KR101563790B1 - Magnetic nano-vector for transferring nucleic acids specific to liver cell and magnatic resonance imaging - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상용 자성 나노벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 리간드와 결합하는 자성나노입자를 포함하는 자성 나노전달체 및 핵산 구조체를 포함하는 ASGPr 결합성 리간드-세포전달용 화합물의 복합 구조로 간세포에 선택적으로 흡수되어 핵산에 의한 형질 도입/변환이 가능한 벡터의 역할과 자기공명영상장치(MRI)를 이용한 간세포 특이성 평가가 동시에 가능한 자성 나노벡터에 관한 것이다.The present invention relates to magnetic nanoparticles for hepatocyte-specific nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging, and more particularly, to magnetic nanoparticles containing magnetic nanotransporter and nucleic acid construct comprising magnetic nanoparticles binding to ASGPr (asialoglycoprotein receptor) The complex structure of ASGPr binding ligand-cell transfer compound is selectively absorbed into hepatocytes and serves as a vector capable of transduction / transformation by nucleic acid and a magnetic nano-vector capable of simultaneously evaluating hepatocyte specificity using magnetic resonance imaging (MRI) .

Description

간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상용 자성 나노벡터{MAGNETIC NANO-VECTOR FOR TRANSFERRING NUCLEIC ACIDS SPECIFIC TO LIVER CELL AND MAGNATIC RESONANCE IMAGING}[0001] MAGNETIC NANO-VECTOR FOR TRANSFERRING NUCLEIC ACID SPECIFIC TO LIVER CELL AND MAGNATIC RESONANCE IMAGING [0002]

본 발명은 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상용 자성 나노벡터 자성 나노벡터에 관한 것이다.
The present invention relates to magnetic nano-vector magnetic nano-vectors for hepatocyte-specific nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging.

나노 기술은 물질을 원자, 분자수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 그 크기로 인해 거시적인 수준의 물리적 법칙과는 다른 물리적 거동을 보이는 특성 때문에 신물질, 또는 신소자 창출에 적합하여 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지, 및 환경 등 그 응용분야가 매우 다양하다. Nanotechnology is a technology that controls and controls materials at the atomic and molecular levels. Because of its size, it exhibits physical behaviors different from those of macroscopic physical laws. Therefore, it is suitable for creating new materials or new devices, Machinery, medicine, agriculture, energy, and environment.

현재 나노 기술은 다양하게 발전하고 있으며, 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. 첫째, 나노 소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노 소자인데 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노 기술을 생명공학에 응용하는 기술에 관한 것이다.At present, nanotechnology has been developed in various ways and classified into three major areas. First, it relates to a technique for synthesizing new materials and materials of extremely small size with nanomaterials. Secondly, the present invention relates to a technique for fabricating a device exhibiting a certain function by combining or arranging nano-sized materials. Third, it relates to the application of nanotechnology, called nano-bio, to biotechnology.

최근의 나노 기술은 나노-바이오 기술분야에서 그 연구규모와 성과가 두드러지게 발전하고 있으며, 특히 자성 나노입자를 이용하여 생체 물질의 분리, 거대자기저항센서를 포함한 바이오센서, 마이크로 유체계 센서, 약물 및 유전체 전달, 자기공명영상 진단 프로브, 자성 고온치료 등의 다양한 응용 연구가 활발히 진행되고 있다. Recently, nanotechnology has been remarkably developed in the field of nanotechnology and biotechnology, and its research and development have been remarkably developed. In particular, the use of magnetic nanoparticles enables separation of biomaterials, biosensors including giant magnetoresistive sensors, And various applications such as dielectric transmission, magnetic resonance imaging probe, and magnetic high temperature treatment have been actively studied.

이중 자성 나노입자의 자기공명영상 진단 프로브로서의 응용은 기존의 자기공명영상(MRI)이 비침습적으로 고해상도의 해부학적 영상을 얻을 수 있는 장점과 맞물려 분자수준의 생물학적 정보의 영상화를 가능하게 하면서 분자영상 기술 분야에서 큰 주목을 받고 있다(비특허문헌 1, 2). The application of dual magnetic nanoparticles as magnetic resonance imaging probes enables the imaging of biological information at the molecular level in conjunction with the advantage of conventional MRI (magnetic resonance imaging) noninvasively obtaining high resolution anatomical images, (Non-Patent Documents 1 and 2).

