 5개의 동일한 구획으로 나누어졌다(피험체들이 서로에 의해 혼란스럽지 않을 수 있도록). 장치에 적응시키기 위해서 생쥐를 4 rpm의 속도로 2분간 장치에서 훈련시킨 후, 30분 후에 평가가 실시되었다. 평가는 4rpm의 속도에서 시작하여 40rpm의 최고 속력까지 가속 패러다임을 적용하였고, 그 후의 회전 속력은 최대 300초 동안 40rpm으로 일정하게 유지하였다. 동물이 회전 드럼 위에서 균형을 유지하는 기간을 측정하였으며, 최대 컷-오프 시간은 300초였다 (참조: Curr. Neuropharmacol., 9, 118-121).

실시예5_도파민(DA), 3,4-디히드록시페닐아세트산(DOPAC) 및 호모바닐릭산(HVA)의 측정

선조체 조직의 무게를 측정한 후, 내부 표준물질인 디히드록시벤질아민 10ng/mg을 함유하는 10% 과염소산 중에서 초음파 처리한 다음, 10분간 20,000 x g에서 원심분리했다. 뇌 조직 추출물 중의 DA와 그것의 대사산물인 3,4-디히드록시페닐아세트산(DOPAC) 및 호모바닐릭산(HVA)의 수준을 HPLC로 전개하여 전기화학적 검출기로 검출하였다. 고정상 컬럼은 3㎛ C18 컬럼을 사용하였고, 이동상은 아세토니트릴 26mL, 테트라히드로퓨란 21mL, 그리고 50mg/L EDTA 및 200mg/L 나트륨옥틸술페이트를 함유하는 0.15M 모노클로로아세트산(pH 3.0) 960mL로 이루어졌다. 조직 샘플의 피크 영역과 표준물질의 피크 영역을 비교하여 DA, DOPAC 및 HVA의 양을 계산했다 (참조: Neurochem. Int., 56, 229-244).

실시예 6_면역조직화학적 염색

생쥐의 선조체와 흑질조직에서 티로신 히드록실라제 발현을 면역조직화학적 염색법을 이용하여 평가하였다. 관류시켜 4% p-포름알데히드로 고정된 뇌조직을 40μm씩으로 절단 후 티로신 히드록실라제 항체 (1:1000, Chemicon International)에 1일 밤 반응시키기 전에 section을 0.2% Triton X-100에 15분간 노출시키고 4% normal goat serum에 반응시켰다. 1일 밤이 지난 후 2차 항체에 1시간 반응시키고 3,3-디아미노벤지딘을 크로모겐으로 하여 면역 염색했다. 각 단계마다 PBS (pH 7.4)로 세척하였다 (참조: Neurochem. Int., 56, 229-244).

실시예 7_Aβ의 중추투여로 성립하는 알츠하이머병 모델에서의 약물투여 및 실험일정

Aβ에 의한 인지기억능의 저하는 12주령의 ICR 생쥐에서 평가되었다. ICR 생쥐는 나라바이오텍 (평택, 경기도, 대한민국)에서 구입하였다. 약물투여 및 인지기억능의 평가는 도 5과 같은 일정으로 실시하였다. 요약하면, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg)를 12시간 간격으로 1일 2회씩 5일간 경구투여 하였다. 독성의 Aβ (1-42) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)와 대조물질인 무독성의 Aβ (42-1) (American Peptide Company, Sunnyvale, CA, USA)은 600 pmol을 제 3뇌실로 투여하였다. Aβ의 투여 3일 후부터 인지기억능 평가를 실행하였다. 인지기억능 평가가 이루어지는 기간에는 행동에 약물들이 직접적인 영향을 미치는 것을 막기 위하여, 행동 및 인지기능 평가가 끝난 후 약물을 투여하였다. 인지기억능 평가가 끝나고 30분 후 동물을 희생시켜 해마(hippocampus) 조직을 취하였다.

