KR101577061B1 - 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 신규 활성 및 이의 용도 - Google Patents

슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 신규 활성 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 티오레독신 환원효소, 페록시다아제, 및 샤페론의 활성을 갖는, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래된 AhpF 단백질, 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 슈도모나스 애루지노사의 AhpF의 새로운 활성을 이용하여, 산화적 스트레스 또는 열 스트레스 등의 다양한 환경스트레스에 대해 강한 내성을 가진 식물체를 제조할 수 있어, 농작물의 생산성 증대 및 유용성분의 대량 생산에 기여할 수 있으며, 고온과 건조 저항성 형질전환 식물체 개발로 사막화와 환경오염을 방지할 수 있다.

Description

슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 신규 활성 및 이의 용도{New activities of AhpF of Pseudomonas aeruginosa and the use thereof}
본 발명은 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase; TR), 티오레독신(thioredxoin; Trx), 퍼옥시데이즈(peroxidase; Prx), 및 샤페론(chaperone)의 활성을 갖는, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래된 AhpF 단백질, 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명에서는 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질이 종래에 알려진 티오레독신 환원효소의 기능 이외에 퍼옥시데이즈, 및 샤페론의 활성을 가지는 것을 새롭게 입증함으로써, 이러한 새로운 활성을 이용하여 상기 AhpF 단백질을 암호화하는 유전자를 생물체에 도입하는 것에 의해 제조되는 환경 스트레스에 내성을 가지는 생물체 및 제조방법에 관한 것이다.
활성산소종(ROS)은 호기성 대사 과정이나 생물개체가 다양한 스트레스 조건에 노출되었을때 발생되어진다(Finkel T., Curr. Opin. Cell Biol. 15: 247-254, 2003). 이러한 활성산소종은 생물적 거대분자(단백질, 지질, 핵산 등)의 산화적 기능저해나 구조변화 등의 심각한 피해를 주게 되고 많은 질병의 원인이 된다 (Neumann et al., Nature, 424: 561-565, 2003). 모든 호기성 생물체들은 산화적 스트레스나 활성산소종에 의해 매개되어지는 단백질의 변성(denaturation)과 이러한 변성으로부터 유도되는 단백질들의 응집(aggregation)으로부터 자신들을 보호하기 위해 다양한 항산화 단백질들과 더불어서 열충격 단백질과 같은 다양한 형태의 분자적 샤페론을 가지고 있다. 이 중 대표적인 그람 음성균이며, 원내 감염(nosocomial infections)을 통해 발견되는 기회감염성 질병균(opportunistic human pathogen)인 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)는 활성 산소종에 대한 강력한 방어 메카니즘을 가지고 있다. 구체적인 방어 메카니즘으로 2개의 SOD(superoxide dismutase), 3개의 CAT(catalase), 및 4개의 Ahp 환원효소 (reductase)를 가지는 것을 들 수 있다.
한편, 상기 Ahp 환원효소 시스템은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 이외에도 많은 미생물에서 산화적 스트레스 등에 대한 방어 시스템으로 작용하는 것으로 보고되었다. Ahp 환원효소 시스템은 유기과산화물 또는 하이드로과산화물의 NAD(P)H 의존적 환원을 촉매화함으로써 생물체 내에서 유해한 활성산소종을 제거하는 기능을 한다. Ahp 환원효소 시스템은 일반적으로 AhpF-AhpC로 구성되어 있으며, 이들 구성 중 AhpF(alkyl hydroperoxide reductase subunit F)는 1566bp의 폴리뉴클레오티드, 521개의 아미노산으로 이루어져 있고, 약 56kDa의 분자량을 가지는 것으로 보고되었다.
종래 대장균(E. coli )이나 살모넬라(Salmonella typhimurium) 등에서 보고되었던 Ahp 환원 효소 시스템에서의 AhpC와 AhpF는 하기 그림과 같이 각각 분리된 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
Figure 112013085217719-pat00001
즉, 대장균이나 살모넬라 등의 일반적인 AhpF는 NAD(P)H에 전자를 받아서 AhpC에 전자를 전달해주는 환원효소로 작용하며, AhpC는 과산화수소(H2O2)를 제거하는 퍼옥시데이즈(peroxidase)역할을 수행한다. 따라서 활성산소종을 효과적으로 제거하기 위해서는 AhpF와 AhpC가 모두 필요한 것으로 알려져 왔었다.
그러나 본 발명자들은 슈도모나스 애루지노사의 AhpF가 종래 미생물의 일반적인 AhpF의 기능으로 알려져 있던 리덕테이즈 활성 뿐 만 아니라, AhpC의 활성으로 알려져 있었던 퍼옥시데이즈 활성 및 샤페론(chaperone) 활성 등을 모두 가지고 있어, 하나의 AhpF 단백질이 다양한 기능을 한다는 것을 최초로 입증하고, 또한 이러한 AhpF 단백질의 활성이 구조 의존적임을 확인하고서 본 발명을 완성하게 되었다.