자기공명영상 프로브로 사용되는 대표적인 자성 나노입자는 나노크기의 철 산화물 입자이다. 나노 크기의 철 산화물 입자는 역스피넬 구조(inverse spinel structure)의 원자배열을 가지며 자기스핀의 배열과 크기, 그리고 첨가되는 전이금속의 종류(MFe2O4, M: Mn, Fe, Co, Ni 등)와 제조하는 공정(공침법, 열분해법)에 따라 자기 민감도가 결정된다. 자성 나노입자의 자기 민감도가 클수록 입자 주변의 물 분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타낸다.Representative magnetic nanoparticles used as magnetic resonance imaging probes are nano-sized iron oxide particles. The nano-sized iron oxide particles have an inverse spinel structure with an atomic arrangement and the arrangement and size of magnetic spins and the type of transition metal (MFe 2 O 4 , M: Mn, Fe, Co, Ni ) And the manufacturing process (co-precipitation method, pyrolysis method). The larger the magnetic sensitivity of the magnetic nanoparticles, the shorter the spin-spin relaxation time of the hydrogen atoms in the water molecules around the particles, thereby amplifying the magnetic resonance image signal.

한편, 자성 나노입자는 세포 또는 체내로의 약물 및 유전체의 전달에도 사용되고 있다. 자성 나노입자에 화학적인 결합 또는 흡착을 통해 약물 또는 유전자를 싣고 외부 자기장을 이용하여 원하는 위치로 이동시켜 특정 부위에 약물 및 유전자를 방출을 가능하게 하여 선택적인 치료 효과를 가져올 수 있게 한다(비특허문헌 3,4).On the other hand, magnetic nanoparticles are also used to transfer drugs and dielectrics into cells or the body. The drug or gene is loaded onto the magnetic nanoparticle through chemical bonding or adsorption and is moved to a desired position by using an external magnetic field to enable the drug and the gene to be released to a specific site so that a selective therapeutic effect can be obtained Literature 3,4).

디옥시리보핵산(DNA)와 리보핵산(RNA)와 같은 유전체의 전달은 크게 바이러스성 운반체(비특허문헌 5)와 비바이러스성 운반체를 이용한 방법으로 나눌 수 있다. 비바이러스성 유전자 운반체로 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)과 같은 양이온성 고분자 물질이나 리포좀(Liposomes)이 널리 이용된다. 그러나, 상기 물질은 생체 외 세포 트랜스펙션에 주로 이용되며, 생체 적용 시 유전자 전달 효율이 낮고 비특이적으로 유전자를 전달하여 문제가 되고 있다. 또한, in vivo에서 면역반응 유발 등의 문제점이 해결되지 못하고 있다.
Transmission of dielectrics such as deoxyribonucleic acid (DNA) and ribonucleic acid (RNA) can be largely divided into methods using viral carriers (non-patent document 5) and non-viral carriers. As nonviral gene carriers, cationic polymers such as polyethylenimine (PEI) or liposomes are widely used. However, these materials are mainly used for in vitro cell transfection, and have low gene transfer efficiency in vivo application, and they are problematic by transferring genes nonspecifically. Also, in and the problems such as induction of an immune response in vivo have not been solved.

NMR Biomed 2011, vol 24, p561NMR Biomed 2011, vol 24, p561 Contrast Media Mol I, 2012, vol 7, p1 Contrast Media Mol I, 2012, vol 7, p1 J Microencapsul, 2006, vol 23(2), p203J Microencapsul, 2006, vol 23 (2), p203 Drug Develop Res, 2006, vol 67, p 55 Drug Develop Res, 2006, vol 67, p 55 Molecular Therapy, 2002, vol 6, p 106 Molecular Therapy, 2002, vol 6, p 106

이에, 본 발명자들은 간세포 특이적 핵산 전달뿐만 아니라 자기공명영상도 가능한 새로운 자성 나노벡터를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
Thus, the present inventors have completed the present invention by developing a novel magnetic nano vector capable of magnetic resonance imaging as well as hepatocyte-specific nucleic acid delivery.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 리간드와 결합하는 자성나노입자를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달용 자성나노전달체를 제공한다.
As a means for solving the above problems, the present invention provides a magnetic nanocrystal for transferring nucleic acid specific for hepatocytes, comprising magnetic nanoparticles which bind to ASGPr (asialoglycoprotein receptor) binding ligand.

상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 자성나노전달체를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상(MRI)용 자성 나노벡터를 제공한다.
As another means for solving the above problems, the present invention provides a magnetic nanocyte for liver cell-specific nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging (MRI) including the magnetic nanotransporter.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 자성나노전달체; 및 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 핵산 구조체를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상(MRI)용 자성 나노벡터를 제공한다.
As another means for solving the above problems, the present invention provides a magnetic nanotuber comprising: the magnetic nanotransporter; And a nucleic acid construct for inhibiting the expression of the pro-protein conformational subtilisinchexin 9 (PCSK9) gene. The present invention also provides a magnetic nanocyte for nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging (MRI).

