KR101580681B1 - Method for producing Glycyl-tRNA synthetase enriched microvesicle - Google Patents

Abstract

본 발명은 글라이실-tRNA 합성효소(GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글라이실-tRNA 합성효소를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 마이크로베지클과 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법으로 제조한 GRS를 포함하는 마이크로베지클은 암을 치료하는데 효과적이다.The present invention relates to a method for producing a microvesicle comprising a glycyl-tRNA synthetase (GRS), and more particularly, to a method for producing microvesicles containing a glycyl-tRNA synthetase and a method for producing ≪ / RTI > and uses thereof.
The microvesicles including GRS prepared by the production method of the present invention are effective for treating cancer.

Description

글라이실-tRNA 합성효소를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법{Method for producing Glycyl-tRNA synthetase enriched microvesicle}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing microvesicles containing glycyl-tRNA synthetase, and more particularly, to a method for producing Glycyl-tRNA synthetase enriched microvesicle,

본 발명은 글라이실-tRNA 합성효소(GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 글라이실-tRNA 합성효소를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 마이크로베지클과 이의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a microvesicle comprising a glycyl-tRNA synthetase (GRS), and more particularly, to a method for producing microvesicles containing a glycyl-tRNA synthetase and a method for producing ≪ / RTI > and uses thereof.

사이토킨은 많은 세포에서 분비되는데, 그 중에서도 특히 면역세포에서 분비된다. 또한 사이토킨은 세포의 증식, 분화, 이동, 세포자살 등을 조절하는 세포 간 신호를 전달한다. 사이토킨들은 세포 내에서는 기능이 없기 때문에, 효과가 있기 위해서는 분비가 돼야만 한다. 대부분의 사이토킨들은 소포체로 향하는 시그널 펩티드 서열을 아미노 말단에 포함하고 있다. COP II 복합체가 사이토킨들을 소포체에서 골지체로 운반하면, 사이토킨들은 세포 외로 분비된다.Cytokines are secreted from many cells, especially from immune cells. In addition, cytokines transmit intercellular signals that regulate cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. Because cytokines do not function in cells, they have to be secreted in order to be effective. Most cytokines contain a signal peptide sequence directed to the endoplasmic reticulum at the amino terminus. When the COP II complex carries cytokines from the endoplasmic reticulum to the Golgi, cytokines are secreted out of the cell.

또한, 세포 내에 존재하는인 전형적인(classical) 사이토킨들은 효소 또는 신호 분자로서 세포 간의 작용을 조절한다. 예를 들어, 핵에서 발현되고, 유전자 발현을 조절하는 HMGB 1(High mobility group box 1)은 세포 외 공간으로 분비되고, 면역 반응에 관여한다. 열 충격 단백질(HSPs)은 세포 내 샤프란 이지만, 주요 스트레스 유도성 HSP인 HSP70은 세포 외 공간에서 발견되고, 면역 세포를 활성화 시킨다. Tryptophayl-tRNA synthetase(WRS)는 IFN-g 에 의해 분비되고, 그 후, 플라스민에 의해 잘려진다. 잘려진 펩티드는 VE-카데린을 통해서 혈관생성 억제 작용을 한다. In addition, classical cytokines present in cells regulate cell-cell interactions as enzymes or signal molecules. For example, HMGB 1 (High mobility group box 1), which is expressed in the nucleus and regulates gene expression, is secreted into the extracellular space and involved in the immune response. Heat shock proteins (HSPs) are intracellular saffranes, but HSP70, a major stress-inducing HSP, is found in the extracellular space and activates immune cells. Tryptophyll-tRNA synthetase (WRS) is secreted by IFN-g and then cleaved by plasmin. The cleaved peptide inhibits angiogenesis through VE-cadherin.

비 전형적인(non-classical) 사이토킨들은 세포 내에서도 기능을 하기 때문에, 아미노 말단에 시그널 펩티드 서열을 갖고 있지 않다. 이런 이유로, 비 전형적인 사이토킨들은 비 보편적인 분비 경로를 통해 분비되는데, 비 보편적인 분비 경로로는 분비 매개 운반체, 외포작용(microvesicle shedding), 엑소좀 방출, 분비성 라이소좀 등이 있다. 상기 비 전형적 분비경로들 중에서 엑소좀은 세포 내 단백질, mRNA, micro RNA 등의 세포 내 분자들을 운반한다. 엑소좀은 직경 30-100 nm인 막 유래 마이크로베지클이다. 엑소좀은 다포성소체(MVBs) 내부에서 기원하여, 세포막에서 유래한 엔도좀과 혼합되어 세포 외로 방출된다. 여러 세포들 중 암세포와 면역 세포들은 세포 간 상호작용을 매개하기 위해 엑소좀을 방출한다.Because non-classical cytokines function in cells, they do not have a signal peptide sequence at the amino terminus. For this reason, atypical cytokines are secreted via a non-universal secretory pathway, which includes secretory mediators, microvesicle shedding, exocytosis, secretory lysosomes, and the like. Of these atypical secretory pathways, exosomes carry intracellular molecules such as intracellular proteins, mRNAs, and microRNAs. Exosome is a membrane-derived microbeacl with a diameter of 30-100 nm. Exosomes originate from the inside of multipolar bodies (MVBs), mixed with the endosome derived from the cell membrane and released ex vivo. Among the various cells, cancer cells and immune cells release exosomes to mediate intercellular interactions.

Glycyl-tRNA synthetase(GRS)는 번역 기작의 주요 요소이다. GRS는 시토졸에서 글리신 tRNA를 글리신에 연결하는 역할을 하기도 하고, 다른 병에 관여하기도 한다. 몇몇 GRS 변이체들은 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth neuropathy)과 연관이 있다. 자가면역질환과 암 환자들은 GRS에 대한 자가항체를 보유하고 있다. 암의 경우, GRS는 세포사멸 시에, 대식세포에서 방출된다. 분비 된 GRS는 CDH6을 통해서, 몇몇 암세포의 ERK-인산화 수준을 낮춘 후, 암세포의 세포 자살을 유도한다. 세포자살을 유도하는 GRS 활성은 알려져 있지만, GRS 분비 기작은 아직 밝혀지지 않았다.
Glycyl-tRNA synthetase (GRS) is a major component of the translation machinery. GRS plays a role in linking glycine tRNA to glycine in cytosols, and can also be involved in other diseases. Some GRS variants are associated with Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Autoimmune diseases and cancer patients have autoantibodies against GRS. In the case of cancer, GRS is released from macrophages during apoptosis. Secreted GRS lowers ERK-phosphorylation levels of some cancer cells through CDH6 and then induces apoptosis of cancer cells. Although GRS activity inducing apoptosis is known, the mechanism of GRS secretion has not yet been elucidated.

이에 본 발명자들은 GRS 분비기작을 연구하던 중, GRS가 마이크로베지클(microvesicle)을 분비 기전으로 이용한다는 것을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors first discovered that GRS uses microvesicles as a secretion mechanism while studying the GRS secretion mechanism, and completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 (a) 세포에 세포사멸 스트레스를 주는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 글라이실 티알엔에이 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase, GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공하는 것이다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method of treating a cell, which comprises: (a) And (b) collecting microbicycles secreted from the cells of step (a). The method of claim 1, wherein the gibberellin is selected from the group consisting of Glycyl-tRNA synthetase (GRS) .

본 발명의 다른 목적은 (a) 세포와 암세포를 공동 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 GRS를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is (a) a step of co-culturing a cell and a cancer cell; And (b) collecting the microvesicles secreted from the cells of the step (a). The present invention also provides a method for producing microvesicles comprising GRS.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 제공하는 것이다.
It is another object of the present invention to provide a microbicule containing GRS prepared by the above process.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로베지클을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the above microbicule.