Derek Parsonage et al., Substrate specificity and redox potential of AhpC, a bacterial peroxiredoxin, PNAS, June 17, 2008, vol. 105, no. 24, 8209-8214.
본 발명의 일 목적은 티오레독신 환원효소, 퍼옥시데이즈 및 샤페론 활성을 가지는 AhpF 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질의 티오레독신 환원효소 활성이 증가된 변이체, 및 샤페론 활성이 증가된 상기 AhpF의 고분자성 결합체, 그리고 페록시다아제의 활성이 증가된 AhpF의 저분자성 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 생물체의 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물 및 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 환경 스트레스 저항성을 가지는 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 티오레독신 환원효소(thioredoxin reductase; TR), 티오레독신(thioredxoin; Trx), 퍼옥시데이즈(peroxidase; Prx), 및 샤페론(chaperone)의 활성을 모두 가지는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질을 제공한다.
본 발명의 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 목적을 해결하기 위해 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 342의 시스테인(cysteine)이 세린(serine) 또는 알라닌(alanine)으로 치환된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 AhpF 단백질의 고분자성 결합체 및 저분자성 결합체를 제공한다. 상기 AhpF 단백질의 고분자성 결합체는 샤페론의 활성이 증가되며, 분자량이 적어도 500-2000kDa을 가지는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 AhpF 단백질의 저분자성 결합체는 페록시다아제의 활성이 증가되며, 분자량이 적어도 100-250kDa을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 생물체의 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환 된 아그로박테리움(Agrobacterium)속 미생물을 제공하며, 본 발명의 상기 AhpF 단백질이 과량으로 발현되어 환경 스트레스 저항성을 가지는 형질전환된 식물체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 저항성을 가지는 식물체의 제조방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한 반복적인 설명인 경우에는 생략한다.
본 발명의 일 양상은 티오레독신 환원효소, 티오레독신, 페록시다아제 및 샤페론 활성을 모두 가지는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질에 관한 것이다. 상기 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 AhpF 단백질의 아미노산이 일부 변형, 손실되었다고 하더라도, 본 발명과 같이 티오레독신 환원효소, 퍼옥시데이즈 및 샤페론 활성을 모두 가지며, 통상의 기술자가 용이하게 도출할 수 있는 90% 이상의 상동성을 가지는 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질들은 본 발명의 범위에 모두 포함된다.
종래 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질은 티오레독신 환원효소(TR) 및 티오레독신(Trx)의 활성만을 가지는 것으로 알려져 있었으나, 본 발명은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질이 TR 및 Trx의 활성 뿐 만 아니라, 서로 구별되는 기능으로 알려져 있었던, AhpC의 퍼옥시데이즈 및 샤페론의 활성 또한 가지는 것을 최초로 규명하였다(도 1 참조). 본 발명의 일 실시예에서 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질이 티오레독신 환원효소, 티오레독신 퍼옥시데이즈, 및 샤페론의 홀데이즈(Holdase), 및 폴데이즈(Foldase)의 기능을 모두 가지는 것을 확인하였다(도 2 내지 도 5 참조).
퍼옥시데이즈 활성(Peroxidase activity)은 NADPH가 NADP+로 전환되면서 전자(H+)를 티오레독신 환원효소(TR)에 전달하고, 상기 TR은 다시 티오레독신(Trx)에게로 전자를 전달하면서 산화되고, 상기 TR로부터 전자를 받고 환원된 Trx은 Prx에 전자를 전달하고 Trx는 산화되며, 환원된 Prx는 H2O2를 O2 + H2O로 분해하는 과정을 의미한다.