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 상기 자성나노전달체; 및 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 핵산 구조체를 포함하는 저밀도지단백(LDL)-콜레스테롤 관련 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
As another means for solving the above problems, the present invention provides a magnetic nanotuber comprising: the magnetic nanotransporter; (LDL) -cholesterol-related diseases, which comprises a nucleic acid construct for inhibiting the expression of the propeptide protein subtilisincexin 9 (PCSK9) gene. The present invention also provides a composition for preventing and treating low-density lipoprotein (LDL) -cholesterol-related diseases.

상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 자성 나노입자에 ASGPr 결합성 리간드를 결합시키는 단계를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달용 자성나노전달체의 제조방법을 제공한다.
As another means for solving the above problems, the present invention provides a method for preparing magnetic nanocrystals for nucleic acid transfer, comprising the step of binding an ASGPr binding ligand to magnetic nanoparticles.

본 발명에 따른 자성나노벡터는 자성나노입자 기반으로 합성된 물질로서, 형질도입 제제의 기능뿐만 아니라 T2 자기공명영상(MRI)까지 가능하다는 점에서, 기존 형질도입 제제가 할 수 없는, 전달과정 및 여부를 모니터링할 수 있는 강력한 기능을 가진 점에 특징이 있다. 또한, 형질도입제제의 전달과정을 모니터링할 수 있어 유전자 조작 여부에 대한 사전 평가가 가능하고 이는 이후 추가 투여 및 결과 평가에 대한 전략을 수립하기 용이하다.The magnetic nano-vector according to the present invention is a substance synthesized on the basis of magnetic nanoparticles, and it can be used not only as a transduction agent but also as a T2 magnetic resonance imaging (MRI) It has a feature that it has powerful function to monitor whether or not it is. In addition, it is possible to monitor the delivery process of the transfusion preparation, so that a preliminary evaluation can be made as to whether or not the gene is manipulated, and it is then easy to establish a strategy for further administration and evaluation of results.

기존의 일부 표적지향성을 도입한 형질도입제제는 표적지향성 리간드가 불안정하거나 높은 가격으로 인해 경제성, 편의성이 떨어지는데 반해, 본 발명에 따른 자성나노벡터는 단시간에 형질도입이 가능하고 안정하며 경제적인 표적지향성 리간드를 갖는 고효율의 형질도입 제제이다.
In contrast, the transgenic agent introducing a part of the target directivity has a disadvantage in that the target orienting ligand is unstable or expensive, resulting in low economic efficiency and convenience. In contrast, the magnetic nano vector according to the present invention is capable of transducing in a short time, Is a high-efficiency transduction agent having a ligand.

도 1a는 실시예 1에서 제조된 자성 나노입자(망간페라이트)의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이고,
도 1b는 실시예 1에서 제조된 자성 나노입자(망간페라이트)의 자기적 특성은 VSM을 이용하여 측정한 그래프이다.
도 2는 실시예 2에서 제조된 자성 나노전달체의 수용상 콜로이드 크기를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 실시예 2에서 제조된 자성 나노전달체의 제조과정과 자성 나노전달체의 구조를 나타낸 단면도이고,
도 3b는 실시예 2에서 제조된 자성 나노전달체의 투과전자현미경 사진이다.
도 4는 실시예 3에서 제조한 자성나노벡터의 siRNA 담지 여부를 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 5는 실시예 4에서 실시한 자성나노벡터의 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 실시예 5에서 실시한 자성나노벡터의 간세포 표적화 기능을 암시야현미경을 이용하여 나타낸 사진이며,
도 6b는 실시예 5에서 실시한 자성나노벡터의 간세포 표적화 기능을 형광현미경을 이용하여 나타낸 사진이다.
도 7은 간세포에 표적화된 자성나노벡터의 형질도입 유효성을 평가하기 위해 웨스턴 블랏(western blot) 실험을 수행한 결과와 이를 수치화하여 나타낸 그래프이다.
도 8a는 실시예 6에서 수행한 자성나노벡터를 C57BL/6 마우스에 주입 전, 후 자기공명영상에 대한 사진이며,
도 8b는 자기공명영상 이후 마우스의 간장을 적출하여 조직검사를 수행한 결과에 대한 사진이다.1A is a transmission electron micrograph of the magnetic nanoparticles (manganese ferrite) produced in Example 1,
1B is a graph showing the magnetic properties of the magnetic nanoparticles (manganese ferrite) prepared in Example 1 using VSM.
FIG. 2 is a graph showing the colloidal size of the host nanoparticles prepared in Example 2. FIG.
FIG. 3A is a cross-sectional view showing a process of manufacturing the magnetic nanotransistor manufactured in Example 2 and a structure of the magnetic nanotransporter,
3B is a transmission electron micrograph of the magnetic nanotransporter prepared in Example 2. FIG.
FIG. 4 is a photograph showing electrophoresis of the magnetic nano vector prepared in Example 3 to confirm whether or not siRNA is carried.
Fig. 5 shows the results of the cytotoxicity evaluation of the magnetic nanovector performed in Example 4. Fig.
6A is a photograph showing the liver cell targeting function of the magnetic nano vector performed in Example 5 using a dark field microscope,
6B is a photograph showing a liver cell targeting function of the magnetic nano vector performed in Example 5 using a fluorescence microscope.
FIG. 7 is a graph showing the result of performing a western blot experiment to evaluate the transfection efficiency of the magnetic nanovector targeted to the hepatocyte, and a numerical value thereof.
8A is a photograph of a magnetic resonance image before and after injecting magnetic nano-vectors in Example 6 into C57BL / 6 mice,
FIG. 8B is a photograph of the result of performing histological examination by extracting mouse liver after magnetic resonance imaging.

