KR101573721B1 - 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이오센서용 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 전자전달매개체로 금속함유 착물과 페나진 유도체를 사용하여 전기화학적 반응 신호를 증폭시킬 수 있으며 산화환원효소 및 조효소와의 높은 반응 안정성을 가지는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.
Description
본 발명은 바이오센서용 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 전자전달매개체로 금속함유 착물과 페나진 유도체를 사용하여 전기화학적 반응 신호를 증폭시킬 수 있으며 산화환원효소 및 조효소와의 높은 반응 안정성을 가지는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.
당뇨관리에 있어 혈당의 주기적인 측정은 매우 중요하다. 최근 정확성과 정밀도가 향상된 자가혈당 측정장치의 사용이 증가하고 있어 개인이 쉽고 빠르게 혈당 관리가 가능하다. 이와 더불어, 최근 제 1형 당뇨병 환자와 고혈당을 가지는 당뇨병 환자들은 주기적으로 혈당을 측정함과 동시에 혈중 케톤체(ketone body)를 측정하여 당뇨병성 케톤산증(Diabetic Ketoacidosis in Dogs and Cats)을 예방하도록 권장하고 있다.
당뇨병성 케톤산증은 인슐린에 대한 저항이나 인슐린 부재로 인해 발생한다. 인슐린이 적으면 포도당이 세포 내로 들어갈 수 없어 혈중에 축적된다. 그 결과 세포는 포도당을 공급받지 못하여 에너지원으로 지방을 사용하게 된다. 지방대사는 지방산과 글리세롤을 만드는데, 글리세롤은 세포에 약간의 에너지를 공급하지만 지방산은 케톤산으로 대사되어 결과적으로 산독증을 일으킨다. 산독증은 세포 안에서 혈관 내로 칼륨 이동을 증가시키게 되고, 이뇨작용에 의하여 과칼륨뇨증을 초래하여 전신의 칼륨 고갈상태를 초래한다.
지방을 연소하는 과정에서 생성되는 케톤체는 β-히드록시부티르산(beta-hydroxybutyrate), 아세토아세트산(acetoacetate) 및 아세톤(acetone)이 있는데, 종래 혈중 케톤체를 측정하는 방식은 뇨의 아세토아세트산(acetoacetate)의 양을 측정하는 방식이 사용되고 있다. 그러나 뇨의 아세토아세트산은 시간이 경과할수록 그 농도가 변하게 되어 샘플 채취 후, 측정 시기에 따라 다른 결과값을 나타낼 수 있는 단점을 가진다.
혈액 중 케토산증의 주요 케톤체인 베타-히드록시부티르산의 경우에는 시간이 경과하여도 농도가 변하지 않아 더 정확한 케토산증의 검사가 가능하다. 따라서 혈액에서 케톤체를 보다 쉽고 빠르게 측정하기 위한 휴대용 바이오센서의 필요성이 증가하고 있다.
이러한 바이오센서의 작동원리는 효소와 조효소, 그리고 전자전달매개체들의 산화-환원 반응에 의해서 작동한다. 케톤체 측정용 바이오센서뿐만 아니라 여러 바이오센서에서 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)가 사용되고 있다. 이러한 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드와 반응하여 신호를 낼 수 있는 전자전달 매개체들로는 페리시아나이드(Fe(CN)6 -), 메틸렌블루(methylene blue), 티오닌(thionine) 등의 몇 가지가 알려져 있는데, 이러한 전자전달 매개체들은 전기화학적인 방법으로 사용하기에는 낮은 신호 크기로 인해 사용에 제한되며, 시간이 지남에 따라 시약이 변질(산화 또는 환원)되거나 원하는 목적물질을 제외한 다른 방해종에 영향을 받는 등 안정성에 있어서 사용이 매우 까다롭다. 일반적으로 산화환원 안정성이 높은 전자전달매개체로 헥사암민루테늄클로라이드[Ru(NH3)6Cl3]가 많이 사용되고 있지만, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드와는 반응하지 않는 문제점을 가진다.