또한 샤페론(chaperone)은 단백질의 접힘(folding)에 관여하는 단백질로 일례로 단백질이 열 충격(heat shock)과 같은 스트레스를 받게 되면 단백질은 제대로 접혀있던 3차원 구조가 풀리게 되어 자신의 역할을 정상적으로 수행할 수 없게 되는데, 샤페론 (chaperone)이라 명명된 그룹의 단백질들은 이렇게 풀려진 단백질들은 인식하고 결합해서 단백질의 변성을 방지하거나 이들이 다시 제대로 접힐 수 있는 좋은 환경을 만들어주는 역할을 하는 단백질을 의미한다. 분자적 샤페론 활성(molecular chaperone activity)은 홀데이즈(holdase)와 폴데이즈(foldase) 활성으로 구별한다. 홀데이즈(Holdase)는 예를 들어, 단백질이 스트레스(산화적 스트레스, 열 스트레스)에 노출되면 변성(denaturation)되어 접혀 있든 3차 구조가 일부 풀어지게 되고, 소수성의 아미노산 잔기들이 노출되어지게 되며, 이러한 과정이 심화되면 변성된 단백질들이 불규칙적으로 뭉쳐 결합체(aggregates)로 변하게 되어 단백질 분해효소(protease)에 의해 분해되어 없어지게 될 때, 샤페론 단백질(sHSPs, DnaJ)이 스트레스에 의해 일부 풀어진 단백질의 소수성 아미노산에 결합하여 결합체로 진행되는 것을 방지하고, 다시 원래의 3차원 구조로 돌아 갈 수 있는 환경을 조성하는 기능을 말한다. 폴데이즈(Foldase)는 예를 들어, 새로운 단백질이 mRNA를 주형으로 리보좀(ribosome) 단백질에 의해 합성되면, 원래 정해진 3차원 구조로 단백질이 접힘(folding)을 형성하는데, 이때 샤페론 단백질(GroEL/ES, DnaK/J/E)이 새로이 신장된 아미노산 사슬이나 변성된 단백질에 결합하여 정확한 3차원 구조로 접혀지도록 환경을 조성하고, 돕는 기능을 말한다.
본 발명의 다른 양상은 상기 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 고분자성 결합체 및 저분자성 결합체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질은 다양한 분자량을 가지는 호모-올리고머릭 복합체(homo-oligomeric complex)의 구조를 가지는데, 고분자성 결합체(High molecular weight, HMW)에서 샤페론의 기능이 우세하게 나타난다. 특히 샤페론의 활성이 증가함을 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서, 열 충격(heat shock)을 주었을 때, 고분자성 결합체로 구조가 변화하며, 샤페론의 기능 중 홀데이즈의 활성이 증가하는 것을 확인하였다(도 8 및 도 10 참조). 또한 본 발명의 AhpF는 저분자성 결합체(Low molecular weight, LMW)에서 퍼옥시데이즈 활성이 우세하게 나타난다. 상기 AhpF 단백질의 고분자성 결합체는 분자량이 적어도 500-2000kDa인 것을 특징으로 한다. 즉 상기 고분자성 결합체는 AhpF 단백질의 단량체가 최소 4량체(decamer) 보다 큰 구조를 가지는 것으로 밝혀졌다. 상기 고분자성 결합체의 분자량은 바람직하게는 최소 500-2000kDa일 수 있다.
또한 상기 AhpF 단백질의 저분자성 결합체는 분자량이 적어도 100-250kDa(2량체-4량체)인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 AhpF 단백질의 구조분석을 위한 일 실시예에서, 고온의 스트레스를 가하지 않았을 때, 가장 일반적인 구조는 4량체(tetramer)이다.
본 발명의 또 다른 양상은 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 변이체에 관한 것이다. 상기 AhpF 단백질의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 342번째 위치의 아미노산인 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 AhpF 단백질은 아미노 말단에 Trx 도메인을 포함하고 있으며, 카르복시기 말단에는 TR 도메인을 포함하고 있다(도 11 참조). 상기 342번째 위치의 시스테인은 TR 도메인에 포함되는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 AhpF 단백질의 변이체가 야생형에 비해서 티오레독신 환원효소의 활성이 약 2배 이상으로 높은 것으로 나타났다. 또한 TR 도메인 내의 다른 시스테인인 344 위치 또는 347 위치의 시스테인을 세린으로 치환시켰을 때, 오히려 TR 의 활성을 거의 보이지 않았다.
본 발명은 상기 슈도모나스 애루지노사에서 유래되는 AhpF 단백질이 본래 알려진 환원효소 기능뿐만 아니라, 퍼록시데이즈 및 샤페론의 기능을 수행한다는 새로운 사실을 밝혀냄에 따라, 이러한 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 특성의 응용에 관한 것이다.
상기 AhpF 단백질의 특성의 응용과 관련된 본 발명의 또 다른 양상은 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 생물체의 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물에 있어서, 상기 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 벡터로 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 알려진 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 pCAMBIA 벡터를 사용할 수 있다. 또한 상기 벡터는 도입된 AhpF의 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 프로모터 및 선별 표지 유전자를 포함할 수 있다. 상기 AhpF의 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 프로모터는 AhpF를 발현, 또는 발현이 증가될 수 있도록 한다. 상기 벡터에 도입되는 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 AhpF 단백질 또는 본 발명의 서열번호 1에서 342번째 위치의 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 변이된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 서열번호 1로 이루어진 AhpF 단백질은 티오레독신 환원효소, 티오레독신, 페록시다아제, 및 샤페론의 활성을 모두 가지고 있으므로, 생물체의 환경 스트레스에 대해 우수한 저항성을 나타낼 수 있다. 또한 서열번호 1에서 342번째 위치의 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 변이된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질은 티오레독신 환원효소의 활성이 야생형보다 2배 이상 증가하므로, 더욱 생물체가 환경 스트레스의 저항성을 가질 수 있게 한다. 뿐만 아니라 본 발명에 다른 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 고분자성 결합체에서는 샤페론 기능이 우세하게 나타나기 때문에, 이러한 특성을 이용하여, 생물체의 다양한 환경스트레스(열충격, 산화적 스트레스, 병원균 등) 저항성 증가에 유용하게 이용할 수 있도록 하는 것이다.