실시예 8_모리스 수중미로 실험 (Morris water maze test)

모리스 수중 미로 테스트는 Behav. Brain Res. (155, 185-196)에 기재된 바에 의하여 수행되었다 (참조 : Behav. Brain Res., 155, 185-196). 수중 미로 테스트에 사용된 수조는 지름이 97 cm이고 높이가 60 cm인 원통형 수조이며, 시험 기간 동안 분유를 희석한 23± 2 ℃의 물을 채워 사용하였다. 수조 안에는 수면에서 2cm 아래에 투명한 플랫폼을 장치하였으며, 수조 바깥쪽에 네 개의 표지를 장치하였다. 마우스의 운동궤적은 비디오 트래킹 시스템 (EthoVision, Noldus, The Netherlands)을 통하여 분석하였다.

1) 참조 기억 평가 ( Reference memory test )

각 시험(trial) 기간 동안 마우스는 다섯 군데의 시작점을 무작위로 선택한 지점에서 플랫폼을 보지 못하는 쪽을 향하여 수조안으로 넣어졌다. 각 시험(trial)에서는 마우스가 수조로 넣어진 후 플랫폼을 찾는 시간(escape latency)을 기록하게 되며, 마우스가 플랫폼을 찾으면 10 초간 플랫폼 위에서 머무르게 한 후 케이지(home cage)로 옮겼다. 마우스가 60초 내로 플랫폼을 찾지 못할 경우 플랫폼을 찾는 시간(escape latency)은 60 초로 기록하였다. 각 시험(trial)은 Aβ를 투여한 3일 후부터 4일간, 하루 네 번씩 실행되었다.

2) 확인 평가 ( Probe test )

Aβ 투여 7일 후에 확인 평가 (probe test)를 진행하였다. 플랫폼을 제거한 후, 60초간 마우스로 하여금 수조 안을 수영하게 하면서 플랫폼이 있던 위치를 몇 번 지나는지 기록하는 방법으로 수행되었다.

3) 작동 기억 평가 ( Working memory test )

작동 기억 평가 (Working memory test)는 Aβ 투여 후 8일 내지 10 일에 진행하였다. 참조 기억 평가와 비슷하지만, 플랫폼의 위치를 매일 바꾸어 주면서 플랫폼을 찾는 시간(escape latency)을 측정하였다. 하루에 5번의 시험(trial)을 진행하며, 2번째 내지 5번째 시험(trial)의 플랫폼을 찾는 시간(escape latency)을 사용하였다.

실시예 9_Y-자형 미로 실험 (Y-maze test)

Y-자형 미로 실험은 J. Alzheimers Dis. (31, 207-223)에 기재된 바에 의하여 수행되었다 (참조 : Alzheimers Dis., 31, 207-223). Y-maze의 구성은 Y-자 형태의 arm으로 되어 있고 길이 25cm 와 높이 14cm 넓이 5cm 의 검은 plastic 상자로 되어 있다. mouse를 한쪽 arm의 끝에 놓고 8분 동안 자유롭게 arm을 왕래하도록 한다. mouse가 각각의 arm에 들어가는 횟수를 video camera로 찍는다. Alternation behavior (공간 교체행동)의 평가지표는 3개의 arm을 모두 들어가는 경우에 1점을 획득하는 것으로 하여 대조군과 비교한다. mouse의 alternation score는 실제 mouse가 획득한 score를 가능한 alternation score로 나누어 100% 로 환산한다.

실시예 10_새로운 물체 인식 실험 (Novel object recognition test)

새로운 물체 인식 실험은 Learn. Mem. (14, 117-125)에 기재된 바에 의하여 수행되었다 (참조 : Learn. Mem., 14, 117-125). 첫 날에는 mouse를 40cm × 40cm × 30cm의 상자에 넣고 10분간 자유롭게 이동하도록 하여 적응시킨다. 2일째에는 상자에 두 개의 물체를 놓고 각각의 물체에 대한 반응시간을 기록한다. 이로부터 24시간 후 두 개 중 한 개의 물체를 새로운 물체(novel object)로 바꾼 후 새로운 물체에 대한 반응시간을 기록한다.

