KR101565652B1 - Biosensor for detecting target material using graphene oxide as electrochemical indicator and method for preparing the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합을 이용함으로써 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 상기 바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 표적물질 검출 효과를 나타낸다.The present invention relates to a biosensor for detecting target substances in vivo using graphene oxide as an electrochemical marker and a method for producing the same. The biosensor for detecting a target material in vivo according to the present invention is an electrochemical marker and has excellent sensitivity and selectivity to a target substance by using direct bonding between a graphene oxide and a target material, When a target substance is detected using a biosensor, it exhibits an excellent target substance detection effect by a simple and economical method.
Description
본 발명은 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 전극에 결합된 표적물질에 그래핀 산화물을 직접적으로 결합하고, 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정함으로써 표적물질의 농도를 측정하는, 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a biosensor for detecting a target substance in vivo using graphene oxide as an electrochemical marker and a method for producing the same, and more particularly, to a biosensor for detecting a target substance in vivo by directly binding graphene oxide to a target substance bound to an electrode, The present invention relates to a biosensor for detecting a target substance and a method for producing the same, which measure the concentration of a target substance by electrochemically reducing the graphene oxide bound to the target substance and measuring the reduction current.
일반적으로 생체 내 존재하는 표적물질로는 금속 이온, DNA, RNA, ATP 및 단백질 등이 있다. 상기 단백질 중 트롬빈은 혈액 내에 존재하는 단백질로서 혈액 응고 기작에서 중요하게 작용하는 단백질이다. 그러나, 혈중 정상적으로 존재하는 트롬빈의 농도를 벗어난 경우, 질병을 초래하는 사례가 보고되어 있고(J. Bichler, J. A. Heit, W. G. Owen, Thromb. Res. 84 (1996) 289-294), 이에 따라 용이한 트롬빈의 농도 측정법이 요구되고 있다.In general, target substances present in vivo include metal ions, DNA, RNA, ATP, and proteins. Among these proteins, thrombin is a protein existing in the blood and is an important protein in the blood coagulation mechanism. However, when the concentration of thrombin normally present in the blood is deviated, a case has been reported that causes disease (J. Bichler, JA Heit, WG Owen, Thromb. Res. 84 (1996) 289-294) A method for measuring the concentration of thrombin is required.
종래의 트롬빈 농도 측정을 위해서는 트롬빈에 정량적으로 1:1 반응하는 히루딘 펩타이드를 이용한 면역 측정법이 사용되었다. 이 때 형성된 트롬빈-히루딘 복합체를 ELISA 검사법이나 친화 크로마토그래피를 통해 트롬빈의 농도를 검출할 수 있다. 그러나, 이 방법은 히루딘의 경우, 생체 외에서 다른 단백질과 공유 결합한 트롬빈과는 결합할 수 없다는 단점이 있다. 또한, 현재 생체 시료 내의 단백질 농도 측정을 위해 주로 사용되는 기술인 면역반응에 기초를 둔 ELISA 검사법의 경우 안정성이 떨어지는 단백질을 사용하기 때문에 센서에 적용할 경우 보관에 특별한 주의가 요구될 뿐 아니라 광학적 분석에 기반을 두고 있으므로 분석 장비가 매우 고가라는 단점이 있다.For conventional thrombin concentration measurement, immunoassay using hirudin peptide, which quantitatively reacts with thrombin in a 1: 1 ratio, was used. The thrombin-Hirudin complex formed at this time can be detected by ELISA or affinity chromatography. However, this method has a disadvantage in that, in the case of hirudin, it can not bind to thrombin covalently bound to another protein in vitro. In addition, since the immune response-based ELISA assay, which is currently used for measuring the protein concentration in a biological sample, uses a protein with low stability, special care is required for storage when applied to a sensor, The analysis equipment is very expensive.
또한, 클락형(Clack-type) 포도당 센서의 출현 이후로, 전기화학적 바이오센서는 그 간단성, 민감도, 선택도, 및 경제성 때문에 질병의 진단, 음식의 분석, 환경의 관찰 및 분석의 분야에서 우수한 분석 기술로 발전되어 왔다. 또한, 다른 바이오센서에 비해서 그 성능의 저하 없이도 소형화를 할 수 있다는 장점이 있다. 새로운 바이오센서의 플랫폼과 전략을 이용하여 전기화학적 바이오센서의 민감도와 선택도 등을 더욱 향상시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 그래핀을 이용한 바이오센서의 플랫폼에 대한 관심이 높아지고 있다.In addition, since the advent of Clack-type glucose sensors, electrochemical biosensors have been recognized as being superior in terms of disease diagnosis, food analysis and environmental observation and analysis due to their simplicity, sensitivity, selectivity, and economy. Analytical technology. In addition, the biosensor can be miniaturized without deterioration in its performance as compared with other biosensors. Studies are underway to further improve the sensitivity and selectivity of electrochemical biosensors using new biosensor platforms and strategies. Among them, interest in a platform of a biosensor using graphene is increasing.