본 발명의 목적의 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 세포에 세포사멸 스트레스를 주는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 글라이실 티알엔에이 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase, GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공한다.
In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for treating a cell, comprising: (a) And (b) collecting microbicycles secreted from the cells of step (a). The method of claim 1, wherein the gibberellin is selected from the group consisting of Glycyl-tRNA synthetase (GRS) do.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (a) 세포와 암세포를 공동 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 GRS를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공한다.
In order to accomplish another object of the present invention, the present invention provides a method for producing a cancer cell, comprising: (a) co-culturing a cell and a cancer cell; And (b) collecting the microvessel secreted from the cells of step (a). The present invention also provides a method for producing microvesicles comprising GRS.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 제공하는 것이다.
In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a microbicule containing GRS prepared by the above-mentioned production method.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 마이크로베지클을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.In order to accomplish still another object of the present invention, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the above microbicule.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 (a) 세포에 세포사멸 스트레스를 주는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 글라이실 티알엔에이 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase, GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공한다.
(A) subjecting cells to apoptosis stress; And (b) collecting microbicycles secreted from the cells of step (a). The method of claim 1, wherein the gibberellin is selected from the group consisting of Glycyl-tRNA synthetase (GRS) do.

(a) 세포에 세포사멸 스트레스를 주는 단계;(a) subjecting cells to apoptotic stress;

상기 (a) 단계는 세포 내에 GRS 생성을 유도하는 단계이다. The step (a) is a step of inducing GRS production in a cell.

상기 세포는 바람직하게는 상피세포 또는 면역 세포일 수 있고, 더 바람직하게는 면역세포 일 수 있다. 면역 세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 감마델타세포, 수지상세포, 단핵구, 대식세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 단핵구, 대식세포 일 수 있다. 대식세포(Macrophage)는 탐식세포라고도 하는데, 면역담당세포의 하나이다. 동물체내의 모든 조직에 분포하며, 이물질 ·세균 ·바이러스 ·체내 노폐세포(老廢細胞) 등을 포식하고 소화하는 대형 아메바상 식세포를 총칭한다.
The cell may preferably be an epithelial cell or an immune cell, and more preferably an immune cell. The immune cells may be T cells, NK cells, NKT cells, gamma delta cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, and most preferably monocytes, macrophages. Macrophage, also called phagocytic cells, is one of the cells responsible for immunity. It is a large amoeba phagocytic cell which is distributed in all the tissues of the animal body and which digests and extinguishes foreign substances, bacteria, virus, reticulocyte, etc.

세포사멸 스트레스를 대식세포에 부여하면, 대식세포 내에서는 GRS가 생성된다. 이는 본 발명의 이전 특허(대한민국 등록특허 제10-1102485호)에서 확인할 수 있다. 세포사멸 스트레스를 부여하는 방법은 세포사멸을 유도하는 환경 조성 또는 세포사멸 유도 물질 처리일 수 있다. 세포사멸 유도 환경은 산소 결핍, 글루코스 결핍, 낮은 pH, 젖산 과다일 수 있고, 가장 바람직하게는 글루코스 결핍일 수 있다. 또한, 세포사멸 유도 물질은 TNF(Tumor necrosis factor)-α, TNF-β, Fas Ligand(Fas L), TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand), Perforin, Bax, Bak 및 아드리아마이신(Adriamycin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 Fas ligand 또는 아드리아마이신 일 수 있다. When apoptotic stress is given to macrophages, GRS is produced in macrophages. This can be confirmed in the prior patent (Korean Patent Registration No. 10-1102485) of the present invention. The method of imparting apoptosis stress may be environmental composition inducing apoptosis or apoptosis inducing agent treatment. The apoptosis inducing environment can be oxygen deficiency, glucose deficiency, low pH, lactic acid excess, and most preferably glucose deficiency. In addition, the cell death inducing substance is composed of TNF (Tumor necrosis factor) -α, TNF-beta, Fas ligand (Fas L), TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand), Perforin, Bax, Bak and Adriamycin , And most preferably may be Fas ligand or adriamycin.

본 발명의 제조예 1-1에서 글루코스 결핍, Fas L, 아드리아마이신을 대식세포 배양에 처리한 결과 모두 GRS가 발견되는 것을 도 13에서 확인할 수 있다. 그러나 세포사멸 스트레스를 받지 않은 대조군에서는 GRS가 발견되지 않았다.
FIG. 13 shows that GRS was found as a result of treating glucose deficiency, Fas L, and adriamycin in macrophage culture in Production Example 1-1 of the present invention. However, no GRS was found in the control group without apoptosis stress.

(b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계;(b) collecting the microvesicles secreted from the cells of step (a);

(b) 단계는 세포 내에서 생성된 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 수득하는 단계이다. 본 발명인은 GRS가 분비 시에 마이크로베지클을 이용한다는 것을 처음으로 밝혔다. (b) is a step of obtaining a microvessel containing GRS produced in a cell. The inventors of the present invention firstly described that GRS uses microvessels in secretion.

대부분의 사이토킨이 분비되는 경로는 소포체-골지체 수송경로이다. 따라서 GRS도 이 경로를 통해 분비되는지 알아보기로 했다. GRS의 단백질 서열 분석 결과, 소포체-골지체 수송경로 이용시 필요한 시그널 펩타이드를 포함하고 있지 않았다. GRS가 소포체-골지체 수송경로를 경유하지 않는다는 것을 더욱 확실히 확인하기 위해, 소포체-골지체 경로를 저해하는 Brefeldin A와 세포막 수포 형성을 저해하는 Y27632를 대식세포에 처리한 결과, 상기 두 시약의 처리 유무와 상관없이, 글루코스 결핍 배지에서 GRS가 발견되었다(실시예 1-1 및 도 1 참조). 따라서 GRS는 소포체-골지체 경로를 분비에 이용하지 않는다는 것을 확신했다.The pathway through which most cytokines secrete is the endoplasmic reticulum-Golgi transport pathway. So we decided to see if GRS is also secreted through this pathway. Protein sequence analysis of GRS did not include the signal peptide needed for the ER-Golgi transport pathway. To further confirm that GRS does not pass through the endoplasmic reticulum-mediated transfection pathway, treatment of macrophages with Brefeldin A, which inhibits the endoplasmic reticulum pathway, and Y27632, which inhibits cell wall blister formation, Regardless, GRS was found in glucose-deficient medium (see Example 1-1 and Figure 1). Thus, GRS was confident that the ER-Golgi pathway was not used for secretion.

이에 다른 신호 기작들을 저해하는 시약들로 실험해본 결과, 이 역시 GRS 분비에는 영향을 미치지 않았다(실시예 1-2 및 도 2 참조). 몇몇 사이토킨들이 마이크로베지클을 통해서 분비되기도 하기 때문에, GRS도 마이크로베지클을 이용하는지 알아보았다. 마이크로베지클의 세포외 방출을 유도하는 물질인 이오노마이신(ionomycin), 마이크로베지클 합성을 저해하는 MβCD를 대식세포에 처리한 결과, 이오노마이신을 처리했을 때, GRS가 더 많이 발견되었고, MβCD를 처리했을 때는 GRS가 훨씬 적게 발견됐다. 따라서 GRS가 분비에 마이크로베지클을 이용할 것이라는 판단하였다(실시예 1-3 및 도 3 참조). 마이크로베지클 이용 여부를 더욱 확실히 해보기 위해, 2,000g, 10,000g, 100,000g 등 다양한 원심력으로 원심분리를 해본 결과, 100,000g 분획에서만 GRS가 발견되었다(실시예 1-3 및 도 4 참조). 100,000g 분획은 마이크로베지클이 포함되는 분획으로서 상기 결과에서 GRS가 마이크로베지클을 이용한다는 것을 알 수 있다. Experiments with reagents that inhibit other signaling mechanisms did not affect GRS secretion (see Examples 1-2 and FIG. 2). Since some cytokines are secreted through microbeads, we have also investigated whether GRS also uses microbeads. Ionomycin, a substance that induces the extracellular release of microbeads, and MβCD, which inhibits microbicycle synthesis, were treated with macrophages, resulting in the discovery of more GRS when treated with ionomycin, When treated with MβCD, much less GRS was found. Thus, it was determined that GRS would utilize microvessels for secretion (see Examples 1-3 and FIG. 3). In order to further confirm the use of microbejicle, centrifugation was carried out at various centrifugal forces such as 2,000 g, 10,000 g and 100,000 g, and GRS was found only in 100,000 g fraction (see Examples 1-3 and Fig. 4). The 100,000 g fraction is a fraction containing microvessels. It can be seen from the above results that GRS uses microbeads.

