KR101568336B1 - Cell producing mutant of target protein, preparing method thereof, and producing method of mutant of target protein using the cell - Google Patents
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Abstract
본원은, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포, 그 제조 방법, 및 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cell that produces a mutant of a target protein, a method for producing the same, and a method for producing a mutant of the target protein.
Description
본원은, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포, 상기 세포의 제조 방법, 및 상기 세포를 이용한 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a cell that produces a mutant of a target protein, a method for producing the cell, and a method for producing a mutant of the target protein using the cell.
단백질 구조 및 기능 연구 방법에 있어서, 새로운 작용기를 가지는 비천연 아미노산을 특정 단백질 내로 도입함으로써 단백질 돌연변이체를 생성하는 실험 기법이 사용되고 있다. 이와 관련하여, 수십 종류의 비천연 아미노산이 유전적인 방법에 의하여 단백질 내로 성공적으로 도입된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허 제2009-0100407호는 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도에 대하여 개시하고 있다. 이러한 비천연 아미노산 중에, 티로신(Tyr) 또는 페닐알라닌(Phe) 유도체와 같은 비교적 간단한 비천연 아미노산들이 현재 상업적으로 이용가능하다. 그러나, 상기 비천연 아미노산들은 대부분 가격이 비싸고, 생화학적으로 흥미로운 비천연 아미노산의 대부분은 아직 상업적으로 이용이 불가능하며, 다단계 합성을 통하여 제조되어야 한다. 광학적으로 순수한 비천연 아미노산을 합성하는 경우, 키랄(chiral) 중심이 아미노산과 같은 자연 발생 화합물로부터 유래되는 경우 외에는 훨씬 많은 노력이 요구된다. 또한, 표준 발현 조건(standard expression condition)이 고농도의 비천연 아미노산(전형적으로 1 mM 또는 그 이상)을 필요로 하고, 라세미(racemic) 비천연 아미노산이 사용된다면, 유효 농도가 반으로 감소된다. 따라서, 숙주 세포 내로 비천연 아미노산을 공급하기 위한, 경제적이고 노동 집약적이지 않은 신기술의 개발이 요구되고 있다.
In the method of studying protein structure and function, an experimental technique of generating a protein mutant by introducing a non-natural amino acid having a new functional group into a specific protein is used. In this regard, dozens of unnatural amino acids have been successfully introduced into proteins by genetic methods. For example, Korean Patent Publication No. 2009-0100407 discloses compositions containing unnatural amino acids and polypeptides, methods involving unnatural amino acids and polypeptides, and uses of unnatural amino acids and polypeptides. Of these unnatural amino acids, relatively simple unnatural amino acids such as tyrosine (Tyr) or phenylalanine (Phe) derivatives are currently commercially available. However, most of these unnatural amino acids are expensive, and most of the unnatural amino acids that are biochemically interesting are not commercially available yet and must be prepared through multistage synthesis. When optically pure unnatural amino acids are synthesized, much more effort is required than when chiral centers are derived from naturally occurring compounds such as amino acids. Also, if standard expression conditions require high concentrations of unnatural amino acids (typically 1 mM or more) and racemic unnatural amino acids are used, the effective concentration is reduced by half. Thus, there is a need for the development of new, economical and labor-intensive technologies for supplying unnatural amino acids into host cells.
본원은, 숙주 세포에 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)의 유전자, 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 도입하고, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 포함된 세 개의 연속된 코돈을 상기 정지 코돈으로 치환시킨 후, 상기 숙주 세포를 비천연 아미노산의 전구체가 포함된 배지 내에서 배양함으로써 상기 숙주 세포가 상기 비천연 아미노산의 전구체를 스스로 비천연 아미노산으로 전환시키고 이를 스스로 단백질 내에 도입하도록 하는 것에 관한 것이다.The present invention relates to a method for introducing a gene of aminotransferase, a gene of tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of aminoacyl-tRNA synthetase, which transfers unnatural amino acid to the tRNA, into a host cell, Replacing the three consecutive codons contained in the nucleic acid sequence with the stop codon and then culturing the host cell in a medium containing a precursor of the unnatural amino acid so that the host cell can form a precursor of the unnatural amino acid itself non- Amino acid and allowing it to be introduced into the protein by itself.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
However, the problems to be solved by the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본원의 제 1 측면은, 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)의 유전자, 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 숙주 세포 내부로 도입하고, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 포함된 세 개의 연속된 코돈을 상기 정지 코돈으로 치환시키는 것을 포함하는, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법을 제공할 수 있다.The first aspect of the present invention relates to a method for introducing a gene of aminotransferase, a gene of tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of aminoacyl tRNA synthetase which transfers unnatural amino acid to the tRNA, There is provided a method for producing a mutant of a target protein, which comprises replacing three consecutive codons contained in a nucleic acid sequence encoding a target protein with the stop codon .
본원의 제 2 측면은, 세포 내에 유전적으로 도입된 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 포함하며, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 중 세 개의 연속된 코돈이 상기 정지 코돈으로 치환된 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포를 제공할 수 있다.The second aspect of the present invention includes a gene of an aminotransferase gene genetically introduced into a cell, a gene of a tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase that transfers an unnatural amino acid to the tRNA, Wherein the three consecutive codons in the nucleic acid sequence coding for the protein are replaced with the stop codon, to produce a mutant of the desired protein.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면의 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포를 비천연 아미노산 전구체를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
A third aspect of the present invention provides a method for producing a mutant of a protein of interest, which comprises culturing a cell that produces a mutant of the protein of interest of the second aspect of the present invention in a medium containing an unnatural amino acid precursor have.
본원에 따르면, 배지 내의 비천연 아미노산 전구체를 세포 내에서 비천연 아미노산으로 전환하고, 이를 단백질 내로 직접 도입하는 것이 가능한 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포를 제조할 수 있다. 본원에 의한 비천연 아미노산의 단백질 내로의 도입 효율은, 비천연 아미노산을 직접 도입하는 효율과 유사하게 높은 효율을 나타낸다. According to the present invention, it is possible to produce a cell that produces a mutant of a target protein, which is capable of converting an unnatural amino acid precursor in a medium into a non-natural amino acid in a cell and directly introducing it into the protein. The introduction efficiency of the unnatural amino acid into the protein according to the present invention shows a high efficiency similarly to the efficiency of directly introducing the unnatural amino acid.
본원의 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포 및 이를 이용한 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법은 비천연 아미노산을 포함하는 목적 단백질의 돌연변이체를 용이하게 합성할 수 있으며, 나아가, 비천연 아미노산을 합성하고 도입시킬 수 있는 독립적인(autonomous) 비천연 유기체의 개발을 위한 기폭제를 제공할 수 있다.
Cells which produce mutants of the target protein of the present invention and methods for producing mutants of the target proteins using the same can easily synthesize mutants of a target protein containing unnatural amino acids and further synthesize unnatural amino acids It is possible to provide an initiator for the development of an autonomous, non-natural organism that can be introduced.
도 1은 3-페닐프로피오닉산(3-phenylpropionic acid)과 착화된 글루타민 아미노트랜스퍼라제의 X-선 결정 구조를 나타낸 이미지이다.
도 2a는 본원의 일 실시예에서 사용된 α-케토산의 구조식이고, 도 2b 내지 도 2j는 본원의 일 실시예에서 사용된 α-케토산 제조 과정을 나타내는 반응식이다.
도 3a 내지 도 3d는 본원의 일 실시예에 따른 아미노기 전이 반응 결과물의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 내지 도 4d는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 비천연 아미노산들의 LCMS(Liquid Chromatography Mass Spectrometry)를 이용한 질량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5e는 본원의 일 실시예에 따른 효소의 아미노기 전이반응의 속도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6d는 본원의 일 실시예에 따라 배양된 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 배양 배지를 HPLC 트레이스(trace) 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따라 제조된 목적 단백질의 돌연변이체의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 이미지이다.
도 8은 본원의 일 실시예에서 사용된 써모스 써모필러스(Thurmus thermophilus, HB8)의 글루타민 아미노트랜스퍼라제 및 이에 상응하는 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 이미지이다.
도 9a 및 도 9b는 본원의 일 실시예에 따라 제조된 목적 단백질의 돌연변이체의 SDS-PAGE 분석 결과(도 9a) 및 MALDI-TOF 분석 결과(도 9b)를 나타낸 이미지이다.
도 10은 본원의 일 실시예에서 글루타민 아미노트랜스퍼라제를 대장균(E.coli)내로 도입하기 위해 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 11은 본원의 일 실시예에서 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소를 세포 내부로 도입하기 위하여 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 12는 본원의 일 실시예에서 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소를 세포 내부로 도입하기 위하여 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 13은 본원의 일 실시예에서 tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성효소를 세포 내부로 도입하기 위하여 사용된 벡터의 구조를 나타낸 개략도이다.1 is an image showing the X-ray crystal structure of glutamine aminotransferase complexed with 3-phenylpropionic acid.
2A is a structural formula of? -Keto acid used in one embodiment of the present invention, and FIGS. 2B to 2J are reaction formulas showing a production process of? -Keto acid used in one embodiment of the present invention.
FIGS. 3A to 3D are graphs showing the results of HPLC analysis of the amino acid transfer reaction products according to one embodiment of the present invention. FIG.
4A to 4D are graphs showing mass spectrometry results of LCMS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) of unnatural amino acids prepared according to one embodiment of the present invention.
FIGS. 5A through 5E are graphs illustrating the rate of amino-transfer reaction of an enzyme according to one embodiment of the present invention. FIG.
FIGS. 6A to 6D are graphs showing the results of HPLC trace analysis of a culture medium of cells producing a mutant of a target protein cultured according to an embodiment of the present invention. FIG.
7 is an image showing the results of SDS-PAGE analysis of a mutant of a target protein prepared according to one embodiment of the present invention.
Figure 8 is an image of a pair of glutamine aminotransferase and corresponding tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase of Thurmus thermophilus (HB8) used in one embodiment of the present invention.
9A and 9B are images showing SDS-PAGE analysis results (FIG. 9A) and MALDI-TOF analysis results (FIG. 9B) of a mutant of a target protein prepared according to an embodiment of the present invention.
10 is a schematic diagram illustrating the structure of a vector used to introduce glutamine aminotransferase into E. coli in one embodiment of the present application.
11 is a schematic diagram showing the structure of a vector used to introduce tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase into a cell in an embodiment of the present invention.
12 is a schematic diagram showing the structure of a vector used for introducing tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase into a cell in one embodiment of the present invention.
13 is a schematic diagram showing the structure of a vector used for introducing tRNA and aminoacyl-tRNA synthetase into a cell in one embodiment of the present invention.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings so that those skilled in the art can easily carry out the present invention. It should be understood, however, that the present invention may be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. In the drawings, the same reference numbers are used throughout the specification to refer to the same or like parts.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. Throughout this specification, when a part is referred to as being "connected" to another part, it is not limited to a case where it is "directly connected" but also includes the case where it is "electrically connected" do.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.Throughout this specification, when a member is "on " another member, it includes not only when the member is in contact with the other member, but also when there is another member between the two members.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.Throughout this specification, when an element is referred to as "including " an element, it is understood that the element may include other elements as well, without departing from the other elements unless specifically stated otherwise. The terms "about "," substantially ", etc. used to the extent that they are used throughout the specification are intended to be taken to mean the approximation of the manufacturing and material tolerances inherent in the stated sense, Accurate or absolute numbers are used to help prevent unauthorized exploitation by unauthorized intruders of the referenced disclosure. The word " step (or step) "or" step "used to the extent that it is used throughout the specification does not mean" step for.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term "combination thereof" included in the expression of the machine form means one or more combinations or combinations selected from the group consisting of the constituents described in the expression of the machine form, And the like.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.Throughout this specification, the description of "A and / or B" means "A or B, or A and B".
본원 명세서 전체에서, "비천연 아미노산"은 20 가지 통상의 아미노산, 파이로리신, 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭하며; 용어 "비천연 아미노산"과 유사한 의미로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비천연적으로 코딩된 아미노산", "자연적으로 존재하지 않는 아미노산" 등이 있다. "비천연 아미노산"은 천연적으로 코딩된 아미노산의 변형에 의해 자연적으로 발생하나, 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩티드 내로 도입되지는 않는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 천연적으로 코딩된 아미노산이란, 20 가지 통상의 아미노산 또는 파이로리신 또는 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
Throughout this specification, "unnatural amino acid" refers to an amino acid that is not one of the 20 common amino acids, pyrosinine, or selenocysteine; Other terms that can be used in a similar sense to the term " unnatural amino acid "include" non-cirrhically coded amino acid ","naturally occurring amino acid ", and the like. An "unnatural amino acid" includes, but is not limited to, an amino acid that occurs naturally by modification of a naturally encoded amino acid, but which is not itself introduced into a polypeptide grown by a translation complex. Such naturally encoded amino acids include, but are not limited to, 20 common amino acids or pyrosinine or selenocysteine.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명하나, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments and examples of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, but the present invention is not limited thereto.
본원의 제 1 측면은, 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase)의 유전자, 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 숙주 세포 내부로 도입하고, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 포함된 세 개의 연속된 코돈을 상기 정지 코돈으로 치환시키는 것을 포함하는 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법에 관한 것이다.The first aspect of the present invention relates to a method for introducing a gene of aminotransferase, a gene of tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of aminoacyl tRNA synthetase which transfers unnatural amino acid to the tRNA, And replacing the three consecutive codons contained in the nucleic acid sequence coding for the target protein with the stop codon to produce a mutant of the desired protein.