그래핀은 탄소원자들이 2차원 상에서 sp2 결합에 의한 벌집 모양의 배열을 이루면서 원자 한 층의 두께를 가지는 반금속성 나노 물질로, 일반적인 탄소 구조체에 비하여 넓은 비표면적(2,630 m2·g-1)을 가지고 있다. 또한, 구조적 및 화학적으로 매우 안정할 뿐만 아니라, 전기 및 열전도도가 우수하여 전자 소자, 센서, 수퍼 캐패스터, 태양전지, 및 방열소재 등에 응용이 가능한 물질로 알려져 있다.Graphene is a semimetallic nanomaterial with a thickness of one layer of carbon atoms, forming a honeycomb arrangement of sp 2 bonds on a two-dimensional topology, and has a large specific surface area (2,630 m 2 · g -1 ) Lt; / RTI > In addition, it is structurally and chemically very stable, and has excellent electrical and thermal conductivity and is known as a material that can be applied to electronic devices, sensors, super capacitors, solar cells, and heat dissipation materials.
또한, 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)은 바이오센서의 구성물, 세포 이미징(cellular imaging), 약물 전달 등에 있어서 활용 가능성이 높은 물질로 알려져 있다. 이들은 기존의 그래파이트보다 매우 큰 표면적을 가지며, 높은 전기전도도 및 강력한 기계적 강도를 가진다. 또한 부서지기 쉬운 그래파이트보다 유연하여, 유연성이 필요한 전기제품 등에 대해서 장점을 가지며, 더 많은 균일하게 분포된 전기화학적 활성사이트를 가지기 때문에 우수한 전극 표면 재료라는 평가를 받고 있다.In addition, graphene oxide (GO) and electrochemically reduced graphene oxide (ERGO) are widely used in biosensor components, cellular imaging, drug delivery, . They have a much larger surface area than conventional graphite, have high electrical conductivity and strong mechanical strength. It is also considered to be an excellent electrode surface material because it is more flexible than graphite which is brittle, has advantages in electric appliances that require flexibility, and has more uniformly distributed electrochemically active sites.
따라서, 이러한 그래핀 산화물을 이용하여 전기화학적으로 트롬빈을 검출하는 방법에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.Therefore, there is a strong demand for a method for electrochemically detecting thrombin using such graphene oxide.
본 발명자들은 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서에 대해 탐색하던 중, 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물을 이용하는 경우, 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합에 의해 표적물질 검출에 있어서 민감도 및 선택도가 우수하여짐을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention discovered that when using graphene oxide as an electrochemical marker while searching for a biosensor for detecting a target material in vivo, the sensitivity and selectivity of the detection of the target substance are excellent due to the direct binding of the graphene oxide to the target substance And the present invention was completed.
따라서, 본 발명은 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조 방법을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention provides a biosensor for detecting a target substance in vivo using direct binding between a graphene oxide and a target substance as an electrochemical marker, and a method for producing the same.
본 발명은 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서 및 이의 제조 방법을 제공한다.The present invention provides a biosensor for detecting target substances in vivo using direct binding of graphene oxide and a target substance as an electrochemical marker, and a method for producing the same.
본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합을 이용함으로써 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 상기 바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 표적물질 검출 효과를 나타낸다.The biosensor for detecting a target material in vivo according to the present invention is an electrochemical marker and has excellent sensitivity and selectivity to a target substance by using direct bonding between a graphene oxide and a target material, When a target substance is detected using a biosensor, it exhibits an excellent target substance detection effect by a simple and economical method.
도 1은 본 발명에 따른 생체 내 표적물질 중 트롬빈의 검출 방법의 개략적인 과정을 나타내는 도이다.
도 2는 그래핀 산화물 용액의 pH에 따른 트롬빈이 결합된 전극과 블랭크(blank) 전극간의 환원 전류의 차이를 나타내는 도이다.
