KR101572314B1 - Pharmaceutical composition with antiviral activity comprising inhibitor of MARCH5 expression and screening method thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 MARCH5 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 MARCH5 유전자 또는 MARCH5 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다. The present invention relates to an antiviral pharmaceutical composition containing mitochondrial E3 ubiquitin ligase (MARCH5) gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient, and a screening method thereof. The present invention provides an antiviral pharmaceutical composition comprising an MARCH5 gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient. The present invention also relates to a method for producing a MARCH5 gene or a MARCH5 protein comprising the steps of: contacting a test substance with a cell comprising a MARCH5 gene or a MARCH5 protein; Measuring the level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity in cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity as compared with a control sample.

Description

MARCH5 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학 조성물 및 이의 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition with antiviral activity comprising inhibitor of MARCH5 expression and screening method thereof}[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for antiviral use containing an inhibitor of MARCH5 expression as an active ingredient and a method of screening for the antiviral activity inhibitor of MARCH5 expression and screening method,

본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an antiviral pharmaceutical composition containing mitochondrial E3 ubiquitin ligase (MARCH5) gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient, and a screening method thereof.

미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase)인 MARCH5(MITOL이라고도 알려짐)는 유비퀴틴화(ubiquitylation)를 통하여 미토콘드리아 형태 조절 단백질을 조절한다. MARCH5는 미토콘드리아 다이나믹스(dynamics) 단백질인 hFis1 및 Mfns(Mfn1,2)을 조절하고, Drp1을 세포질(cytosol)로부터 미토콘드리아로 이동시킨다. 최근 연구에 의하면, MARCH5는 돌연변이 수퍼옥사이드 디스뮤타제 1(superoxide dismutase 1; mSOD1)의 미토콘드리아 축적에 의해 야기되는 미토콘드리아 기능 장애에 대응한 방어적 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 잘못 접힌(misfolded) mSOD1은 심각한 신경퇴행성 질환인 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 환자의 신경 세포에 축적되는 것으로 나타났다. 또한, MARCH5는 미토콘드리아에 축적되고 미토콘드리아 기능 장애를 유발하는 폴리글루타민-확장 단백질(polyglutamine-expanded protein; PolyQ)에 대한 세포 독성을 조절한다고 밝혀졌는데, PolyQ는 헌팅턴병, 마카도 조셉병(machado joseph disease) 또는 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia)과 같은 질병에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase MARCH5 (also known as MITOL) regulates mitochondrial morphogenetic proteins through ubiquitination. MARCH5 regulates the mitochondrial dynamics proteins hFis1 and Mfns (Mfn1,2) and moves Drp1 from the cytosol to the mitochondria. Recent studies have shown that MARCH5 plays a protective role in mitochondrial dysfunction caused by mitochondrial accumulation of mutant superoxide dismutase 1 (mSOD1). Misfolded mSOD1 has been shown to accumulate in neurons in patients with severe neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). In addition, MARCH5 has been shown to regulate cytotoxicity against polyglutamine-expanded protein (PolyQ), which accumulates in mitochondria and causes mitochondrial dysfunction. PolyQ has been shown to inhibit Huntington's disease, machado joseph disease, Or spinocerebellar ataxia. ≪ RTI ID = 0.0 > [0004] < / RTI >

한편, 한국등록특허 제10-1285375호는 항바이러스 활성을 갖는 화합물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 뉴라미니다제 항원, 탄소나노튜브 반도체 소자 센서, 프로브 스테이션, 및 소스 미터 장치를 사용하여 항바이러스 활성을 갖는 신규의 화합물을 스크리닝하는 방법에 대해 개시하고 있지만, 본원발명의 MARCH5 유전자의 발현 억제를 통한 항바이러스제 스크리닝에 대한 언급은 없다.
Korean Patent No. 10-1285375 relates to a method for screening a compound having an antiviral activity, wherein an antiviral activity is detected using a neuraminidase antigen, a carbon nanotube semiconductor device sensor, a probe station, and a source meter device , But there is no mention of antiviral screening through inhibition of the expression of the MARCH5 gene of the present invention.

따라서, 본 발명자들은 siRNA를 사용하여 MARCH5 유전자의 발현을 억제하면 바이러스 증식이 억제되고, MARCH5 유전자를 과발현시킨 경우 바이러스 증식이 증가된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have confirmed that inhibiting the expression of MARCH5 gene using siRNA inhibits the proliferation of the virus, and when the MARCH5 gene is overexpressed, the proliferation of the virus is increased, thus completing the present invention.

본 발명의 목적은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.It is an object of the present invention to provide an antiviral pharmaceutical composition comprising mitochondrial E3 ubiquitin ligase (MARCH5) gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 MARCH5 유전자 또는 MARCH5 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다. It is another object of the present invention to provide a method for producing a MARCH5 gene or a MARCH5 protein comprising the steps of: Measuring the level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity in cells in contact with the test substance; And a step of selecting a test substance having a reduced degree of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity as compared with a control sample.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항바이러스용 약학 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 MARCH5 유전자는 Human MARCH5 (GenBank/EMBL/DDBJ accession no. NM_017824)일 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 상기 MARCH5 유전자는 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 하고, 상기 MARCH5 단백질은 서열번호 2로 표시된 것을 특징으로 한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides an antiviral pharmaceutical composition comprising mitochondrial E3 ubiquitin ligase (MARCH5) gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient. Specifically, the MARCH5 gene may be but is not limited to Human MARCH5 (GenBank / EMBL / DDBJ accession no. NM_017824). Preferably, the MARCH5 gene is represented by SEQ ID NO: 1, and the MARCH5 protein is represented by SEQ ID NO: 2.