본원의 일 구현예에 의하여 제조된 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포는, 비천연 아미노산(Unnatural Amino Acids, UAAs)을 써모스 써모필러스(Thurmus thermophilus, HB8)의 글루타민 아미노트랜스퍼라제(glutamine aminotransferase)를 이용하여 대응하는 α-케토산으로부터 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. Cells that produce mutants of the target protein produced according to one embodiment of the present invention can be obtained by transforming unnatural amino acids (UAAs) with glutamine aminotransferase of Thurmus thermophilus (HB8) May be synthesized from the corresponding? -Keto acid using, but not limited to,? -Keto acid.
상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제 효소는 천연 기질에 대해 나타내는 활성에 비해 약간 감소된 활성으로, 비천연 기질의 전환(conversion)을 효율적으로 촉진할 수 있다. 상기 α-케토산은 상기 세포 내에서 상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제에 의하여 대응하는 비천연 아미노산으로 전환되며, 상기 비천연 아미노산은 단백질 내로 직접 도입될 수 있다. 상기 α-케토산을 이용하여 수득된 도입 효율은 비천연 아미노산을 직접적으로 이용하여 수득된 효율과 유사하였다. α-케토산은 키랄 중심(chiral center)이 없으며 용이하게 합성에 이용할 수 있기 때문에, 본원의 방법은 유전적 도입 기술을 더욱 향상시킬 것이며, 광학적으로 순수한 비천연 아미노산의 제조에 대한 새로운 접근법을 제시할 수 있다. The glutamine aminotransferase enzyme can efficiently promote the conversion of the unnatural substrate with a slightly reduced activity compared to the activity exhibited for the natural substrate. The α-keto acid is converted in the cell to the corresponding unnatural amino acid by the glutamine aminotransferase, and the unnatural amino acid can be directly introduced into the protein. The introduction efficiency obtained using the [alpha] -keto acid was similar to that obtained by using the unnatural amino acid directly. Since α-keto acids are free of chiral centers and are readily available for synthesis, the present methods will further improve the genetic introduction technology and present a novel approach to the production of optically pure unnatural amino acids can do.
또한, 본원발명은 비천연 아미노산을 합성하고 도입시킬 수 있는 독립적인(autonomous) 비천연 유기체의 개발을 위한 기폭제를 제공할 수 있다.In addition, the present invention can provide an initiator for the development of an autonomous, non-natural organism capable of synthesizing and introducing unnatural amino acids.
여러 가지 유용한 방법이 단백질에 비천연 아미노산을 도입하기 위하여 사용될 수 있음에도 불구하고, 최근 개발된 유전학적 방법이 기술적으로 단순하고 효율이 높아, 유전학적 방법에 의한 비천연 아미노산 도입 및 응용의 수가 증가되어 왔다. 이러한 유전학적 방법에 있어서, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질 돌연변이체를 생합성하기 위해 요구되는 대부분의 성분은 발달된 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 (tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS) 쌍의 유전자를 함유하는 플라스미드 및 목적 단백질이 도입된 숙주 세포(host cell)에 의하여 제공된다. 유일한 예외적 요소는 비천연 아미노산이며, 상기 비천연 아미노산은 성장 배지로부터 공급되어야 한다. Although many useful methods can be used to introduce unnatural amino acids into proteins, recently developed genetic methods are technically simple and highly efficient, increasing the number of unnatural amino acid introductions and applications by genetic methods come. In this genetic approach, most of the components required to biosynthesize protein mutants containing unnatural amino acids are the genes for the tRNA / aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) pair of tRNAs And a host cell into which the target protein is introduced. The only exceptional element is the unnatural amino acid, which must be fed from the growth medium.
그러나, 상기한 바와 같이 비천연 아미노산들은 대부분 가격이 비싸고, 생화학적으로 흥미로운 비천연 아미노산의 대부분은 상업적으로 이용이 불가능하며, 복잡한 다단계 합성을 통하여 제조되어야 한다. 이러한 고비용 및 저효율 문제를 해결하기 위한 접근법 중 하나는 간단한 매개체를 이용하여 숙주 세포 내에서 비천연 아미노산을 생합성하는 것이며, 이것은 상기 유전학적 방법의 효율을 향상시킬 수 있다. 또한, 비천연 아미노산의 생합성은 비천연 아미노산을 합성하고 단백질 내로 도입할 수 있는 비천연 유기체의 디자인을 가능케 할 것이다. 본원에서는 아미노트랜스퍼라제를 발현시키는 세포에 의하여 용이하게 합성에 이용할 수 있는 매개체로부터 생합성되고 직접 단백질로 도입될 수 있는 비천연 아미노산에 대하여 개시한다.However, as noted above, non-natural amino acids are mostly expensive and most of the unnatural amino acids that are biochemically interesting are not commercially available and must be made through complex multi-step synthesis. One approach to addressing these high cost and low efficiency problems is to biosynthesize unnatural amino acids in host cells using simple mediators, which can improve the efficiency of the genetic method. In addition, the biosynthesis of unnatural amino acids will enable the design of non-natural organisms that can synthesize unnatural amino acids and introduce them into proteins. Naturally occurring amino acids that can be biosynthesized from a mediator that can be readily synthesized by cells expressing the amino transferase and directly introduced into the protein are disclosed herein.
아미노트랜스퍼라제는 피리독살 5'-포스페이트(pyridoxal 5'-phosphate)를 조효소로서 이용함으로써 아미노산 및 α-케토산을 각각 대응하는 α-케토산 및 대응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노기 전이반응을 가역적으로 촉매화시키는 효소이다. 다양한 종으로부터 많은 아미노트랜스퍼라제가 클로닝(cloned) 되었고 기능적 및 구조적 특성이 분석된 바 있다.Aminotransferase reversibly catalyzes the transamination of amino acids, which converts pyridoxal 5'-phosphate (5'-phosphate) as a coenzyme and converts the amino acid and a-keto acid to the corresponding? -Keto acid and the corresponding amino acid, respectively It is an enzyme that rotates. Many aminotransferases from various species have been cloned and their functional and structural properties have been analyzed.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질의 돌연변이체는 상기 목적 단백질 서열 내에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 비천연 아미노산은 4-아세틸-L-페닐알라닌(4-acetyl-L-phenylalanine), 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine), 4-페닐-L-페닐알라닌(4-phenyl-L-phenylalanine), 4-시아노-L-페닐알라닌(4-cyano-L-phenylalanine), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. According to one embodiment of the present invention, the mutant of the target protein may include, but is not limited to, the unnatural amino acid in the target protein sequence. For example, the unnatural amino acid may be 4-acetyl-L-phenylalanine, 4-azido-L-phenylalanine, But are not limited to, those selected from the group consisting of phenylalanine, 4-phenyl-L-phenylalanine, 4-cyano-L-phenylalanine, .
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포는, 배양 배지 내에 존재하는 비천연 아미노산 전구체를 세포 내부에서 상기 아미노트랜스퍼라제를 이용하여 상기 비천연 아미노산으로 전환시키고, 상기 비천연 아미노산은 상기 아미노아실 tRNA 합성효소 및 상기 tRNA에 의하여 상기 치환된 코돈에 대응하는 상기 목적 단백질 내의 위치에 삽입되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the mutant cell of the target protein is produced by converting a non-natural amino acid precursor present in the culture medium into the unnatural amino acid in the cell using the amino transferase, The natural amino acid may be inserted into the amino acid tRNA synthetase and the target protein corresponding to the substituted codon by the tRNA, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자는 글루타민 아미노트랜스퍼라제(GlnAT)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 특히 써모스 써모필러스(Thermus thermophilus) HB8 의 글루타민 아미노트랜스퍼라제(ttGlnAT)가 높은 활성 및 다양한 방향족 아미노산 및 α-케토산에 대한 폭넓은 기질 특이성을 나타낸 것으로 보고된 바 있다.According to one embodiment of the present invention, the gene of the aminotransferase may include but is not limited to glutamine aminotransferase (GlnAT). For example, in particular, Thermus Thermophilus HB8 glutamine aminotransferase (ttGlnAT) has been reported to exhibit high activity and broad substrate specificity for various aromatic amino acids and a-keto acids.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제는, 써모스 써모필러스의 글루타민 아미노트랜스퍼라제(ttGlnAT)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 도 1은 3-페닐프로피오닉산(3-phenylpropionic acid)과 착화된 상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제의 X-선 결정 구조를 나타낸 이미지로서, 피리독살 5'-포스페이트 및 3-페닐프로피오닉산이 막대 모양으로 표시되며, 3-페닐프로피오닉산으로부터 8 Å 이내의 잔기들이 선으로 표시된다. 도 1에 나타난 바에 따르면, 상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제는 4-위치가 치환된 α-케토산을 수용하기 위한 여유 공간(extra space)을 포함한다. 즉, 상기 구조는 3-페닐프로피오닉산의 결합 부위가 4-위치에서 치환된 방향족 α-케토산을 수용하기 위한 여유 공간을 포함함을 보여준다.According to one embodiment of the present invention, the glutamine aminotransferase may include, but not limited to, glutamine aminotransferase (ttGlnAT) of Thermus thermophilus. 1 is an image showing an X-ray crystal structure of the glutamine aminotransferase complexed with 3-phenylpropionic acid, wherein pyridoxal 5'-phosphate and 3-phenylpropionic acid are rod-shaped And residues within 8 Å from 3-phenylpropionic acid are indicated by lines. As shown in Fig. 1, the glutamine aminotransferase contains an extra space to accommodate the 4-substituted? -Keto acid. That is, the structure shows that the binding site of the 3-phenylpropionic acid contains a free space for accommodating the aromatic? -Keto acid substituted at the 4-position.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산은 티로신(tyrosine, Tyr) 또는 페닐알라닌(phenylalanine, Phe)으로부터 유도된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 티로신(Tyr) 및 페닐알라닌(Phe)은 성공적으로 도입된 비천연 아미노산들의 대략 50%가 속하는 범주이므로, 비천연 아미노산이 효소에 의하여 생합성될 목적 비천연 아미노산으로서 고려될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid may include, but is not limited to, those derived from tyrosine (Tyr) or phenylalanine (Phe). Tyrosine (Tyr) and phenylalanine (Phe) are categories in which roughly 50% of the unnatural amino acids successfully introduced belong, so that unnatural amino acids can be considered as unnatural amino acids for purposes of being biosynthesized by enzymes, have.
예를 들어, 상기 비천연 아미노산의 전구체로서 α-케토산이 사용될 수 있으며, 상기 α-케토산 분자는 용이하게 합성에 이용할 수 있고 입체특이적 방법으로 아미노기를 가지는 케톤을 대체시킴으로써 단일 단계에 의하여 효소에 의해 아미노산으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.For example, alpha -keto acid can be used as a precursor of the unnatural amino acid, and the alpha -keto acid molecule can be easily synthesized and substituted by a single step by substituting a ketone having an amino group in a stereospecific manner Can be converted to an amino acid by an enzyme, but it may not be limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산은 4-위치(4-position)에 페닐기를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 도 1에 나타난 바에 따르면, 3-페닐프로피오닉산(3-phenylpropionic acid)과 착화된 GlnAT의 X-선 결정 구조는 페닐 고리(phenyl ring)가 소수성 포켓(pocket)에 위치되며, 4-위치가 치환된 방향족 α-케토산을 수용하기 위한 여유 공간(extra space)을 포함한다. 페닐알라닌 또는 티로신으로부터 유래되는 대부분의 유전적으로 도입된 비천연 아미노산들은 4-위치가 치환되어 있다. 따라서, 상기 GlnAT는 폭넓은 기질 특이성으로 방향족 α-케토산을 인식하고 이들을 대응하는 아미노산으로 전환시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid may contain, but not be limited to, a phenyl group at the 4-position. 1, the X-ray crystal structure of GlnAT complexed with 3-phenylpropionic acid indicates that the phenyl ring is located in the hydrophobic pocket and the 4-position And an extra space for accommodating the substituted aromatic? -Keto acid. Most genetically introduced unnatural amino acids derived from phenylalanine or tyrosine are substituted at the 4-position. Thus, the GlnAT may be, but not limited to, recognizing aromatic? -Keto acids with a wide range of substrate specificities and converting them to corresponding amino acids.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산은 4-아세틸-L-페닐알라닌(4-acetyl-L-phenylalanine, AcF), 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine, AzF), 4-페닐-L-페닐알라닌(4-phenyl-L-phenylalanine, PhP), 4-시아노-L-페닐알라닌(4-cyano-L-phenylalanine, CNF), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment, the unnatural amino acid is 4-acetyl-L-phenylalanine, AcF, 4-azido-L-phenylalanine, AzF ), 4-phenyl-L-phenylalanine (PhP), 4-cyano-L-phenylalanine, CNF and combinations thereof. But may not be limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어 상기 원핵 세포는 대장균을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 진핵 세포는 효모 및/또는 포유동물의 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the host cell may include, but is not limited to, prokaryotic cells and eukaryotic cells. For example, the prokaryotic cell may be E. coli, and the eukaryotic cell may include yeast cells and / or mammalian cells, but the present invention is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 상기 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 상기 숙주 세포 내부로 도입하는 것은, 상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 상기 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자 중 하나 이상을 포함하는 벡터(vector)를 상기 숙주 세포 내부로 도입하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, a gene of the amino transferase, a gene of the tRNA corresponding to the stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase that transfers the unnatural amino acid to the tRNA are introduced into the host cell , A vector comprising at least one of the gene of the amino transferase, the gene of the tRNA corresponding to the stop codon, and the gene of the aminoacyl tRNA synthetase which transfers the unnatural amino acid to the tRNA, But it is not limited thereto.