도 3은 금 전극, 금/압타머 전극, 금/압타머/트롬빈 전극, 및 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극에 대한 (a) 전기화학 임피던스 분광법, 및 (b) 순환전압전류법의 측정 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 트롬빈 농도에 따른 따른 (a) 순환전압전류법의 측정 결과, 및 (b) 환원 전류 값의 변화를 나타내는 도이다.
도 5는 트롬빈, ADH, Avidin, Rabit-IgG, 및 Myoglobin의 다양한 단백질의 종류에 따른 (a) 순환전압전류법의 측정 결과, 및 (b) 환원 전류 값의 변화를 나타내는 도이다.
도 6은 트롬빈 용액에 (a) 담그기 전, 및 (b) 담근 후의 그래핀 산화물 처리된 전극 표면의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 나타내는 도이다.FIG. 1 is a diagram showing a schematic process of a method for detecting thrombin in a target material in vivo according to the present invention.
FIG. 2 is a graph showing a difference in reduction current between a thrombin bonded electrode and a blank electrode according to the pH of a graphene oxide solution. FIG.
FIG. 3 shows the results of (a) electrochemical impedance spectroscopy for a gold electrode, a gold / plumerator electrode, a gold / plumerator / thrombin electrode, and a gold / plumer / thrombin / graphene oxide electrode, and (b) Fig.
FIG. 4 is a graph showing the results of (a) measurement of the cyclic voltammetry and (b) reduction of the reduction current according to the thrombin concentration. FIG.
FIG. 5 is a graph showing the results of (a) measurement of cyclic voltammetry and (b) reduction current values according to various kinds of proteins of thrombin, ADH, Avidin, Rabit-IgG and Myoglobin.
Fig. 6 is a scanning electron microscope (SEM) image of a surface of a graphene oxide-treated electrode before (a) immersion and (b) after immersion in a thrombin solution.
본 발명은 표적물질-특이적 압타머(specific aptamer)가 전극에 고정되어 있고, 상기 고정된 표적물질-특이적 압타머와 표적물질이 결합하여 형성된 압타머에 결합된 표적물질을 포함하며,The present invention relates to a target substance-specific aptamer, which is immobilized on an electrode, and which comprises a target substance bound to a platemer formed by combining the target substance-specific tympanic membrane with a target substance,
상기 표적물질은 그래핀 산화물과 직접적으로 결합하는 것을 특징으로 하고, 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정함으로써 표적물질의 농도를 측정하는, 그래핀 산화물을 이용한 표적물질 검출용 바이오센서를 제공한다.Characterized in that the target substance is directly bound to the graphene oxide and the concentration of the target substance is measured by electrochemically reducing the graphene oxide bound to the target substance to measure the reduction current, A biosensor for detecting a target substance is provided.
또한, 본 발명은In addition,
1) 전극에 표적물질-특이적 압타머(specific aptamer)를 고정화하는 단계;1) immobilizing a target substance-specific aptamer on the electrode;
2) 상기 표적물질-특이적 압타머가 고정된 전극에 6-머캅토-1-헥산올을 가하여 6-머캅토-1-헥산올을 전극에 결합시키는 단계; 2) adding 6-mercapto-1-hexanol to the electrode to which the target substance-specific aptamer is immobilized to bind 6-mercapto-1-hexanol to the electrode;
3) 상기 표적물질-특이적 압타머 및 6-머캅토-1-헥산올이 고정화된 전극에 표적물질을 포함하는 용액을 가하여 표적물질을 압타머에 결합하는 단계;3) adding a solution containing the target material to the electrode on which the target material-specific platemer and 6-mercapto-1-hexanol are immobilized, thereby binding the target material to the platemaker;
4) 상기 압타머에 결합된 표적물질에 그래핀 산화물을 결합시키는 단계; 및4) bonding the graphene oxide to the target material bound to the squamometer; And
5) 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정하는 단계를 포함하는, 그래핀 산화물을 이용한 표적물질의 검출 방법을 제공한다.5) electrochemically reducing the graphene oxide bound to the target substance to measure a reduction current, thereby detecting a target substance using graphene oxide.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는, 전극에 결합된 표적물질에 그래핀 산화물이 직접적으로 결합하고, 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정함으로써 표적물질의 농도를 측정하는 것을 특징으로 한다.The biosensor for detecting a target material in vivo using the graphene oxide according to the present invention is characterized in that graphene oxide is directly bound to a target substance bound to the electrode and the graphene oxide bound to the target substance is electrochemically reduced And the concentration of the target substance is measured by measuring the reduction current.