상세하게는, 상기 MARCH5 유전자 발현 억제제는 MARCH5 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 siRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 한다.Specifically, the MARCH5 gene expression inhibitor may be an antisense nucleotide complementary to mRNA of the MARCH5 gene, a small interfering RNA (siRNA), and a short hairpin RNA (shRNA) It is not. Preferably, the siRNA is characterized by being represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.

상세하게는, 상기 MARCH5 단백질 활성 억제제는 MARCH5 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Specifically, the MARCH5 protein activity inhibitor may be a compound that specifically binds to the MARCH5 protein, a peptide, a peptide mimetic, an aptamer, an antibody, and a natural product, but is not limited thereto.

바람직하게는, 상기 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV) 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스(H1N1 influenza virus; A/PR8/8/34)이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
Preferably, the virus is Vesicular stomatitis virus (VSV) or H1N1 influenza virus (A / PR8 / 8/34), but is not limited thereto.

본 발명에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.
The term "antisense nucleotide " in the present invention means DNA or RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a specific mRNA, and binds to a complementary sequence in mRNA to inhibit translation of mRNA into a protein .

본 발명에서 용어 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
The term "small interfering RNA (siRNA)" in the present invention means a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing. Since siRNA can inhibit the expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knockdown method or as a gene therapy method.

본 발명에서 용어 "짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)"는 목적유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.
The term "short hairpin RNA (shRNA)" in the present invention refers to an oligonucleotide synthesizing oligonucleotides connecting 3-10 base linkers between the sense of the target gene siRNA sequence and the complementary nonsense, Or by shRNA insertion into retroviruses such as lentivirus and adenovirus, the short hairpin RNA with a looped hairpin structure is produced and converted into siRNA by intracellular Dicer to produce an RNAi effect It says. The shRNA shows a relatively long-term RNAi effect as compared to siRNA.

본 발명에서 용어 "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 MARCH5 활성을 이끄는 MARCH5 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다.
The term "Peptide Minetics" in the present invention is a peptide or non-peptide that inhibits the binding domain of MARCH5 protein leading to MARCH5 activity.

본 발명에서 용어 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
In the present invention, the term "Aptamer" is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure and capable of binding to a target molecule with high affinity and specificity. Aptamers are comparable to monoclonal antibodies due to their inherent high affinity (usually pM levels) and their ability to bind to target molecules with specificity, and there is a high likelihood of being an alternative antibody, especially as a "chemoantibody".

본 발명의 "항체"는 MARCH5 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. "Antibodies" of the present invention can be used either as prepared by MARCH5 injection or as commercially available products. In addition, the antibody includes a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a fragment capable of binding to an epitope.

다클론 항체는 상기 MARCH5를 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.A polyclonal antibody can be produced by a conventional method of injecting the MARCH5 into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art and can be made from any animal species host such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, cows, dogs and the like.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다.
Monoclonal antibodies can be prepared using any technique that provides for the generation of antibody molecules through the cultivation of continuous cell lines. Such techniques include, but are not limited to, hybridoma technology, human B-cell line hybridoma technology, and EBV-hybridoma technology.

본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 항바이러스용 약학 조성물 또는 항바이러스용 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 항바이러스용 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may contain a chemical substance, a nucleotide, an antisense, an siRNA oligonucleotide and a natural product extract as an active ingredient. The antiviral pharmaceutical composition or the antiviral combination preparation of the present invention may be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the active ingredients, and examples of the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, A solubilizing agent such as a coating agent, a swelling agent, a lubricant, a lubricant or a flavoring agent may be used. The antiviral pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient for administration. Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile water and sterile water suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.

본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
Pharmaceutical dosage forms of the pharmaceutical compositions of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, suspending agents or injectable solutions or suspensions . The pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated and administered in a conventional manner via intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrasternal, percutaneous, intranasal, inhalation, topical, rectal, ≪ / RTI > The effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means the amount required for prevention or treatment of the disease. Accordingly, the present invention is not limited to the particular type of the disease, the severity of the disease, the kind and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the patient's age, body weight, general health status, sex and diet, Rate of administration, duration of treatment, concurrent medication, and the like. For example, in the case of an adult, the inhibitor of the present invention may be administered at a dose of 0.1 ng / kg to 10 g / kg when the compound is administered once to several times a day, a polypeptide, In the case of protein or antibody, 0.1 ng / kg to 10 g / kg, antisense nucleotide, siRNA, shRNAi or miRNA can be administered at a dose of 0.01 ng / kg to 10 g / kg.

또한, 본 발명은 MARCH5 유전자 또는 MARCH5 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 시험물질을 접촉한 세포에서 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 항바이러스제 스크리닝 방법을 제공한다.
The present invention also relates to a method for producing a MARCH5 gene or a MARCH5 protein comprising the steps of: contacting a test substance with a cell comprising a MARCH5 gene or a MARCH5 protein; Measuring the level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity in cells in contact with the test substance; And selecting a test substance having a reduced level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity as compared with a control sample.

상세하게는, 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 측정할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
In detail, the MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity level is measured by RT-PCR, ELISA, immunohistochemistry, Western blotting and immunohistochemical staining. But are not limited to, flow cytometry (FACS).

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.The term "test substance" used in reference to the screening method of the present invention refers to an unknown candidate substance used in screening in order to examine whether it affects the expression amount of a gene or affects the expression or activity of a protein. do. Such samples include, but are not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, siRNA (small interference RNA) and natural extracts.

본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제 또는 MARCH5 단백질 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, MARCH5 유전자의 발현을 억제함으로써 바이러스 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 MARCH5 유전자는 항바이러스제 개발에 매우 유용한 타겟으로 활용될 것으로 사료된다.The present invention relates to an antiviral pharmaceutical composition containing Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase (MARCH5) gene expression inhibitor or MARCH5 protein activity inhibitor as an active ingredient, and a screening method therefor. It was confirmed that virus proliferation was suppressed. Therefore, the MARCH5 gene is expected to be a very useful target for the development of antiviral drugs.