마이크로베지클도 여러 종류가 있는데, 그 중 GRS가 이용하는 마이크로베지클의 특성을 파악했다. 그 결과, 글루코스 결핍 배지에서 배양한 대식세포 내에서 GRS가 MHC II와 함께 MVBs(Multivescular Bodies) 내에 있는 것을 발견했다. 그러나 일반 배지에서 배양한 대식세포 내에서는 발견할 수 없었다(실시예 2-1 및 도 5 참조).There are many kinds of microbejicles, among which the characteristics of microbeads used by GRS have been identified. As a result, we found that GRS was present in MVs (Multivescular Bodies) with MHC II in macrophages cultured in glucose-deficient medium. But not in macrophages cultured in normal medium (see Example 2-1 and Fig. 5).

마이크로베지클 관련 단백질들은 MVBs로 함입되기 전에, 유비퀴틴화가 되어야 하는데, 면역화학검출법을 통하여, GRS가 유비퀴틴화 되는 것을 확인했다(실시예 2-2 및 도 6 참조). 따라서 GRS는 분비 전에 MVBs 함입된다는 것을 알 수 있다.The microbicycle-related proteins should be ubiquitinated before they are incorporated into MVBs, and it was confirmed by immunochemical detection that GRS was ubiquitinated (see Examples 2-2 and 6). Thus, we can see that GRS is incorporated into MVBs before secretion.

MVBs는 세포막과 융합하면 엑소좀 또는 엑소좀과 유사한 마이크로베지클로 변하므로, GRS가 분비할 때 엑소좀과 유사한 특성을 지는 마이크로베지클로 분비된다는 것을 추측할 수 있다. 마이크로베지클의 특성을 더 파악하기 위해 설탕밀도기울기로 분석한 결과, GRS가 발견된 분획에서 엑소좀 마커이기도 한 HSP70 및 MHC II도 함께 발견되었다(실시예 2-3 및 도 7 참조). 또한, 글루코스 결핍 배지에서 RAW 264.7 세포를 배양한 후, 마이크로베지클을 분리한 결과, 평균 지름이 36.9 nm (엑소좀 지름은 30-100 nm)이었다. 전자현미경으로 마이크로베지클을 관찰한 결과 20-50nm의 구상형임을 확인하였다(실시예 2-3 참조).When MVBs are fused with cell membranes, microbejcheol is similar to exosomes or exosomes, so it can be deduced that microbeschle is secreted with similar properties to exosome when GRS secretes. Analysis of the sugar density slope to further characterize the microbicule revealed that HSP70 and MHC II, both exosomal markers in the fraction in which GRS was found, were also found (see Examples 2-3 and FIG. 7). After RAW 264.7 cells were cultured in glucose-deficient medium, the microvesicles were separated and found to have an average diameter of 36.9 nm (exosome diameter of 30-100 nm). Observation of the microbejicle with an electron microscope revealed that it was spherical at 20-50 nm (see Example 2-3).

따라서 GRS가 분비 시 이용하는 마이크로베지클은 분비 전 MVBs에 함입되고, MHC II 및 HSP70 단백질을 포함하고 있으며, 지름 10 내지 60nm 크기의 구상형이다. 이런 결과는 GRS가 이용하는 마이크로베지클이 엑소좀과 유사하다는 것을 보여준다Therefore, the microvasicles used for secretion by GRS are incorporated into pre-secretory MVBs, contain MHC II and HSP70 proteins, and are spherical with a diameter of 10 to 60 nm. These results show that the microvesicles used by GRS are similar to exosomes

GRS가 분비에 이용하는 마이크로베지클은 엑소좀, 엑소좀 형태의 마이크로베지클, epididimosomes, argosomes, promininosomes, prostasomes, dexosomes, texosomes, archeosomes 및 oncosomes로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 마이크로베지클일 수 있다. 가장 바람직하게는 엑소좀 형태의 마이크로베지클일 수 있다.The microvessel used for the secretion of GRS can be any microbeacycle selected from the group consisting of exosomes, exosomal microbesicles, epididimosomes, argosomes, promininosomes, prostasomes, dexosomes, texosomes, archeosomes and oncosomes. Most preferably, the microsphere may be in the form of an exosome.

마이크로베지클을 수집하는 방법은 당업계에 공지된 모든 방법일 수 있으며, 바람직하게는 원심법 또는 밀도기울기원심법 일 수 있다.The method of collecting the microbeads may be any method known in the art, and may preferably be a centrifugation method or a density gradient centrifugation method.

본 발명은 (a) 세포와 암세포를 공동 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 GRS를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법을 제공한다.
(A) co-culturing a cell and a cancer cell; And (b) collecting the microvessel secreted from the cells of step (a). The present invention also provides a method for producing microvesicles comprising GRS.

(a) 세포와 암세포를 공동 배양하는 단계;(a) co-culturing the cells with cancer cells;

상기 (a) 단계는 세포를 암세포와 공동 배양함으로서 세포 내에 GRS 생성을 유도하는 것이다. 상기 세포는 상피 세포 또는 면역세포일 수 있고, 바람직하게는 면역세포 일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 감마델타세포, 수지상세포, 단핵구, 대식세포일 수 있고, 가장 바람직하게는 단핵구, 대식세포 일 수 있다. The step (a) induces GRS production in cells by co-culturing the cells with cancer cells. The cell may be an epithelial cell or an immune cell, and may preferably be an immune cell. The immune cells may be T cells, NK cells, NKT cells, gamma delta cells, dendritic cells, monocytes, macrophages, and most preferably monocytes, macrophages.

세포와 암세포를 공동배양한 결과에서만 마이크로베지클 마커 단백질인 HSP70과 GRS를 발견할 수 있었다. 각자 배양한 대조군에서는 상기 두 단백질 모두 발견할 수 없었다(제조예 1-2 및 도 14 참조).
HSP70 and GRS, the microvessel marker proteins, were found only in the co-culture of cells and cancer cells. In the respective cultures, the two proteins were not found (see Production Examples 1-2 and 14).

(b) 상기 (a) 단계의 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계;(b) collecting the microvesicles secreted from the cells of step (a);

상기 서술에서 GRS가 분비 시, 마이크로베지클을 이용한다는 것을 설명했다. 마이크로베지클을 수집하는 방법은 당업계에 공지된 모든 방법일 수 있으며, 바람직하게는 원심법 또는 밀도기울기원심법 일 수 있다.
In the above description, it has been explained that GRS uses microvessels in secretion. The method of collecting the microbeads may be any method known in the art, and may preferably be a centrifugation method or a density gradient centrifugation method.

본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 제공한다.The present invention provides a microvessel comprising GRS prepared by the above-described method.

상기 제조방법을 통해 수득한 마이크로베지클은 GRS를 포함한다. GRS가 항암 효과를 갖는 것을 본 발명인들이 밝힌 적이 있다. 그러나 GRS만을 처방하는 것보다는 마이크로베지클과 결합한 상태로 이용하는 것이 항암 효능이 훨씬 우수하다.The microvesicles obtained through the above method include GRS. The present inventors have found that GRS has an anticancer effect. However, it is far superior to antibiotics in that it is used in combination with microvessel rather than prescribing GRS alone.