본원의 제 2 측면은, 세포 내에 유전적으로 도입된 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 포함하며, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 중 세 개의 연속된 코돈이 상기 정지 코돈으로 치환된 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포를 제공할 수 있다.The second aspect of the present invention includes a gene of an aminotransferase gene genetically introduced into a cell, a gene of a tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase that transfers an unnatural amino acid to the tRNA, Wherein the three consecutive codons in the nucleic acid sequence coding for the protein are replaced with the stop codon, to produce a mutant of the desired protein.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자는 글루타민 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the gene of the aminotransferase may include, but not limited to, glutamine aminotransferase.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, the cells may include, but are not limited to, prokaryotic cells and eukaryotic cells.
본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포를 비천연 아미노산 전구체를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법을 제공할 수 있다.A third aspect of the present invention provides a method for producing a mutant of a protein of interest, which comprises culturing a cell producing a mutant of the protein of interest according to the second aspect of the present invention in a medium containing an unnatural amino acid precursor .
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질의 돌연변이체는 상기 목적 단백질 서열 내에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the mutant of the target protein may include, but is not limited to, the unnatural amino acid in the target protein sequence.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산 전구체가 상기 아미노트랜스퍼라제에 의하여 상기 세포 내부에서 비천연 아미노산으로 전환되고, 상기 비천연 아미노산은 상기 세포 내부에서 상기 아미노아실 tRNA 합성효소 및 상기 tRNA에 의하여 상기 치환된 코돈에 대응하는 상기 목적 단백질 내의 위치에 삽입되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the unnatural amino acid precursor is converted into a non-natural amino acid within the cell by the aminotransferase, and the unnatural amino acid is converted into the aminoacyl tRNA synthetase and the tRNA Inserted into a position in the target protein corresponding to the substituted codon, but the present invention is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산 전구체는 4-위치에 페닐기를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid precursor may contain, but not be limited to, a phenyl group at the 4-position.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산 전구체는 α-케토산(α-keto acid)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid precursor may include, but is not limited to, α-keto acid.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 α-케토산은 4-아세틸페닐피루브산(4-acetylphenylpyruvic acid, AcPPA), 4-아지도페닐피루브산(4-azidophenylpyruvic acid, AzPPA), 4-페닐페닐피루브산(4-phenylphenylpyruvic acid, PhPPA), 4-시아노페닐피루브산(4-cyanophenylpyruvic acid, CNPPA), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the α-keto acid is selected from the group consisting of 4-acetylphenylpyruvic acid (AcPPA), 4-azidophenylpyruvic acid (AzPPA), 4-phenylphenylpyruvic acid 4-cyanophenylpyruvic acid (CNPPA), and combinations thereof. The term " polyphenylpyruvic acid "
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산은 4-위치(4-position)에 페닐기를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid may contain, but not be limited to, a phenyl group at the 4-position.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 비천연 아미노산은 4-아세틸-L-페닐알라닌, 4-아지도-L-페닐알라닌, 4-페닐-L-페닐알라닌, 4-시아노-L-페닐알라닌, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.According to one embodiment of the present invention, the unnatural amino acid is 4-acetyl-L-phenylalanine, 4-azido-L-phenylalanine, 4-phenyl- But are not limited to, those selected from the group consisting of combinations.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 단백질 돌연변이체는 상기 세포 외로 배출되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
According to one embodiment of the present invention, the protein mutant may include, but is not limited to, being released from the cell.
이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 보다 더 구체적으로 설명하지만, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
[[ 실시예Example ]]
본 실시예에서, 모든 화합물 및 DNA 올리고머는 상업적 소스로부터 수득되었고 추가 정제 없이 사용되었다. 1H NMR 및 13C NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란(tetratmethylsilane)에 대하여 기록되는 화학적 이동(chemical shifts)을 이용하여 베리안 제미니-400 (Varian Gemini-400) (1H에 대해 400 MHz, 및 13C에 대해 100 MHz), 또는 베리안 이노바-500 (Varian Inova-500) (1H에 대해 500 MHz, 및 13C에 대해 125 MHz) 분광기를 이용하여 수득되었다.In this example, all compounds and DNA oligomers were obtained from commercial sources and used without further purification. 1 H NMR and 13 C NMR spectra were recorded on a Varian Gemini-400 (400 MHz for 1 H and 13 C for 1 H) using chemical shifts recorded for
[α-[? - 케토산의Keto-acid 제조] Produce]
본 실시예에서는, 글루타민 아미노트랜스퍼라제(GlnAT)가 비천연 방향족 α-케토산을 인식하는지를 확인하기 위하여, His6-태깅된 GlnAT가 발현 및 정제되었고, 4 종류의 α-케토산이 제조되었다 (도 2a 참조). 도 2a의 A는 비교예로서 페닐피루브산(phenylpyruvic acid) 및 L-페닐알라닌(L-phenylalanine), B는 4-아세틸페닐피루브산(4-acetylphenylpyruvic acid, AcPPA) 및 4-아세틸-L-페닐알라닌(4-acetyl-L-phenylalanine, AcF), C는 4-아지도페닐피루브산(4-azidophenylpyruvic acid, AzPPA) 및 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine, AzF), D는 4-페닐페닐피루브산(4-phenylphenylpyruvic acid, PhPPA) 및 4-페닐-L-페닐알라닌(4-phenyl-L-phenylalanine, PhF), 및 E는 4-시아노페닐피루브산(4-cyanophenylpyruvic acid, CNPPA) 및 4-시아노-L-페닐알라닌(4-cyano-L-phenylalanine, CNF)이다.In this example, to confirm that glutamine aminotransferase (GlnAT) recognizes unnatural aromatic? -Keto acid, His 6 -tagged GlnAT was expressed and purified and four kinds of? -Keto acids were prepared 2a). 2A is a comparative example of phenylpyruvic acid and L-phenylalanine, B is 4-acetylphenylpyruvic acid (AcPPA) and 4-acetyl-L-phenylalanine (4- acetyl-L-phenylalanine, AcF), C is 4-azidophenylpyruvic acid (AzPPA) and 4-azido-L-phenylalanine (AzF) 4-phenyl-L-phenylalanine, PhF, and 4-cyanophenylpyruvic acid (CNPPA) and 4 (phenylphenylpyruvic acid, Cyano-L-phenylalanine (CNF).
도 2b를 참고하여 볼 때, 1a-1d에서 이중 결합의 입체화학(stereochemistry)은 화학적 이동의 이론적인 값 및 메틴 프로톤의 1H NMR 화학적 이동의 유비(analogy)에 의하여 확인되었다. 또한, 적은 양의 케토 이성질체, 피루브산 (약 5%)이 4 개의 화합물 모두의 1H NMR에서 보여졌다 (방향족 영역 및 벤질 α-메틸렌 피크에 대해 약 4.2 ppm에서).Referring to Fig. 2b, the stereochemistry of the double bond in 1a-1d was confirmed by the theoretical value of chemical shift and the analogy of 1 H NMR chemical shift of methine proton. In addition, a small amount of the keto isomer, pyruvic acid (about 5%) was seen in 1 H NMR of all four compounds (at about 4.2 ppm for the aromatic region and benzyl a-methylene peak).
문헌적인 절차에 따른 2-하이드록시아크릴산(2-hydroxyacrylic acids) 합성 루트 1a-1c 가 문헌 절차에 따랐다 (도 2b). The synthetic route 2-hydroxyacrylic
화합물 2a-2c에 대한 일반적 절차General procedure for
도 2c는 화합물 2a-2c에 대한 일반적 절차를 나타낸다. 환류 냉각기를 갖춘 플라스크 내에 상업적으로 이용할 수 있는 대응하는 4-치환된 벤즈알데하이드 (1.0 당량), N-아세킬글리신 (1.2 당량), 및 소듐 아세테이트 (1.3 당량)의 샘플들이 아세트산 무수물 (5.0 당량)과 함께 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 120℃에서 8 시간 동안 아르곤 하에 가열하고(상기 반응 공정들로서 형성된 회백색 침전물) 23℃까지 냉각시켰다. 상기 반응 혼합물이 EtOAc 및 10% 수성 NaCl을 이용하여 희석되었다. 상들(phases)이 분리되고, 유기상(organic phase)은 물을 이용하여 세척하였고 수성 NaCl을 포화시키고, 건조하고 (Na2SO4), 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 제공하였다. 상기 미정제 생성물은 아세톤을 이용하여 재결정화를 거쳤고, 모액(mother liquid)은 플래시(flash) 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하여 (SiO2, 20% EtOAc-헥산) 화합물 2a-2c를 제공하였다. Figure 2c shows the general procedure for
(Z)-4-(4-(Z) -4- (4-
시아노벤질리덴Cyanobenzylidene
)-2-)-2-
메틸옥사졸Methyloxazole
-5(4H)-온 (화합물 2a)-5 (4H) -one (
화합물 2a는 4-시아노벤조알데하이드로부터 출발하여 수득되었다: 흰색 고체 (910 mg, 74%); ; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.14 (d, J =8.4 Hz, 2H), 7.71(d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.08 (s, 1H), 2.44 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.2, 167.1, 135.3, 132.5 (2C), 132.3 (2C), 128.3, 128.2, 118.5, 113.8, 16.0; Anal. C12H8N2O2에 대해 계산된 값: C, 67.92; H, 3.80; N, 13.20. 분석 결과: C, 67.97; H, 3.83; N, 13.13.
(Z)-4-(4-(Z) -4- (4-
아세틸벤질리덴Acetylbenzylidene
)-2-)-2-
메틸옥사졸Methyloxazole
-5(4H)-온 (화합물 2b)-5 (4H) -one (
화합물 2b 는 4-아세틸벤조알데하이드로부터 출발하여 수득되었다: 흰색 고체 (2.14 g, 82%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.14 (s, 1H), 2.63 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 197.5, 167.6, 167.4, 138.3, 137.4, 134.6, 132.3 (2C), 129.5, 128.7 (2C), 26.9, 15.9; Anal. C13H11NO3에 대해 계산된 값: C, 68.11; H, 4.84; N, 6.11. 분석 결과: C, 68.17; H, 5.00; N, 5.95.
(Z)-4-(4-(Z) -4- (4-
페닐벤질리덴Phenylbenzylidene
)-2-)-2-
메틸옥사졸Methyloxazole
-5(4H)-온 (화합물 2c)-5 (4H) -one (
화합물 2c 는 4-페닐벤조알데하이드로부터 출발하여 수득되었다: 흰색 고체 (1.78 g, 61%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.16 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.65 (m, 2H), 7.47 (m, 2H), 7.40 (m, 1H), 7.19 (s, 1H), 2.43 (s, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.9, 166.1, 143.8, 140.1, 132.8 (2C), 132.6, 132.3, 131.2, 131.1, 129.1 (2C), 128.2, 127.6 (2C), 127.3 (2C), 15.8; Anal. C17H13NO2에 대해 계산된 값: C, 77.55; H, 4.98; N, 5.32. 분석 결과: C, 77.57; H, 5.01; N, 5.15.
화합물 3a-3c에 대한 일반적 절차General procedure for
도 2d는 화합물 3a-3c에 대한 일반적 절차를 나타낸다. EtOAc (0.5 M) 중 화합물 2a-2c의 용액이 수성 0.2 N HCl (0.1 M)과 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 아르곤(Ar) 하에서 30℃에서 16 시간 동안 교반하였고 EtOAc을 이용하여 0.02 M로 희석시켰다. 상들이 분리되었고, 유기상은 1 : 1 (수성 2 N HCl) : (수성 포화 NaCl)을 이용하여 세척되었고, (Na2SO4) 건조시켰고 감압 하에서 농축시켜 미정제 생성물을 제공하였다. 미정제 생성물은 EtOH를 이용하여 재결정화 하였고, 상기 모액은 후레쉬 크로마토그래피[SiO2, 0 내지 7% MeOH/(CH2Cl2 중 0.1% TFA) 그래디언트]를 이용하여 추가 정제되어 대응하는 2-아세트아미도 아크릴산 3a-3c를 제공하였다. Figure 2d shows the general procedure for
(Z)-2-(Z) -2-
아세트아미도Acetamido
-3-(4--3- (4-
시아노페닐Cyanophenyl
)아크릴산 (화합물 3a)) Acrylic acid (
화합물 3a 는 2a로부터 출발하여 수득되었다: 흰색 고체 (960 mg, 63%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.95 (br s, 1H), 9.66 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.19 (s, 1H), 1.98 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.0, 166.0, 138.7, 132.2 (2C), 130.1 (2C), 129.9, 127.9, 118.6, 110.8, 22.5; Anal. C12H10N2O3 에 대해 계산된 값: C, 62.60; H, 4.38; N, 12.17. 분석 결과: C, 62.60; H, 4.48; N, 12.25.
(Z)-2-(Z) -2-
아세트아미도Acetamido
-3-(4--3- (4-
아세틸페닐Acetylphenyl
)아크릴산 (화합물 3b)) Acrylic acid (
화합물 3b 는 2b로부터 출발하여 수득되었다: 회색 고체 (630 mg, 62%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.80 (br s, 1H), 9.54 (s, 1H), 7.94 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.67 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.20 (s, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.99 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 197.3, 169.0, 166.1, 138.4, 136.4, 129.6 (2C), 129.2, 129.0, 128.2 (2C), 26.7, 22.5; Anal. C13H13NO4 에 대해 계산된 값: C, 63.15; H, 5.30; N, 5.67. 분석 결과: C, 63.18; H, 5.31; N, 5.54.