도 1은 THP-1 세포에서 MARCH5 유전자의 녹다운(knockdown) 결과, 바이러스 증식이 억제된다는 것을 나타낸다.
도 2는 RAW264.7 세포에서 MARCH5 유전자의 녹다운(knockdown) 결과, 바이러스 증식이 억제된다는 것을 나타낸다.
도 3은 RAW264.7 세포에서 MARCH5 유전자의 과발현 결과, 바이러스 증식이 증가된다는 것을 나타낸다.
도 4는 293T 세포에서 MARCH5 유전자의 과발현 결과, 바이러스 증식이 증가된다는 것을 나타낸다.
도 5는 293T 세포에서 MARCH5 유전자의 과발현 결과, 바이러스 증식이 증가된다는 것을 나타낸다. FIG. 1 shows that virus replication is inhibited as a result of knockdown of the MARCH5 gene in THP-1 cells.
Fig. 2 shows that virus growth is inhibited as a result of knockdown of the MARCH5 gene in RAW264.7 cells.
Figure 3 shows that overexpression of the MARCH5 gene in RAW264.7 cells results in an increase in virus proliferation.
Figure 4 shows that overexpression of the MARCH5 gene in 293T cells results in an increase in virus proliferation.
Figure 5 shows that overexpression of the MARCH5 gene in 293T cells results in an increase in virus proliferation.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example 1 :  One : MARCH5MARCH5 유전자 녹다운( Gene knockdown ( knockdownknockdown )에 의한 바이러스 증식 억제 ) Inhibit virus growth

1. 세포 배양1. Cell culture

본 발명에 사용한 세포는 ATCC (the global biosource center; atcc.org)에서 구매하여 사용하였으며, 293T 세포와 Mouse leukaemic monocyte macrophage (Raw264.7) 모두 DMEM high glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco) 배지에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 항생제를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포를 배양하였다.
The cells used in the present invention were purchased from ATCC (the global biosource center; atcc.org), and 293T cells and mouse leukemic monocyte macrophages (Raw264.7) were cultured in DMEM high glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco) Fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin antibiotics were added and the cells were cultured at 37 ° C in 5% CO ₂ Cells were cultured in an incubator.

2. 형질감염(transfection) 및 면역블롯팅(immunoblotting)2. Transfection and immunoblotting.

MARCH5 siRNA [5'-CUCAUCCUGACGAGUCUGU-3'(서열번호 3) 및 5'-CUGAUACUAGGCAAAAUGA-3'(서열번호 4)]를 Opti-MEM media에 리포펙타민(lipofectamin) 2000 (invitrogen)과 배양시킨 뒤, 3시간 후에 배지를 새로운 것으로 교체하고 48시간 배양하여, 형질감염(transfection)을 유도하였다.The MARCH5 siRNA [5'-CUCAUCCUGACGAGUCUGU-3 'and 5'-CUGAUACUAGGCAAAAUGA-3' (SEQ ID NO: 4) were cultured on Opti-MEM media with lipofectamine 2000 (Invitrogen) After 3 hours the medium was replaced with fresh and incubated for 48 hours to induce transfection.

형질감염하여 단백질 발현이 줄어든 것을 면역블롯팅(immunoblotting)으로 확인하였는데, 세포를 트립신(trypsin)을 이용하여 모은 뒤, 1x 단백질 sample buffer로 direct lysis하여 얻어진 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후에, NC(nitrocellulose membrane)로 옮겼다. 얻어진 NC blot을 5% non-fat milk를 포함한 TBST buffer에 1시간 동안 블로킹(blocking) 한 후, 각각의 1,2차 항체를 각각 반응(incubation)시킨 뒤, ECL(enhanced chemiluminescence systeme)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.  After the cells were collected using trypsin, direct lysis was performed with a 1x protein sample buffer, and the resulting protein was electrophoresed on a polyacrylamide gel. The protein was then analyzed by immunoblotting , And transferred to a nitrocellulose membrane (NC). The resulting NC blot was blocked in TBST buffer containing 5% non-fat milk for 1 hour, incubated with each of the first and second antibodies, and then subjected to ECL (enhanced chemiluminescence system) Protein expression was confirmed.

THP-1 세포에 control siRNA, MARCH5 siRNA를 발현시킨 뒤, GFP를 발현하는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)와 H1N1 인플루엔자 바이러스(H1N1 influenza virus; A/PR8/8/34)를 바이러스를 감염시킨 뒤 형광으로 바이러스의 감염 정도를 측정하고, 형광을 스캔닝(scanning)하여 그 양을 정량적으로 측정하였다. After expressing control siRNA and MARCH5 siRNA in THP-1 cells, viruses such as Vesicular stomatitis virus (VSV) expressing GFP and H1N1 influenza virus (A / PR8 / 8/34) After infecting, the degree of infection of the virus with fluorescence was measured, and the amount of fluorescence was quantitatively measured by scanning.

바이러스 감염 과정은 다음과 같다. GFP-tagged VSF와 H1N1 인플루엔자 바이러스는 세포에서 증폭시켰으며, standard plaque assay를 통해서 정량하였다. GFP 발현은 Fluorescence module of GloMax®-Multi Microplate Multimode Reader (Promega, E7031)를 통해서 디지털화하여 수치로 확인하였다. 바이러스 감염은 배양 배지를 혈청이 없는 DMEM 배지로 감염 직전에 교체해준 뒤, 바이러스를 원하는 MOI 만큼 배지에 직접 첨가하여 주었다. 2시간 후에, 배지를 교체하여 세포밖에 있는 바이러스를 제거하여주었다.
The virus infection process is as follows. GFP-tagged VSF and H1N1 influenza virus were amplified in cells and quantitated by standard plaque assay. GFP expression was digitized and quantified using the Fluorescence module of the GloMax®-Multi Microplate Multimode Reader (Promega, E7031). Viral infections were induced by replacing the culture medium with serum-free DMEM medium immediately before infection, and then adding the virus directly to the medium as much as the desired MOI. Two hours later, the medium was replaced to remove the virus outside the cells.