본 발명은 위에서 언급한 종래 전기화학적 바이오센서용으로 사용되는 시약 조성물이 가지는 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명이 이루고자 하는 목적은 전기화학적 바이오센서에서 반응성이 우수하며 산화환원 안전성이 우수한 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 목적은 조효소인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드와 반응성이 우수한, 전자전달매개체를 구비하는 시약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 또 다른 목적은 혈액 중 β-히드록시부티르산의 양을 정량하여 케토산증을 검사할 수 있는 시약 조성물 및 이를 이용한 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소, 조효소 및 전자전달매개체를 포함하며 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 페나진 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는
여기서 조효소는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 혈액 대사물질의 정량을 측정하는데, 바람직하게 혈액 대사물질은 베타-히드록시부틸레이트(beta-hydroxybutyrate)인 것을 특징으로 한다.
여기서 산화환원효소는 히드록시부틸레이트탈수소 효소(hydroxyl butyrate dehydrogenase)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게 금속함유 착물은 루테늄(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex) 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게 루테늄 착물은 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)인 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 페나진 유도체는 아래 화학식1의 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트(1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)
[화학식 1]
아래 화학식2의 5-메틸페나지니움 메틸설페이트(5-Methylphenazinium methyl sulfate
[화학식 2]
아래 화학식3의 5-에틸디벤조피라진 에틸설페이트(5-Ethylphenazin-5-ium ethyl sulfate)
[화학식 3]
중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물 및 이를 이용한 바이오센서는 다음과 같은 다양한 효과를 가진다.
첫째, 본 발명에 따른 시약조성물은 전기화학적 바이오센서에서 측정하고자 하는 대사물질과의 반응속도가 빨라 대사물질의 검출 성능이 우수하며 산화환원 안전성이 우수하다.
둘째, 본 발명에 따른 시약조성물은 조효소인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드와 반응하고 안정성이 우수하여 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드를 사용할 수 있는 전기화학적 바이오센서를 제작할 수 있다.
셋째, 본 발명에 따른 시약조성물은 혈액 중 β-히드록시부티르산의 양을 정량하여 빠른 시간에 정확하게 케토산증을 검사할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도를 도시하고 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도를 도시하고 있다.
도 3은 본 발명에 따른 실험예에서 전압 인가 조건을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5는 실시예 1-2에 따른 대면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 실시예 1-1 및 실시예 2-1 내지 실시예 3-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대면형 전기화학적 바이오센서의 분해 사시도를 도시하고 있다.
도 3은 본 발명에 따른 실험예에서 전압 인가 조건을 나타낸 도면이다.
도 4는 실시예 1-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5는 실시예 1-2에 따른 대면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 6은 실시예 1-1 및 실시예 2-1 내지 실시예 3-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
이하 첨부한 도면을 참고로 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약 조성물 및 이를 이용한 바이오센서에 대해 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 산화환원효소, 조효소 및 전자전달매개체를 포함하되, 전자전달매개체는 금속함유 착물 및 페나진 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서용 산환환원반응 시약조성물을 제공한다. 여기서 금속함유 착물은 MaXb(M은 주로 전이금속(Fe, Ru, Os등)이고 X는 비금속이온 및 금속과 결합가능한 분자(Cl-, CN-, NH3 및 그 pyridine 계열)의 구조를 가지고, 전자의 전달이 용이한 분자 성질을 가진다.
본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물에 있어서, 산화환원효소는 측정하고자 하는 다양한 대사물질과 반응하여 환원되고, 다시 환원된 효소와 조효소가 반응하여 환원된 조효소를 생성하는데, 환원된 조효소와 전자전달매개체가 반응하여 발생하는 전기신호 크기에 의해 대사물질을 정량하게 된다.
본 발명은 베타-히드록시부틸레이트를 정량하는 바이오센서를 실시예로 설명하지만, 정량하고자 하는 대사물질에 상응하는 특정효소에 알맞은 전자전달매개체를 도입함으로써 다양한 대사물질, 예를 들면 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 글루타메이트 등과 같은 유기물 또는 무기물도 정량할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시약조성물에 포함되는 산환환원효소의 종류를 측정하고자 하는 대사물질에 따라 달리함으로써, 다양한 대사물질의 정량에 이용될 수 있다.