본 발명은 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 리간드와 결합하는 자성나노입자를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달용 자성나노전달체에 관한 것이다.The present invention relates to a magnetic nanocrystal for transferring nucleic acid specific for hepatocytes comprising magnetic nanoparticles which bind to ASGPr (asialoglycoprotein receptor) -binding ligand.

상기 ASGPr 결합성 리간드는 ASGPr 결합성 당류 또는 이의 유도체가 바람직하며, ASGPr 결합성 이당류 또는 이의 유도체가 보다 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 상기 당류 또는 이당류에는 갈락토오즈가 포함되어야 하며, 상기 ASGPr 결합성 이당류로는 락토오즈(lactose), 락툴로오즈 (lactulose), 멜리비오즈 (melibiose) 및 멜리빌로오즈(melibiulose) 등 중에서 하나와 갈락토오즈(galactose)와 다른 단당류의 결합으로 이루어진 이당류가 바람직하다. 또한, 갈락토실글루코닉 산(galactosylgluconic acid), 락토바이오닉 산(lactobionic acid)과 같은 갈락토오즈(galactose)와 다른 단당류 산성 형(acid form)의 결합으로 이루어진 유도체도 포함될 수 있다.The ASGPr binding ligand is preferably an ASGPr binding sugar or a derivative thereof, more preferably an ASGPr binding disaccharide or a derivative thereof, but is not limited thereto. In particular, the saccharide or disaccharide should contain galactose and the ASGPr-binding disaccharide may include lactose, lactulose, melibiose, melibiulose, etc. And a disaccharide composed of a combination of galactose and other monosaccharides. In addition, derivatives of galactose such as galactosylgluconic acid, lactobionic acid and other acidic forms of monosaccharides may be included.

본 발명에서 사용된 자성 나노입자는 당 분야에서 사용되는 통상의 자성 나노입자로, 자성을 가지고, 직경이 1 내지 1000 nm, 보다 바람직하게는 2 내지 100 nm인 입자라면 특별히 제한하지는 않는다. 가장 바람직하게는 상기 직경을 갖는 금속, 자성 물질, 또는 자성 합금이 좋다. 상기 금속은 특별히 제한하지는 않으나, Pt, Pd, Ag, Cu, 또는 Au 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. The magnetic nanoparticles used in the present invention are conventional magnetic nanoparticles used in the art and are not particularly limited as long as they are magnetic and have a diameter of 1 to 1000 nm, more preferably 2 to 100 nm. Most preferable is a metal, a magnetic material, or a magnetic alloy having the above-mentioned diameter. The metal is not particularly limited, but Pt, Pd, Ag, Cu, Au, etc. may be used alone or in combination of two or more.

상기 자성 물질은 특별히 제한하지는 않으나, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 또는 MxOy (M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 식 “0 < x ≤ 3” 및 “0 < y ≤ 5”을 만족한다.) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. The magnetic material is not particularly limited, Co, Mn, Fe, Ni , Gd, Mo, MM '2 O 4, or MxOy (M and M' are each independently selected from Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, Or Cr, and x and y each satisfy the formula "0 <x? 3" and "0 <y? 5").

상기 자성 합금은 특별히 제한하지는 않으나, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, 또는 NiFeCo 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. The magnetic alloy is not particularly limited, but CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe, or NiFeCo may be used alone or in combination of two or more.

상기 자성 나노전달체는 자성 나노입자 상에 추가로 기능성 실란층이 형성될 수 있다.The magnetic nanotransporter may further comprise a functional silane layer on the magnetic nanoparticles.