또한 본 발명은 상기 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환 된 아그로박테리움 속 미생물에 관한 것이다. 상기 AhpF의 유전자가 도입된 재조합 벡터를 아그로박테리움 속 미생물에 도입하여 AhpF 단백질을 발현할 수 있도록 아그로박테리움 속 미생물이 형질전환 된다. 상기 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 AhpF 단백질이거나, 또는 본 발명의 서열번호 1에서 342번째 위치의 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 변이된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질일 수 있다. 상기 아그로박테리움 속 미생물은 바람직하게는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumerfaciens)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 또한 아그로박테리움속 미생물 뿐만 아니라, 식물체를 형질전환시킬 수 있는 미생물을 모두 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 또 다른 양상은 상기 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질이 과량으로 발현되어 환경 스트레스 저항성을 가지도록 형질전환 된 식물체에 관한 것이다. 상기 식물체는 쌍자엽 식물, 또는 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 애기장대(Arabidopsis thaliana), 배추(Brassica rapa), 또는 벼(Oryza sativa)일 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 AhpF 단백질이 과량으로 발현될 수 있도록 형질전환 가능한 식물체는 모두 본 발명에 포함된다. 상기 식물체에 과량 발현되는 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 AhpF 단백질이거나, 또는 본 발명의 서열번호 1에서 342번째 위치의 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 변이된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질일 수 있다.
또한 상기 형질전환 가능한 식물체는 본 발명의 AhpF 단백질을 발현하는 아그로박테리움속 미생물이 식물 세포주에 도입되어 생성된 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제조합 벡터를 식물체에 형질전환 시키는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 저항성을 가지는 식물체에 제조방법에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터에 포함되는 슈도모나스 애루지노사 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 이루어진 AhpF 단백질 또는 본 발명의 서열번호 1에서 342번째 위치의 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 변이된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 암호화하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 식물체의 형질전환은 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985)에 예시된 방법을 사용할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하고, 이를 식물체에 형질전환시키는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 아그로박테리움 투머파시엔스 이외에 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등, 식물체를 형질전환시킬 수 있는 바람직한 미생물들은 모두 사용가능하다.
본 발명에 따르면 슈도모나스 애루지노사의 AhpF의 새로운 활성을 이용하여, 산화적 스트레스 또는 열 스트레스 등의 다양한 환경스트레스에 대해 강한 내성을 가진 식물체를 제조할 수 있어, 농작물의 생산성 증대 및 유용성분의 대량 생산에 기여할 수 있다. 또한 지구 온난화로 인한 기상이면, 가뭄, 건조 등의 심각한 환경변화에도 적응 가능한 식물체 개발에 매우 유용하게 활용할 수 있어, 고온과 건조 저항성 형질전환 식물체 개발로 사막화와 환경오염을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 유용작물에 도입함으로서 인류의 식량난 해결에도 도움을 줄 수 있다.
도 1은 본 발명의 슈도모나스 애루지노사((Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF(PaAhpF)의 활성을 종래 대장균이나 살모넬라에서 알려진 AhpF와 AhpC의 활성과 비교해서 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 AhpF의 농도에 따른 퍼록시데이즈(peroxidase) 활성을 나타낸 것이다.
도 3은 슈도모나스 애루지노사의 AhpF와 AhpC의 퍼록시데이즈(peroxidase) 활성의 영향력을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 AhpF의 농도에 따른 샤페론의 (a) 홀데이즈(Holdase) 및 (b) 폴데이즈(Foldase)의 활성을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 AhpF의 (a) TR(Thioredoxin reductase) 및 (b) Trx(Thioredoxin)의 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 AhpF 단백질의 구조를 보여주는 모식도이며, 본 발명의 각 말단에 포함된 아미노산들의 변이체 제조를 위한 클로닝 방법을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 AhpF가 고분자성 결합체 및 저분자성 결합체의 구조체 형성에 따른 AhpF의 기능 전환을 설명하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 AhpF의 구조를 분석하기 위해, 슈도모나스 애루지노사의 AhpF의 재조합 단백질을 발현시켜 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 정제한 결과를 나타낸 그래프(a) 및, FPLC의 각 피크의 분획을 native-PAGE로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 AhpF의 고분자성 결합체(HMW) 및 저분자성 결합체(LMW)의 구조에 따른 퍼록시데이즈 활성(a) 및 샤페론의 Holdase의 활성(b) 결과를 나타낸다.