예를 들면, 히드록시부틸레이트탈수소효소(hydroxyl butyrate dehydrogenase), 글루탐산 탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코빅산산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소(bilirubin oxidase)을 사용하여 글루타메이트, 콜레스테롤, 락테이트, 아스코빅산, 알코올, 빌리루빈 등의 정량을 수행할 수 있다. 즉, 히드록시부틸레이트탈수소효소(hydroxyl butyrate dehydrogenase)를 사용하여 베타하이드록시부틸레이트을 정량하거나, 글루탐산 탈수소효소(glutamate dehydrogenase)를 사용하여 글루탐산을 정량하거나, 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase)를 사용하여 콜레스테롤을 정량하거나, 콜레스테롤에스테르화효소(cholesterol esterase)를 사용하여 콜레스테롤을 정량하거나, 락테이트산화효소(lactate oxidase)를 사용하여 락테이트을 정량하거나, 아스코빅산산화효소(ascorbic acid oxidase)을 사용하여 아스코빅산을 정량하거나, 알코올산화효소(alcohol oxidase)을 사용하여 알코올을 정량하거나, 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase)을 사용하여 알코올을 정량하거나, 빌리루빈산화효소(bilirubin oxidase)를 사용하여 빌리루빈을 정량한다.
한편 산화환원효소는 조효소(cofactor)와 함께 사용되는데, 산환환원효소는 대사물질로부터 수소를 뺏어와 대사물질을 산화시키는 탈수소화 기능을 수행하며, 조효소는 다시 환원된 산화환원효소로부터 수소를 뺏어와 환원된 산화환원효소를 산화시키는 탈수소화 기능을 수행한다. 조효소로는 NAD(nicotinamide adenine dinucleotide), NADP(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), FAD(flavin adenine dinucleotide), FADP(flavin adenine dinucleotide phosphate) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물에 있어서, 전자전달매개체는 대사물질로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관중인 조효소와 산화환원 반응하여 환원되게 되며, 이렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 산화 전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시키는 역할을 수행한다.
이때, 전자전달매개체로는 금속함유 착물과 페나진 유도체를 함께 혼합하여 사용할 수 있으나, 종래에 사용된 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinone), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt) 또는 비오로겐(viologen)을 배제하는 것은 아니다.
전자전달매개체에서, 금속함유 착물로는 루테늄(ruthenium complex) 또는 페리시아나이드 착물(ferricyanide complex)을 사용할 수 있다. 여기서 루테늄 착물로는 Ru(NH3)6Cl3, [Ru(2,2',2''-terpyridine)(1,10-phenanthroline)(OH2)]2+,trans-[Ru(2,2'bipyridine)2(OH2)(OH)]2+, [(2,2'-bipyridine)2(OH)RuORu(OH)(2,2?py)2]4+ 및 [Ru(4,4'-bipyridine)(NH3)5]2+ 등을 사용할 수 있고, 페리시아나이드 착물로는 K3Fe(CN)6 등을 사용할 수 있다.
전자전달매개체에서, 페나진 유도체로는 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트, 5-메틸페나지니움 메틸설페이트, N-에틸디벤조피라진 에틸설페이트 중 어느 하나 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로 아래 화학식1의 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트(1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate)
[화학식 1]
아래 화학식2의 5-메틸페나지니움 메틸설페이트(5-Methylphenazinium methyl sulfate)
[화학식 2]
아래 화학식3의 5-에틸디벤조피라진 에틸설페이트(5-Ethylphenazin-5-ium ethyl sulfate)
[화학식 3]
바람직하게, 본 발명에서 루테늄 착물로 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)를 사용하는데, 헥사아민루테늄클로라이드는 수용액에서 산화 상태가 안정하며 가역적이고, 환원된 전자전달매개체의 산화가 pH에 민감하지 않으며, 전기화학적 방해물질인 아세트아미노펜(acetaminophene), 아스코빅산(ascorbic acid), 빌리루빈(Bilirubin), 도파민(Dopamine), 요산(Uric acid), 겐티신산(gentisic acid) 등과 거의 반응하지 않는 특성이 있다.
본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100중량부를 기준으로 조효소 30~300 중량부, 금속함유 착물 100~340 중량부를 함유하는 것이 바람직하다. 만약, 금속함유 착물을 100 중량부 미만으로 함유할 경우에는 높은 베타-히드록시부틸레이트 농도에서 바이오 센서의 반응이 둔감해지는 문제가 있고, 340 중량부를 초과하여 함유할 경우에는 혈액에 의하여 시약이 빨리 녹지 않는 문제가 있을 수 있다. 즉, 고농도의 분석물을 측정할 때 해당하는 농동에 상응하는 신호가 나타나지 않는다. 예를 들어 측정하고자 하는 분석물의 농도가 100일 때, 100만큼의 신호가 나타나지 않고 70만큼의 신호만 나타나기 때문에 70 이상의 농도 검출이 안된다.