상기 표적물질은 생체 내 존재하는 물질로, 그래핀 산화물과 물리적 또는 화학적 상호작용에 의해 결합할 수 있는 물질이라면 제한 없이 검출될 수 있다. 즉 표적물질은 생체 내 존재하는 금속 이온, DNA, RNA, ATP 및 단백질 등과 같은 화학 또는 바이오 물질을 일컫는다.The target substance can be detected without limitation as long as it is a substance present in vivo and capable of binding by physical or chemical interaction with graphene oxide. That is, the target substance refers to a chemical or biomaterial such as metal ions, DNA, RNA, ATP, and proteins present in vivo.
상기 단백질로는 트롬빈(thrombin), 피브리노겐(fibrinogen), 면역글로불린 G(immunoglobulin G, IgG), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 D(IgD), 헤모글로빈(hemoglobin), 미오글로빈(myoglobin), 알부민(albumin), 카제인(casein), 프롤라민(prolamin), 액틴(actin), 미오신(myosin), 콜라겐(collagen), 및 케라틴(keratin) 등 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Such proteins include thrombin, fibrinogen, immunoglobulin G, IgG, immunoglobulin M, IgA, IgD, hemoglobin, But are not limited to, myoglobin, albumin, casein, prolamin, actin, myosin, collagen, and keratin, and the like. Do not.
일반적으로 "압타머"란 검출하고자 하는 표적물질과 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 의미하는데, 본 발명에서는 상기 표적물질과 특이적으로 결합하는 압타머를 사용하였다.Generally, "abtamer" means an abatumer capable of specifically binding with a target substance to be detected. In the present invention, an abatumer that specifically binds to the target substance is used.
상기 표적물질-특이적 압타머는 표적물질과 선택적으로 결합하는 DNA, RNA 서열이라면 무엇이든지 가능하며, 표적물질과의 결합 효율을 높이기 위해, 탄소 6개를 추가적으로 포함할 수도 있다. 특히, 금 전극 표면에 고정을 위하여 표적물질-특이적 압타머의 5'-말단에 티올기(thiol group)를 추가할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 표적물질-특이적 압타머로서 트롬빈과 특이적으로 결합하는 5'-Thiol(C6)-TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3'을 사용하였다.The target substance-specific aptamer can be any DNA or RNA sequence that selectively binds to a target substance, and may additionally include six carbon atoms to enhance binding efficiency with the target substance. In particular, a thiol group may be added to the 5'-end of the target material-specific platemer for immobilization on the surface of the gold electrode. In one embodiment of the present invention, thrombin as the target material- 5'-thiol (C 6 ) -TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3 'which specifically binds to the 5'-
상기 전극은 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 전극은 금, 은, 구리, 백금 탄소, 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO) 및 알루미늄 등을 포함할 수 있으며, 본 발명에서는 금 전극이 바람직하다. The electrode can be used without limitation as long as it is commonly used in the field. The electrode may include gold, silver, copper, platinum carbon, indium tin oxide (ITO), and aluminum. In the present invention, a gold electrode is preferable.
상기 표적물질과 그래핀 산화물의 결합은 정전기적 인력 또는 π-π 상호작용에 의해 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The binding of the target material to the graphene oxide can be performed by electrostatic attraction or? -Π interaction, but is not limited thereto.
상기 그래핀 산화물을 포함하는 용액의 pH는 4 내지 6인 것이 바람직하고, 본 발명에서는 5인 것이 더욱 바람직하다. 상기 pH 5에서 그래핀 산화물의 산소기(oxygen group)들이 탈양성자화(deprotonation)되어 음전하를 띠는 표적물질-특이적 압타머와의 정전기적 반발력은 증가시키고, 표적물질과의 정전기적 상호 작용이 지배적으로 되기 때문이다.The pH of the solution containing the graphene oxide is preferably 4 to 6, more preferably 5 in the present invention. At
본 발명에 있어서, 상기 그래핀 산화물을 이용한 표적물질의 농도 측정은, 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물의 양을 측정하는 것을 의미하며, 상기 표적물질에 결합된 그래핀 산화물의 양은 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정함으로써 수행될 수 있다. In the present invention, the measurement of the concentration of the target substance using the graphene oxide means the measurement of the amount of the graphene oxide bound to the target substance, and the amount of the graphene oxide bonded to the target substance is the graphene oxide And electrochemically reducing it to measure the reduction current.
상기 환원 전류를 측정하기 위해서, 순환전압전류법 또는 전기화학 임피던스 분광법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In order to measure the reduction current, a cyclic voltammetry method or an electrochemical impedance spectroscopy method may be used, but the present invention is not limited thereto.