3. 플라크 분석(plaque assay)3. Plaque assay

세포를 상층액과 분리(cell down)시킨 후 상층액을 따서 보관하였다. 펠렛(pellet)에 DMEM 200ul를 넣고 -75℃에서 얼린 후 37℃에서 녹이는 과정을 5번 반복하였다. 12000rpm, 5min으로 원심분리한 후 상층액을 상기에 보관했던 상층액과 섞어서 보관하였다. 12 well에 293T 세포를 깔아주고, 상기 보관했던 바이러스가 포함된 상층액을 1/10, 1/100, 1/1000으로 희석하여 12 well에 2~3시간 감염시켰다. 2% 아가(aga) 10ml과 2×DMEM을 섞어서 12 well에 있는 배지 제거 후에 1ml 씩 넣어준 후 상온에서 20분 정도 굳혔다. 37℃에서 24h 배양시킨 후 플라크(plaque)를 계수하였다.
The cells were separated from the supernatant (cell down) and stored in supernatant. 200 ul of DMEM was added to the pellet, and the mixture was frozen at -75 ° C and then dissolved at 37 ° C for 5 times. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 min, the supernatant was mixed with the supernatant stored in the supernatant. 293T cells were plated in 12 wells, and the virus-containing supernatant was diluted to 1/10, 1/100 and 1/1000, and infected in 12 wells for 2-3 hours. 2 ml of agar and 10 ml of 2 × DMEM were added to each well. After removing the medium from the wells, 1 ml of the medium was added and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After incubation at 37 ° C for 24 h, plaques were counted.

4. 결과4. Results

MARCH5 단백질을 siRNA를 이용하여 THP-1 세포 내에서 발현량을 저하시켰을 때, 단백질 발현수준이 현저하게 감소한 것을 확인하였으며(도 1A), control siRNA 또는 MARCH5 siRNA를 세포에 형질감염(transfection) 시킨 후, GFP가 태깅(tagging) 되어져 있는 PR8-gfp 바이러스와 VSV-gfp를 감염(infection) 시킨 후 바이러스의 증식을 GFP를 통해 관찰하였다. 이때, MARCH5를 세포 내에서 발현 저하시킨 실험군에서 바이러스의 증식이 감소한 것을 관찰하였다(도 1B). 바이러스의 증식을 플라크 분석(planqe assay)을 통해 정량검사한 결과, MARCH5 발현저하 실험군에서 바이러스 증식이 감소한 것을 관찰하였고, GFP의 발현량을 정량적으로 수치화 시킨 그래프에서도 바이러스의증식이 감소한 것을 관찰하였다(도 1C).When the expression level of MARCH5 protein was lowered in THP-1 cells using siRNA, the level of protein expression was markedly decreased (Fig. 1A). After transfection of control siRNA or MARCH5 siRNA into cells , And the proliferation of the PR8-gfp virus and VSV-gfp tagged with GFP was observed through GFP. At this time, it was observed that virus proliferation decreased in the experimental group in which MARCH5 expression was decreased in the cells (Fig. 1B). Quantitative analysis of viral proliferation by a planqe assay showed that virus growth was reduced in the MARCH5 expression-lowering experimental group and that in the graph quantitatively quantifying the expression level of GFP, virus proliferation was reduced 1C).

도 1에서와 같은 방법으로 RAW264.7 세포에서도 바이러스의 증식을 조사하였다. MARCH5 siRNA를 이용하여 세포 내에서 단백질 발현을 감소시킨 후, 단백질 양이 성공적으로 감소한 것을 관찰하였다(도 2A). PR8-gfp, VSV-gfp 바이러스를 control siRNA, MARCH5 siRNA를 각각 발현시킨 뒤 감염시키고, 바이러스의 증식을 GFP로 관찰하였다. 이때, MARCH5를 발현 저하시킨 실험군에서 바이러스의 증식이 현저하게 감소하여 있었으며, 정량화한 후 그래프화 시켰을 때에도 역시 감소한 것을 관찰할 수 있었다(도 2B). 또한, MARCH5 발현이 저하된 세포에서 바이러스의 증식에 대해 플라크 분석(planqe assay)를 실시한 결과 control siRNA를 발현시킨 실험군에 비해 바이러스의증식이 감소된 것을 관찰하였다(도 2C).
Virus growth was also examined in RAW264.7 cells by the same method as in Fig. After the protein expression was reduced in the cells using MARCH5 siRNA, the protein amount was observed to be successfully decreased (Fig. 2A). PR8-gfp and VSV-gfp viruses were transfected with control siRNA and MARCH5 siRNA, respectively, and the proliferation of viruses was observed with GFP. At this time, virus proliferation was remarkably decreased in the experimental group in which expression of MARCH5 was decreased, and it was also decreased when quantified and then graphed (FIG. 2B). In addition, a planqe assay for the proliferation of viruses in cells with decreased MARCH5 expression showed that virus proliferation was reduced as compared with the control siRNA-expressing experimental group (Fig. 2C).