또한 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100중량부를 기준으로 페나진 유도체를 1-30 중량부 함유하는 것이 바람직하다. 만약, 페나진 유도체를 1 중량부 미만으로 함유할 경우에는 높은 베타-히드록시부틸레이트 농도에서 바이오 센서의 반응이 둔감해지는 문제가 있고, 30 중량부를 초과하여 함유할 경우에는 혈액에 의하여 시약이 빨리 녹지 않는 문제가 있을 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 계면활성제, 수용성 고분자, 당화합물, 단백질, 알칼리금속 또는 알칼리토금속 등과 같은 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
첨가제 중 계면활성제는 전기화학적 바이오센서에 구비되어 있는 전극에 시약을 분주할 때 시약이 전극 위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 한다. 계면활성제로는 트리톤 X-100(Triton X-100), 소듐도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트(perfluorooctane sulfonate) 및 소듐스테아레이트(sodium stearate) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제를 0.1-25 중량부 함유하는 것이 바람직하다.
한편, 첨가제 중 수용성 고분자는 시약조성물의 고분자 지지체로서 산화환원효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행한다. 수용성 고분자는 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리플루오로설포네이트(perfluoro sulfonate), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 하이드록시에틸셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리아미드(polyamide) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 0.1-80 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.
한편, 첨가제 중 당화합물 및 단백질은 산화환원효소의 안정화를 돕는 역할을 수행한다. 당화합물로는 글루코오즈(D-글루코오스, C6O6H12), 수크로오즈(α-D-글루코피라노실-β-D-푸룩토프라노시드, C12H22O11), 락토오즈(4-O-β-D-갈락토피라노실-D-글루코피라노오스, C12H22O11), 프락토오즈(D-프룩토오스, C6H12O6), 트리할로오즈(α,α-트레할로오스, C12H22O11), 솔비톨(D-소비톨, C6H14O6), 라피노오즈(β-D-프룩토프라노실 6-o-α-D-글루코피라노시드, C18H32O16) 등을 사용할 수 있고, 단백질은 보바인세럼알부민(Bovine serum albimun), 알부민(albumin), 네오프로테인세이버, (Neo Protein Saver) 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 당화합물은 0.1-100 중량부, 단백질은 0.1-50 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.
한편, 첨가제 중 알칼리 금속 및 알칼리토금속은 효소의 안정화를 돕는 역할을 수행한다. 알칼리금속으로는 Na, K 등을 사용할 수 있고, 알칼리토금속으로는 Mg, Ca을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 금속물은 0.01-10 중량부를 함유하는 것이 바람직하다.
앞서 설명한 시약조성물을 이용하여 전기화학적 바이오센서를 제조할 수 있는데, 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약조성물이 코팅된 평면형 전기화학적 바이오센서로 제작되거나, 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약조성물이 코팅된 대면형 전기화학적 바이오센서로 제작될 수 있다.
본 발명에 따른 평면형 또는 대면형 전기화학적 바이오센서를 도 1 및 도 2를 참조하여 설명한다.
먼저, 본 발명에 따른 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 도 1을 참고로 보다 구체적으로 살펴보면 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(10)를 구비한 상판(11)과, 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(9)과, 하기 작동 전극(2)에 코팅되는 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물(8)와, 하기 작동전극(2)과 보조전극(3)의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(7)과, 작동전극(2)과 보조전극(3)이 프린팅 형성되는 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.
다음으로, 도 2를 참고로 본 발명에 따른 대면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에 대면하도록 구비되는 것으로, 도 2를 참고로 보다 구체적으로 살펴보면 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부(10)를 구비하는 상판(11)과, 상판(11)에 프린트되는 보조전극(3)과, 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상판(11)과 하기 하판(1)을 접착하는 역할을 하고 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판(9)과, 하기 작동전극(2)에 코팅되는 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물(8)과, 하기 작동전극(2)과 보조전극(3)의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판(7)과, 보조전극(3)과 하기 보조전극의 리드(4)를 연결하는 회로연결접지(5)와, 하판(1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다. 여기서 작동전극(2), 보조전극의 리드(4) 및 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극(6)는 하판(1)에 프린팅되어 형성된다.