본 발명에 따른 그래핀 산화물을 이용한 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 표적물질의 농도가 증가할수록 순환전압전류법에서의 그래핀 산화물의 환원 피크 전류가 더욱 증가하므로 비교적 정확한 표적물질의 농도를 측정할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오센서는 pH 5의 환경에서 표적물질 검출이 가장 최적화된다.
The biosensor for detecting a target material in vivo using the graphene oxide according to the present invention increases the reduction peak current of the graphene oxide in the cyclic voltammetric method as the concentration of the target material increases, can do. In addition, the biosensor of the present invention is most optimized for detecting target substances in an environment of
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출용 바이오센서는 전기화학적 표지자로서 그래핀 산화물과 표적물질의 직접적인 결합을 이용함으로써 표적물질에 대한 민감도 및 선택도가 우수하여 표적물질의 농도 분석이 용이하고, 상기 바이오센서를 이용하여 표적물질을 검출하는 경우, 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 표적물질 검출 효과를 나타낸다.
As described above, the biosensor for detecting an in vivo target substance according to the present invention is an electrochemical marker, and it has excellent sensitivity and selectivity to a target substance by using a direct bonding between a graphene oxide and a target substance, And when the target substance is detected using the biosensor, it exhibits an excellent target substance detection effect by a simple and economical method.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
실시예 1. 그래핀 산화물을 이용한 트롬빈의 검출Example 1. Detection of thrombin using graphene oxide
1-1. 금 전극 표면에 티올화 트롬빈 결합 압타머(thiolated thrombin binding aptamer, TBA)의 고정화1-1. Immobilization of thiolated thrombin binding aptamer (TBA) on gold electrode surface
표면 개질에 앞서, 금으로 코팅된 유리전극을 piranha 용액(H2SO4:H2O2 = 3:1)으로 세척한 뒤, 물로 세척하고 질소 기체로 건조하였다. 이후, 상기 세척된 금 전극을 10 nM의 티올화 트롬빈 결합 압타머(thiolated thrombin binding aptamer, 5'-Thiol(C6)-TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3') 및 1mM의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)에 담그어 트롬빈 결합 압타머를 금 전극에 고정화하였다. 금 전극에 압타머를 고정화한 후에, 상기 전극을 1mM의 6-머캅토-1-헥산올에 1시간 동안 담그어 6-머캅토-1-헥산올을 금 전극에 결합하였다.
Prior to surface modification, the glass electrode coated with gold was washed with a piranha solution (H 2 SO 4 : H 2 O 2 = 3: 1), washed with water and dried with nitrogen gas. Then, the washed gold electrode was immersed in a 10 nM thiolated thrombin binding aptamer (5'-Thiol (C 6 ) -TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3 ') and 1 mM (TCEP) of tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) to fix the thrombin-bonded platemer to the gold electrode. After the platemer was immobilized on the gold electrode, the electrode was immersed in 1 mM 6-mercapto-1-hexanol for 1 hour to bind 6-mercapto-1-hexanol to the gold electrode.
1-2. 트롬빈 및 그래핀 산화물의 결합1-2. Combination of thrombin and graphene oxide
개질된 전극을 다양한 농도의 트롬빈 용액에 1.5시간 동안 담그어 트롬빈을 전극에 결합하였다. 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)은 그라파이트 분말로 수정된 Hummers 방법(W. Hummers, R. Offeman, Journal of the American Chemical Society 80 (1958) 1339.)을 이용하여 제조하였다. 제조된 그래핀 산화물을 초음파 분산기로 1시간 동안 초음파 처리한 뒤, 450 nm 컷오프(cut-off) 막 유리 필터로 걸렀다. 그래핀 산화물 용액의 pH는 HCl 및 NH4OH를 이용하여 조정하였다. 이후, 상기 트롬빈이 결합된 전극 표면을 상기 0.1 mg/ml의 그래핀 산화물 용액에 50분 동안 담그어 트롬빈 표면 위에 그래핀 산화물을 결합시켰다. 상기 그래핀 산화물이 결합된 전극에 대하여 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS) 및 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)을 수행하여 환원 전류를 측정하였다.The modified electrode was immersed in various concentrations of thrombin solution for 1.5 hours to bind thrombin to the electrode. Graphene Oxide (GO) was prepared using a modified Hummers method (W. Hummers, R. Offeman, Journal of the American Chemical Society 80 (1958) 1339) modified with graphite powder. The prepared graphene oxide was sonicated with an ultrasonic disperser for 1 hour and then passed through a 450 nm cut-off membrane glass filter. The pH of the graphene oxide solution was adjusted using HCl and NH 4 OH. Thereafter, the surface of the thrombin-bound electrode was immersed in the 0.1 mg / ml solution of the graphene oxide for 50 minutes to bind the graphene oxide on the thrombin surface. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) were performed on the electrode having the graphene oxide bound thereto to measure the reduction current.