마이크로베지클의 일종인 exosome 같은 형태로 단백질이 분비되면 안정성이 높아져 더 효과가 좋게 나타난다고 알려져 있다(Merad M, et. al., Journol of Immunology 172. 2137-214, 2004). 또한 GRS가 분비에 이용하는 상기 마이크로베지클에는 GRS 이외에 다른 단백질들(MHC II, HSP70)도 함께 포함이 되어져 있기 때문에 더 강력한 효과를 나타낼 수 있다. (Thery C, et.al., Journal of Immonology 166. 7309-7318. 2001) It is known that secretion of the protein in the form of exosome, a kind of microbejic, increases the stability and is more effective (Merad M, et al., Journol of Immunology 172, 2137-214, 2004). In addition, the microvessels used for the secretion of GRS can also have a stronger effect because they include other proteins (MHC II, HSP70) in addition to GRS. (Thery C, et al., Journal of Im- munology 166, 7309-7318, 2001)

본 발명의 GRS를 포함하는 마이크로베지클은 항암 효과가 우수하다. GRS를 포함하는 마이크로베지클(GEV, GRS-enriched microvesicle)이 암세포에 흡수되는 것을 공초점 현미경 및 전자 현미경으로 확인했다(실험예 1-1 및 도 8, 도 9 참조). 또한, GEV가 암세포에 독성 효과가 있고, 암세포에 세포사멸을 유도한다는 것을 Tunnel assay로 확인하였다(실험예 1-2 및 도 10 내지 11 참조).
The microbicule containing GRS of the present invention is excellent in anticancer effect. Confocal microscopy and electron microscopy confirmed the absorption of GRS-containing microspheres (GEV, GRS-enriched microvesicle) into cancer cells (see Examples 1-1 and 8 and 9). Also, it was confirmed by the Tunnel assay that GEV has a toxic effect on cancer cells and induces apoptosis in cancer cells (see Experimental Example 1-2 and FIGS. 10 to 11).

따라서 본 발명은 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, which comprises microbicide containing GRS as an active ingredient.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).The pharmaceutical composition may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier. &Quot; Pharmaceutically acceptable " refers to compositions which are physiologically acceptable and which, when administered to humans, do not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like. Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, water for parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols And may further contain stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol. Other pharmaceutically acceptable carriers can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 경구 투여용 제형으로 제핵산과 약학적으로 허용 가능한 염을 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton,Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.The pharmaceutical composition of the present invention is not limited thereto, but may be formulated for oral administration. The nucleic acid and the pharmaceutically acceptable salt may be mixed with an excipient to prepare ingestible tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups and wafers , ≪ / RTI > These formulations may contain, in addition to the active ingredient, a diluent such as lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine and a lubricant such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salt and / Or polyethylene glycol). The tablets may contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, optionally mixed with starch, agar, A disintegrating agent such as sodium salt, an absorbent, a coloring agent, a flavoring agent and / or a sweetening agent. The formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods. The injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents. For example, each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer. In the case of a preparation for parenteral administration, the composition can be formulated in the form of injections, creams, lotions, ointments, ointments, moisturizers, gels, aerosols and nasal inhalers by methods known in the art. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a commonly known formulary for all pharmaceutical chemistries.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 암의 치료 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.The pharmaceutical composition formulated as described above may be administered in an effective amount through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular. The term "effective amount" as used herein refers to an amount that shows a therapeutic effect of cancer when administered to a patient. The "subject" may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human. Derived cells, tissues, organs, and the like. The subject may be a patient requiring treatment.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며, 바람직하게는 원하는 효과 즉, 내피세포 사멸 및/또는 항암 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 표적 세포나 조직(예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤(예: 콜레스테롤), 지질(예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as it is or may be prepared and administered in various formulations as described above, preferably administered until the desired effect, that is, endothelial cell death and / or anti-cancer effect . The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by various routes according to methods known in the art. In other words, it can be administered orally or parenterally such as oral, intramuscular, intravenous, intradermal, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraperitoneal, intranasal, vaginal, rectal, sublingual or subcutaneous, gastrointestinal, ≪ / RTI > For example, the pharmaceutical composition of the present invention may be directly applied to the skin, or the polypeptide may be prepared into a form for injection, and a predetermined amount may be injected into the lower layer of the skin using a 30 gauge thin injection needle, ). ≪ / RTI > Preferably directly on the skin. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in the form of being bound to a molecule that causes high affinity binding to a target cell or tissue (for example, skin cells or dermal tissue), or encapsulated in the molecule. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, e.g., in the form of a sterol (e.g., cholesterol), a lipid (e.g., a cationic lipid, a virosome or a liposome), or a target cell- specific binding agent Lt; / RTI > ligand). Suitable coupling or crosslinking agents may include, for example, protein A, carbodiimide, N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propiotate (SPDP), and the like.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명의 GEV의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리 할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1㎍ 내지 1g의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 유효 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 투여목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the total effective amount of the GEV of the present invention may be administered to a subject in a single dose, and the fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a prolonged period of time ). ≪ / RTI > The pharmaceutical composition of the present invention may be administered several times a day at an effective dose of 0.1 μg to 1 g per one dose, although the content of the active ingredient may be varied depending on the purpose of administration. However, the effective dose is determined not only by the route of administration and the number of treatments but also by various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of disease, diet and excretion rate of the individual requiring treatment, Therefore, in view of this point, one of ordinary skill in the art will be able to determine an appropriate effective dose depending on the purpose of administration. The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited to the formulation, administration route and administration method as long as the effect of the present invention is exhibited.

상기 본 발명의 항암용 조성물은 암의 치료에 매우 효과적이다. 상기 암으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있다.
The anticancer composition of the present invention is highly effective in the treatment of cancer. Such cancers include but are not limited to breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, stomach cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, Cancer, endometrioid cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, adenocarcinoma, soft tissue sarcoma, adenocarcinoma, adenocarcinoma, endometrioid adenocarcinoma, endometrioid adenocarcinoma, Renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, pituitary adenoma, pancreatic adenoma, pancreatic adenoma, The same cancer, or a combination of one or more of these cancers.

본 발명의 제조방법으로 제조한 GRS를 포함하는 마이크로베지클은 암을 치료하는데 효과적이다.
The microvesicles including GRS prepared by the production method of the present invention are effective for treating cancer.