도 10은 AhpF 단백질에 각각의 열 충격이 가해졌을 때, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용한 정제 결과를 나타내는 것으로, 열 충격(heat shock)에 따른 AhpF 구조적 전환이 있음을 보여준다.
도 11은 본 발명의 AhpF의 구조 및 제작된 변이체를 나타낸다. 도 11에서 AhpF(PA)는 본 발명의 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 를 의미하며, AhpF(PP)는 수도모나스 퓨티타(Pseudomonas putida)를 의미한다.
도 12는 본 발명의 AhpF의 342번 위치의 시스테인에서의 변이체가 TR 활성이 야생형에 비해 2배 이상 증가하였음을 보여주는 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 AhpF 단백질이 과량 발현되도록 형질전환 된 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 열저항성을 가지는 것을 보여주는 사진으로, AhpF 유전자를 포함한 벡터로 형질전환 된 애기장대의 T3 세대 및 야생형을 2시간 동안 고온(42℃) 처리한 후 7일이 지난 상태를 보여주는 사진이다.
도 14는 야생형 애기장대 및 본 발명의 AhpF이 과량 발현되도록 형질전환 된 애기장대를 4일 동안 37℃로 스트레스를 준 후, 상기 형질전환된 애기장대가 저항성을 가지는지를 나타내는 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예들에 한정되지 않는다.
< 실시예 1> 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 유전자 클로닝
PaAhpF 유전자는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) PAO1의 게놈 DNA로부터 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 클로닝 벡터(cloning vector)인 pGEM T-easy 벡터에 클로닝 하였고, 염기서열 분석(Sequencing analysis)을 이용하여 유전자를 확인하였다. PaAhpF 유전자의 클로닝을 위해 하기와 같은 조건에서 PCR을 수행하였다. 게놈 DNA 10 ng, dNTP 0.2 μM, 정방향 프라이머 20 pmol, 역박향 프라이머 20 pmol, Taq 폴리머레이스 1 유닛(unit) 및 증류수 20 μl의 혼합물을, 1 사이클(cycle)의 전변성(94℃, 1분), 35 사이클의 변성(94℃, 30초), 어닐링(50℃, 45초), 연장(72℃, 45초), 및 1 사이클의 연장(72℃, 10분)으로 반응시켰다. 이때, 상기 정방향 프라이머는 PaAhpF-F(NdeI) 5`-AAGCTCATATGTTGGACGCCAATC-3` (서열번호 2)이었고, 상기 역방향 프라이머는 PaAhpF-R(BamH1) 5`-GGGATCCTCACTCCGGCGCG-3`(서열번호 3)이었다.
< 실시예 2> 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 분리 및 정제
AhpF 단백질을 분리 정제하기 위하여 상기 <실시예 1>에서 pGEM T- easy 벡터에 클로닝 된 PaAhpF 유전자를 발현 벡터인 pET28a 벡터에 제한효소 자리를 이용하여 서브-클로닝(sub-cloning) 하였다. 염기서열 분석을 통해 pET28a::PaAhpF 서브-클로닝을 확인하였다. PaAhpF 단백질을 pET28a 벡터에 있는 T7 프로모터 시스템(promoter system)을 이용하여 대장균(BL21 (DE3))에서 0.2 mM IPTG를 첨가하여 과발현시켰다. 6개의 히스티딘(histidine)이 붙여진 과다 발현된 PaAhpF 단백질을 Ni-NTA-킬레이트 레진(chelate resin)을 이용하여 순수분리하였다.
단백질의 정제과정은 다음과 같이 수행하였다: 500 ml의 LB가 들어 있는 2 L 삼각 플라스크에 1/100 종균 배양(pET28a::PaAhpF in BL21(DE3))을 접종한 후, 30℃에서 120rpm으로 배양하였다. 600nm 흡광도에서 0.5까지 배양한 후 최종 0.2 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 120 rpm으로 4시간 동안 PaAhpF 단백질의 발현을 유도하였다. 원심분리(6000 rpm, 10분, 4℃)하여 세포를 채취하고, PBS 버퍼(137 mM NaCl, 27 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)를 이용하여 세포를 용해하였다. 초음파 파쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 분해시키고, 상기 용해물을 원심분리(15000 rpm, 40분, 4℃)하여 상등액만을 분리하였다. 친화력 크로마토그래피(Affinity chromatography)법으로 미리 평형화시킨 NTA-킬레이트 레진(chelate resin)에 세포 용해물을 첨가하여 레진에 히스티딘(histidine)이 붙여진 과다 발현된 PaAhpF 단백질 결합시킨 후 트롬빈(Thrombin) 처리하여 PaAhpF 단백질을 순수분리 하였다. 순수분리 된 단백질을 막 튜브(membrane tube)에 옮긴 후, 1 L의 50 mM HEPES(pH8.0) 버퍼로 3회 반복 투석(dialysis)하여 냉동보관하였다. 이렇게 분리 정제된 단백질을 가지고 효소의 활성을 분석하였다.