본 발명에서 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자 제조 시에 아민기 등의 기능기를 가지는 기능성 실란 화합물을 사용하여 자성 나노입자의 표면에 아민기 등의 기능기를 도입하게 된다. 이 과정을 통하여 자성 나노입자에 기능성를 부여하게 되며, 코팅된 아민기 등의 기능기를 이용하여 다양한 기능을 가진 다른 화합물을 결합시킬 수 있게 된다. 상기 기능성 실란 화합물로는 아민기를 갖는 실란 화합물들 및 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 기능성 실란 화합물은 자성 나노입자 1 중량부에 대하여 2 내지 12 중량부의 함량으로 사용되는 것이 바람직하다. 만일, 2 중량부 미만이면 자성 나노입자 표면에 기능성 실란 화합물이 충분히 코팅되지 않아 기능기에 의한 효과가 잘 나타나지 않는 문제가 있다. 기능성 실란 화합물은 자성나노입자의 표면에 단일분자층으로 형성되기 때문에 사용되는 기능성 실란 화합물의 양이 많을수록 공정 시간 및 코팅의 효율성을 높일 수 있지만, 12 중량부를 초과하더라도 효과에 큰 차이가 없다.In the present invention, a functional silane compound having a functional group such as an amine group is used in the production of the magnetic nanoparticle having the functional silane layer to introduce functional groups such as an amine group onto the surface of the magnetic nanoparticle. Through this process, the magnetic nanoparticles are imparted with functionality, and functional groups such as coated amine groups can be used to bind other compounds having various functions. As the functional silane compound, it is preferable to use silane compounds having an amine group and a mixture thereof. The functional silane compound is preferably used in an amount of 2 to 12 parts by weight based on 1 part by weight of the magnetic nanoparticles. If the amount is less than 2 parts by weight, there is a problem that the functional silane compound is not sufficiently coated on the surface of the magnetic nanoparticles, and the effect of the functional group is not shown well. Since the functional silane compound is formed as a single molecular layer on the surface of the magnetic nanoparticles, the larger the amount of the functional silane compound used, the higher the process time and the coating efficiency. However, even if the functional silane compound exceeds 12 parts by weight,

본 발명에 따른 제조방법에서 기능성 실란 화합물은 RxSiY(4-x)(R: 아민기를 포함하는 유기 작용기(organic functional group), Y: 무기 작용기, x:1~3)의 구조를 갖는 실란 커플링제(coupling agent) 중 Y 그룹은 금속 수산화물(metal hydroxide)의 수산화기 또는 실란올(silanol)과 가수분해반응을 통해 실록산 결합(siloxane bond)을 형성할 수 있는 알콕시(예, 메톡시 또는 에톡시) 그룹을 포함)이며, 예를 들면, 아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 및 아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane)에서 선택된 하나 이상일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.In the production method according to the present invention, the functional silane compound is a silane having a structure of R x SiY (4-x) (R is an organic functional group containing an amine group, Y is an inorganic functional group, x is 1 to 3) Among the coupling agents, the Y group is an alkoxy group capable of forming a siloxane bond through hydrolysis reaction with a hydroxyl group or silanol of a metal hydroxide (e.g., methoxy or ethoxy ) Group, and may be, for example, at least one selected from aminopropyltrimethoxysilane and 3-aminopropyltriethoxysilane, but is not limited thereto.

상기 실란 화합물의 알콕시 그룹은 금속 수산화물의 수산화그룹 또는 실란올과 가수분해반응을 통해 실록산 결합을 형성할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서는 자성나노입자를 강한 염기성 물질인 수산화암모늄과 같이 매질에 분산시켜, 해리된 수산화이온이 자성나노입자 표면에 흡착되게 되도록 하여 이렇게 형성된 수산화기는 실란 화합물의 알콕시기와 실록산 결합을 형성하게 된다.The alkoxy group of the silane compound may form a siloxane bond through a hydrolysis reaction with a hydroxyl group of a metal hydroxide or silanol. In one embodiment of the present invention, the magnetic nanoparticles are dispersed in a medium such as ammonium hydroxide, which is a strong basic substance, so that the dissociated hydroxyl ions are adsorbed on the surface of the magnetic nanoparticles, and thus the hydroxyl groups formed as described above are reacted with an alkoxy group and a siloxane bond Respectively.

또한, 본 발명은 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자에 세포 전달용 화합물을 반응시켜 세포전달용 화합물층을 형성시킬 수 있다.In addition, the present invention can form a cell-transporting compound layer by reacting the cell-transferring compound with the magnetic nanoparticles formed with the functional silane layer.