본 발명에 따른 생체 내 표적물질 검출 방법의 개략정인 과정을 도 1에 나타내었다.
The process of detecting a target substance in vivo according to the present invention is schematically shown in FIG.
실험예 1. 전기화학 임피던스 분광법 및 순환전압전류법 측정Experimental Example 1. Electrochemical Impedance Spectroscopy and Cyclic Voltammetry Measurement
상기 실시예 1에 따라, 트롬빈 결합 압타머가 결합된 전극에 트롬빈을 결합하고, 그래핀 산화물을 가하여 제조한 전극에 대하여 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy, EIS) 및 순환전압전류법(Cyclic voltammetry, CV)을 측정하였다. 전기화학 임피던스 분광법 및 순환전압전류법은 각각 PC와 연결된 일정 전위기(potentiostat)로 lvium compactstat를 이용하여 수행하였다. 전기화학적 셀에서 Ag/AgCl에 연결된 작업 전극은 개질된 금 전극, 및 백금 와이어가 각각 사용된 기준 전극과 상대전극으로 구성되었다.Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry were performed on the electrodes prepared by binding thrombin to the electrodes to which the thrombin-bound aptamer was bound and adding graphene oxide according to Example 1, CV) were measured. Electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry were performed using lvium compactstat as a potentiostat connected to PC, respectively. The working electrode connected to Ag / AgCl in the electrochemical cell consisted of a reference electrode and a counter electrode, each of which had a modified gold electrode and a platinum wire, respectively.
전기화학 임피던스 분광법은 PBS 내의 K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6](1 mM, 1:1 분자비)의 형식전위(formal potential)에서 10 kHz 및 0.05 Hz 사이에서 측정하였다. 랜들(Randle) 등가회로는 나이퀴스트 플롯으로 나타난 임피던스 스펙트럼을 피팅하는데 사용되었다.
Electrochemical impedance spectroscopy was performed at 10 kHz and 0.05 Hz at a formal potential of K 4 [Fe (CN) 6 ] / K 3 [Fe (CN) 6 ] (1 mM, 1: Respectively. A Randle equivalent circuit was used to fit the impedance spectrum presented by the Nyquist plot.
1-1. 그래핀 산화물 용액의 pH 최적화1-1. PH optimization of graphene oxide solution
실시예 1에 따른 트롬빈의 검출 효율을 높이기 위하여 그래핀 산화물 용액의 pH를 최적화 하였다. 그래핀 산화물 용액의 pH에 따른 트롬빈이 결합된 전극과 블랭크(blank) 전극간의 순환전압전류법에 의한 환원 전류의 차이를 도 2에 나타내었다. The pH of the graphene oxide solution was optimized to increase the detection efficiency of thrombin according to Example 1. FIG. 2 shows the difference in the reduction current due to cyclic voltammetry between the thrombin-bound electrode and the blank electrode according to the pH of the graphene oxide solution.
도 2에 나타난 바와 같이, 그래핀 산화물 용액의 pH가 5인 경우 가장 큰 환원 전류 값의 차이를 나타내었다. 이것은 pH가 5에서 그래핀 산화물의 산소기(oxygen group)들이 탈양성자화(deprotonation)되어 음전하를 띠는 트롬빈 결합 압타머와의 정전기적 반발력은 증가시키고, 트롬빈과의 정전기적 상호 작용이 지배적으로 되기 때문이다.
As shown in FIG. 2, when the pH of the graphene oxide solution was 5, the maximum reduction current value was different. This means that at
1-2. 전극의 제조 단계별 평가1-2. Evaluation of electrode manufacturing steps
금 전극, 금/압타머 전극, 금/압타머/트롬빈 전극, 및 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극에 대한 전기화학 임피던스 분광법(EIS) 및 순환전압전류법(CV)의 결과를 도 3에 나타내었다. Results of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and cyclic voltammetry (CV) on gold electrodes, gold / ablator electrodes, gold / abdomen / thrombin electrodes, and gold / ablator / thrombin / Respectively.