< 실시예 3> 본 발명의 AhpF 단백질의 효소적 기능 분석
<3-1> 퍼옥시데이즈 ( Peroxidase ) 활성 측정
퍼옥시데이즈(Peroxidase) 활성을 측정하기 위하여 Ahp 환원 효소 시스템을 이용하였다. 과산화수소(H2O2)의 소거는 간접적으로 NADH가 NAD+로 산화되는 정도를 340nm에서 흡광도 변화로 측정하였다. 총 500 μl의 반응액(0.3 mM NADH, PaAhpF(1~4 μM), PaAhpC(1~4 μM), 1 mM H2O2)을 10분 동안 340nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
<3-2> 티오레독신 리덕테이즈 ( TR ) 활성측정
티오레독신 환원효소(TR) 활성을 측정하기 위하여 DTNB(Di-thio-bisnitrobenzoic acid)의 환원을 이용하였다. 구체적으로 티오레독신 환원효소(TR) 활성측정은 먼저 대조군으로 AhpF가 없는 상태에서 흡광도 412nm에서 DTNB가 환원되어 2분자의 TNB(2-nitro thiobenzoate anion)가 되는 환원율을 측정하였다. 총 500 μl의 반응액(50 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), 2 mM EDTA, 5 mM DTNB, 0.3 mM NADH, AhpF (0.1~1μM)을 5분 동안 412 nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. 효모의 티오레독신 환원효소(yeast Thioredoxin Reductase (yTR))는 양성 대조구로 사용하였다.
<3-3> 티오레독신(Trx) 활성측정
티오레독신(Trx) 활성을 측정하기 위하여 인슐린 환원(Insulin reductase)을 이용하였다. 일반적으로 인슐린(Insulin)은 α 와 β체인이 이황화결합(Disulfide bond)에 의해서 결합한 형태로 존재하고 있는데 티오레독신(Trx)가 이황화결합을 환원시킬 경우 β체인이 변성되어 응집체로 변하게 된다. 이러한 응집체가 형성되는 정도를 650 nm 에서 흡광도를 측정하여 알아보았다. 총 500 μl의 반응액(100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), 2 mM EDTA, 500 μg insulin, 2 mM DTT, PaPrx(1~10 μM))을 30분 동안 650nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
<3-4> 분자샤페론 ( Molecular chaperone ) 활성 측정
분자샤페론 (Molecular chaperone) 활성측정은 일반적으로 홀데이즈(holdase)와 폴데이즈(foldase)활성으로 구분되는데, 본 실험에서는 이 두 가지 활성분석을 모두 수행하였다. 먼저 홀데이즈(holdase) 활성분석은 열(Heat) 스트레스에 민감한 말산 탈수소효소 (malate dehydrogenase, MDH)를 43℃로 가열하게 되면 변성이 일어나 MDH의 응집(aggregation)이 일어나 흡광도가 증가하게 된다. 그러나 분자 샤페론 (Molecular chaperone) 활성을 가지는 단백질과 공존하는 상태에서는 MDH가 변성되는 되는 것을 막아 응집체 형성이 억제되어 흡광도가 증가하지 않는다. 이러한 원리를 이용하여 본 실험에서는 총 반응액(50 mM Hepes buffer (pH 7.5), 52 μg MDH, 다양한 농도의 PaAhpF)을 15분 동안 340nm에서 흡광도 변화를 측정하였다.
폴데이즈(foldase) 활성측정은 Glucose-6-phosphate dehydogenase(G6PDH)단백질을 guanidine-HCl을 처리하여 변성시킨 다음 회복되는 G6PDH활성을 측정하였다. 총 반응액 다시 refolding 되는 정도를 측정하였다. 구체적으로 40 μM G6PDH를 변성 버퍼 조건(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 4 M guanidine-HCl)에서 2시간 30분 동안 실온에서 화학적 변성을 시키고 난 후 재생(renaturation) 버퍼(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 다양한 농도의 AhpF 단백질 또는 GroEL 단백질, 10 mM ATP, 10 mM KCl, 2.5 mM MgCl2)에서 50배 희석을 한 다음 6시간, 12시간, 24시간 동안 반응 시킨 후 재생된 G6PDH의 활성을 측정하였다. 구체적으로 총 500 μl의 반응액(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM NADP, 2 mM glucose-6-phosphate(Glucose-6-P), 4 nM 재생된 G6PDH)에서 5분 동안 생성된 NADPH를 흡광도 340nm에서 측정하여 계산하였다. GroEL은 양성대조구로 이용하였다.