실시예 11_음용수 찾기 평가 (Water finding test)

음용수 찾기 평가는 Mol. Pharmacol. (71, 1598-1609)에 기재된 바에 의하여 수행되었다 (참조 : Mol. Pharmacol., 71, 1598-1609). 이 test는 주의집중력 및 지연학습능력을 측정하는 방법으로, 훈련일에 보았던 물병꼭지의 위치를, 24시간 동안의 절수 후의 목마른 상태에서도 기억할 수 있는지를 판단한다. 훈련일에는 50cm × 30cm × 15cm의 상자의 옆에 10cm × 10cm × 10cm의 빈 물병꼭지가 달려있는 상자 (alcove)를 벽이 통하게 붙여놓고 alcove에 들어갈 때까지 시간과 물병꼭지를 찾는 시간을 최고 5분 동안에 기록한다. 이 때 물병꼭지는 벽쪽에 가깝게 위치시킨다. 평가일에는 물을 채워놓은 물병꼭지로 바꾸되, alcove의 중심에 위치시킨다. 기록은 훈련일과 같은 방법으로 기록한다.

실시예 12_수동회피반응실험법 (passive avoidance test)

수동회피반응실험법은 Behav. Brain Res. (155, 185-196)에 기재된 바에 의하여 Gemini Avoidance System (San Diego Instrument, San Diego, CA)를 이용하여 측정한다 (참조 : Behav. Brain Res., 155, 185-196). 이 시스템은 바닥에 쇼크발생기가 장치되어진 2개의 공간으로 이루어져 있으며 두 공간의 사이에는 길로틴 도어(guillotine door)를 구비한다. 학습단계(Acquisition trial)에서는 생쥐를 한 공간 (start chamber)에 넣은 후 20초간 적응시킨다. 20초 후 생쥐가 넣어진 공간에 불이 켜지면서 가운데의 길로틴 도어가 열리고, 생쥐가 불이 켜지지 않은 반대편 공간으로 들어가는 즉시 길로틴 도어가 닫히면서 전기 쇼크 (0.3 mA, 3s, 1회)가 주어지게 된다. 24시간 후 기억단계(retention trial)에서는 생쥐를 스타트 챔버에 다시 넣고 불을 켠 후, 반대쪽 공간으로 가는 시간 (step-through latency)을 기록한다.(최고 300초)

실시예 13_아세틸콜린(ACh), 아세틸콜린에스터라제(AChE) 및 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)의 활성측정

해마와 피질조직의 ACh 수치 및 AChE의 활성은 AmplexRed Acetylcholine/ Acetylcholinesterase Assay Kit (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)을 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다. ChAT의 활성은 다음과 같이 측정했다 (참조: J. Neurosci. Res. 87, 3658-3670). 0.5M sodium phosphate buffer (pH 7.2), acetyl-CoA (6.2mM), choline chloride (1M), neostigmine sulfate (0.76mM), NaCl (3M), EDTA (1.1mM)의 용액을 각각 25μl씩 취한 후 증류수를 이용하여 부피를 400μl로 맞추고, 이 용액을 37°C에서 5분간 프리인큐베이션한 후, 시료 100μl을 넣어 37°C에서 20분간 인큐베이션하였다. 검체를 2분간 끓여서 반응을 종결시킨 후, 1ml의 증류수를 넣었다. 원심분리를 통하여 변성된 단백질을 제거한 후 1ml의 상등액을 4,4‘-dithiopyridine (10mM)이 30μl 들어 있는 시험관에 넣었다. 15분 후 324nm에서 흡광도를 측정하였다. ChAT의 활성을 coenzyme nmol/hrg protein으로 표기하였다. 단백질 농도는 BCA protein assay reagent (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 제작회사의 프로토콜에 따라 측정하였다.