(Z)-2-(Z) -2-
아세트아미도Acetamido
-3-(-3- (
바이페닐Biphenyl
-4-일)아크릴산 (화합물 3c)Yl) acrylic acid (
화합물 3c 는 2c로부터 출발하여 수득되었다: 회색 고체 (610 mg, 66%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 12.70 (br s, 1H), 9.53 (s, 1H), 7.69-7.72 (m, 6H), 7.48 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 2.01 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.1, 166.3, 140.5, 139.2, 132.9, 130.5, 130.3 (2C), 129.0 (2C), 127.8, 127.3, 126.62 (2C), 126.57 (2C), 22.5; Anal. C13H13NO4 에 대해 계산된 값: C, 72.58; H, 5.37; N, 4.98. 분석 결과: C, 72.59; H, 5.37; N, 4.87.
화합물 1a-1c에 대한 일반적 절차General procedure for
도 2e는 화합물 1a-1c에 대한 일반적 절차를 나타낸다. t-BuOH (0.5 M) 중 화합물 3a-3c의 혼합물이 농축 HCl (0.5 M)과 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 밀봉된 조건에서 100℃에서 8 시간 동안 (2b 및 2c) 또는 2 시간 동안 (2a) 교반시켰다. 상기 반응 혼합물은 균일하게 될 때까지 EtOAc을 이용하여 희석시켰고, 1 : 1 (수성 2 N HCl) : (수성 포화 NaCl)을 이용하여 세척되었고, (Na2SO4) 건조시켰고 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 제공하였다. 후레쉬 크로마토그래피[SiO2, 0 내지 7% MeOH/(CH2Cl2 중 0.1% TFA) 그래디언트]는 대응하는 2-하이드록시 아크릴산 1a-1c를 제공하였다.Figure 2e shows the general procedure for
(E)-3-(4-(E) -3- (4-
시아노페닐Cyanophenyl
)-2-)-2-
하이드록시아크릴산Hydroxyacrylic acid
(화합물 1a) (
화합물 1a 는 3a로부터 출발하여 수득되었다: 흰색 고체 (120 mg, 67%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.52 (br s, 1H), 9.96 (s, 1H), 7.92 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.78 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.44 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 165.7, 144.7, 139.9, 132.1 (2C), 129.5 (2C), 119.0, 108.7, 107.4; Anal. C10H7NO3 에 대해 계산된 값: C, 63.49; H, 3.73; N, 7.40. 분석 결과: C, 63.41; H, 3.77; N, 7.55.
(E)-3-(4-(E) -3- (4-
아세틸페닐Acetylphenyl
)-2-)-2-
하이드록시아크릴산Hydroxyacrylic acid
(화합물 1b) (
회색 고체 (70 mg, 98%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.43 (br s, 1H), 9.74 (s, 1H), 7.92 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 6.45 (s, 1H), 2.56 (s, 3H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 197.2, 165.9, 143.9, 139.7, 134.8, 129.1 (2C), 128.2 (2C), 108.1, 26.6; Anal. C11H10O4 에 대해 계산된 값: C, 64.07; H, 4.89. 분석 결과: C, 64.08; H, 4.95.Off-white solid (70 mg, 98%); 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 13.43 (br s, 1H), 9.74 (s, 1H), 7.92 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 6.8 Hz, 2H ), 6.45 (s, 1 H), 2.56 (s, 3 H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO- d 6 )? 197.2, 165.9, 143.9, 139.7, 134.8, 129.1 (2C), 128.2 (2C), 108.1, 26.6; Anal. Calculated for C 11 H 10 O 4 : C, 64.07; H, 4.89. Analysis found: C, 64.08; H, 4.95.
(E)-3-((E) -3- (
바이페닐Biphenyl
-4-일)-2-Yl) -2-
하이드록시아크릴산Hydroxyacrylic acid
(화합물 1c) (
회색 고체 (60 mg, 71%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.25 (br s, 1H), 9.37 (s, 1H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69 (m, 4H), 7.46 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.36 (m, 1H), 6.45 (s, 1H); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 ) δ 166.2, 142.0, 139.6, 138.5, 134.2, 129.8 (2C), 128.9 (2C), 127.4, 126.43 (2C), 126.42 (2C), 109.1; Anal. C15H12O3 에 대해 계산된 값: C, 74.99; H, 5.03. 분석 결과: C, 74.93; H, 5.11.
Off-white solid (60 mg, 71%); 1 H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 )? 13.25 (br s, 1 H), 9.37 (s, 1 H), 7.85 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.69 , ≪ / RTI > J = 7.6 Hz, 2H), 7.36 (m, 1H), 6.45 (s, 1H); 13 C NMR (125 MHz, DMSO- d 6 )? 166.2, 142.0, 139.6, 138.5, 134.2, 129.8 (2C), 128.9 (2C), 127.4, 126.43 (2C), 126.42 (2C), 109.1; Anal. The value calculated for C 15 H 12 O 3: C , 74.99; H, 5.03. Analysis: C, 74.93; H, 5.11.
(E)-3-(4-(E) -3- (4-
아지도페닐Azidophenyl
)-2-)-2-
하이드록시아크릴Hydroxyacrylate
산 (화합물 1d)의 합성 경로 The synthesis route of the acid (
화합물 1d는 상업적으로 이용할 수 있는 에틸 1,3-디티안-2-카르복실레이트 및 4-브로모벤질 브로마이드 양쪽 모두 간에 알킬화로 출발하는 다단계 공정으로부터 제조되어 화합물 4를 제공했고, 페닐 고리에 이의 4-브로모-치환기는 붕소 에스터 5로 전환되었고, 화합물 5는 중요한 매개체 4-아지도페닐 화합물 6을 제공한 Cu(II)의 존재 하에 소듐 아자이드에 노출되었다. NBS를 이용한 1,3-디티안 고리의 산화적 제거로 인하여 아크릴 에스터 7이 생성되었고, 상기 에스터의 가수분해로 원하는 화합물 1d이 생성되었다 (도 2f 참조). 도 2f는 1d의 합성 스킴을 나타낸다.
에틸 2-(4-Ethyl 2- (4- 브로모벤질Bromobenzyl )-1,3-) -1,3- 디티안Dithian -2--2- 카르복실레이트Carboxylate (화합물 4) (Compound 4)
Ar 하에서 -78℃에서 무수 THF (13 mL) 중 상업적으로 이용가능한 에틸 1,3-디티안-2-카르복실레이트 (962 mg, 5.00 mmol)의 교반된 용액은 핵산 중 n-BuLi의 용액(3.3 mL, 1.6 M)과 함께 적가하여 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 30 분 동안 교반되었고 무수 THF (10 mL) 중 상업적으로 이용할 수 있는 4-브로모벤질 브로마이드(1.50 g, 5.25 mmol)의 용액과 함께 10 분 이상 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 -78℃에서 4 시간 동안 교반시켰고 포화 수성 NH4Cl (10 mL)을 이용하여 켄칭(quenched)시켰다. 상기 결과로 나타나는 혼합물을 23℃까지 가열하고, EtOAc (100 mL)을 이용하여 희석시켰고, 물 (3 x 20 mL) 및 포화 수성 NaCl을 이용하여 세척시켰고, (Na2SO4) 건조시켰고, 감압 하에서 농축시켜 미정제 생성물을 생성하였다. 후레쉬 크로마토그래피 (SiO2, 5% EtOAc-헥산)은 상기 알킬화 화합물 4를 제공하였다: 흰색 고체 (1.29 g, 71%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.25 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.30 (s, 2H), 3.20 (m, 2H), 2.67 (dt, J = 14.4, 3.8 Hz, 2H), 2.15-2.07 (m, 1H), 1.87-1.74 (br m, 1H), 1.32 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.5, 133.6, 132.5 (2C), 131.1(2C), 121.6, 62.2, 53.1, 43.8, 28.1 (2C), 24.4, 14.3; Anal. C14H17BrO2S2 에 대해 계산된 값: C, 46.54; H, 4.74; S, 17.75. 분석 결과: C, 46.65; H, 4.64; S, 17.76.A stirred solution of commercially
에틸 2-(4-4,4,5,5- 테트라메틸 -1,3- 디옥사 -2-보로란-2-일)벤질)-1,3- 디티안 -2-카르복실레이트 (화합물 5) Ethyl 2- (4-4,4,5,5- tetrahydro-1,3-dioxa-2-Boro is 2-yl) benzyl) -1, 3-dithiane-2-carboxylate (Compound 5)
DMF (33 mL) 중 화합물 4 (1.80 g, 4.97 mmol)의 용액은 비스(피나콜라토)디보론 (1.39 g, 5.47 mmol), PdCl2 (pddf) (406 mg, 0.50 mmol), KOAc (1.46 g, 14.91 mmol)과 처리되었다. 반응 혼합물은 10 분 동안 탈기시켰고 그리고 나서 Ar 하에 3 시간 동안 85℃로 가열시켰다. 상기 반응은 물 (10 mL)을 이용하여 켄칭시켰고, 상기 결과로 수득되는 혼합물은 EtOAc (300 mL)을 이용하여 희석시켰고, 수성 1 N HCl, 물 (5 x 30 mL) 및 포화 수성 NaCl (30 mL)을 이용하여 세척시켰고, (Na2SO4) 건조시켰고, 감압 하에서 농축시켜 미정제 생성물을 제조하였다. 후레쉬 크로마토그래피 (SiO2, 10% EtOAc-헥산)은 상기 알킬화 화합물 5를 제공하였다 (도 2g 참조): 무색 오일 (1.81 g, 89%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.71 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.24(q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.38 (s, 2H), 3.23 (m, 2H), 2.66 (dt, J = 14.0, 3.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 1.89-1.77 (br m, 1H), 1.34-1.30 (m 15H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.6, 137.8, 134.4 (2C), 130.1 (2C), 83.7, 62.1 (2C), 53.6, 44.6, 28.1 (2C), 24.9 (4C), 24.4, 14.2 (하나의 페닐 탄소는 확인되지 않았음); Anal. C20H29BO4S2 에 대해 계산된 값: C, 58.82; H, 7.16; S, 15.70. 분석 결과: C, 58.88; H, 7.16; S, 15.72. A solution of compound 4 (1.80 g, 4.97 mmol) in DMF (33 mL) was treated with bis (pinacolato) diboron (1.39 g, 5.47 mmol), PdCl 2 (pddf) (406 mg, 0.50 mmol) g, 14.91 mmol). The reaction mixture was degassed for 10 minutes and then heated to 85 < 0 > C for 3 hours under Ar. The reaction was quenched with water (10 mL) and the resulting mixture was diluted with EtOAc (300 mL) and washed with aqueous 1 N HCl, water (5 x 30 mL) and saturated aqueous NaCl (30 mL), dried (Na 2 SO 4 ) and concentrated under reduced pressure to give the crude product. Flash chromatography (
에틸 2-(4-Ethyl 2- (4- 아지도벤질Azidobenzyl )-1,3-) -1,3- 디티안Dithian -2--2- 카르복실레이트Carboxylate (화합물 6) (Compound 6)
MeOH (18 mL) 중 화합물 5 (1.47 g, 3.60 mmol)의 교반시킨 용액은 NaN3 (351 mg, 5.40 mmol) 및 Cu(OAc)2 (122 mg, 1.08 mmol)과 처리되었다. 반응 혼합물은 55℃에서 4 시간 동안 교반시켰고 23℃까지 냉각시켰다. 휘발성 물질은 감압 하에서 제거되어 미정제 생성물을 제조하였다. 후레쉬 크로마토그래피 (SiO2, 7% EtOAc-헥산)은 화합물 6를 제공했다 (도 2h 참조): 녹황색 반-고체 (878 mg, 75%); 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.34 (s, 2H), 3.24 (m, 2H), 2.68 (dt, J = 14.1, 3.8 Hz, 2H), 2.17-2.08 (m, 1H), 1.89-1.77 (br m, 1H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.7, 139.3, 132.3 (2C), 131.5, 118.7 (2C), 62.3, 53.6, 43.9, 28.2 (2C), 24.5, 14.4; Anal. C14H17N3O2S2 에 대해 계산된 값: C, 51.99; H, 5.30; S, 19.83. 분석 결과: C, 51.90; H, 5.22; S, 19.93. A stirred solution of 5 (1.47 g, 3.60 mmol) in MeOH (18 mL) was treated with NaN 3 (351 mg, 5.40 mmol) and Cu (OAc) 2 (122 mg, 1.08 mmol). The reaction mixture was stirred at 55 [deg.] C for 4 hours and cooled to 23 [deg.] C. The volatiles were removed under reduced pressure to produce the crude product. Flash chromatography provided the (SiO 2, 7% EtOAc- hexane) is compound 6 (see Fig. 2h): green-yellow semi-solid (878 mg, 75%); 1 H NMR (400MHz, CDCl 3 ) δ 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.26 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.34 (s, 2H), 3.24 (m, 2H), 2.68 (dt, J = 14.1, 3.8 Hz, 2H), 2.17-2.08 (m, Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 )? 170.7, 139.3, 132.3 (2C), 131.5, 118.7 (2C), 62.3, 53.6, 43.9, 28.2 (2C), 24.5, 14.4; Anal. C 14 H 17 N 3 O 2 calculated value for the S 2: C, 51.99; H, 5.30; S, 19.83. Analysis: C, 51.90; H, 5.22; S, 19.93.