전자전달매개체로는 금속함유 착물 및 페나진 유도체를 포함하는, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물은 대사물질과 빠르게 반응하여 현저히 향상된 대사물질 검출 성능을 가지며, 방해물질의 영향을 거의 받지 않는다. 특히. 당뇨병성 케톤산증의 주요 케톤체인 혈액 내 베타-하이드록시부틸레이트 검출을 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
<실시예 1>
전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드 및 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트를 포함하는 산화환원반응 시약조성물1의 제조
산화환원효소로 히드록시부틸레이트탈수소효소(hydroxyl butyrate dehydrogenase) 100 중량부에 대하여, 조효소로 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide) 163 중량부와, 금속함유 착물로 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3) 141.5 중량부와, 메톡시페나진메토설페이트(이하, 페나진 유도체a라 함) 13.7 중량부와, 수용성 고분자로 10% 수화된 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC) 10 중량부와, 당화합물로 트리할로오즈(Trehalose) 50 중량부와, 단백질로 보바인세럼알부민(BSA) 10 중량부와, 알칼리토금속으로 마그네슘(Mg) 0.04 중량부와, 계면활성제(상품명: Triton X-100) 17.4 중량부를 카바모일메틸아미노에탄설포닉에시드(2(carbamoylmethylamino)ethanesulfonic acid, C4H10N2O4S) 완충액(pH7.5, 0.1M 농도의 10 ml)에 녹여서 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응용 시약 조성물1을 제조하였다.
<실시예 1-1> 실시예 1에서 제조한 시약조성물1을 포함하는 평면형 바이오센서의 제조
본 발명에 따른 평면형 바이오센서의 일예로서 도 1에 도시되어 있는 것과 같이 평균값 0.5㎕ 시료도입부를 가진 평면형 바이오센서를 제조하였다.
폴리에스터로 만든 하판 플라스틱(1)에 탄소그래파이트를 스크린 프린트하여 만든 작동전극(면적: 1.19mm2, 2)과 보조전극(3)를 형성한다. 절연체(7)로써 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하고, 작동전극에 실시예 1에서 제조한 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물1(8)을 코팅한다. 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 75㎛ 두께의 끼움판(9)을 배치하는데, 끼움판(9)은 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판(11)과 하판(1)을 접착시키는 역할을 한다. 통기구(10)는 혈액이 센서안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구이며, 상판(11)은 하판과 동일한 폴리에스터로 제조된다.
<실시예 1-2> 실시예 1에서 제조한 시약조성물1을 포함하는 대면형 바이오센서의 제조
본 발명에 따른 대면형 바이오센서의 일예로서 도 2에 도시되어 있는 것과 같이 평균값 0.5㎕ 시료도입부를 가진 대면형 바이오센서를 제조하였다. 폴리에스터로 만든 하판 플라스틱(1)에 탄소그래파이트를 스크린 프린트하여 작동전극(면적: 1.95 mm2, 2), 보조전극(3), 보조전극 리드(4) 및 유동감지전극(6)을 형성한다. 유동감지전극(6)은 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 점도측정전극이다. 보조전극(3)과 보조전극 리드(4)를 연결하기 위한 회로연결접지(5)를 은과 염화은(Ag/AgCl)으로 형성하고, 절연물질로 작동전극(2)의 면적을 규정하는 절연체를 형성한다. 작동전극에 실시예 1에서 제조한 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물1(8)을 코팅한다. 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 75㎛ 두께의 끼움판(9)을 배치는데, 끼움판(9)은 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판(11)과 하판(1)을 접착시키는 역할을 한다. 통기구(10)는 혈액이 센서안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구이며, 상판(11)은 하판과 동일한 폴리에스터로 제조된다.
<실시예 2> 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드 및 페나진 유도체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물2의 제조
실시예 1의 시약조성물1에서 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트 대신에 도 2에 제시된 페나진 유도체 중, 5-Methylphenazinium methyl sulfate (이하, 페나진 유도체 b라 함) 1mM을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 시약조성물2을 제조하였다.