본 발명에서는 상기 기능성 실란이 코팅된 산화 금속 자성 나노입자에 아민기를 가지고 있는 세포전달용 화합물들을 붙이게 되는데, 여기서 세포전달용 화합물들은 세포에 트렌스펙션을 용이하게 하고 세포 내에서 핵산의 엔도좀(endosome) 탈출(escape)을 가능하게 하여 핵산 유전자가 세포 내로 전달되어 고유의 역할을 하게 해 준다.In the present invention, the functional silane-coated metal oxide magnetic nanoparticles are coated with a cell-transferring compound having an amine group. Here, the cell-transferring compound facilitates the transfection of cells and the endosome ) Allows escape, allowing the nucleic acid gene to be delivered into the cell and play its own role.

상기 세포 전달용 화합물은 양이온성 고분자가 바람직하며, 구체적으로, 가지형(branched) 폴리에틸렌이민(Polyethylene imine; PEI)일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 폴리에틸렌이민은 중량평균 분자량이 10,000 내지 50,000인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 20,000 내지 25,000인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 분자량이 10,000 미만일 경우, 고분자의 길이가 짧아 수용상 분산 안정성을 확보하기 어렵고, 핵산을 담지하는데 필요한 1차 아민 구조의 위치가 잘 노출되지 않아 핵산의 담지 효율이 떨어질 가능성이 크다. 분자량이 50,000을 초과하는 경우, 상대적으로 긴 고분자의 길이로 인한 수용상 분산 안정성은 향상될 수 있으나, 입자 크기가 너무 커져서 결론적으로는 수용상 분산 안정성이 감소하고, 입자 표면과 입자 중심의 자성나노입자 간의 거리가 멀어져 자성나노입자의 MRI 조영 효과를 감소시킬 수 있다.The cell transferring compound is preferably a cationic polymer, and may be, but is not limited to, branched polyethylene imine (PEI). The polyethyleneimine preferably has a weight average molecular weight of 10,000 to 50,000. More preferably from 20,000 to 25,000. When the molecular weight is less than 10,000, the length of the polymer is too short to secure the stability of the aqueous phase dispersion, and the primary amine structure necessary for supporting the nucleic acid is not easily exposed, and the loading efficiency of the nucleic acid is likely to be lowered. When the molecular weight exceeds 50,000, the stability of the aqueous phase dispersion due to the length of the relatively long polymer can be improved, but the particle size becomes too large and consequently the aqueous phase dispersion stability decreases, and the magnetic nano- The distances between the particles become far apart, which can reduce the MRI contrast effect of the magnetic nanoparticles.

본 발명에서 핵산 세포전달용 자성 나노전달체를 제조 시 세포 전달용 화합물을 사용하여, 자성 나노입자가 세포 안으로 트렌스펙션되고, 부착된 핵산이 효과적으로 전달되도록 한다. 상기 세포전달용 화합물은 자성 나노입자 1 중량부에 대하여 10 중량부 내지 30 중량부의 함량으로 사용되는 것이 바람직하다. 만일 30 중량부를 초과하게 되면, 제조된 핵산 세포전달용 자성 나노입자의 크기가 너무 크고 세포 독성이 강하여, 세포 트렌스펙션이 안되는 문제점이 있고, 10 중량부 미만이면 자성 나노입자 표면에 세포 전달용 화합물이 충분하지 않아 세포 트렌스펙션이 효과적으로 되지 않는 문제가 있다.In the present invention, when a magnetic nanotransmitter for nucleic acid cell transfer is manufactured, a cell-transferring compound is used to allow the magnetic nanoparticles to be transfected into the cell, thereby effectively transferring the attached nucleic acid. The cell transferring compound is preferably used in an amount of 10 parts by weight to 30 parts by weight based on 1 part by weight of the magnetic nanoparticles. If the amount of the magnetic nanoparticles is more than 30 parts by weight, there is a problem that the produced magnetic nanoparticles for cell-mediated cell transfer are too large and the cytotoxicity is strong and cell transfection is not performed. If the amount is less than 10 parts by weight, There is a problem that the cell transfection is not effective.