실시예Example 2 :  2 : MARCH5MARCH5 유전자 과발현에 의한 바이러스 증식 증가  Increase of virus proliferation by gene overexpression

1. 사용 균주1. Strain used

Human MARCH5 (GenBank/EMBL/DDBJ accession no. NM_017824)를 PCR을 통해 증폭한 후, N-terminal에 3xMyc을 tagging하여 pcDNA3.1(-) vector에 Nhe1과 XhoI enzyme을 이용하여 삽입하였다. H43W 돌연변이(mutant)는 primer set(5′-GAGGATCTACAAAATGGGTTTGGCAAGCTTGTCTACAACGCTGGGTG-3′)을 이용하여 아미노산 43번 히스티딘(histidine)을 트립토판(tryptophan; W)으로 변환하여, 점돌연변이를 획득하였다. 또한, RING deletion mutant 제작을 위하여 MARCH5 아미노산 1-72번까지를 삭제하여 제작하였다.
Human MARCH5 (GenBank / EMBL / DDBJ accession no. NM_017824) was amplified by PCR, and N-terminal was tagged with 3xMyc and inserted into pcDNA3.1 (-) vector using Nhe1 and XhoI enzymes. The H43W mutant was converted to tryptophan (W) amino acid 43 amino acid histidine using a primer set (5'-GAGGATCTACAAAATGGGTTTGGCAAGCTTGTCTACAACGCTTGTCTAC-3 ') to obtain point mutation. In addition, for the production of RING deletion mutant, deletion of up to 72 amino acids of MARCH5 was made.

2. 결과2. Results

RAW 264.7 세포에 control vector, MARCH5 WT, MARCH5 HW (ligase activity 없음)를 각각 발현시킨 후, PR8-gfp바이러스와 VSV-gfp바이러스를 감염시킨 뒤, 바이러스의 증식을 관찰하였다. 이때 MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 증가하였으며, RING mutant을 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 증가하지 않았으며, control과 비슷한 수준임을 형광으로 관찰하였다(도 3A). 또한 바이러스의 증식양을 정량적으로 관찰하기 위하여, 도 3A 와 같은 각 DNA를 세포에 발현시킨 뒤, 플라크 분석(plaque assay)를 실시한 결과, MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스 복제가 증가하였고, RING mutant에서는 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 형광의 양을 정량적으로 측정한 그래프에서도 바이러스 감염 24시간 후에 현저하게 MARCH5 WT에 의해 형광을 띈 바이러스의 증식이 증가한 것이 관찰되었다(도 3). RAW 264.7 cells were infected with the PR8-gfp virus and the VSV-gfp virus, respectively, and then the viruses were proliferated after expressing the control vector, MARCH5 WT, and MARCH5 HW (no ligase activity). At this time, virus proliferation was increased in cells expressing MARCH5 WT, and virus proliferation was not increased in cells expressing RING mutant, and fluorescence was observed as similar to control (FIG. 3A). In order to quantitatively observe the proliferation amount of viruses, when plaque assay was performed after each DNA as shown in FIG. 3A was expressed in cells, virus replication was increased in MARCH5 WT expressing cells, and RING mutant And the decrease was observed. A quantitative measurement of the amount of fluorescence also showed an increase in the proliferation of the fluorescence virus markedly by MARCH5 WT after 24 hours of viral infection (Fig. 3).

293T 세포에 control vector, MARCH5 WT, MARCH5 HW (ligase activity 없음)를 각각 발현시킨 후, 단백질 발현양을 면역 블랏팅 방법으로 확인하였으며(도 4A), PR8-gfp바이러스와 VSV-gfp바이러스를 감염시킨 뒤, 바이러스의 증식을 관찰하였다. 이때 MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 증가하였으며, RING mutant을 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 증가하지 않았으며, control과 비슷한 수준임을 형광으로 관찰하였다(도 4B). 또한 바이러스의 증식양을 정량적으로 관찰하기 위하여, 도 4B와 같은 각 DNA를 세포에 발현시킨 뒤, 플라크 분석(plaque assay)를 실시한 결과, MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스 복제가 증가하였고, RING mutant에서는 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 형광의 양을 정량적으로 측정한 그래프에서도 바이러스 감염 24시간 후에 현저하게 MARCH5 WT에 의해 형광을 띈 바이러스의 증식이 증가한 것이 관찰되었다(도 4). After expressing the control vector, MARCH5 WT, and MARCH5 HW (no ligase activity) in 293T cells, the amount of protein expression was confirmed by immunoblotting method (Fig. 4A). The PR8-gfp virus and the VSV-gfp virus Later, virus proliferation was observed. At this time, the virus was increased in the cells expressing MARCH5 WT, and the virus was not increased in the cells expressing the RING mutant, and fluorescence was observed to be similar to the control (Fig. 4B). In order to quantitatively observe the amount of viral proliferation, each of the DNAs as shown in FIG. 4B was expressed in cells and subjected to a plaque assay. As a result, virus replication was increased in MARCH5 WT expressing cells, and RING mutant And the decrease was observed. A quantitative measurement of the amount of fluorescence also showed an increase in the proliferation of the fluorescently fluorescent virus markedly by MARCH5 WT 24 hours after viral infection (Fig. 4).