실험예 1_MPTP로 유도된 파킨슨병 모델에서 인삼열매 추출물의 약리효과

1) MPTP 로 인한 운동실조

생쥐에서 MPTP의 투여는 로타-로드 평가에서 회전봉 위에서 균형을 유지하는 시간을 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 자발운동량을 유의하게 감소시켜 (P < 0.05) 유의하게 운동실조를 유도하였다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 MPTP에 의한 이러한 운동실조 증상을 유의하게 개선시켰다 [Rota-rod tes와 locomotor activity: P < 0.05, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + MPTP vs. Saline + MPTP; ]. 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 ropinirole (10 mg/kg, p.o.)과 유사하거나 우수한 약리효과를 나타내었다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 MPTP로 인해 유도된 운동실조 증상에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 2).

2) MPTP 로 인한 도파민 수치의 감소와 도파민 대사물 수치의 변화

생쥐에서 MPTP의 투여는 도파민과 그 대사물들의 수치를 유의하게 감소시켰으며 (dopamine, DOPAC, HVA, P < 0.01), 도파민 턴오버는 유의하게 증가시켰다 (P < 0.01). 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 MPTP에 의한 이러한 도파민 수치와 도파민 턴오버의 변화를 유의하게 억제하였다 [dopamine and dopamine turnover rate: P < 0.01, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + MPTP vs. Saline + MPTP; DOPAC: P < 0.05, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + MPTP vs. Saline + MPTP]. 반면 reference 약물인 ropinirole (10 mg/kg, p.o.)은 유의한 약리효과를 나타내지 않았다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 MPTP로 인해 유도된 선조체에서의 도파민의 결핍과 도파민 턴오버의 증가에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 3).

3) MPTP 로 인한 tyrosine hydroxylase 발현의 감소

면역조직화학적 염색법으로 검색한 결과 생쥐에서 MPTP의 투여는 선조체와 흑질에서 tyrosine hydroxylase 발현을 유의하게 감소시켰다 (P < 0.01). 인삼열매 추출물의 투여는 MPTP에 의한 이러한 tyrosine hydroxylase 발현의 감소를 유의하게 억제하였다 [선조체와 흑질: P < 0.01, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + MPTP vs. Saline + MPTP]. 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 ropinirole (10 mg/kg, p.o.)과 유사하였다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 MPTP로 인해 유도된 선조체에와 흑질에서의 tyrosine hydroxylase의 발현 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 4).

실험예 2_ Aβ (1-42)의 중추투여로 유도된 인지기억능 저하 및 콜린성 신경계 기능저하에 대한 인삼열매 추출물의 약리효과

1) 모리스 수중 미로 실험 ( Morris water maze )

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 Morris water maze의 reference memory test에서 platform을 찾는 시간 (escape latency)을 유의하게 연장시켰으며 (P < 0.01), 이는 공간 참조 기억력 (spatial reference memory)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 escape latency의 연장을 유의하게 감소시켰다 (500 mg/kg, P < 0.01) (도 6의 A). 공간 참조 기억력을 다시 한 번 확인하는 probe test에서도 같은 결과를 나타냈다 (도 6의 B).

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 Morris water maze의 working memory test에서 escape latency을 유의하게 연장시켰으며 (P < 0.01), 이는 공간 작동 기억력 (spatial working memory)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 escape latency의 연장을 유의하게 감소시켰다 (500 mg/kg, P < 0.05) (도 6의 C). 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)과 유사한 약리효과를 나타내었다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 공간 참조 기억력과 공간 작동 기억력 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 6).

2) Y-자형 미로실험 (Y- maze test )

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 Y-자형 미로실험에서 공간교체행동 (alternation behavior)를 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 공간 작동 기억력 (spatial working memory)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 공간교체행동의 감소를 유의하게 억제시켰다 (500 mg/kg, P < 0.05). 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)과 유사한 약리효과를 나타내었다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 공간 작동 기억력 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 7).