(Z)-에틸 3-(4- (Z) -ethyl 3- (4- 아지도페닐Azidophenyl )-2-)-2- 하이드록시아크릴레이트Hydroxyacrylate (화합물 7) (Compound 7)
-10℃ (아이스/ MeOH)에서 95% 수성 아세톤 (3 mL) 중 화합물 6 (107 mg, 0.33 mmol)의 교반시킨 용액은 95% 수성 아세톤 (5 mL) 중 NBS (589 mg, 3.30 mmol)의 냉각 용액 (-10℃)과 함께 처리되었다. 상기 반응 혼합물은 30 분 동안 -10℃에서 교반시켰고 (생성물은 연장 반응 기간 하에서 또는 0℃ 이상 온도에서 불안정함), 및 상기 반응은 수성 3 M Na2SO3(3 mL)을 이용하여 켄칭되었다. 유기 휘발성 물질은 N2 의 스트림을 이용하여 제거되었고, 잔류물은 EtOAc (200 mL) 중 용해시켰고, 물 (5 x 40 mL) 및 포화 수성 NaCl을 이용하여 세척시켰고, (Na2SO4) 건조시켰고 감압 하에서 농축시켜 미정제 생성물이 제공되었다. 후레쉬 크로마토그래피 (SiO2, 7% EtOAc-헥산)는 화합물 7을 제공했다 (도 2i 참조): 황색 고체 (56 mg, 73%); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.47 (d, J = 12.42 Hz, 2H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3H), (하나의 하이드록실 피크는 나타나지 않았음); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166.2, 139.4, 139.2, 131.4(2C), 131.2, 119.2 (2C), 109.6, 62.8, 14.4; HRMS EI-DFA m/z C11H11N3O3 +[M+] 에 대해 계산된 값: 233.0800. 분석 결과 233.0803.A stirred solution of compound 6 (107 mg, 0.33 mmol) in 95% aqueous acetone (3 mL) at -10 C (ice / MeOH) was treated with NBS (589 mg, 3.30 mmol) in 95% aqueous acetone Lt; RTI ID = 0.0 > (-10 C). ≪ / RTI > The reaction mixture (the product is unstable in the under extension reaction period, or more than 0 ℃ temperature) was stirred at -10 ℃ for 30 minutes, and the reaction was quenched with an aqueous 3 M Na 2 SO 3 (3 mL) . The organic volatiles were removed using a stream of N 2 and the residue was dissolved in EtOAc (200 mL), washed with water (5 x 40 mL) and saturated aqueous NaCl, dried (Na 2 SO 4 ) ≪ / RTI > and concentrated under reduced pressure to provide the crude product. Flash chromatography (SiO 2, 7% EtOAc- hexane) provided the compound 7 (see FIG. 2i): yellow solid (56 mg, 73%); 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3) δ 7.77 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 6.47 (d, J = 12.42 Hz, 2H), 4.37 (q , J = 7.2 Hz, 2H), 1.40 (t, J = 7.2 Hz, 3H), (one hydroxyl peak not shown); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 )? 166.2, 139.4, 139.2, 131.4 (2C), 131.2, 119.2 (2C), 109.6, 62.8, 14.4; HRMS EI-DFA m / z Calculated for C 11 H 11 N 3 O 3 + [M + ]: 233.0800. The analysis showed 233.0803.
(E)-3-(4-(E) -3- (4-
아지도페닐Azidophenyl
)-2-)-2-
하이드록시아크릴Hydroxyacrylate
산 (화합물 1d) Acid (
0℃에서 THF: 물의 1:1 혼합물 (8 mL) 중 화합물 7 (62 mg, 0.27 mmol)의 용액은 LiOH·H2O (113 mg, 2.70 mmol)과 함께 처리되었다. 반응 혼합물은 0℃에서 6 시간 동안 교반시켰고 수성 2 N HCl (2 mL)과 함께 켄칭되었다. 상기 결과로 수득되는 혼합물은 EtOAc (50 mL) 및 물 (20 mL)을 이용하여 희석시켰다. 상들(phases)은 분리되었고, 상기 유기상은 포화 수성 NaCl을 이용하여 세척시켰고, (Na2SO4) 건조시켰고, 감압 하에서 농축시켜 상기 미정제 생성물이 제공되었다. 후레쉬 크로마토그래피 [SiO2, 그래디언트 0 내지 7% MeOH/(CH2Cl2 중 0.1% TFA)]는 1d를 제공하였다 (도 2j 참조): 황색 고체 (49 mg, 81%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.2 (brs, 1H), 9.33 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), (하나의 하이드록실 피크는 나타나지 않았음); 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ 166.2, 141.7, 137.8, 132.1, 130.8 (2C), 119.1 (2C), 119.0, 108.8; Anal. C9H7N3O3 에 대해 계산된 값: C, 52.69; H, 3.44; N, 20.48. 분석 결과: C, 52.64; H, 3.45; N, 20.32.
A solution of 7 (62 mg, 0.27 mmol) in a 1: 1 mixture of THF: water (8 mL) at 0 ° C was treated with LiOH.H 2 O (113 mg, 2.70 mmol). The reaction mixture was stirred at 0 < 0 > C for 6 hours and quenched with aqueous 2N HCl (2 mL). The resulting mixture was diluted with EtOAc (50 mL) and water (20 mL). The phases were separated and the organic phase was washed with saturated aqueous NaCl, dried (Na 2 SO 4 ) and concentrated under reduced pressure to give the crude product. Flash chromatography [SiO 2 , gradient 0-7% MeOH / (0.1% TFA in CH 2 Cl 2 ) provided 1d (see Figure 2j): yellow solid (49 mg, 81%); 1 H NMR (400 MHz, DMSO -d 6) δ 13.2 (brs, 1H), 9.33 (s, 1H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 8.6 Hz, 2H) , 6.40 (s, 1H), (one hydroxyl peak not shown); 13 C NMR (125 MHz, DMSO-d 6 )? 166.2, 141.7, 137.8, 132.1, 130.8 (2C), 119.1 (2C), 119.0, 108.8; Anal. C 9 H 7 N values calculated for the 3 O 3: C, 52.69; H, 3.44; N, 20.48. Analytical results: C, 52.64; H, 3.45; N, 20.32.
[[ ttGlnATttGlnAT 의 발현 및 정제]≪ / RTI > expression and purification)
C-말단이 헥사히스티딘-태깅된 ttGlnAT 유전자는 써모스 써모필러스(Thurmus thermophilus, HB8) 유전체 DNA로부터 NdeI 및 BglII 제한 부위를 갖는 프라이머와 함께 증폭되었다. 상기 ttGlnAT 유전자 서열은 서열 번호 1에 나타나 있다. 상기 프라이머의 서열은 NdeI 부위 (밑줄)를 포함하는 5′-ATATCATATGCGTCTCCACCCCCGCACCGACGAGGCGGCCA-3′ (정방향 프라이머) 및 BglII 부위 (밑줄)를 포함하는 5′-ATATAGATCTTTATTATCCAGATACCGCACCACCTTCGGCT-3′ (역방향 프라이머) 였다. 상기 유전자는 pET20b (인비트로젠)의 NdeI 및 BamHI 부위 사이에 삽입되어 이후 E.coli BL21 (DE3) 내로 전이되어 pET20b-ttBlnAT을 생성시켰다. 상기 ttGlnAT의 도입에 사용된 벡터의 구조는 도 10에 나타나 있다. 종균 배양 (starter culture, 5 mL)은 LB 배지 약 200 mL에 접종하는 데 사용되었다. 상기 배양은 IPTG (1 mM, 최종 농도)를 첨가함으로써 OD = 0.8 (600 nm)에서 유도되었다. 세포는 약 37℃에서 약 14 시간 내지 약 16 시간 동안 성장되었고 원심 분리에 의하여 수득되었다. 상기 발현된 단백질은 제조자의 프로토콜 [퀴아젠(Qiagen), 힐덴(Hilden), 독일]에 따라서 천연 조건 하에서 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
The C-terminal hexa histidine-tagged ttGlnAT gene was amplified from a Thurmus thermophilus (HB8) genomic DNA with a primer having NdeI and BglII restriction sites. The ttGlnAT gene sequence is shown in SEQ ID NO: 1. The sequence of the primer was 5'- ATAT AGATCT TTATTATCCAGATACCGCACCACCTTCGGCT-3 '(reverse primer) containing 5'- ATAT CATATG CGTCTCCACCCCCGCACCGACGAGGCGGCCA-3' (forward primer) and BglII site (underlined) containing the NdeI site (underlined). The gene was inserted between the NdeI and BamHI sites of pET20b (Invitrogen) and then transferred into E. coli BL21 (DE3) to generate pET20b-ttBlnAT. The structure of the vector used for the introduction of ttGlnAT is shown in Fig. The starter culture (5 mL) was used to inoculate about 200 mL of LB medium. The culture was induced at OD = 0.8 (600 nm) by adding IPTG (1 mM, final concentration). Cells were grown at about 37 ° C for about 14 hours to about 16 hours and were obtained by centrifugation. The expressed protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography under natural conditions according to the manufacturer's protocol (Qiagen, Hilden, Germany).
[효소에 의한 아미노기 전이 반응([Amino group transfer reaction by enzyme enzymaticenzymatic transamination과사 reactionreaction )])]
본 실시예에서는 아민 수용체로서 α-케토산, 및 아민 공여체로서 메티오닌을 사용하여 아미노기 전이반응을 수행하였다. 대응하는 아미노산의 생성 여부는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 분석되었다 (도 3a 내지 도 3d). 구체적으로, 아미노기 전이반응 반응은 10 mM α-케토산, 5 mM 메티오닌, 50 mM HEPES-NaOH (PH 8.0), 0.1 KCl, 및 0.1 m EDTA를 함유하는 혼합물에 상기 효소(10 μM, 최종 농도)를 첨가하여 총 부피 약 50 ㎕의 반응 혼합물을 제조함으로써 개시되었고, 상기 반응 혼합물은 약 25℃에서 약 1 시간 동안 배양되었다. 상기 효소는 메탄올 (50 ㎕)을 첨가함으로써 침전되었고, 상기 상등액은 원심 분리 후에 HPLC 분석을 위해 사용되었다. 대조군으로서, 상기 효소는 물에 의하여 대체되었다. HPLC 분석을 위하여 C18 컬럼(Zorbax Eclipse Plus C18, Agilent)이 사용되었으며 HPLC는 254 nm에서 수행되었다. In this example, an amino transfer reaction was carried out using [alpha] -keto acid as the amine acceptor and methionine as the amine donor. The generation of the corresponding amino acid was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) (Figs. 3A to 3D). Specifically, the amino transfer reaction was carried out by adding the enzyme (10 μM, final concentration) to a mixture containing 10 mM α-keto acid, 5 mM methionine, 50 mM HEPES-NaOH (pH 8.0), 0.1 KCl, To prepare a reaction mixture with a total volume of about 50 [mu] l, and the reaction mixture was incubated at about 25 [deg.] C for about 1 hour. The enzyme was precipitated by the addition of methanol (50 [mu] l) and the supernatant was used for HPLC analysis after centrifugation. As a control, the enzyme was replaced by water. C18 column (Zorbax Eclipse Plus C18, Agilent) was used for HPLC analysis and HPLC was performed at 254 nm.
도 3a는 4-아세틸페닐피루브산, 도 3b는 4-아지도페닐피루브산, 도 3c는 4-페닐페닐피루브산, 및 도 3d는 4-시아노페닐피루브산에 대한 T. thermophilus의 글루타민 아미노트랜스퍼라제에 의한 아미노기 전이 반응의 HPLC 추적(traces) 결과이다 (UV 254 nm). 각 그래프의 상단은 상기 효소 없는 대조 반응의, 하단은 아미노기 전이 반응의 결과이다. KA는 α-케토산, AA는 아미노산의 피크를 의미한다. 4-시아노페닐피루브산의 경우, AA의 낮은 몰 흡광계수 때문에 254 nm에서 AA 피크가 상대적으로 작았다.Figure 3a is 4-acetyl-phenyl pyruvic acid, 3b is 4-O map phenylpyruvic acid, Figure 3c 4-phenylpyruvic acid, and Figure 3d by glutamine amino transferase of T. thermophilus for a 4-cyanophenyl pyruvic HPLC traces of the amino transfer reaction (UV 254 nm). The top of each graph is the result of the enzyme-free control reaction and the bottom is the result of an amino transfer reaction. KA means? -Keto acid, and AA means a peak of amino acid. For 4-cyanophenylpyruvic acid, the AA peak was relatively small at 254 nm due to the low molar extinction coefficient of AA.
상기 시험된 α-케토산 모두의 경우, 상기 효소에 의하여 상당한 양의 비천연 아미노산들이 제조되었으며, 이것은 원래의(authentic) 아미노산의 체류 시간(retention)과 비천연 아미노산들의 체류 시간 비교, 및 질량 분석기(mass spectroscopic, MS) 분석에 의하여 확인되었다 (도 4a 내지 도 4d).In the case of all of the α-keto acids tested, significant quantities of unnatural amino acids have been produced by the enzyme, which includes a comparison of the retention times of the authentic amino acids with the retention times of the unnatural amino acids, (mass spectroscopic, MS) analysis (Figs. 4A to 4D).
도 4a는 4-아세틸페닐피루브산, 도 4b는 4-아지도페닐피루브산, 도 4c는 4-페닐페닐피루브산, 및 도 4d는 4-시아노페닐피루브산에 대한 T. thermophilus의 글루타민 아미노트랜스퍼라제에 의한 아미노기 전이 반응의 HPLC 추적(traces) 결과이다 (UV 254 nm). 1 번째 행은 α-케토산 (1 mM), 2 번째 행은 상기 효소 없는 대조 반응, 3 번째 행은 정상적인 아미노산 (1 mM), 및 4 번째 행은 반응 혼합물에 대한 것이다. 반응 생성물의 질량은 LCMS(Liquid Chromatography Mass Spectrometry)에 의하여 분석되었다. AcPPA는 C11H13NO3 (M-1)에 대하여 계산된 값은 206.2이고 관찰된 값은 206.5이고; AzPPA는 C9H10N4O2 (M-1)에 대하여 계산된 값은 205.2이고 관찰된 값은 205.9이고; PhPPA는 C15H15NO2 (M-1)에 대하여 계산된 값은 240.3이고 관찰된 값은 240.4이고; CNPPA는 C10H10N2O2 (M-1)에 대하여 계산된 값은 189.2이고 관찰된 값은 189.2이었다.