도 1은 GRS가 소포체-골지체 수송 경로를 통해 분비되는지 여부를 실험한 결과이다.(WCL : Whole cell Lysate(대조군), + : 첨가, - : 비첨가)
도 2는 GRS가 다른 경로를 통해 분비되는지 여부를 실험한 결과이다.(WCL : Whole cell Lysate(대조군), + : 첨가, - : 비첨가)
도 3은 GRS가 분비 시에 마이크로베지클을 이용한다는 것을 보여주는 실험결과이다.(WCL : Whole cell Lysate(대조군), + : 첨가, - : 비첨가)
도 4는 GRS가 분비 시에 마이크로베지클을 이용한다는 것을 보여주는 실험결과이다.(2,000g, 10,000g, 100,000g : 원심분리 원심력 조건, + : 첨가, - : 비첨가)
도 5는 GRS가 분비 전에 MVBs로 함입된다는 것을 보여주는 결과이다.
(빨간 부분이 MVBs 이다.)
도 6은 GRS가 유비퀴틴화 되고 있는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 설탕밀도기울기 분획결과이다.
도 8은 GEV가 암세포로 함입되는 것을 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다. (Hoechst : 핵염색/ DIC : 세포 형태/ Exosome : GEV/ Merge : 병합 사진)
도 9는 GEV의 암세포로 함입 여부를 전자현미경으로 촬영한 사진이다.(화살표 : GEV)
도 10은 GEV가 암세포에 대해 독성이 있는 것을 보여주는 실험결과이다.
도 11은 GEV가 암세포에 세포사멸을 유도한다는 것을 보여주는 사진이다.(con : GEV 비처리한 대조군 / Exosome : GEV 처리한 실험군)
도 12는 세포사멸 스트레스 유도 시, 마이크로베지클 단백질 량을 대조군을 1로 놓고, 그의 배수로 표현한 그래프이다.(SF : 스트레스 비유도한 대조군/ adri : 아드리아마이신 처리한 실험군 / Glu - : 글루코스 결핍 처리한 실험군 / Fas : Fas Ligand 처리한 실험군)
도 13은 세포사멸 스트레스 유도 시, GRS 존재 여부를 SDS-PAGE로 관찰한 결과이다. (SF : 스트레스 비유도한 대조군/ adri : 아드리아마이신 처리한 실험군 / Glu - : 글루코스 결핍 처리한 실험군 / Fas : Fas Ligand 처리한 실험군)
도 14는 U937세포와 H460세포 공동배양, 단독배양에 따른 단백질들의 발현 여부를 관찰한 SDS-PAGE 결과이다.
도 15는 GRS가 분비 시 이용하는 마이크로베지클의 지름을 측정한 결과이다.
도 16은 GRS가 분비 시 이용하는 마이크로베지클을 전자현미경으로 촬영한 것이다.
도 17의 A는 제조예 1-1을 도식화한 것이다.
도 17의 B는 제조예 1-2를 도식화한 것이다.Figure 1 shows the results of experiments on whether GRS is secreted through the endoplasmic reticulum-Golgi transport pathway. (WCL: Whole cell lysate (control group), +: addition, -: non-addition)
Figure 2 shows the results of experiments on whether GRS is secreted through different routes. (WCL: Whole cell lysate (control group), +: addition, -: non-addition)
FIG. 3 shows experimental results showing that GRS uses microvessel during secretion (WCL: Whole cell lysate (control group), +: addition, -: non-addition)
Figure 4 shows the results of experiments showing that GRS uses microbicycles at the time of secretion (2,000 g, 10,000 g, 100,000 g: centrifugal centrifugal force, +: addition, -: no addition)
Figure 5 is a graph showing that GRS is incorporated into MVBs prior to secretion.
(The red part is MVBs.)
Figure 6 shows the results showing that GRS is ubiquitinated.
Figure 7 shows the results of the sugar density gradient fraction.
8 is a photograph of a GEV embedded in a cancer cell by a confocal microscope. (Hoechst: nuclear staining / DIC: cell morphology / Exosome: GEV / Merge: merge photograph)
FIG. 9 is a photograph of an image of the GEV embedded in cancer cells by an electron microscope. (Arrow: GEV)
Figure 10 shows the results of experiments showing that GEV is toxic to cancer cells.
11 is a photograph showing that GEV induces apoptosis in cancer cells (con: control group without GEV / Exosome: group treated with GEV)
FIG. 12 is a graph showing the amount of microbeagle protein in the control group as 1 when induced to induce apoptosis stress. (SF: Stress-like control group / adri: Adriamycin treated group / Glu-: Glucose deficiency treatment One experimental group / Fas: Fas Ligand treated group)
FIG. 13 shows the results of SDS-PAGE for the presence of GRS upon induction of apoptosis stress. (SF: Stress-like control group / adri: Adriamycin treated group / Glu-: Glucose deficient treated group / Fas: Fas Ligand treated group)
FIG. 14 shows SDS-PAGE results of observing the expression of proteins by co-culture of U937 cells and H460 cells and by single culture.
Fig. 15 shows the result of measuring the diameter of the microvessel used for the secretion of GRS.
FIG. 16 is an electron micrograph of a microvasicle used for secretion by GRS.
17A is a schematic diagram of Production Example 1-1.
FIG. 17B is a schematic representation of Production Example 1-2.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실험방법><Experimental Method>

1. 세포 배양과 시약들1. Cell culture and reagents

RAW 264.7 cell은 10% FBS를 포함하는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에서 배양했고, 이외 다른 세포들은 RPMI1640 배지에서 배양했다. 분비경로 저해제들 중 Brefeldin A, probenicid, sodium azide, ionomycin, methyl-beta-cyclodextrin 등은 Sigma에서, Y27632 는 Calbiochem에서 구입하였다. 면역 블롯팅에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였고, 항-GRS 항체는 Abcam에서 구입하였다.
RAW 264.7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS, and the other cells were cultured in RPMI1640 medium. Brefeldin A, probenicid, sodium azide, ionomycin, and methyl-beta-cyclodextrin were purchased from Sigma and Y27632 from Calbiochem. Antibodies used in immunoblotting were purchased from Santa Cruz Biotechnology, and anti-GRS antibodies were purchased from Abcam.

2. Secretion assay2. Secretion assay

분비 경로 탐색방법은 “Park, S. G. et.al., Human lysyl-tRNAsynthetase is secreted to trigger proinflammatory response. ProcNatlAcadSci USA 102, 63566361;2005”를 이용하였다. 간단하게 설명하자면, 배지를 획득하여 10% TCA 용액으로 4℃, 12시간 조건에서 단백질을 침전하였다. 펠렛화된 단백질은 SDS-PAGE 버퍼로 resuspense 한 후, SDS-PAGE로 면역블롯팅을 이용하여 분리하였다.
The secretory pathway search method is "Park, SG et al., Human lysyl-tRNAsynthetase is secreted to trigger proinflammatory response. ProcNatlAcadSci USA 102 , 63566361; 2005 &quot;. Briefly, the medium was harvested and proteins were precipitated with 10% TCA solution at 4 ° C for 12 hours. The pelleted proteins were resuspended in SDS-PAGE buffer and then separated by SDS-PAGE using immunoblotting.

3. 면역형광염색(Immunofluorescence)3. Immunofluorescence.

RAW 264.7 세포를 22 X 22 mm 커퍼글라스에 깔은 후, PBS로 두 번 세척하여 메탄올에서 10분 동안 고정시킨다. 세포들을 30분 동안 PBS 내에서 5% CAS로 차단시킨 후, 1% CAS 용액에서 항-GRS 항체와 2시간동안 배양한다. 항-GRS 항체는 Alexa488-conjugated secondary antibody (Invitrogen)로 획득된다. 핵 염색은 DAPI 염색을 이용하였다. 셀 관찰은 공초점 현미경(Nikon, C-1)을 이용하였다.
RAW 264.7 cells are spread on 22 x 22 mm cupper glass, washed twice with PBS and fixed in methanol for 10 minutes. Cells are blocked with 5% CAS in PBS for 30 min, then incubated with anti-GRS antibody in 1% CAS solution for 2 h. Anti-GRS antibody is obtained with Alexa488-conjugated secondary antibody (Invitrogen). Nuclear staining was performed using DAPI staining. Cell observation was performed using a confocal microscope (Nikon, C-1).

4. 마이크로베지클 분리4. Micro-bezel separation

RAW 264.7을 배양한 후, 그 배지를 분리하여 연속적인 원심분리를 한다. 500g(15분), 10,000g(15분), 100,000g(90분) 총 3번을 하여 마이크로베지클 펠렛을 형성한다. 마이크로베지클 단백질의 양은 Bradford assay를 이용했다. 마이크로베지클 농도를 측정하기 위해, 펠렛화된 마이크로베지클을 설탕밀도기울기에 깔아준 후, 150,000g에서 15시간 동안 원심분리 해 준다. 10 개의 분획들을 수득하여, 굴절률로 밀도를 측정한 후, 특이 항체들로 SDS-PAGE로 면역 블롯팅을 한다.
After RAW 264.7 is cultured, the medium is separated and subjected to continuous centrifugation. 500 g (15 min), 10,000 g (15 min) and 100,000 g (90 min) for 3 times to form the microbeak pellet. The amount of microbeptide protein was determined by Bradford assay. To determine microbeze concentration, the pelleted microbeques are plated on a sugar density gradient and centrifuged at 150,000 g for 15 hours. Ten fractions are obtained, the density is measured at the refractive index, and then immunoblotting is performed by SDS-PAGE with specific antibodies.

5. 동적광산란법(Dynamic light scattering)5. Dynamic light scattering

분리된 마이크로베지클들을 PBS로 re-suspending 시켜준 후, 입자 크기를 광산란분광광도계 ELS-Z (Otsuka Electronics, Japan)를 이용하여 측정했다. 측정은 20℃에서 5분동안 동적평형을 이룬 후에 이뤄졌다. 데이터는 multiple narrow mode에서 제조업체의 소프트웨어를 이용하여 진행됐다.
The separated microbeads were re-suspended in PBS and the particle size was measured using a light scattering spectrophotometer ELS-Z (Otsuka Electronics, Japan). Measurements were made after dynamic equilibration for 5 minutes at &lt; RTI ID = 0.0 &gt; 20 C. &lt; / RTI &gt; Data was generated using manufacturer's software in multiple narrow mode.