기능성 실란층의 아민기와 세포 전달용 화합물의 아민기는 아민-알데히드 결합반응을 통해 이민과 H2O로 만들어진다. 이를 위해서는 가교물질이 필요하며, 상기 가교물질은 알데히드 기를 가지는 것이 보다 바람직하다. 알데히드 기는 산소와 탄소간의 이중결합이 상대적으로 전기음성도가 강한 산소 쪽으로 전자쌍이 치우치게 되어 산소 쪽이 δ- 전하, 탄소 쪽이 δ+ 전하를 띠고 있다. 아민기도 마찬가지로, 전기음성도가 강한 질소 쪽이 δ- 전하를 띠고 있으며 이는 알데히드 기의 탄소를 공격하기 쉬운 상태이다. 아민기의 질소가 알데히드기의 탄소를 공격하면 일시적으로 알데히드기의 탄소-산소간 이중결합이 단일결합이 되며 탄소-질소간 단일결합이 형성된다. 이 구조는 매우 불안정하고 쉽게 수소와 산소가 물이 되어 분리되고 탄소-질소간 이중결합을 형성, 이민기가 되며 안정하게 된다. 잔여 알데히드 기는 위와 동일한 결합과정으로 세포 전달용 화합물의 아민기와 반응, 이민(imine, N=C=O)기를 형성하여 최종적으로 자성나노입자-실란층-세포전달용 화합물층을 이루게 된다. 상기 가교물질은 자성 나노입자 1 중량부에 대하여 4 내지 12 중량부를 사용하는 것이 바람직하다. 4 중량부 미만으로 사용될 경우, 자성 나노입자 표면의 기능성 실란층에 가교물질이 충분히 결합되지 않는 문제점이 있고, 그 양이 많을수록 기능성 실란 화합물과의 결합 공정 시간 및 결합의 효율성을 높일 수는 있으나 12 중량부를 초과하여 사용하는 경우는 그 효과가 미미하다.The amine group of the functional silane layer and the amine group of the cell transfer compound are made from imine and H 2 O through an amine-aldehyde bonding reaction. For this purpose, a crosslinking material is required, and it is more preferable that the crosslinking material has an aldehyde group. In the aldehyde group, the double bond between oxygen and carbon is biased toward the oxygen, which is relatively electronegative, and the oxygen side is delta - charge and the carbon side is delta + charge. Similarly, the electronegative nitrogen has a delta - charge, which is apt to attack the carbon of the aldehyde group. When the nitrogen of the amine group attacks the carbon of the aldehyde group, the carbon-oxygen double bond of the aldehyde group becomes a single bond and a carbon-nitrogen single bond is formed. This structure is very unstable and easily separates hydrogen and oxygen into water, forms a double bond between carbon and nitrogen, becomes immune and becomes stable. The remaining aldehyde group reacts with the amine group of the cell transfer compound to form imine (N = C = O) group through the same binding process as above, and finally forms a compound layer for magnetic nanoparticle-silane layer-cell transfer. The cross-linking material is preferably used in an amount of 4 to 12 parts by weight based on 1 part by weight of the magnetic nanoparticles. When the amount of the crosslinking agent is less than 4 parts by weight, crosslinking material is not sufficiently bonded to the functional silane layer on the surface of the magnetic nanoparticles. The amount of the crosslinking agent may be increased to increase the bonding time and the coupling efficiency with the functional silane compound. The effect is insignificant when used in excess by weight.

본 발명은 또한, 자성 나노입자에 ASGPr 결합성 리간드를 결합시키는 단계를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달용 자성 나노전달체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for preparing magnetic nanocrystals for nucleic acid delivery, comprising the step of binding an ASGPr binding ligand to magnetic nanoparticles.

ASGPr 결합성 리간드 결합 전에, 자성 나노입자 상에 기능성 실란층을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The method may further comprise forming a functional silane layer on the magnetic nanoparticles prior to ASGPr binding ligand binding.

상기 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자에 세포 전달용 화합물을 반응시켜 세포 전달용 화합물층을 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.And reacting the magnetic nanoparticles formed with the functional silane layer with a cell transfer compound to form a cell transfer compound layer.

본 발명은 구체적으로, 자성 나노입자에 기능성 실란화합물과 초순수를 반응시켜 기능성 실란층을 형성시키는 단계;Specifically, the present invention provides a method for producing a magnetic nanoparticle, comprising: reacting a magnetic nanoparticle with a functional silane compound and ultrapure water to form a functional silane layer;

상기 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자를 가교물질로 세포 전달용 화합물과 반응시켜 세포 전달용 화합물층을 형성시키는 단계; 및Reacting the magnetic nanoparticles formed with the functional silane layer with a cell transferring compound as a crosslinking material to form a cell transferring compound layer; And

상기 세포 전달용 화합물층이 형성된 자성 나노입자에 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 리간드를 결합시키는 단계 Binding an ASGPr (asialoglycoprotein receptor) -binding ligand to the magnetic nanoparticle formed with the cell-transporting compound layer

를 포함하는 자성 나노전달체의 제조방법에 관한 것이다.And a method for producing the magnetic nanotransporter.