Fig. 4A is a graph showing the effect of 4-acetylphenyl pyruvic acid on the glutamine aminotransferase of T. thermophilus against 4-cyanophenyl pyruvic acid, Fig. 4B is the 4-azidophenyl pyruvic acid, HPLC traces of the amino transfer reaction (UV 254 nm). The first row is α-keto acid (1 mM), the second row is the enzyme-free control reaction, the third row is the normal amino acid (1 mM), and the fourth row is for the reaction mixture. The mass of the reaction product was analyzed by LCMS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry). AcPPA is the value calculated for C 11 H 13 NO 3 (M -1) was 206.2 and the observed value of 206.5, and; AzPPA is C 9 H 10 N 4 O 2 value calculated with respect to (M-1) was 205.2 and the observed value of 205.9, and; PhPPA is a C 15 H 15 NO 2 The calculated value for (M-1) is 240.3 and the observed value is 240.4; CNPPA is the value calculated for C 10 H 10 N 2 O 2 (M-1) was 189.2 and the observed value of 189.2.
[효소의 반응 속도 측정][Measurement of enzyme reaction rate]
본 실시예에서는, 반쪽 반응(half reaction)에 대한 미카엘리스-멘텐 효소반응 속도식(Michaelis-Menten kinetics)을 이용하여 각각의 α-케토산에 대한 효소 활성을 분석하였다. 과잉의 메티오닌의 존재 하에서 상이한 α-케토산 농도들에서 상기 반쪽 반응의 초기 속력이 측정되었다. In this example, enzymatic activity of each α-keto acid was analyzed using a Michaelis-Menten kinetics equation for the half reaction. Initial velocities of the half-reactions were measured at different [alpha] -keto acid concentrations in the presence of excess methionine.
반응 속도 측정은 약 50 mM의 헤페스(HEPES) 내에서 ttGlnAT (0.1 μM) 및 메티오닌 (5 mM)이 일정한 농도로 유지되는 조건 하에서 α-케토산의 농도를 다양화하며 수행되었다 (3.5, 7, 15, 30, 60, 120, 및 250 μM). 아미노산의 생성은 최대 흡수도에서의 α-케토산의 흡수도 감소를 측정함으로써 평가하였고 [4-아지도페닐피루브산(4-azidophenylpyruvic acid) 310 nm, 4-아세틸페닐피루브산(4-phenylphenylpyruvic acid) 302 nm, 및 4-시아노페닐피루브산(4-cyanophenylpyruvic acid) 308 nm], 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. Reaction rate measurements were performed by varying the concentration of α-keto acid under conditions in which ttGlnAT (0.1 μM) and methionine (5 mM) were maintained at constant concentrations in about 50 mM HEPES (3.5, 7 , 15, 30, 60, 120, and 250 [mu] M). The production of amino acids was evaluated by measuring the decrease in absorption of α-keto acid at the maximum absorbance [4-azidophenylpyruvic acid 310 nm, 4-phenylphenylpyruvic acid 302 nm, and 4-cyanophenylpyruvic acid (308 nm). The results are shown in Table 1 below.
도 5a 내지 도 5e는 효소의 아미노기 전이반응 속도를 측정하여 나타낸 결과이다. α-케토산의 농도에 대한 초기 반응 속도를 그래프로 표시하였다. 도 5a는 페닐피루브산, 도 5b는 4-아세틸페닐피루브산, 도 5c는 4-아지도페닐피루브산, 도 5d는 4-페닐페닐피루브산, 및 도 5e는 4-시아노페닐피루브산에 대한 것이다.5A to 5E show the result of measuring the rate of amino-transfer reaction of the enzyme. The initial rate of reaction to the concentration of α-keto acid was graphically displayed. Figure 5a is for phenylpyruvic acid, Figure 5b is for 4-acetylphenylpyruvic acid, Figure 5c for 4-azidophenylpyruvic acid, Figure 5d for 4-phenylphenylpyruvic acid, and Figure 5e for 4-cyanophenylpyruvic acid.
반응 시간 경로의 최초 직선 부분의 최적합 경사로부터 수득한 최초 반응 속도는 이어서 Michaelis-Menten 식과 일치하였다.The initial reaction rate obtained from the best slope of the first straight portion of the reaction time path was then consistent with the Michaelis-Menten equation.
표 1에 표시된 kcat/KM 값은 상기 α-케토산들에서 촉매 효율에 현저한 차이는 없음을 나타내었다. 더욱 중요한 것은, GlnAT의 비천연 기질에 대한 효소 활성이 상기 GlnAT에 대해 가장 효율적인 천연 아민 수용체 중의 하나인 페닐피루브산(PPA)에 대한 활성과 비슷하였다는 것이다. 이러한 결과는, 예상된 바와 같이, 상기 GlnAT의 활성 부위의 공간이 충분히 크고 유연하여, 현저한 활성 감소 없이 본원에서 시험된 비천연 기질을 수용하였다는 것을 뜻한다.
The k cat / K M values shown in Table 1 indicate that there is no significant difference in catalytic efficiency in the α-keto acids. More importantly, the enzymatic activity of GlnAT on a non-natural substrate was similar to that of phenylpyruvic acid (PPA), one of the most efficient natural amine receptors for GlnAT. This result implies that the space of the active site of GlnAT was sufficiently large and flexible, as expected, to accommodate the non-native substrate tested herein without noticeable activity reduction.
[세포 내에서의 아미노기 전이 반응][Amino group transfer reaction in the cell]
본 실시예에서는, α-케토산으로부터 합성된 비천연 아미노산들을 단백질에 도입하기 위하여, 상기 케토산이 세포 내에서 효율적으로 아미노산으로 전환되는지 여부를 시험하였다. 먼저, GlnAT를 발현하는 박테리아 세포가 각각의 α-케토산의 존재 하에서 배양되었고, 상기 α-케토산의 비천연 아미노산으로의 전환 여부가 HPLC를 통하여 분석되었다. In this Example, in order to introduce unnatural amino acids synthesized from? -Keto acid into a protein, it was examined whether or not the keto acid was efficiently converted into an amino acid in a cell. First, GlnAT-expressing bacterial cells were cultured in the presence of each? -Keto acid, and the conversion of? -Keto acid to unnatural amino acid was analyzed by HPLC.
구체적으로, pET-20b-ttGlnAL를 포함하는 ttGlnAT-발현 세포는 LB 배지 내에서 2 mM α-케토산의 존재 하에서 배양되었다. ttGlnAT의 발현은 OD = 0.8 (600 nm)에서 IPTG (최종 농도 1mM)를 첨가함으로써 유도되었다. 세포들은 약 37℃에서 약 14 시간 내지 약 16 시간 동안 배양되었고, 상기 배지는 원심분리 후에 HPLC에 의하여 분석되었다.Specifically, ttGlnAT-expressing cells containing pET-20b-ttGlnAL were cultured in the presence of 2 mM [alpha] -keto acid in LB medium. Expression of ttGlnAT was induced by adding IPTG (
도 6a 내지 도 6d는 ttGlnAT-발현 세포를 α-케토산의 존재 하에서 배양하는 데에 사용된 배지의 HPLC 트레이스 (UV 254 nm) 결과이며, 도 6a는 AcPPA, 도 6b는 AzPPA, 도 6c는 PhPPA, 및 도 6d는 CNPPA에 대한 것이다. 각각의 그래프의 상단은 α-케토산 (2 mM)을 포함하는 초기 배지, 중단은 포화된 후의 배지, 및 하단은 정상 아미노산에 해당한다.Figures 6a to 6d show the HPLC trace (UV 254 nm) results of the medium used to incubate ttGlnAT-expressing cells in the presence of a-keto acid, Figure 6a shows AcPPA, Figure 6b shows AzPPA, Figure 6c shows PhPPA , And 6D are for CNPPA. The top of each graph corresponds to an initial medium containing α-keto acid (2 mM), a medium after the medium has been saturated, and a bottom amino acid.
모든 α-케토산의 경우에, 오버나잇(overnight) 인큐베이션 후에 상기 배양 배지들이 대응하는 아미노산들을 함유하였음이 상기 분석으로부터 확인되었다. 동일한 분석이 세포 용해물 (cell lysate)을 이용하여 또한 수행되었고, 그 결과, 상기 크로마토그램(chromatogram)이 좀 더 복잡함에도 불구하고, 전환이 발생했음을 나타내었다 (미도시).
In the case of all α-keto acids, it was confirmed from the above analysis that after incubation overnight the culture medium contained the corresponding amino acids. The same assay was also performed using cell lysate and as a result showed that the conversion occurred despite the more complex chromatogram (not shown).
α-α- 케토산으로부터From keto acid 합성된 Synthesized 비천연Non-natural 아미노산의 유전적 도입( Genetic introduction of amino acids incorporationincorporation ))
ttGlnAT-발현 세포를 함유하는 박테리아 세포의 배양시 α-케토산이 대응 아미노산으로 전환된다는 것이 상기 실시예로부터 확인되었으므로, 본 실시예에서는 생합성된 비천연 아미노산을 단백질로 직접적으로 도입하였다. aaRS 및 tRNA 유전자를 함유하는 플라스미드, 및 GlnAT 및 His6-태깅된 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 유전자를 함유하는 플라스미드를 포함하는 박테리아 세포가 α-케토산의 존재 및 부재 하에서 성장 되었다. 상기 플라스미드에 도입된 tRNA 및 aaRS는 각각 Methanocaldococcus jannaschii의 tRNA 및 aaRS를 사용하였고, 상기 tRNA의 DNA 서열은 서열번호 2에 나타나 있으며, 상기 aaRS 유전자의 DNA 서열은 서열번호 3 및 5에 나타나 있다. 서열번호 3은 4-아세틸-L-페닐알라닌(p-Acetyl-L-phenylalanine)을 상기 tRNA에 전달하는 aaRS의 DNA 서열이고, 서열번호 4는 p-아지도-L-페닐알라닌(p-Azido-L-phenylalanine)을 상기 tRNA에 전달하는 aaRS의 DNA 서열이며, 서열번호 5는 p-시아노-L-페닐알라닌(p-Cyano-L-phenylalanine) 및 p-페닐-L-페닐알라닌(p-Phenyl-L-phenylalanine)을 상기 tRNA에 전달하는 aaRS의 DNA 서열이다. 상기 서열번호 3의 4-아세틸-L-페닐알라닌의 aaRS는 32 번째 아미노산인 티로신(Tyr)이 류신(Leu)으로, 158 번째 아스파르트산(Asp)이 글리신(Gly)으로 대체된 것이고, 상기 서열번호 4의 p-아지도-L-페닐알라닌의 aaRS는 32 번째 아미노산인 티로신(Tyr)이 트레오닌(Thr)으로, 107 번째 글루탐산(Glu)이 아스파라긴(Asn)으로, 158 번째 아스파르트산(Asp)이 프롤린(Pro)으로, 159 번째 이소류신(Ile)이 류신(Leu)으로, 및 162 번째 류신(Leu)이 글루타민(Gln)으로 대체된 것이고, 상기 서열번호 5의 p-시아노-L-페닐알라닌 및 p-페닐-L-페닐알라닌의 aaRS는 32 번째 티로신(Tyr)이 류신(Leu)으로, 65 번째 류신(Leu)이 발린(Val)으로, 108 번째 페닐알라닌(Phe)이 트립토판(Trp)으로, 109 번째의 글루타민(Gln)이 메티오닌(Met)으로, 158 번째 아스파르트산(Asp)이 글리신(Gly)으로, 및 159 번째 이소류신(Ile)이 알라닌(Ala)으로 대체된 것이다.Since it was confirmed from the above example that the α-keto acid is converted into the corresponding amino acid in culturing the bacterial cell containing ttGlnAT-expressing cells, the biosized unnatural amino acid was directly introduced into the protein in this example. Bacterial cells containing plasmids containing aaRS and tRNA genes and plasmids containing GlnAT and His 6 -tagged green fluorescent protein (GFP) genes were grown in the presence and absence of [alpha] -keto acid. The tRNA and aaRS introduced into the plasmid were respectively Methanocaldococcus was used as the tRNA and aaRS of jannaschii, DNA sequences of the tRNA is shown in SEQ ID NO: 2, wherein the DNA sequence of the aaRS gene is shown in SEQ ID NOS: 3 and 5. SEQ ID NO: 3 is a DNA sequence of aaRS that transfers 4-acetyl-L-phenylalanine to the tRNA and SEQ ID NO: 4 is a DNA sequence of p-azido-L-phenylalanine (p- (p-Cyano-L-phenylalanine) and p-phenyl-L-phenylalanine (p-phenylalanine) -phenylalanine) to the tRNA. The aaRS of 4-acetyl-L-phenylalanine of SEQ ID NO: 3 is a substitution of threonine (Tyr), which is the 32nd amino acid, with leucine (Leu), 158th aspartic acid (Asp) AlaRS of p-azido-L-phenylalanine of 4 is a threonine (Thr) which is threonine (Tyr) which is the 32nd amino acid, 107th glutamic acid (Glu) is asparagine (Asn), 158th aspartic acid (Pro), 159th isoleucine (Ile) is replaced with leucine (Leu), and 162nd leucine (Leu) is replaced by glutamine (Gln), and p-cyano- Phenyl-L-phenylalanine, the aaRS of the 32nd tyrosine (Tyr) is leucine (Leu), the 65th leucine (Val) is leucine, the 108th phenylalanine (Phe) is tryptophan (Trp) (Gln) is methionine (Met), 158th aspartic acid (Asp) is glycine (Gly), and 159th isoleucine (Ile) It was replaced by Nin (Ala).