<실시예 2-1> 실시예 2에서 제조한 시약조성물2을 포함하는 평면형 바이오센서2의 제조
실시예 1-1에서 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약조성물1 대신에 실시예 2의 시약조성물2을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 평면형 바이오센서2를 제조하였다.
<실시예 3> 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드 및 페나진 유도체를 포함하는 산화환원반응 시약 조성물3의 제조
실시예 1의 시약조성물1에서 메톡시페나진메토설페이트 대신에 5-Ethylphenazin-5-ium ethyl sulfate(이하, 페나진 유도체 c라 함) 1mM을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 시약조성물3을 제조하였다.
<실시예 3-1> 실시예 3에서 제조한 시약조성물3을 포함하는 평면형 바이오센서의 제조
실시예 1-1에서 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약조성물1 대신에 실시예 3의 시약조성물3을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 평면형 바이오센서3를 제조하였다.
<비교예 1> 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드를 포함하는 산화환원반응 시약조성물의 제조
1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트를 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 시약조성물을 제조하였다.
<비교예 1-1> 비교예 1에서 제조한 시약조성물을 포함하는 평면형 바이오센서의 제조
실시예 1-1에서 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약조성물1 대신에 비교예 1에서 제조한 시약조성물을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 평면형 바이오센서를 제조하였다.
<비교예 2> 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드를 포함하지 않는 산화환원반응 시약조성물의 제조
헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)를 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시하여 시약조성물을 제조하였다.
<비교예 2-1> 비교예 2에서 제조한 시약조성물을 포함하는 평면형 바이오센서의 제조
실시예 1-1에서 작동전극에 코팅되는 실시예 1의 시약조성물1 대신에 비교예 2에서 제조한 시약조성물을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 평면형 바이오센서를 제조하였다.
<실험예 1> 평면형 바이오센서의 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정
실시예 1-1에서 제조한 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다. 여기서, 베타-히드록시부틸레이트 표준용액은 정맥에서 추출한 혈액을 헤마토크릿(hematocrit) 42%에 맞추고 베타-히드록시부틸레이트 측정기(제조사:Abbott, 모델명:Precision Xceed)를 사용하여 여러가지의 베타-히드록시부틸레이트 농도를 가지도록 제조한 혈액을 말한다.
베타-히드록시부틸레이트 표준용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 0 mV를 걸어주고, 5초간 대기한 후 작동전극에 5초 동안 200 mV를 걸어준 뒤 전류를 측정하였다.(도 3참조). 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고, 그 평균값을 도 4에 나타내었다.
이때, 실시예 1-1에서 제조한 평면형 바이오센서 도입부에 적용된 시료의 양은 0.5 ㎕이었으며, 42% 헤마토크릿을 포함한 전혈이 도입부를 채우는데 걸린 시간은 약 0.2초 이내였다.
도 4는 실시예 1-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 전자전달매개체로 헥사아민루테늄클로라이드와 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트을 함께 포함하는 실시예 1-1의 평면형 바이오센서는 베타-히드록시부틸레이트 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하는 좋은 직선성을 보이는 반면에, 전자전달매개체로 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트을 포함하지 않고 헥사아민류테늄클로라이드만을 포함하는 비교예 1-1의 평면형 바이오센서는 베타-히드록시부틸레이트 농도에 따른 직선성을 관측할 수 없었다. 이때, 실시예 1-1에 따른 평면형 바이오센서에서 측정되는 전류의 기울기는 작동전극의 단위면적당 435 nA/㎟/(mmol/L)로 나타나, 베타-히드록시부틸레이트에 대한 반응속도가 매우 신속함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물을 평면형 바이오센서에 적용하였을 경우 베타-히드록시부틸레이트에 대하여 매우 신속하게 반응하므로, 혈액 내 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.
<실험예 2> 대면형 바이오센서의 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정
실시예 1-2에서 제작한 대면형 바이오센서를 이용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다.