3) 새로운 물체 인식 실험 ( Novel object recognition test )

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 새로운 물체 인식 실험에서 새로운 물체에 대한 탐색행위를 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 시각 재인지 기억력 (visual recognition memory)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 새로운 물체에 대한 탐색행위의 감소를 유의하게 억제시켰다 (500 mg/kg, P < 0.05). 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)과 유사한 약리효과를 나타내었다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 시각 재인지 기억력 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 8).

4) 수동회피반응실험법( Passive avoidance test )

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 수동회피반응실험에서 검은 방으로 가는 step-through latency를 유의하게 감소시켰으며 (P < 0.01), 이는 연합학습능력 (associative learning)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 step-through lantency의 감소를 유의하게 억제하였다 (500 mg/kg, P < 0.01). 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)보다 우수한 약리효과를 나타내었다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 연합학습능력의 감소에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 9).

5) 음용수 찾기 평가 ( Water finding test )

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 음용수 찾기 평가에서 물병꼭지를 찾는 finding latency를 유의하게 증가시켰으며 (P < 0.01), 이는 지연학습능력 (latent learning)의 저하를 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 finding latency의 연장을 유의하게 억제하였다 (500 mg/kg, P < 0.01). 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)과 유사하였다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 유도된 지연학습능력의 저하에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 10).

6) 해마에서 아세틸콜린 농도 및 아세틸콜린에스터라제와 콜린 아세틸트랜스 퍼라제의 활성의 측정결과

생쥐에서 Aβ (1-42)의 투여는 해마 (hippocampus) 조직의 아세틸콜린 농도(P < 0.01)와 아세틸콜린 합성효소인 콜린아세틸트렌스페라제의 활성을 유의하게 감소시킨 반면 (P < 0.05), 아세틸콜린 분해효소인 아세틸콜린에스터라제의 활성은 유의하게 증가시켰으며 (P < 0.01), 이는 해마의 콜린성 신경계 기능이 저하되었음을 의미한다. 생쥐에서 인삼열매 추출물의 투여는 Aβ (1-42)에 의한 이러한 콜린성 변화를 유의하게 억제하였다. [acetylcholine: P < 0.01, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + Aβ (1-42) vs. Saline + Aβ (1-42); acetylcholinesterase and choline acetyltransferase: P < 0.05, 인삼열매 추출물 (500 mg/kg) + Aβ (1-42) vs. Saline + Aβ (1-42)]. 인삼열매 추출물의 효과는 reference 약물인 은행엽 추출물 (40 mg/kg, p.o.)과 유사하였다. 이상의 결과는 인삼열매 추출물이 Aβ (1-42)에 의해 해마의 콜린성 신경계 기능저하에 유의한 약리효능이 있음을 나타낸다 (도 11).

본 발명은 인삼열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 파킨슨병과 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 파킨슨병과 알츠하이머병에 치료효과를 나타내며, 적당한 제제화를 거쳐 경구투여 및 비경구용 의약품으로 제조될 수 있다. 특히, 지금까지 인삼열매는 폐기되고 있는 실정이기 때문에, 버려지는 자원을 활용할 수 있다는 것이 본 발명의 중요한 산업상 이용가능성 중 하나이다.

Claims (5)

1. 인삼열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 인삼열매 추출물은, 인삼열매를 물, C1 내지 C3의 저급알콜 또는 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출 및 농축하는 것을 특징으로 하는 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 인삼열매 추출물은, 인삼열매를 물, C1 내지 C3의 저급알콜 또는 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출 및 농축하여 조추출물을 수득하고 이를 부탄올로 재추출한 부탄올 최종 추출물인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 인삼열매 추출물은 인삼열매를 물, C1 내지 C3의 저급알콜 또는 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 용매로 추출 및 농축하여 조추출물을 수득하고 이를 물에 현탁한 후 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올 순으로 재추출한 부탄올 최종 분획물인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
5. 제 2항에 있어서, C1 내지 C3의 저급알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 파킨슨병 또는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

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