상기 aaRS들 모두에 대하여 상기 서열번호 3의 DNA 서열에 의하여 합성되는 동일한 tRNA가 사용되었다. 비천연 아미노산이 단백질 내로 성공적으로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 GFP 유전자 내의 Y151에 대한 코돈은 정지 코돈인 앰버 코돈 (TAG)으로 교체되었다. 비교를 위하여, 동일한 세포가 상기 대응하는 아미노산의 존재 하에서 성장되었다. 밤새(overnight) 발현시킨 후에 상기 세포는 용해되었고, 전체 용해물은 SDS-PAGE에 의하여 분석되었다 (도 7 참조).The same tRNA synthesized by the DNA sequence of SEQ ID NO: 3 was used for all of the aaRSs. To confirm whether the unnatural amino acid was successfully introduced into the protein, the codon for Y151 in the GFP gene was replaced with the amber codon (TAG), which is a stop codon. For comparison, the same cells were grown in the presence of the corresponding amino acids. After overnight expression, the cells were lysed and the entire lysate was analyzed by SDS-PAGE (see FIG. 7).
구체적으로, ttGlnAT 및 GFP 유전자들이 pET-duet1(인비트로젠) 내로 삽입되었다. ttGlnAT 유전자는 BspHI 및 EcoRI 제한 부위를 가지는 프라이머를 이용하여 pET20b-ttGlnAT로부터 증폭되었다. 상기 GFP 유전자의 DNA 서열은 서열 번호 6에 나타나 있으며, 단백질 서열은 서열번호 7에 나타나 있다. 상기 프라이머의 서열은 BspH1 부위(밑줄)를 가지는 5′-ATATTCATGAAACTCCACCCCCGCACC-3′(정방향 프라이머) 및 EcoRI 부위(밑줄)를 가지는 5′-ATATGAATTCTCAATGGTGATGATGGTGATGTCCA GATACC-3′(역방향 프라이머)였다. 상기 유전자는 상기 벡터의 NcoI 및 EcoRI 부위 사이에 삽입되었다. 상기 C-말단 헥사히스티딘-태그된 GFP 유전자는 이후 동일한 벡터의 Ndel 및 KpnI 부의 사이에 삽입되어 pET-duet1-ttGlnAT-GFP를 생성하였다. 이러한 과정을 위하여 사용된 프라이머의 서열은 NdeI 부위(밑줄)를 가지는 5′-GCACGCATATGAGTAAAGGAGAAGAACTT TTCACTGGAGT-3′(정방향 프라이머) 및 KpnI 부위(밑줄)를 가지는 5′-ATATGGTACCTCAGTGGTGGTGGTGGTGG-3′(역방향 프라이머)였다. 자리지정돌연변이는 GFP 유전자 내에 Y151TAG 돌연변이를 유도하기 위하여 사용되었다 (이 돌연변이 유도를 위해 사용된 프라이머 : 5′-CTATAACTCACACAATGTATAGATCACGGCAGACAAAC-3′ 및 5′-GTCTGCCGTGATCTATACATTGTGTGAGTTATAGTTG-3′). pET-duet1-ttGlnAT-GFP-Y151TAG 벡터는 tRNA 및 aaRNA 유전자를 포함하는 플라스미드와 함께 E. coli BL21(DE3) 내로 공동형질전이 되었다. 4-아세틸페닐피루브산은 pEvolpAcF7 벡터 (도 11), 4-아지도페닐피루브산은 pEvol-pAzF7 벡터 (도 12), 및 4-페닐페닐피루브산 및 4-시아노페닐피루브산은 pUltra-CNF8 벡터 (도 13)를 이용하여 형질전이(transformation)를 수행하였다. 상기 형질전이를 위하여, DH10b competent 세포 20 ㎕에 상기 벡터 1 ㎕를 첨가하고, 상기 세포에 전기 충격을 가함으로써 상기 벡터를 상기 세포 내로 도입하는 일렉트로트랜스포메이션(electrotransformation) 방법을 사용하였다. 세포는 앰피실린 (100 μg/mL) 및 클로람페니콜 (35 g/mL)이 포함된 LB 배지 내에서 증폭되었다. pUltra-CNF가 사용된 경우, 스펙티노마이신(spectinomycin, 30 μg/mL)이 클로람페니콜 대신 사용되었다. 종균 배양(starter culture, 2.5 mL)은 100 mL의 LB 배지에 접종하는 데에 사용되었다. 세포는 약 37℃에서 약 14 시간 내지 약 16 시간 동안 배양되었고, 원심분리에 의하여 회수(harvest)하였다. 발현된 단백질은 변성되지 않은 상태에서 제조자의 프로토콜(Qiagen, Hilden, Germany)에 따라 Busbuster(Novagen)를 이용하여 세포를 용해시켜 분석하거나 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.Specifically, the ttGlnAT and GFP genes were inserted into pET-duetl (Invitrogen). The ttGlnAT gene was amplified from pET20b-ttGlnAT using primers with BspHI and EcoRI restriction sites. The DNA sequence of the GFP gene is shown in SEQ ID NO: 6, and the protein sequence is shown in SEQ ID NO: The sequence of the primer was 5'- ATAT GAATTC TCAATGGTGATGATGGTGATGTCCA GATACC-3 '(reverse primer) having 5'- ATAT TCATGA AACTCCACCCCCGCACC-3' (forward primer) and EcoRI site (underlined) with BspH1 site (underlined). The gene was inserted between the NcoI and EcoRI sites of the vector. The C-terminal hexahistidine-tagged GFP gene was then inserted between Ndel and KpnI portions of the same vector to generate pET-duet1-ttGlnAT-GFP. The sequence of the primers used for this procedure was 5'-ATAT GGTACC TCAGTGGTGGTGGTGGTGG-3 '(reverse direction) with 5'-GCACG CATATG AGTAAAGGAGAAGAACTT TTCACTGGAGT-3' (forward primer) and KpnI site (underlined) Primer). Placement mutations were used to induce Y151TAG mutations in the GFP gene (primers used for this mutagenesis: 5'-CTATAACTCACACAATGTA TAG ATCACGGCAGACAAAC-3 'and 5'-GTCTGCCGTGAT CTA TACATTGTGTGAGTTATAGTTG-3'). The pET-duet1-ttGlnAT-GFP-Y151TAG vector was cotransfected into E. coli BL21 (DE3) with a plasmid containing the tRNA and the aaRNA gene. PEvol-pAzF7 vector (Fig. 12), and 4-phenylphenylpyruvic acid and 4-cyanophenylpyruvic acid are pUltra-CNF8 vector (Fig. 11), 4-acetylphenylpyruvic acid is pEvolpAcF7 vector ). ≪ / RTI > For the transduction, an electrotransformation method was used in which 1 μl of the vector was added to 20 μl of DH10b competent cells, and the vector was introduced into the cells by electric shock. Cells were amplified in LB medium containing ampicillin (100 μg / mL) and chloramphenicol (35 g / mL). When pUltra-CNF was used, spectinomycin (30 μg / mL) was used instead of chloramphenicol. The starter culture (2.5 mL) was used to inoculate 100 mL of LB medium. The cells were incubated at about 37 ° C for about 14 hours to about 16 hours and harvested by centrifugation. The expressed proteins were purified by using Ni-NTA affinity chromatography or by dissolving the cells using Busbuster (Novagen) according to the manufacturer's protocol (Qiagen, Hilden, Germany) in the unmodified state.
도 7은 Y151 위치에 앰버 코돈을 포함하는 GFP 돌연변이의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다. ttGlnAT 및 이에 상응하는 tRNA/aaRS 쌍(도 8)이 세포 내에서 공발현(coexpress)되었다. 세포는 용해되었고 전세포용해물(whole cell lysate)이 분석되었다. KA 및 AA는 각각 α-케토산 및 아미노산을 나타내는 것이다. 또한, AcF은 4-acetyl-L-phenylalanine을, AzF는 4-azido-L-phenylalanine을, PhF는 4-phenyl-L-phenylalanine을, 및 CNF는 4-cyano-L-phenylalanine을 나타내는 것이다.Fig. 7 shows the result of SDS-PAGE analysis of GFP mutation containing an amber codon at position Y151. ttGlnAT and its corresponding tRNA / aaRS pair (Figure 8) coexpressed in the cells. The cells were lysed and the whole cell lysate was analyzed. KA and AA represent? -Keto acid and amino acid, respectively. Also, AcF represents 4-acetyl-L-phenylalanine, AzF represents 4-azido-L-phenylalanine, PhF represents 4-phenyl-L-phenylalanine, and CNF represents 4-cyano-L-phenylalanine.
도 9a는 GFP의 Y151 위치에 UAA 코돈을 함유하는, 정제된 GFP 돌연변이의 SDS-PAGE 분석 결과이고, 도 9b는 MALDI-TOF MS 분석 결과를 나타내는 것이다. 레인(lane) 1은 야생형 GFP이고, 레인 2는 4-시아노페닐피루브산과 함께 발현된 GFP 돌연변이이고, 레인 3은 4-페닐페닐피루브산과 함께 발현된 GFP 돌연변이이고, 레인 4는 4-아세틸페닐피루브산과 함께 발현된 GFP 돌연변이이며, 레인 5는 4-아지도페닐피루브산과 함께 발현된 GFP 돌연변이이다. 계산상의 질량은 괄호 안에 표시되어 있다. 레인 3의 경우, SDS-PAGE에서 목적한 밴드가 알 수 없는 이유에 의하여 크기가 작게 나왔으나, MS 분석에서는 예상했던 질량이 나타났다.9A is an SDS-PAGE analysis of a purified GFP mutation containing a UAA codon at the Y151 position of GFP, and FIG. 9B is a result of MALDI-TOF MS analysis.
모든 α-케토산에서 전체 길이 단백질(full length protein)의 발현이 관찰되었다. 2 mM α-케토산을 이용하여 관찰된 발현 수준은 1 mM 비천연 아미노산을 이용하여 수득된 발현 수준과 비슷하였다. 상기 전체 길이 단백질이 목적 단백질이고 비천연 아미노산 도입에 의하여 유도된 앰버 억제(amber suppression)에 의하여 제조되었음을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 단백질을 정제한 뒤 이를 SDS-PAGE 및 MS를 이용하여 분석하였다. 상기 정제된 단백질의 SDS-PAGE 분석은 예상된 크기의 목적 단백질 밴드를 보여주었고, 말디토프 질량 분석기(matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS) 분석의 결과 상기 비천연 아미노산들이 관찰 가능한 천연 아미노산 없이 도입되었음이 확인되었다 (도 9a 및 도 9b 참조).
Expression of full-length proteins was observed in all? -Keto acids. The level of expression observed using 2 mM a-keto acid was similar to that obtained with 1 mM non-natural amino acids. To confirm that the full-length protein was produced by amber suppression induced by the introduction of unnatural amino acid, the present inventors purified the protein and analyzed it by SDS-PAGE and MS. SDS-PAGE analysis of the purified protein showed the expected size of the target protein band, and the results of the matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF MS) It was confirmed that the unnatural amino acids were introduced without observable natural amino acids (see FIGS. 9A and 9B).
상기 실시예들에 따르면, 4 개의 α-케토산은 T. thermophilus HB8의 GlnAT에 의하여 대응하는 아미노산으로 전환되었고, 상기 대응하는 아미노산은 단백질 내로 직접 도입되었다. 2 mM의 α-케토산을 이용하여 수득된 이러한 비천연 아미노산의 효율은 1 mM의 비천연 아미노산을 이용하여 수득된 도입 효율과 비슷하였다. 본 연구에서 사용된 α-케토산의 구조를 고려해 볼 때, 이러한 방법은 티로신 또는 페닐알라닌으로부터 유래된 다른 비천연 아미노산들의 유전적 도입에도 적용될 수 있다. 상기 GlnAT가 비록 무차별(promiscuous)적이지만, 효소 공학은 최적 기질의 범위를 넓힐 수 있을 것이다. 상기 α-케토산은 키랄 중심이 없고 용이하게 합성에 이용할 수 있기 때문에, 이러한 방법은 유전적 도입 기술을 더욱 향상시킬 것이고, 광학적으로 순수한 비천연 아미노산들의 제조에 대한 새로운 접근법을 제시할 것이다. 또한, α-케토산의 생합성 경로를 조작하는 것은 보다 단순한 매개체로부터 비천연 아미노산을 도입하는 유전적 도입 시스템을 디자인하는 것이 가능하도록 할 것이다. According to the above examples, the four a-keto acids were converted to the corresponding amino acids by GlnAT of T. thermophilus HB8, and the corresponding amino acids were introduced directly into the protein. The efficiency of this unnatural amino acid obtained using 2 mM of [alpha] -keto acid was similar to that obtained using 1 mM of unnatural amino acid. Considering the structure of α-keto acids used in this study, this method can be applied to the genetic introduction of other unnatural amino acids derived from tyrosine or phenylalanine. Although GlnAT is promiscuous, enzyme engineering will be able to broaden the range of optimal substrates. Since the [alpha] -keto acid is free of chiral centers and is readily available for synthesis, this method will further improve the genetic introduction technology and will present a new approach to the production of optically pure unnatural amino acids. In addition, manipulating the biosynthetic pathway of alpha -keto acid will make it possible to design a genetic introduction system that introduces unnatural amino acids from simpler vectors.