도 3(a)에 나타난 바와 같이, 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극에서 산화환원 쌍(redox couple)의 전하 이동 저항값(charge transfer resistance)이 가장 크게 측정되었으며, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극에서 가장 큰 환원 피크 분리를 나타내었다.As shown in FIG. 3 (a), the charge transfer resistance of the redox couple in the gold / plumerator / thrombin / graphene oxide electrode was measured to the greatest, Showed the largest reduction peak separation in the gold / plumma / thrombin / graphene oxide electrode, as shown in Fig.
상기 결과로부터, 금 전극, 금/압타머 전극, 금/압타머/트롬빈 전극, 및 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극으로 갈수록 EIS의 전하 이동 저항값 및 CV의 환원 피크 분리가 점점 증가하는 것으로 보아 전극의 제조 단계별 센서 표면이 잘 형성되어 있음을 알 수 있다.
From the above results, it was found that the charge transfer resistance of the EIS and the reduction peak separation of CV gradually increased as the gold electrode, the gold / plumerator electrode, the gold / platemaker / thrombin electrode, and the gold / platemaker / thrombin / It can be seen that the surface of the sensor according to the manufacturing steps of the electrode is well formed.
1-3. 트롬빈 검출의 민감도(sensitivity) 평가1-3. Assessing the sensitivity of thrombin detection
트롬빈 검출에 대한 민감도를 평가하기 위하여, 트롬빈의 농도를 0 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml 100 ng/ml 및 1 ug/ml으로 하여 금/압타머/트롬빈/그래핀 산화물 전극에 대한 환원 전류를 0.0 V 부터 -1.2 V까지 전압을 가하여 측정하였다. 트롬빈 농도에 따른 따른 (a) 순환전압전류법의 측정 결과, 및 (b) 환원 전류 값의 변화를 도 4에 나타내었다.In order to evaluate the sensitivity to thrombin detection, the concentration of thrombin was measured with gold / platemper / thrombin at a concentration of 0 pg / ml, 100 pg / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml and 100 ng / / Reduction current for graphene oxide electrode was measured by applying voltage from 0.0 V to -1.2 V. The results of (a) measurement of the cyclic voltammetry and (b) reduction of the reduction current according to thrombin concentration are shown in FIG.
도 4(a)에 나타난 바와 같이, 환원 피크 전류는 -0.9 V에서 나타났으며, 트롬빈의 농도가 증가함에 따라 환원 피크 전류가 증가함을 확인하였다. 따라서 트롬빈의 농도가 증가할수록 전극에 결합하는 그래핀 산화물의 양이 증가한다는 사실을 확인하였다.As shown in FIG. 4 (a), the reduction peak current was found at -0.9 V, and the reduction peak current was increased as the thrombin concentration was increased. Therefore, it was confirmed that as the concentration of thrombin increases, the amount of graphene oxide bound to the electrode increases.
도 4(b)에 나타난 바와 같이, 선형 상관 계수가 0.987인 교정 곡선(calibration curve)을 얻었으며, 이를 통하여 100 pg/ml의 아주 낮은 검출 한계(detection limit)을 얻었다.
As shown in Fig. 4 (b), a calibration curve with a linear correlation coefficient of 0.987 was obtained, which resulted in a very low detection limit of 100 pg / ml.
1-4.1-4. 트롬빈 검출의 선택도(selectivity) 평가Evaluation of selectivity of thrombin detection
트롬빈 검출에 대한 선택도를 평가하기 위하여, 트롬빈, ADH, Avidin, Rabit-IgG, 및 Myoglobin의 다양한 단백질의 종류에 따른 (a) 순환전압전류법의 측정 결과, 및 (b) 환원 전류 값의 변화를 도 5에 나타내었다.To evaluate the selectivity for thrombin detection, (a) measurement results of cyclic voltammetry and (b) changes in the reduction current value according to various kinds of proteins of thrombin, ADH, Avidin, Rabit-IgG and Myoglobin Is shown in Fig.
도 5에 나타난 바와 같이, 트롬빈의 경우에는 ADH, Avidin, Rabit-IgG, 및 Myoglobin에 비하여 환원 피크 전류가 증가한 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 검출용 바이오센서는 트롬빈에 특이적임을 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 5, in the case of thrombin, the reduction peak current was increased compared to ADH, Avidin, Rabit-IgG, and Myoglobin. Therefore, it can be confirmed that the biosensor for detection of the present invention is specific to thrombin.