Figure 112013085217719-pat00002

AhpF의 효소적 활성의 분석 결과, 도 2 내지 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 슈도모나스 애루지노사의 AhpF가 티오레독신 환원효소, 티오레독신, 페록시다아제 및 샤페론 활성을 모두 가지는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4> 본 발명의 AhpF 단백질의 구조적 변화 및 이에 따른 활성 분석
AhpF의 단백질 구조를 분석하기 위해, 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography; SEC)를 수행하였다. 구체적으로 FPLC(Amersham Biosciences; AKTA)를 이용하여 일정한 속도로(0.5 ml/min) AhpF 단백질과 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 Superdex 200 10/300 GL column에 통과시키고 각각의 시간별로 0.5 ml씩 column을 통과한 완충용액과 AhpF 단백질을 받았다. 그리고 흡광도 280nm에서 검출된 단백질 peak에 따라 크게 3그룹(F1, F2, F3)으로 나누어 분획하였다. 각 각의 분획 단백질들은 단백질 활성 검증을 위하여 농축하였다.
< 실시예 5> AhpF 단백질의 변이체 제조 및 이들의 활성 분석
AhpF 단백질의 TR 도메인(AhpF_C), Trx 도메인(AhpF_N) 가지는 돌연변이 및 활성 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 다양한 돌연변이체(C128S, C131S, C342S, C344S, C347S, C342A, C128/131S, C342/344/347S, All C to S_AhpF)를 도 6, 및 도 11과 같이 제작하였다. 이 돌연변이체를 <실시예 2>에서처럼 각각의 단백질을 친화력 크로마토그래피 방법을 통하여 순수분리 하였고 <실시예 3>의 방법과 동일하게 각 효소의 활성을 측정하였다.
그 결과, 다른 돌연변이체들은 야생형보다 TR의 활성이 줄었지만, C342S 및 C342A 돌연변이체는 야생형보다 TR의 활성이 두배이상 증가하였다.(도 12 참조)
< 실시예 6> AhpF 의 유전자가 도입된 재조합 벡터로 형질전환 된 애기장대 제조 및 열 충격에 대한 저항성 확인
PaAhpF가 과발현 되는 형질전환 애기장대(Arabidopsis thaliana)제작을 위하여, PaAhpF 유전자를 형질전환 벡터인 pCAMBIA1302 벡터에 construction(pCAMBIA1302 :: PaAhpF) 하였고 이 construct를 아그로박테리움에 형질전환시킨 다음 애기장대로 형질전환 시켰다. 형질전환체 확인을 위하여 하이그로마이신 선택배지에서 저항성을 가지는 형질전환체를 선발하였고, 반복적 선별을 통하여 3세대 형질전환체(T3)를 확보하였다. 또한 western blotting 실험을 통하여 T3 형질전환체에서 과발현된 PaAhpF 단백질을 확인 하였다.
선별된 PaAhpF 과발현 형질전환 애기장대의 열 충격 저항성은 배지와 토양에서 검증하였다. 배지에서의 열 충격 저항성 실험은 22℃에서 10일 키운 애기장대를 42℃에서 2시간 열 충격을 준 후 다시 22℃에서 3~7일 동안 회복을 관찰하였다. 토양에서의 열 충격 저항성 실험은 22℃에서 3주 키운 애기장대를 37℃에서 4일간 열 충격을 준 후 다시 22℃에서 5일 동안 회복을 관찰하였다. PaAhpF가 과발현 된 형질전환 식물체는 배지 뿐만아니라 토양에서도 열에 대한 저항성을 나타내었다(도 13, 도 14 참조).
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항에 의해 정해질 것이다.