6. 전자현미경 관찰6. Electron microscope observation

음성 염색을 위해 분리된 마이크로베지클들을 PBS로 5배 희석했다. 그 후, 5㎕를 글로방전(Glow-discharged/ Harrick Plasma, U.S)된 탄소 코팅 격자에 3분 동안 공기 중에서 넣은 후, 1% uranyl acetate로 격자 음성 염색을 실시한다(Jung, H. S., et.al., Mol.Biol.Cell: 19; 3234-3242, 2008 참조). 상기 방법을 모든 시료에 적용한다. 면역-전자현미경을 위해서 마이크로베지클을 polyclonal anti-GRS Abs와 6시간 이하로 섞어준 후, 6nm 금색 입자(JIRE, U.K.) 를 입힌 토끼 2차 항체와 결합시킨다. 그 후, 얼음위에 12시간 동안 놓아둔 후, 위에 설명한대로 음성염색을 시킨다. 격자는 120 kV로 작동하는 Technai G2 Spirit Twin TEM(FEI, USA)으로 실험한다. 이미지는 4K x 4K Ultrascan 895 CCD (Gatan, U.S)로 기록했다.
For negative staining, isolated microbeads were diluted 5-fold with PBS. After that, 5 μl was placed in a carbon-coated lattice with glow-discharged / Harrick Plasma (US) for 3 minutes in air, followed by lattice negative staining with 1% uranyl acetate (Jung, HS, et. Mol. Biol . Cell : 19; 3234-3242, 2008). The method is applied to all samples. For immuno-electron microscopy, the microvessel is mixed with polyclonal anti-GRS Abs for less than 6 hours and then bound to the rabbit secondary antibody coated with 6 nm gold particles (JIRE, UK). After that, it is placed on ice for 12 hours, and negative staining is performed as described above. The lattice is tested with a Technai G2 Spirit Twin TEM (FEI, USA) operating at 120 kV. Images were recorded on a 4K x 4K Ultrascan 895 CCD (Gatan, US).

7. 세포 분획7. Cell fraction

세포를 배양한 후, 수득하여 buffer A (25mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA, 0.5mM EGTA, 10mM NaCl)에 넣고 균질화(Dounce homogenizer) 시킨다. 2.5M의 설탕을 함유하는 Buffer A를 상기 균질화 액 부피의 1/10만큼 균질화용액에 넣는다. 그 후, 균질화 용액을 1,000g에서 10분동안 원심분리한다. 펠렛은 50% sucrose 함유 Buffer A와 다시 resuspending 시킨 후, 10,000g에서 5분동안 원심분리한다. 상기 원심분리로 인해, 핵 분획이 분리된다. 상기 단계의 상층액을 15,000g에서 15분동안 원심분리하면, 세포막 분획이 분리된다. 다시 상층액을 100,000g에서 60분동안 원심분리하면, 마이크로솜 분획이 분리된다. 상층액은 세포질 분획이다.
After the cells are cultured, they are obtained and homogenized (Dounce homogenizer) in buffer A (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 10 mM NaCl). Buffer A containing 2.5 M of sugar is put into the homogenization solution by 1/10 of the volume of the homogenization liquid. The homogenization solution is then centrifuged at 1,000 g for 10 minutes. The pellet is resuspended in Buffer A containing 50% sucrose and centrifuged at 10,000 g for 5 minutes. Due to the centrifugation, the nuclear fraction is separated. Centrifugation of the supernatant at 15,000 g for 15 minutes separates the cell membrane fraction. Again centrifuging the supernatant at 100,000 g for 60 minutes separates the microsomal fraction. The supernatant is a cytoplasmic fraction.

8. 면역침전8. Immunoprecipitation

세포를 분해 버퍼(50mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5% Triton X-100, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 10% glycerol and protease inhibitor)에 녹인 후, 분해물을 15,000g, 15분 조건으로 원심분리한다. 단백질 추출물은 항-GRS 항체와 함께 4℃에서 2시간동안 배양한후, protein A agarose를 넣어준다. 분해 버퍼로 3번 세척한 후, 침전물을 녹여 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 후, 단백질을 polyvinylidene fluoride (PVDF) 막으로 옮긴다.
The cells were dissolved in digestion buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.5% Triton X-100, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol and protease inhibitor) Lt; / RTI &gt; Protein extracts are incubated with anti-GRS antibody at 4 ° C for 2 hours, and then protein A agarose is added. After washing three times with dissolution buffer, the precipitate was dissolved and separated by SDS-PAGE. The protein is then transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane.

<실시예 1> &Lt; Example 1 >

GRS(Glycyl-tRNA-synthetase) 분비 경로 탐색GRS (Glycyl-tRNA-synthetase) secretory pathway detection

<1-1> 소포체-골지체 수송경로와 GRS(Glycyl-tRNA-synthetase) 분비와의 관계<1-1> Relationship between ER-Golgi transport pathway and GRS (Glycyl-tRNA-synthetase) secretion

많은 사이토킨들이 분비되는 보편적 경로인 소포체-골지체 경로를 통해 GRS도 분비되는지 조사하기 위해, GRS 단백질 서열을 Signal IP database (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)로 분석한 결과, GRS는 소포체-골지체 시그널 펩티드 서열을 포함하고 있지 않았다. 따라서 소포체-골지체를 거치지 않고 GRS가 분비된다는 것을 추측하였으나, 더 확실히 알아보기 위해, 소포체-골지체 분비 저해제인 Brefeldin A(Sigma, Korea)를 처리하여, GRS 분비 여부를 측정하였다.To investigate the secretion of GRS through the ER-Golgi pathway, which is a common pathway for the secretion of many cytokines, the GRS protein sequence was analyzed by the Signal IP database (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) As a result, GRS did not contain an ER-Golgi signal peptide sequence. Therefore, it was estimated that GRS was secreted without passing through the endoplasmic reticulum-Golgi body. To confirm more clearly, GRF secretion was measured by treating with Brefeldin A (Sigma, Korea) which is an endoplasmic reticulum secretion inhibitor.

RAW 264.7 세포를 10% FBS 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)와 이 배지에서 글루코스(Glucose)를 결핍시킨 배지에서 배양한 후, Brefeldin A, Y27632(Rho-관련 단백질 키나아제(ROCK) 저해제, 세포막 수포 형성을 억제)를 각각 처리한 실험군과 미처리한 실험군을 준비하였다. 각 실험군의 배지 및 세포를 분리하여 10% TCA용액으로 4℃에서 12시간 동안 GRS를 침전시켜, SDS-PAGE 를 실시해보았다. 결과는 [도 1]에 표시하였다.RAW 264.7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS and glucose-deficient medium in this medium, followed by Brefeldin A, Y27632 (Rho-related protein kinase (ROCK) inhibitor, (Inhibition of the formation) were prepared and untreated experimental groups were prepared. The medium and cells of each experimental group were separated and subjected to SDS-PAGE by precipitation of GRS with 10% TCA solution at 4 ° C for 12 hours. The results are shown in Fig.

상기 도 1에서 Brefeldin A 및 Y27632 모두 GRS 분비에 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있고, 이는 GRS가 소포체-골지체 분비경로를 거치지 않는다는 것을 의미한다.
In FIG. 1, it can be seen that Brefeldin A and Y27632 do not affect GRS secretion, which means that GRS does not pass through the ER-Golgi secretory pathway.

<1-2> Probenecid / 아지드화나트륨 처리<1-2> Probenecid / sodium azide treatment

GRS가 어떤 경로를 이용하는지 알아보기 위해, 여러 신호 기작을 차단하는 시약들을 이용했다. 상기 시약에는 Probenecid(ABC 수송체 활성 저해), 아지드화 나트륨(NaN₃/미토콘드리아 호흡 저해) 등을 이용했다.To see how GRS uses the pathway, we used reagents that block several signaling mechanisms. Probenecid (inhibition of ABC transporter activity), sodium azide (NaN ₃ / mitochondrial respiration inhibition) and the like were used as the above reagents.