293T 세포에 control vector, MARCH5 WT, MARCH5 HW (ligase activity 없음)와 MARCH5 RING domain deletion mutant를 각각 발현시킨 후, PR8-gfp바이러스를 감염시킨 뒤, 바이러스의 증식을 관찰하였다. 이때 MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 증가하였으며, RING mutant또는 RING domain deletion mutant를 발현시킨 세포에서는 바이러스의 증식이 감소한 것을 형광으로 관찰하였다. 또한 바이러스의 증식양을 정량적으로 관찰하기 위하여, 도 5A 와 같은 각 DNA를 세포에 발현시킨 뒤, 플라크 분석(plaque assay)를 실시한 결과, MARCH5 WT을 발현시킨 세포에서는 바이러스 복제가 증가하였고, RING mutant에서는 감소한 것을 관찰할 수 있었다. 형광의 양을 정량적으로 측정한 그래프에서도 바이러스 감염 24시간 후에 현저하게 MARCH5 WT에 의해 형광을 띈 바이러스의 증식이 증가한 것이 관찰되었다(도 5).
The control vector, MARCH5 WT, MARCH5 HW (no ligase activity) and MARCH5 RING domain deletion mutant were expressed in 293T cells, and the virus was proliferated after infection with PR8-gfp virus. At this time, virus proliferation increased in cells expressing MARCH5 WT, and fluorescence was observed in the cells expressing RING mutant or RING domain deletion mutant. In order to quantitatively observe the amount of virus to be proliferated, each of the DNAs as shown in FIG. 5A was expressed on the cells and subjected to a plaque assay. As a result, virus replication was increased in the cells expressing MARCH5 WT and RING mutant And the decrease was observed. A quantitative measurement of the amount of fluorescence also showed an increase in the proliferation of the fluorescence virus markedly by MARCH5 WT after 24 hours of viral infection (Fig. 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition with antiviral activity comprising inhibitor of MARCH5 expression and screening method thereof <130> ADP-2013-0321 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3941 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcttacctca caaaggtagc tcctccgccg gcagcaactc ggcgcccgcg gtccatggac 60 cggaacctcg ggccgacgga cgggaacccg ggccgcgatc gccgcctccc cgcctcaggc 120 tcctcctcct cgctctccgc cgcctccgcc ggactcccgc aggccctgca ccgccgccgc 180 caggctagcg gagctgcccc gggaagctgg gtgacgggtt cgcggctgcc gccggactgc 240 ggcctactcc gccgcctctc agtgctattg tccctgggcc tggccttgag cgggtccact 300 ggggaaggcc gtgtgcgccg gctccgcgga agatgccgga ccaagcccta cagcagatgc 360 tggacagaag ttgctgggtt tgttttgcta ctgatgaaga tgatagaaca gctgaatggg 420 tgagaccatg caggtgcaga ggatctacaa aatgggttca ccaggcctgt ctacaacgct 480 gggtggatga aaagcaaaga ggaaacagta cagccagagt ggcatgtcct cagtgcaatg 540 ctgaatacct aatagttttt ccaaaattgg gtccagtggt ttacgtcttg gatcttgcag 600 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ctgaggacca gagtggcctc tagccccgaa ttgaacactt ttaaacctaa 3180 agagccttat tattattagc tcgagaaata ccacatgcca gtcttcccag gaaggtgacc 3240 tgcctgacca tgaagcaaca aaagagcata ggcagactta aagttggata gacctgggtt 3300 caaatcatag ttcagctttc aataactgta tgtatgattt tggctaaagg atttgacttt 3360 ctctcaactg cagttttctt aatctttgaa atgcaaataa tgtttatctc agaagactat 3420 ttctaggatt aactgagaga ttaaaggaac agcagcactt aggctcaaaa tcgcccctac 3480 aaagcagtag ttgtttctta attgctaagt aatctgtttg cactctagga aaagtaaatg 3540 gagaggtaaa agaaaggcat tggggacaaa tgaaagagat gatgtagatt tttcggatgg 3600 gtgggtatat tttattttcc agtttatttt catatttctt tactgtgtta tttctggaaa 3660 ctttaatgtt ttaaacctct tttataaaat tcaatgacga ctactagaat tcttttcaaa 3720 agttaactta tctccaaagt ggctgaaaat attgtttacc attacatgat tatgaaatga 3780 ctgtgaagaa tataaaatta aacttagtga cttaattagt cactgccttg ctaactttgc 3840 tgtaattttt ttaaacgtct tgtttttaat atagcaaact atctcaatac tggctggatt 3900 aggttaaata aagaattttt atgttcaaaa aaaaaaaaaa a 3941 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Asp Gln Ala Leu Gln Gln Met Leu Asp Arg Ser Cys Trp Val 1 5 10 15 Cys Phe Ala Thr Asp Glu Asp Asp Arg Thr Ala Glu Trp Val Arg Pro 20 25 30 Cys Arg Cys Arg Gly Ser Thr Lys Trp Val His Gln Ala Cys Leu Gln 35 40 45 Arg Trp Val Asp Glu Lys Gln Arg Gly Asn Ser Thr Ala Arg Val Ala 50 55 60 Cys Pro Gln Cys Asn Ala Glu Tyr Leu Ile Val Phe Pro Lys Leu Gly 65 70 75 80 Pro Val Val Tyr Val Leu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Ile Ser Lys Ala 85 90 95 Cys Pro Phe Ala Ala Ala Gly Ile Met Val Gly Ser Ile Tyr Trp Thr 100 105 110 Ala Val Thr Tyr Gly Ala Val Thr Val Met Gln Val Val Gly His Lys 115 120 125 Glu Gly Leu Asp Val Met Glu Arg Ala Asp Pro Leu Phe Leu Leu Ile 130 135 140 Gly Leu Pro Thr Ile Pro Val Met Leu Ile Leu Gly Lys Met Ile Arg 145 150 155 160 Trp Glu Asp Tyr Val Leu Arg Leu Trp Arg Lys Tyr Ser Asn Lys Leu 165 170 175 Gln Ile Leu Asn Ser Ile Phe Pro Gly Ile Gly Cys Pro Val Pro Arg 180 185 190 Ile Pro Ala Glu Ala Asn Pro Leu Ala Asp His Val Ser Ala Thr Arg 195 200 205 Ile Leu Cys Gly Ala Leu Val Phe Pro Thr Ile Ala Thr Ile Val Gly 210 215 220 Lys Leu Met Phe Ser Ser Val Asn Ser Asn Leu Gln Arg Thr Ile Leu 225 230 235 240 Gly Gly Ile Ala Phe Val Ala Ile Lys Gly Ala Phe Lys Val Tyr Phe 245 250 255 Lys Gln Gln Gln Tyr Leu Arg Gln Ala His Arg Lys Ile Leu Asn Tyr 260 265 270 Pro Glu Gln Glu Glu Ala 275 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCH5 siRNA <400> 3 cucauccuga cgagucugu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCH5 siRNA <400> 4 cugauacuag gcaaaauga 19 <110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition with antiviral activity          inhibitor of MARCH5 expression and screening method thereof <130> ADP-2013-0321 <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 3941 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tcttacctca caaaggtagc tcctccgccg gcagcaactc ggcgcccgcg gtccatggac 60 cggaacctcg ggccgacgga cgggaacccg ggccgcgatc gccgcctccc cgcctcaggc 120 tcctcctcct cgctctccgc cgcctccgcc ggactcccgc aggccctgca ccgccgccgc 180 caggctagcg gagctgcccc gggaagctgg gtgacgggtt cgcggctgcc gccggactgc 240 ggcctactcc gccgcctctc agtgctattg tccctgggcc tggccttgag cgggtccact 300 ggggaaggcc gtgtgcgccg gctccgcgga agatgccgga ccaagcccta cagcagatgc 360 tggacagaag ttgctgggtt tgttttgcta ctgatgaaga tgatagaaca gctgaatggg 420 tgagaccatg caggtgcaga ggatctacaa aatgggttca ccaggcctgt ctacaacgct 