<110> KOREA ATOMIC ENERGY RESEARCH INSTITUTE <120> New activities of AhpF of Pseudomonas aeruginosa and the use thereof <130> P13060960833 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 521 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Met Leu Asp Ala Asn Leu Lys Thr Gln Leu Lys Ala Tyr Leu Glu Lys 1 5 10 15 Val Ser Gln Pro Phe Glu Ile Val Ala Ser Leu Asp Asp Ser Asp Lys 20 25 30 Ser Arg Glu Leu Leu Gly Leu Leu Gln Asp Ile Val Gly Leu Thr Asp 35 40 45 Lys Ile Thr Leu Lys Thr Asp Gly Ser Asp Ala Arg Lys Pro Ser Phe 50 55 60 Ser Leu Asn Arg Pro Gly Ala Asp Ile Gly Leu Arg Phe Ala Gly Ile 65 70 75 80 Pro Met Gly His Glu Phe Thr Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Gln Val 85 90 95 Gly Gly His Pro Ser Lys Leu Asp Ala Asp Val Ile Glu Gln Val Lys 100 105 110 Gly Ile Glu Gly Thr Phe Glu Phe Glu Thr Tyr Phe Ser Leu Ser Cys 115 120 125 Gln Asn Cys Pro Asp Val Val Gln Ala Leu Asn Leu Met Ala Val Leu 130 135 140 Asn Pro Asn Ile Arg His Val Ala Ile Asp Gly Ala Leu Phe Gln Asp 145 150 155 160 Glu Val Glu Ala Arg Gln Ile Met Ser Val Pro Ser Ile Tyr Leu Asn 165 170 175 Gly Glu Val Phe Gly Gln Gly Arg Met Gly Val Glu Glu Ile Leu Ala 180 185 190 Lys Ile Asp Thr Gly Ala Ala Ala Arg Asp Ala Glu Lys Leu Thr Ala 195 200 205 Arg Asp Ala Phe Asp Val Leu Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ile Tyr Ala Ala Arg Lys Gly Ile Arg Thr Gly Val Ala 225 230 235 240 Ala Glu Arg Phe Gly Gly Gln Val Leu Asp Thr Met Ala Ile Glu Asn 245 250 255 Phe Ile Ser Val Gln Glu Thr Glu Gly Pro Lys Leu Ala Arg Ala Leu 260 265 270 Glu Glu His Val Arg His Tyr Glu Val Asp Ile Met Asn Leu Gln Arg 275 280 285 Ala Ser Lys Leu Val Pro Ala Lys Asn Ala Gly Glu Leu His Glu Val 290 295 300 Arg Phe Glu Ser Gly Gly Ser Leu Lys Ala Lys Thr Leu Ile Leu Ala 305 310 315 320 Thr Gly Ala Arg Trp Arg Glu Met Gly Val Pro Gly Glu Gln Glu Tyr 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Val Cys Phe Cys Pro His Cys Asp Gly Pro Leu Phe 340 345 350 Lys Gly Lys Arg Val Ala Val Ile Gly Gly Gly Asn Ser Gly Val Glu 355 360 365 Ala Ala Ile Asp Leu Ala Gly Ile Val Ala His Val Thr Leu Leu Glu 370 375 380 Phe Asp Ser Lys Leu Arg Ala Asp Ala Val Leu Gln Arg Lys Leu Tyr 385 390 395 400 Ser Leu Pro Asn Val Glu Val Ile Thr Ser Ala Leu Thr Ser Glu Val 405 410 415 Lys Gly Asp Gly Gln Lys Val Thr Gly Leu Val Tyr Lys Asp Arg Asn 420 425 430 Ser Glu Glu Phe Lys Ser Ile Glu Leu Glu Gly Ile Phe Val Gln Ile 435 440 445 Gly Leu Leu Pro Asn Thr Glu Trp Leu Lys Gly Ser Val Glu Leu Ser 450 455 460 Pro Arg Gly Glu Ile Ile Val Asp Ala Arg Gly Glu Thr Ser Leu Pro 465 470 475 480 Gly Ile Phe Ala Ala Gly Asp Val Thr Thr Val Pro Tyr Lys Gln Ile 485 490 495 Val Ile Ala Val Gly Glu Gly Ala Lys Ala Ser Leu Ser Ala Phe Asp 500 505 510 His Leu Ile Arg Thr Ser Ala Pro Glu 515 520 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaAhpF forward primer <400> 2 aagctcatat gttggacgcc aatc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaAhpF reverse primer <400> 3 gggatcctca ctccggcgcg 20

Claims (12)

  1. 티오레독신 환원효소, 티오레독신, 퍼옥시데이즈, 및 샤페론 활성을 가지는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 AhpF 단백질.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 따른 AhpF 단백질의 최소 4량체보다 큰 구조를 갖는 고분자성 호모-올리고머릭 복합체로, 샤페론의 홀데이즈(holdase) 활성이 증가되며, 분자량이 적어도 500-2000kDa인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 고분자성 호모-올리고머릭 복합체.
  4. 제 1항에 따른 AhpF 단백질의 2량체 내지 4량체인 구조를 갖는 저분자성 호모-올리고머릭 복합체로, 퍼옥시데이즈의 활성이 증가되며, 분자량이 적어도 100-250kDa인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 저분자성 호모-올리고머릭 복합체.
  5. 제 1항의 서열번호 1의 아미노산 서열에서 위치 342의 아미노산 시스테인이 세린 또는 알라닌으로 치환된 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질의 변이체.
  6. 제 1항에 따른 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 벡터를 포함하는 생물체의 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 산화적 스트레스 또는 열 스트레스인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1항에 따른 슈도모나스 애루지노사의 AhpF 단백질을 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 미생물.
  9. 제 1항의 AhpF 단백질이 과량으로 발현되어 환경 스트레스 저항성을 가지는 형질전환된 식물체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 배추 또는 벼인 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
  11. 제 1항에 따른 AhpF 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 저항성을 가지는 식물체의 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하고, 이를 식물체에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 환경 스트레스에 저항성을 가지는 식물체의 제조방법.
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