본 실시예 <1-2>의 실험 방법은 상기 실시예 <1-1>에서의 방법과 동일하고, 시약의 차이만 있다. 실험결과는 [도 2]에 표시하였다. 상기 도 2에서 상기 세 시약들 모두 GRS 분비에는 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다.
The experimental method of this embodiment <1-2> is the same as the method of the above-mentioned example <1-1>, only the difference of the reagents. The experimental results are shown in Fig. In FIG. 2, it can be seen that all of the three reagents do not affect GRS secretion.

<1-3> 마이크로베지클 관련 여부 분석<1-3> Microbegic related analysis

몇몇 특이 사이토킨들은 마이크로베지클을 통해서 분비된다. GRS도 이러한 경로를 이용하는지 분석하기 위해 이오노마이신(Ionomycin), MβCD (Methy-beta-cyclodextrin)을 대식세포에 처리한 후, 글루코스 결핍 배지에서 GRS를 분비하는지 살펴보았다. 이오노마이신은 마이크로베지클의 세포외 방출을 유도하는 물질이고, MβCD는 마이크로베지클을 구성하는 콜레스테롤 합성을 저해하는 물질이다. 배양 후, SDS-PAGE를 실시하였다.Some specific cytokines are secreted through microbeads. To analyze whether GRS also utilizes this pathway, Ionomycin, MβCD (Methy-beta-cyclodextrin) was treated with macrophages and then secreted GRS in glucose-deficient medium. Ionomycin is a substance that induces the extracellular release of microvesicles, and MβCD is a substance that inhibits the synthesis of cholesterol that constitutes a microbeptide. After culturing, SDS-PAGE was performed.

결과는 [도 3]에 기재하였다. 상기 도 3에서 이오노마이신을 첨가했을 때와, MβCD를 첨가하지 않았을 때, GRS가 더 많이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 이는 GRS 분비에 마이크로베지클이 관여되어 있다는 것을 보여준다.The results are shown in Fig. In FIG. 3, it can be seen that more GRS is expressed when ionomycin is added and when MβCD is not added. This shows that microbicycles are involved in GRS secretion.

GRS 분비에 마이크로베지클이 이용되는 것을 더욱 확실히 하기 위해, RAW264.7 세포를 배양한 배지를 2,000g( 10 min ), 10,000g( 15 min ), 100,000g( 120 min ) 로 원심분리 분획을 실시하여 SDS-PAGE를 해 본 결과, 마이크로베지클이 분획되는 100,000g 분획물에 GRS가 존재하는 것을 [도 4]에서 확인할 수 있다.
To further ensure the use of microbicycles for GRS secretion, centrifugation was performed at 2,000 g (10 min), 10,000 g (15 min), and 100,000 g (120 min) in RAW264.7 cell culture medium As a result of SDS-PAGE, the presence of GRS in the 100,000 g fraction in which microbicycle was fractionated can be confirmed in [Fig. 4].

<실시예 2>&Lt; Example 2 >

GRSGRS 가 분비에 사용하는 Secretory 마이크로베지클의Microbesic 특성 파악 Characterization

<2-1> <2-1> GRSGRS 가 이동해가는 On the move 마이크로베지클Micro vizic 관찰 observe

GRS가 라이소좀 또는 MVBs(다포성소체, Multivescular Bodies) 중 어느 기관으로 이동하는지 살펴보았다. 글루코스 결핍 된 배지에서 배양한 RAW 264.7 세포에서 GRS를 타겟팅한 금 입자와 MHC II가 MVBs 내에 있는 것을 초저온 전자 현미경으로 확인했다. 그러나 일반 배지의 경우, MVBs 내에서 발견할 수 없었다. 이는 [도 5]에서 확인할 수 있다.
We examined whether GRS migrates to lysosomal or MVBs (Multivescular Bodies). The presence of GRS-targeted gold particles and MHC II in MVBs in RAW 264.7 cells cultured in glucose-deficient medium was confirmed by cryo-electron microscopy. However, in the case of the general medium, it was not found in the MVBs. This can be confirmed in FIG.

<2-2> 유비퀴틴화로 MVBs로의 함입 여부 확인<2-2> Confirmation of incorporation into MVBs by ubiquitinization

마이크로베지클 연관 단백질들은 ESCRT(Endosomal sorting complex required for transport) 복합체를 통해 MVBs로 흡수된다. ESCRT 복합체는 유비퀴틴화(Ubiquitinated)된 단백질을 선별하여, MVBs로 흡수시킨다. 따라서 글루코스 결핍 시에 GRS-유비퀴틴화가 이루어지는지 여부를 확인해보았다.α-GRS로 GRS를 면역 침전시킨 후, 항-유비퀴틴 항체를 이용한 면역화학적 검출을 통해 유비퀴틴화 여부를 관찰하였다. 유비퀴틴화 된 GRS는 시간이 지남에 따라 증가함을 [도 6]에서 확인할 수 있다.
Microbeptide-associated proteins are absorbed into MVBs through the ESCRT (Endosomal sorting complex required for transport) complex. The ESCRT complexes screen the ubiquitinated proteins and absorb them into MVBs. Therefore, we investigated whether GRS-ubiquitination occurs when glucose deficiency occurs. After immunoprecipitation of GRS with α-GRS, immunohistochemical detection using ubiquitin antibody was performed. The ubiquitinated GRS increases with time (FIG. 6).

<2-3> GRS 분비가 마이크로베지클을 이용하는 것을 확인<2-3> Confirmation that GRS secretion uses microbejecle

글루코스 결핍 배지에서 RAW 264.7을 배양한 후, 배지를 수득하여 설탕밀도기울기로 분획을 해보았다. 결과는 [도 7]에 표시하였다. 상기 도 7에서 GRS가 1.13 - 1.17 g/mL 농도 분획에서 엑소좀 마커이기도 한 HSP70 및 MHC II 와 함께 발견됐다. gp96은 마이크로베지클 관련 단백질 이지만, 소포체-골지체 경로를 통해 분비되는 단백질이다.After RAW 264.7 was cultured in glucose-deficient medium, medium was obtained and fractionated with a sugar density gradient. The results are shown in Fig. In Figure 7, GRS was found with HSP70 and MHC II, which are also exosomal markers in fractions of 1.13-1.17 g / mL. gp96 is a microbeptide-related protein, but is secreted through the endoplasmic reticulum pathway.

또한, 글루코tm 결핍 배지에서 RAW264.7 세포를 배양한 후, 배지로부터 마이크로베지클을 분리하여 평균지름을 광산란분광광도계(Light Scattering Spectrometer)로 측정한 결과, 36.9nm이었다. 이 지름은 엑소좀 사이즈인 30-100 nm 에 속한다(결과 [도 15]에 표시). 또한, 전자현미경으로 상기 마이크로베지클을 관찰한 결과, 20-50 nm 지름의 구상형이었다([도 16] 참조).
Further, RAW264.7 cells were cultured in a glucose-deficient medium, and microvessels were separated from the medium. The average diameter of the RAW264.7 cells was 36.9 nm as measured by a light scattering spectrometer. This diameter belongs to the exosome size of 30-100 nm (the result is shown in Fig. 15). Further, the microbicule was observed with an electron microscope, and it was found to be spherical with a diameter of 20-50 nm (see Fig. 16).

<< 제조예Manufacturing example 1> 1>

GRSGRS 를 함유하는 마이크로베지클(Lt; RTI ID = 0.0 &gt; ( GRSGRS -- enrichedenriched microvesiclemicrovesicle , , GEVGEV )의 제조)

<1-1> 대식세포 배양을 이용한 제조<1-1> Production using macrophage culture

RAW 264.7 세포를 Fas L(10 ng/mL, 4-6시간) 함유 배지, 글루코스 결핍 배지(4시간), Adriamycin 함유 배지(1㎍/mL, 4시간)에서 각각 배양한다. 그 후, 배지를 500g(15분), 10,000g(15분), 100,000g(90분) 3번 원심분리한 후, 펠렛을 수득한다. 이 펠렛이 GRS가 풍부한 마이크로베지클(GRS-enriched microvesicle, GEV)이다. 펠렛 내 마이크로베지클 단백질 양 측정 결과를 [도 12]에 표시하였다. 또한, 펠렛 내 GRS를 면역블롯팅으로 관찰한 결과를 [도 13]에 표시했다.
RAW 264.7 cells are cultured in medium containing Fas L (10 ng / mL, 4-6 hours), glucose-deficient medium (4 hours) and Adriamycin-containing medium (1 μg / mL, 4 hours). Thereafter, the medium was centrifuged three times for 500 g (15 min), 10,000 g (15 min) and 100,000 g (90 min), and pellets were obtained. This pellet is a GRS-enriched microvesicle (GEV). The result of measurement of the amount of microbicule protein in the pellet is shown in Fig. Further, the results of observation of GRS in the pellet by immunoblotting are shown in Fig.