도 5는 실시예 1-2에 따른 대면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1-2에서 제조한 대면형 바이오센서도 실험예 1에서 사용한 실시예 1-1의 평면형 바이오센서와 유사하게 베타-히드록시부틸레이트 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하는 좋은 직선성을 보이는 것을 알 수 있었다. 이때, 실시예 1-2에 따른 대면형 바이오센서에서 측정되는 전류의 기울기는 작동전극의 단위면적당 469 nA/㎟/(mmol/L)로 나타나 베타-히드록시부틸레이트에 대한 반응속도가 매우 신속함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 산화환원반응 시약조성물은 대면형 바이오센서에 적용하였을 경우 베타-히드록시부틸레이트에 대하여 매우 신속하게 반응하므로, 혈액 내 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.
<실험예 3> 실시예 2-1 내지 3-1에 따른 평면형 바이오센서의 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정
실시예 2-1 내지 3-1에서 제작한 평면형 바이오센서와 실시예 1-1에서 제작한 평면형 바이오센서를 이용하여 실험예 1과 동일한 방법으로 베타-히드록시부틸레이트 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다.
도 6은 실시예 1-1 및 실시예 2-1 내지 실시예 3-1에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 베타-히드록시부틸레이트 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1-1의 페나진 유도체 a(1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트)를 사용한 평면형 바이오센서의 경우 전류의 기울기는 작동전극의 단위면적당 435 nA/㎟/(mmol/L)로 나타나 베타-히드록시부틸레이트에 대한 반응속도가 매우 신속함을 알 수 있었다. 이는 실시예 3-1의 페나진 유도체 b, c를 사용한 평면형 바이오센서의 경우와 비교해 볼 때 더욱 높은 전류의 기울기임을 확인하였다. 검출 신호 크기가 페나진 유도체a에 비하여 작지만, 농도에 따른 감응성 그래프가 직선적으로 증가하고 있음을 확인할 수 있다. 페나진 유도체 b, c를 또한 금속함유 착물과 함께 사용하지 않으면 도4에서와 같이 직선적으로 농도에 따라 증가하는 신호는 나타나지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 시약조성물은 평면형 바이오센서에 적용하였을 경우 베타-히드록시부틸레이트에 대하여 매우 신속하게 반응하므로, 혈액 내 베타-히드록시부틸레이트 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다.
특히, 본 발명에 따른 전자전달매개체로 루테늄 착물과 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트를 함께 사용함으로써 베타-히드록시부틸레이트 검출 성능이 현저히 증가하였다. 예를 들어, 본 발명의 비교예 1에서 전자전달매개체로 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트를 사용하지 않고 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3)를 단독으로 사용할 경우에는 반응에 의해 형성된 NADH와 반응속도가 느려 바이오센서로 적용하기가 어렵다. 그러나 본 발명에 따른 전자전달매개체로 루테늄 착물 및 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트를 함께 사용할 경우에는 반응에 의해 형성된 조효소와 페나진 유도체 사이의 반응속도가 빠르고, 페나진 유도체와 금속함유 착물과의 반응속도가 빨라서 바이오센서의 제조에 유용하게 사용할 수 있다.
10: 평면형 바이오센서
20: 대면형 바이오센서
20: 대면형 바이오센서
Claims (9)
- 산화환원효소, 조효소 및 전자전달매개체를 포함하는, 혈액 대사물질의 정량을 측정하는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물에 있어서,
상기 산화환원효소는 히드록시부틸레이트탈수소 효소(hydroxyl butyrate dehydrogenase)이고,
상기 전자전달매개체는 헥사아민루테늄클로라이드(Ru(NH3)6Cl3); 및 화학식1의 1-메톡시-5-메틸페나지니움 메틸설페이트(1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate), 화학식2의 5-메틸페나지니움 메틸설페이트(5-Methylphenazinium methyl sulfate) 및 화학식3의 5-에틸디벤조피라진 에틸설페이트(5-Ethylphenazin-5-ium ethyl sulfate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 페나진 유도체를 포함하며,
상기 혈액 대사물질은 베타-히드록시부틸레이트(beta-hydroxybutyrate)인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
. - 제 1 항에 있어서, 상기 조효소는
니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)인 것을 특징으로 하는 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 작동 전극 및 보조 전극이 한 평면상에 배치되어 있으며,
상기 작동 전극 위에 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물이 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서. - 작동 전극 및 보조 전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 배치되어 있으며,
상기 작동 전극 위에 상기 제 1 항 또는 제 2 항의 전기화학적 바이오센서용 산화환원반응 시약조성물이 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서.
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