마지막으로, 본 연구에서의 발견은 비천연 아미노산을 합성하고 도입할 수 있는 독립적인 비천연 유기체를 개발하는 것을 목표로 하는 미래 작업에 대한 자극제를 제공할 수 있을 것이다.
Finally, the findings in this study could provide a stimulus for future work aimed at developing an independent, non-natural organism capable of synthesizing and introducing unnatural amino acids.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수도 있다.
It will be understood by those of ordinary skill in the art that the foregoing description of the embodiments is for illustrative purposes and that those skilled in the art can easily modify the invention without departing from the spirit or essential characteristics thereof. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. For example, each component described as a single entity may be distributed and implemented, and components described as being distributed may also be implemented in a combined form.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be interpreted as being included in the scope of the present invention .
<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> CELL PRODUCING MUTANT OF TARGET PROTEIN, PREPARING METHOD <130> DP20130143KR <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 1 atgaaactcc acccccgcac cgaggcggcc aaggagagca tcttccccag gatgagcggg 60 ctcgcccagc gcctgggcgc ggtgaacctg ggccaggggt ttccctctaa tcccccgcct 120 cccttcctcc tggaggcggt gcggcgcgcc ttgggccgcc aggatcagta cgcccccccg 180 gcggggcttc ccgcccttag ggaggccctt gccgaagagt tcgccgtgga gcccgaaagc 240 gtggtggtca cctccggggc cacggaggcc ctctacgtcc tcctgcaaag cctcgtgggc 300 ccgggggacg aggtagtggt gctggagcct ttctttgacg tctacctgcc ggacgccttc 360 ctggcggggg ccaaggccag gcttgtgcgc ttagacctca cccctgaggg cttccgcctg 420 gacctttccg ccctggagaa ggccctcacc ccaaggaccc gggccctcct cctcaacacc 480 cccatgaacc ccacgggcct cgtcttcggg gagagggagc tagaggccat cgcccgcctc 540 gcaagggcgc acgacctctt cctcatatcc gacgaggtct acgacgagct ctactacggg 600 gagaggccaa ggcgccttag ggagttcgcc ccggagcgca ccttcaccgt 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aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 5 <211> 921 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 5 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctctgatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tagtgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtaa ctggatgctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagtg gcgcgcttat acagagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tggcattcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga 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aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660 cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaactcgag 720 caccaccacc accaccactg a 741 <210> 7 <211> 246 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 7 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu 225 230 235 240 His His His His His His 245 <110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> CELL PRODUCING MUTANT OF TARGET PROTEIN, PREPARING METHOD <130> DP20130143KR <160> 7 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1164 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 1 atgaaactcc acccccgcac cgaggcggcc aaggagagca tcttccccag gatgagcggg 60 ctcgcccagc gcctgggcgc ggtgaacctg ggccaggggt ttccctctaa tcccccgcct 120 cccttcctcc tggaggcggt gcggcgcgcc ttgggccgcc aggatcagta cgcccccccg 180 gcggggcttc ccgcccttag ggaggccctt gccgaagagt tcgccgtgga gcccgaaagc 240 gtggtggtca cctccggggc cacggaggcc ctctacgtcc tcctgcaaag cctcgtgggc 300 ccgggggacg aggtagtggt gctggagcct ttctttgacg tctacctgcc ggacgccttc 360 ctggcggggg ccaaggccag gcttgtgcgc ttagacctca cccctgaggg cttccgcctg 420 gacctttccg ccctggagaa ggccctcacc ccaaggaccc gggccctcct cctcaacacc 480 cccatgaacc ccacgggcct cgtcttcggg gagagggagc tagaggccat cgcccgcctc 540 gcaagggcgc acgacctctt cctcatatcc gacgaggtct acgacgagct ctactacggg 600 ggaggccaa ggcgccttag ggagttcgcc ccggagcgca ccttcaccgt ggggagcgca 660 gggaagcgcc tcgaggccac gggctaccgg gtgggctgga tcgtggggcc caaggagttc 720 atgccccgcc tcgcggggat gcgccagtgg acgagcttct ccgcccccac gcccctccag 780 gccggggtgg cggaggccct gaagctggcg aggagagagg ggttctacga ggccctgcgg 840 gaaggctacc ggaggaggcg ggacctcctc gccggggggc ttagggcgat ggggcttagg 900 gtctacgtcc ccgagggcac ctacttcctc atggccgagc ttcccgggtg ggacgccttc 960 cggctcgtgg aggaggcgcg ggtggccctc atccccgcct cggccttcta ccttgaagac 1020 cctcccaagg acctcttccg cttcgccttc tgcaagactg aggaggagct tcacctcgcc 1080 ctggagcgcc tggggcgtgt ggtaaactcc ccccgtgaag ccgaaggtgg tgcggtatct 1140 ggacatcacc atcatcacca ttga 1164 <210> 2 <211> 77 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 2 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 3 <211> 921 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 3 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctctgatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtga attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tggcattcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 4 <211> 921 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 4 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctaccatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtaa cttccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagtc cgctgcttat acagagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tggcattcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 5 <211> 921 <212> DNA <213> Methanocaldococcus jannaschii <400> 5 atggacgaat ttgaaatgat aaagagaaac acatctgaaa ttatcagcga ggaagagtta 60 agagaggttt taaaaaaaga tgaaaaatct gctctgatag gttttgaacc aagtggtaaa 120 atacatttag ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tagtgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatgttt atggaagtaa ctggatgctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagtg gcgcgcttat acagagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tggcattcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagattata a 921 <210> 6 <211> 741 <212> DNA <213> Aequorea victoria <400> 6 atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180 gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca catgaaacgg 240 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc 300 aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360 aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa 420 ctcgaataca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480 atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac 540 cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600 ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt 660 cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaactcgag 720 caccaccacc accaccact a 741 <210> 7 <211> 246 <212> PRT <213> Aequorea victoria <400> 7 Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe 50 55 60 Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg 65 70 75 80 His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val 100 105 110 Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile 115 120 125 Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn 130 135 140 Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly 145 150 155 160 Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val 165 170 175 Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro 180 185 190 Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val 210 215 220 Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu 225 230 235 240 His His His His His 245
Claims (22)
목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 포함된 세 개의 연속된 코돈을 상기 정지 코돈으로 치환시키는 것을 포함하며,
상기 비천연 아미노산은 4-아세틸-L-페닐알라닌(4-acetyl-L-phenylalanine), 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine), 4-페닐-L-페닐알라닌(4-phenyl-L-phenylalanine), 4-시아노-L-페닐알라닌(4-cyano-L-phenyla lanine), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조방법으로서,
상기 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포는, 배양 배지 내에 존재하는 비천연 아미노산 전구체를 세포 내부에서 상기 아미노트랜스퍼라제를 이용하여 상기 비천연 아미노산으로 전환시키고, 상기 비천연 아미노산은 상기 아미노아실 tRNA 합성효소 및 상기 tRNA에 의하여 상기 치환된 코돈에 대응하는 상기 목적 단백질 내의 위치에 삽입되는 것이고,
상기 비천연 아미노산의 전구체는 4-아세틸페닐피루브산(4-acetylphenylpyruvic acid), 4-아지도페닐피루브산(4-azidophenylpyruvic acid), 4-페닐페닐피루브산(4-phenylphenylpyruvic acid), 4-시아노페닐피루브산(4-cyanophenylpyruvic acid), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 α-케토산을 포함하는 것인,
목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
A gene of an aminotransferase, a gene of a tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase which transfers an unnatural amino acid to the tRNA are introduced into a host cell,
And replacing the three consecutive codons contained in the nucleic acid sequence encoding the target protein with the stop codon,
The unnatural amino acids include 4-acetyl-L-phenylalanine, 4-azido-L-phenylalanine, 4- phenyl- phenyl-L-phenylalanine, 4-cyano-L-phenyla lanine, and combinations thereof, to produce a mutant of the desired protein As a production method,
Wherein the cell producing the mutant of the target protein converts the non-natural amino acid precursor present in the culture medium into the unnatural amino acid using the aminotransferase inside the cell, and the unnatural amino acid converts the aminoacyl tRNA synthetase Is inserted at a position in the target protein corresponding to the substituted codon by the enzyme and the tRNA,
The precursors of the unnatural amino acids include 4-acetylphenylpyruvic acid, 4-azidophenylpyruvic acid, 4-phenylphenylpyruvic acid, 4-cyanophenylpyruvic acid, (4-cyanophenylpyruvic acid), and combinations thereof.
A method for producing a cell that produces a mutant of a target protein.
상기 목적 단백질의 돌연변이체는 상기 목적 단백질 서열 내에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the mutant of the target protein comprises the unnatural amino acid in the target protein sequence.
상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자는 글루타민(glutamine) 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the gene of said aminotransferase comprises glutamine aminotransferase. ≪ RTI ID = 0.0 > 11. < / RTI >
상기 글루타민 아미노트랜스퍼라제는, 써모스 써모필러스(Thurmus thermophilus)의 글루타민 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the glutamine aminotransferase comprises glutamine aminotransferase of Thurmus thermophilus, wherein the mutant of the target protein is produced.
상기 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the host cell comprises a prokaryotic cell and a eukaryotic cell.
상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 상기 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자를 상기 숙주 세포 내부로 도입하는 것은, 상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자, 상기 정지 코돈에 대응하는 tRNA의 유전자, 및 상기 tRNA에 비천연 아미노산을 전달하는 아미노아실 tRNA 합성효소의 유전자 중 하나 이상을 포함하는 벡터를 상기 숙주 세포 내부로 도입하는 것을 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Introduction of the gene of the amino transferase, the gene of the tRNA corresponding to the stop codon, and the gene of the aminoacyl tRNA synthetase, which transfers the unnatural amino acid to the tRNA, into the host cell is carried out by introducing the gene of the aminotransferase , A gene of a tRNA corresponding to the stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase which carries an unnatural amino acid to the tRNA, into the host cell. A method for producing a cell that produces a mutant of a protein.
목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열 중 세 개의 연속된 코돈이 상기 정지 코돈으로 치환된 것이고,
상기 비천연 아미노산은 4-아세틸-L-페닐알라닌, 4-아지도-L-페닐알라닌, 4-페닐-L-페닐알라닌, 4-시아노-L-페닐알라닌, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이며,
제 1 항의 방법에 의해 제조되는 것인,
목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포.
A gene of a tRNA corresponding to a stop codon, and a gene of an aminoacyl tRNA synthetase which transfers an unnatural amino acid to the tRNA,
Wherein three consecutive codons in the nucleic acid sequence encoding the target protein are replaced by the stop codon,
Wherein the unnatural amino acid is selected from the group consisting of 4-acetyl-L-phenylalanine, 4-azido-L-phenylalanine, 4-phenyl-L-phenylalanine, 4-cyano- ≪ / RTI >
A process for the preparation of a compound according to claim 1,
Cells that produce mutants of the desired protein.
상기 아미노트랜스퍼라제의 유전자는 글루타민 아미노트랜스퍼라제를 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포.
12. The method of claim 11,
Wherein the gene of the aminotransferase comprises glutamine aminotransferase.
상기 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체를 생성하는 세포.
12. The method of claim 11,
Wherein the cell comprises a prokaryotic cell and a eukaryotic cell.
상기 비천연 아미노산의 전구체는 4-아세틸페닐피루브산(4-acetylphenylpyruvic acid), 4-아지도페닐피루브산(4-azidophenylpyruvic acid), 4-페닐페닐피루브산(4-phenylphenylpyruvic acid), 4-시아노페닐피루브산(4-cyanophenylpyruvic acid), 및 이들의 조합들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 α-케토산을 포함하는 것인,
목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법.
14. A method for producing a protein comprising the steps of: culturing a cell producing a mutant of the protein of interest of any one of claims 11 to 13 in a medium containing an unnatural amino acid precursor,
The precursors of the unnatural amino acids include 4-acetylphenylpyruvic acid, 4-azidophenylpyruvic acid, 4-phenylphenylpyruvic acid, 4-cyanophenylpyruvic acid, (4-cyanophenylpyruvic acid), and combinations thereof.
A method for producing a mutant of a target protein.
상기 목적 단백질의 돌연변이체는 상기 목적 단백질 서열 내에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법.
15. The method of claim 14,
Wherein the mutant of the target protein comprises the unnatural amino acid in the target protein sequence.
상기 비천연 아미노산 전구체가 상기 아미노트랜스퍼라제에 의하여 상기 세포 내부에서 비천연 아미노산으로 전환되고,
상기 비천연 아미노산은 상기 세포 내부에서 상기 아미노아실 tRNA 합성효소 및 상기 tRNA에 의하여 상기 치환된 코돈에 대응하는 상기 목적 단백질 내의 위치에 삽입되는 것을 포함하는 것인, 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법.
15. The method of claim 14,
Wherein said unnatural amino acid precursor is converted into a non-natural amino acid within said cell by said aminotransferase,
Wherein the unnatural amino acid is inserted into the cell at a position in the target protein corresponding to the substituted amino acid by the aminoacyl tRNA synthetase and the tRNA.
상기 단백질 돌연변이체는 상기 세포 외로 배출되는 것을 포함하는, 목적 단백질의 돌연변이체의 제조 방법.15. The method of claim 14,
Wherein said protein mutant is excreted outside said cell.
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| KR20150004095A (en) | 2015-01-12 |
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