<1-2> 공동배양을 이용한 제조<1-2> Manufacture using co-culture

인간 단핵세포인 U937 세포와 폐암 세포인 H 460 세포를 혈청 결핍 배지에서 12시간동안 공동 배양(Co-cultured)하였다. 배양한 배지를 분리하여, 500g(15분), 10,000g(15분), 100,000g(90분) 으로 3번 원심분리 한 후, GEV가 포함된 pellet을 수득한다. 상기 펠렛에 수득된 면역블롯팅을 해 본 결과, 공동배양한 배지에서만 엑소좀 마커 단백질인 HSP70 및 GRS를 발견할 수 있었다. 상기 결과는 [도 14]에서 확인할 수 있다.Human monocyte U937 cells and lung cancer cells H 460 cells were co-cultured in serum-deficient medium for 12 hours. The cultured medium was separated and centrifuged three times at 500 g (15 min), 10,000 g (15 min) and 100,000 g (90 min) to obtain a pellet containing GEV. As a result of immunoblotting obtained on the pellet, exosomal marker proteins HSP70 and GRS were found only in the co-cultured medium. The above result can be confirmed in [Fig. 14].

상기 제조예 <1-1> 및 <1-2>를 [도 17]에 표시하였다.
The production examples <1-1> and <1-2> are shown in FIG.

<< 실험예Experimental Example 1>  1>

GEVGEV (( GRSGRS -- enrichedenriched microvesiclemicrovesicle )의 항암효과 확인) On the anti-cancer effect

<1-1> <1-1> GEVGEV 의 암세포로의 흡수Of cancer cells

GRS를 포함하는 엑소좀(GEV)를 싸이올-반응 탐침(녹색)으로 레이블링 한 후, H460 세포를 상기 GEV와 3시간 동안 함께 배양한다. GEV가 암세포에 흡수되는지 여부는 실시간 공초점 현미경으로 관찰했다. 핵은 Hoechst(파랑)로 염색했고, 차등간섭대비(DIC) 이미지는 세포 형태를 보여준다. 배양한 지 0시간, 1시간, 3시간 후의 이미지를 [도 8]에 표시했다. 배양한 지 1시간, 3시간 후의 이미지에서 GEV가 H460에 함입된 것을 확인할 수 있다. After labeling the exosomes (GEV) containing GRS with a thiol-reactive probe (green), H460 cells are co-cultured with the GEV for 3 hours. Whether GEV is absorbed into cancer cells was observed with a real-time confocal microscope. The nuclei were stained with Hoechst (blue), and the differential interference contrast (DIC) image shows cell morphology. Images of 0 hours, 1 hour, and 3 hours after incubation were shown in FIG. One hour and three hours after the incubation, the GEV was embedded in H460.

또한, GEV를 처리한 지 10분 후에 H460 세포는 가시화를 위해 고정하고, GEV의 세포 함입 여부를 전자 현미경으로 관찰했다. 그 결과는 [도 9]에 기재하였다. 상기 도 9에서 GEV가 H460 세포막에 융합되어 H460 세포로 함입되는 것을 확인할 수 있다.
In addition, 10 minutes after the treatment of GEV, H460 cells were fixed for visualization, and the presence of GEV cells was observed under an electron microscope. The results are shown in Fig. In FIG. 9, it can be confirmed that the GEV is fused to the H460 cell membrane and incorporated into the H460 cell.

<1-2> <1-2> GEVGEV 의 암세포에 대한 독성 효과Toxic Effects on Cancer Cells

H460, RAW 264.7 세포 각각에 GEV를 24시간 동안 처리한 후, 살아있는 세포를 계수하였다. 그 결과는 [도 10]에 표시했다. 상기 도 10에서 GEV 첨가량에 비례하여 암세포 생존률이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 반면, 대식세포의 생존률에는 크게 영향을 주지 않는다.H460, and RAW 264.7 cells were treated with GEV for 24 hours, and then living cells were counted. The results are shown in Fig. In FIG. 10, it can be seen that cancer cell survival rate decreases in proportion to the amount of GEV added. On the other hand, there is no significant effect on the survival rate of macrophages.

또한, GEV가 암세포인 H460에 세포사멸을 유도하는지 Tunnel assay로 측정하였고, 공초점 현미경으로 가시화하여 [도 11]에 표시했다. 상기 도 11에서 GEV를 처리안한 대조군은 세포가 멀쩡하지만, GEV를 처리한 실험군은 매우 높은 세포사멸률을 보임을 확인할 수 있다.
In addition, whether GEV induces apoptosis in cancer cell H460 was measured by the Tunnel assay, visualized by confocal microscopy, and shown in FIG. In FIG. 11, it can be seen that the control group without GEV treatment had a high cell death rate, but the experimental group treated with GEV showed very high cell death rate.

본 발명은 GRS를 포함하는 마이크로베지클을 제공하고, 상기 마이크로베지클은 암을 치료하는 효능이 있는 바, GRS를 포함하는 마이크로베지클을 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제조할 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 높다.The present invention provides a microbicide containing GRS, which is effective for treating cancer, and is capable of producing a pharmaceutical composition for treating cancer comprising microbicycles containing GRS as an active ingredient The possibility of industrial use is high.

Claims (8)

(a) 면역 세포에 세포사멸 스트레스를 주는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 글라이실 티알엔에이 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase, GRS)를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법.
(a) subjecting immune cells to apoptosis stress; And
(b) collecting microvessels secreted from the immune cells of step (a). 2. The method of claim 1, wherein the Glycyl-tRNA synthetase is GRS.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 세포사멸 스트레스를 주는 방법은 산소 결핍, 글루코스 결핍, 파스 리간드(Fas Ligand) 처리, 종양괴사인자(Tumor necrosis facto, TNF)-α 처리, 종양괴사인자-β 처리, 종양괴사인자 관련 세포자살 유도성 리간드(TRAIL, TNF-related apoptosis inducing ligand) 처리, 퍼포린(Perforin) 처리, 백스(Bax) 단백질 처리, 백(Bak) 단백질 처리 및 아드리아마이신(Adriamycin) 처리로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법인 것을 특징으로 하는 GRS를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the step (a) is carried out using oxygen deficiency, glucose deficiency, Fas ligand treatment, Tumor necrosis facto (TNF) apoptosis inducing ligand (TRAIL), perforin treatment, Bax protein treatment, Bak protein treatment, and adriamycin (TRAIL) treatment, tumor necrosis factor- ) Treatment. &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 8. &lt; / RTI &gt;
삭제delete (a) 면역 세포와 암세포를 공동 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 면역 세포에서 분비된 마이크로베지클을 수집하는 단계를 포함하는 GRS를 포함하는 마이크로베지클의 제조방법.
(a) co-culturing an immune cell and a cancer cell; And
(b) collecting the microvesicles secreted from the immune cells of step (a).
삭제delete 제1항, 제2항 및 제4항 중에서 선택되는 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 GRS를 포함하는 마이크로베지클.
A microvessel comprising GRS produced by the method of any one of claims 1, 2, and 4.
제6항의 마이크로베지클을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the microbicide of claim 6 as an active ingredient.
제7항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.The method of claim 7, wherein the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, colorectal cancer, lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, Endometrioid cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, pituitary cancer, soft tissue sarcoma, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, A group consisting of cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, renal cancer, ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary adenoma Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

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