480 gggtggatga aaagcaaaga ggaaacagta cagccagagt ggcatgtcct cagtgcaatg 540 ctgaatacct aatagttttt ccaaaattgg gtccagtggt ttacgtcttg gatcttgcag 600 atagactgat ctcaaaagcc tgtccatttg ctgcagcagg aataatggtc ggctctatct 660 attggacagc tgtgacttat ggagcagtga cagtgatgca ggttgtaggt cataaagaag 720 gtctggatgt tatggagaga gctgatcctt tattcctttt aattggactt cctactattc 780 ctgtcatgct gatattaggc aagatgattc gctgggagga ctatgtgctt agactgtggc 840 gcaaatactc gaataaacta caaattttaa atagtatatt tccagggata ggttgtcctg 900 ttcctcgaat tccagctgag gccaatcctt tagcagatca tgtctctgct actcgaatct 960 tgtgtggagc ccttgtcttt cctactattg ctacaatagt tggtaaattg atgttcagta 1020 gtgttaactc taatttacaa aggacaatct tgggtggaat tgcgtttgtt gccataaaag 1080 gagcatttaa agtttacttc aaacagcagc aatatttacg acaggcacac cgcaaaattc 1140 tgaattatcc agaacaagaa gaagcataaa actgacttct ggttgttctg cagttctctc 1200 atccttatga atctgttgtg ttgttttgat tccatcatta atgcacttgt ggagacttgt 1260 gataagctgc tgctcctata ttttttaaga aatataataa agcacttagg gcaggggaaa 1320 tcatctcggt aatcatggaa cctaaggatg tgatttgttt tcattgtttg tatgtactac 1380 ttttatggca gtcatatgaa ccattatctt agcatggtaa acctgggttt tgttcatatt 1440 ttctccagac agaaatgcaa agatcaaact gtgcaaatat taaaaaaatg cacatgctgt 1500 tttattcaaa tgcctctttt gtacatgttc atgtttagtg ttttctcaga atcagcaact 1560 caaggtacta tgaggatttt tctcactgac ataatttgat tacatactaa ataagaggat 1620 atgttaatat gaggaaatgt aaattaaatt agttataaat aaataaccaa aaatgtatgt 1680 aaacattcaa atgattatct gaacaaatga gattttgtgg tgttttcttt aacccatgtg 1740 atgtcctcca aaatgtgtag ggtaaaaatt cacagggctt ccagatcact ttttcaatat 1800 taaattttat ttacataatg ttgacatctc atacttcatg aagtaatttt gactcatgca 1860 gtcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tatttgtgtg tttcagtgtt 1920 tcatcaggtc cttccatctc tgggagtttt ttcaacccat atttctagaa attacagctg 1980 ccagtttata gtagtttgag cagaggatga tttgcaaaaa taaaaataaa gttattttac 2040 tctcctcttg cattgattca gttattgaga tattcgttga tcacctccta tttcccaggc 2100 actgtgcaga gtgctgtagg acatagtggt gaacaagaca gacttggtcc aagctcttac 2160 agagttgaca gtctagtttc agcacataga aaaccagcag tgaataaacc aaggtgaggc 2220 cttgagctct ttgtttttat attaatgagg agaaaagtat gaaaacaaga agtcttaagt 2280 aaatattgag gtcattgttt ttggcttaag tttattatag aaaatcaaca ctaatgtttt 2340 tagattttaa ttgtcctatt gatgaggcta gcaccttaat cactgtttag ttttgtattc 2400 atttttaaaa gcaattattg aagccatttt caatagattg gccattttaa tgttcagcaa 2460 cctgaatggt tatttttgtt aattaaaatt aaatttttaa gagatatttt caaaacccta 2520 tttattttct tgttcacagt aatgcatgtc aataataaat gtttcccctt actgataagc 2580 ggccacttta ggagtgtagc aaatatagat tgagctatgt tagtttgcaa taatatatgt 2640 taactttagt aattaaagac tggtttctat agtatgaatg tcttaatttt gagttatatg 2700 atgtttattt gaatgactgt tgaacattca aatttgtatt atttggagat gaagatttga 2760 ctaacagtga gccttattaa gaacactact acagttctga aggggaaata taacatctat 2820 ggttatatat tttaaaaact tagattatag gctgtaatta taaaatatat tggcttttgt 2880 tttcaatgtg aaagatacat taaatggaca catatcttgc aaaattttgt tgtatagaac 2940 agtttttagg cagcctttac taaagttatg caaacacaca gttccccatt tactacatta 3000 atgcccttga cagggagtag ctgcttggtt ttataggtat tagggctcat gaaggccggg 3060 gaacaactct aatccttttg gggcaggagg gagggttttt ttagggttgc ggggagggaa 3120 ctgcaagtgc ctgaggacca gagtggcctc tagccccgaa ttgaacactt ttaaacctaa 3180 agagccttat tattattagc tcgagaaata ccacatgcca gtcttcccag gaaggtgacc 3240 tgcctgacca tgaagcaaca aaagagcata ggcagactta aagttggata gacctgggtt 3300 caaatcatag ttcagctttc aataactgta tgtatgattt tggctaaagg atttgacttt 3360 ctctcaactg cagttttctt aatctttgaa atgcaaataa tgtttatctc agaagactat 3420 ttctaggatt aactgagaga ttaaaggaac agcagcactt aggctcaaaa tcgcccctac 3480 aaagcagtag ttgtttctta attgctaagt aatctgtttg cactctagga aaagtaaatg 3540 gagaggtaaa agaaaggcat tggggacaaa tgaaagagat gatgtagatt tttcggatgg 3600 gtgggtatat tttattttcc agtttatttt catatttctt tactgtgtta tttctggaaa 3660 ctttaatgtt ttaaacctct tttataaaat tcaatgacga ctactagaat tcttttcaaa 3720 agttaactta tctccaaagt ggctgaaaat attgtttacc attacatgat tatgaaatga 3780 ctgtgaagaa tataaaatta aacttagtga cttaattagt cactgccttg ctaactttgc 3840 tgtaattttt ttaaacgtct tgtttttaat atagcaaact atctcaatac tggctggatt 3900 aggttaaata aagaattttt atgttcaaaa aaaaaaaaaa a 3941 <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Asp Gln Ala Leu Gln Gln Met Leu Asp Arg Ser Cys Trp Val   1 5 10 15 Cys Phe Ala Thr Asp Glu Asp Asp Arg Thr Ala Glu Trp Val Arg Pro              20 25 30 Cys Arg Cys Arg Gly Ser Thr Lys Trp Val His Gln Ala Cys Leu Gln          35 40 45 Arg Trp Val Asp Glu Lys Gln Arg Gly Asn Ser Thr Ala Arg Val Ala      50 55 60 Cys Pro Gln Cys Asn Ala Glu Tyr Leu Ile Val Phe Pro Lys Leu Gly  65 70 75 80 Pro Val Val Tyr Val Leu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Ile Ser Lys Ala                  85 90 95 Cys Pro Phe Ala Ala Gly Ile Met Val Gly Ser Ile Tyr Trp Thr             100 105 110 Ala Val Thr Tyr Gly Ala Val Thr Val Met Gln Val Val Gly His Lys         115 120 125 Glu Gly Leu Asp Val Met Glu Arg Ala Asp Pro Leu Phe Leu Leu Ile     130 135 140 Gly Leu Pro Thr Ile Pro Val Met Leu Ile Leu Gly Lys Met Ile Arg 145 150 155 160 Trp Glu Asp Tyr Val Leu Arg Leu Trp Arg Lys Tyr Ser Asn Lys Leu                 165 170 175 Gln Ile Leu Asn Ser Ile Phe Pro Gly Ile Gly Cys Pro Val Pro Arg             180 185 190 Ile Pro Ala Glu Ala Asn Pro Leu Ala Asp His Val Ser Ala Thr Arg         195 200 205 Ile Leu Cys Gly Ala Leu Val Phe Pro Thr Ile Ala Thr Ile Val Gly     210 215 220 Lys Leu Met Phe Ser Ser Val Asn Ser Asn Leu Gln Arg Thr Ile Leu 225 230 235 240 Gly Gly Ile Ala Phe Val Ala Ile Lys Gly Ala Phe Lys Val Tyr Phe                 245 250 255 Lys Gln Gln Gln Tyr Leu Arg Gln Ala His Arg Lys Ile Leu Asn Tyr             260 265 270 Pro Glu Gln Glu Glu Ala         275 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCH5 siRNA <400> 3 cucauccuga cgagucugu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MARCH5 siRNA <400> 4 cugauacuag gcaaaauga 19