실험예 2. 주사 전자 현미경(SEM) 측정Experimental Example 2. Scanning Electron Microscope (SEM) Measurement
전극 표면에 흡착된 그래핀 산화물의 양을 확인하기 위해, 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 측정하였다. 트롬빈 용액에 (a) 담그기 전, 및 (b) 담근 후의 그래핀 산화물 처리된 전극 표면의 SEM 이미지를 도 6에 나타내었다. Scanning electron microscope (SEM) images were measured to determine the amount of graphene oxide adsorbed on the electrode surface. SEM images of the surface of the electrode treated with graphene oxide before (a) immersion and (b) after immersion in the thrombin solution are shown in Fig.
도 6에 나타난 바와 같이, 트롬빈 용액에 담근 후에 그래핀 산화물 처리된 전극 표면의 경우, 흡착된 그래핀 산화물의 양이 훨씬 많은 것을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 6, it can be seen that the amount of adsorbed graphene oxide is much larger in the case of the electrode surface treated with graphene oxide after immersion in the thrombin solution.
Claims (11)
2) 상기 표적물질-특이적 압타머가 고정된 전극에 6-머캅토-1-헥산올을 가하여 6-머캅토-1-헥산올을 전극에 결합시키는 단계;
3) 상기 표적물질-특이적 압타머 및 6-머캅토-1-헥산올이 고정화된 전극에, 표적물질인 트롬빈(thrombin)을 포함하는 용액을 가하여 트롬빈을 압타머에 결합시키는 단계;
4) 트롬빈이 결합된 전극 표면을 pH 5의 그래핀 산화물 용액에 담그어, 상기 압타머에 결합된 트롬빈에, 그래핀 산화물을 직접적으로 결합시키는 단계; 및
5) 상기 트롬빈에 결합된 그래핀 산화물을 전기화학적으로 환원시켜 환원 전류를 측정하는 단계;를 포함하며,
상기 5) 단계는 순환전압전류법을 이용하여, 트롬빈의 농도가 증가함에 따라 함께 증가하는 환원 피크 전류값을 측정하여 수행되는 것임을 특징으로 하는,
그래핀 산화물을 전기화학적 표지자로 이용한 표적물질의 검출 방법.1) immobilizing a target substance-specific aptamer on the electrode;
2) adding 6-mercapto-1-hexanol to the electrode to which the target substance-specific aptamer is immobilized to bind 6-mercapto-1-hexanol to the electrode;
3) adding a thrombin-containing solution to the electrode on which the target material-specific platemaker and 6-mercapto-1-hexanol are immobilized to bind thrombin to the platemer;
4) immersing the surface of thrombin-bound electrode in a graphene oxide solution of pH 5 to directly bind graphene oxide to the thrombin bound to the thrombin; And
5) electrochemically reducing the graphene oxide bound to the thrombin to measure a reduction current,
Wherein the step 5) is performed by measuring a reduction peak current value which increases together with the concentration of thrombin by using a cyclic voltammetric method.
A method for detecting a target substance using graphene oxide as an electrochemical marker.
상기 표적물질-특이적 압타머는 압타머의 5'-말단에 티올기(thiol group)를 갖는 DNA 또는 RNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 전기화학적 표지자로 이용한 표적물질의 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the target substance-specific aptamer comprises a DNA or RNA sequence having a thiol group at the 5'-terminus of the platamer, and a method for detecting a target substance using the graphene oxide as an electrochemical marker .
상기 표적물질-특이적 압타머는 5'-Thiol(C6)-TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3'인 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 전기화학적 표지자로 이용한 표적물질의 검출 방법.3. The method of claim 2,
Characterized in that the target substance-specific aptamer is 5'-Thiol (C 6 ) -TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T-3 '. Detection method.
상기 전극은 금, 은, 구리, 백금 탄소, 인듐 주석 산화물(Indium Tin Oxide, ITO) 및 알루미늄으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 전기화학적 표지자로 이용한 표적물질의 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the electrode is any one selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum carbon, indium tin oxide (ITO), and aluminum. Way.
상기 트롬빈과 그래핀 산화물의 결합은 정전기적 인력에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 그래핀 산화물을 전기화학적 표지자로 이용한 표적물질의 검출 방법.The method according to claim 1,
Wherein the binding of the thrombin to the graphene oxide is carried out by an electrostatic attractive force, wherein the graphene oxide is used as an electrochemical marker.
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| Biosensors. 2012, vol. 2, pp. 1-14.* |
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