Claims (10)

미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 유전자 발현 억제제를 유효성분으로 포함하며, 상기 억제제는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 siRNA이며, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV) 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스(H1N1 influenza virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 항바이러스용 약학 조성물.Wherein the inhibitor is an siRNA represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4, wherein the inhibitor is a vesicular stomatitis virus (VSV), a mitochondrial E3 ubiquitin ligase (MARCH5) gene expression inhibitor, Or an H1N1 influenza virus (H1N1 influenza virus). 제1항에 있어서, 상기 MARCH5 유전자는 서열번호 1로 표시된 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학 조성물.2. The antiviral pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the MARCH5 gene is represented by SEQ ID NO: 1. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete MARCH5 유전자 또는 MARCH5 단백질을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
상기 시험물질을 접촉한 세포에서 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도를 측정하는 단계; 및
대조구 시료와 비교하여 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV) 또는 H1N1 인플루엔자 바이러스(H1N1 influenza virus)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 항바이러스제 스크리닝 방법.Contacting the test substance with a cell comprising the MARCH5 gene or the MARCH5 protein;
Measuring the level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity in cells in contact with the test substance; And
Comprising the step of selecting a test substance having decreased MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity as compared to a control sample, comprising the steps of: (a) Antiviral agent. 제8항에 있어서, 상기 MARCH5 유전자 발현 또는 MARCH5 단백질 활성 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 항바이러스제 스크리닝 방법.9. The method according to claim 8, wherein the level of MARCH5 gene expression or MARCH5 protein activity is determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, Western blotting ) And flow cytometry (FACS). &Lt; RTI ID = 0.0 &gt; 11. &lt; / RTI &gt; 삭제delete

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