본 발명에서 자성 나노전달체를 위해 사용된 자성 나노입자는 열분해법에 의해 제조되는 것이 바람직하며, 구체적으로 벤질에테르 용매에서 도데실산과 도데실 아민 및 자성 입자 전구체를 열분해 화학반응(thermal decomposition)시켜 합성한다The magnetic nanoparticles used for the magnetic nanotransporter in the present invention are preferably prepared by pyrolysis. Specifically, the magnetic nanoparticles are synthesized by thermal decomposition of dodecyl acid, dodecylamine and magnetic particle precursors in a benzyl ether solvent, do

상기 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자 제조 시에 기능성 실란 화합물과 초순수를 반응시켜 자성 나노입자 표면에 기능성 실란층을 형성하게 된다. The functional silane compound and the ultrapure water are reacted with each other to form a functional silane layer on the surface of the magnetic nanoparticles when the magnetic nanoparticles having the functional silane layer are formed.

상기 실란 화합물의 알콕시 그룹은 금속 수산화물의 수산화그룹 또는 실란올과 가수분해반응을 통해 실록산 결합을 형성할 수 있다. . 본 발명에서는 자성나노입자를 강한 염기성 물질인 수산화암모늄과 같이 매질에 분산시켜, 해리된 수산화이온이 자성나노입자 표면에 흡착되게 되도록 하여 이렇게 형성된 수산화기는 실란 화합물의 알콕시기와 실록산 결합을 형성하게 된다.The alkoxy group of the silane compound may form a siloxane bond through a hydrolysis reaction with a hydroxyl group of a metal hydroxide or silanol. . In the present invention, the magnetic nanoparticles are dispersed in a medium such as ammonium hydroxide, which is a strong basic substance, so that the dissociated hydroxyl ions are adsorbed on the surface of the magnetic nanoparticles, and the thus formed hydroxyl groups form a siloxane bond with the alkoxy group of the silane compound.

기능성 실란층의 아민기와 세포 전달용 화합물의 아민기는 아민-알데히드 결합반응을 통해 이민과 H2O로 만들어진다. 세포 전달용 화합물의 아민기와 반응, 이민기를 형성하여 최종적으로 자성나노입자-실란층-세포전달용 화합물층을 이루게 된다.The amine group of the functional silane layer and the amine group of the cell transfer compound are made from imine and H 2 O through an amine-aldehyde bonding reaction. React with the amine group of the cell transfer compound, form an imine group, and finally form a compound layer for magnetic nanoparticle-silane layer-cell transfer.

본 발명은 또한, 상기 자성 나노전달체를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상(MRI)용 자성 나노벡터에 관한 것이다.The present invention also relates to magnetic nanoparticles for hepatocyte-specific nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging (MRI) comprising the magnetic nanotransporter.

구체적으로, 본 발명은 자성나노전달체; 및 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 핵산 구조체를 포함하는 간세포 특이적 핵산 전달 및 자기공명영상(MRI)용 자성 나노벡터를 포함할 수 있다. 상기 핵산 구조체는 DNA, 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide), 업타머(Aptamers), RNA, 라이보자임(Ribozymes), shRNA, siRNA, miRNA 및 dsRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Specifically, the present invention provides magnetic nanotubes; And magnetic nanoparticles for hepatocyte-specific nucleic acid transfer and magnetic resonance imaging (MRI), including nucleic acid constructs for the inhibition of the expression of the pro-protein conformation subtilis nephexin 9 (PCSK9) gene. The nucleic acid construct may be at least one selected from the group consisting of DNA, Oligonucleotide, Aptamers, RNA, Ribozymes, shRNA, siRNA, miRNA and dsRNA, but is not limited thereto.

특히, 본 발명에 따른 자성 나노벡터는 자성나노전달체와 핵산 구조체가 30 내지 145 : 0.15의 중량 비율로 혼합하여 제조되는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나면 자성나노전달체의 양이온성 기능기의 노출로 인한 세포독성을 유발할 수 있다.In particular, the magnetic nano vector according to the present invention is preferably prepared by mixing the magnetic nanotransporter and the nucleic acid construct in a weight ratio of 30 to 145: 0.15. Exceeding the above range may cause cytotoxicity due to exposure of the cationic functional group of the magnetic nanotransporter.

본 발명은 또한, 상기 자성 나노전달체; 및 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 핵산 구조체를 포함하는 저밀도지단백(LDL)-콜레스테롤 관련 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to the above-mentioned magnetic nanotransporter; (LDL) -cholesterol-related diseases, which comprises a nucleic acid construct for inhibiting the expression of the propeptide-converting enzyme subtilisincexin 9 (PCSK9) gene.

상기 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 자성 나노전달체는 상술한 것과 같으며, 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 핵산 구조체는 PCSK9 발현을 사일런싱(silencing)시키는 핵산 구조체를 의미란다. 핵산 구조체는 DNA, 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide), 업타머(Aptamers), RNA, 라이보자임(Ribozymes), shRNA, siRNA, miRNA 및 dsRNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The magnetic nanotransporter contained in the pharmaceutical composition of the present invention is as described above, and the nucleic acid construct for inhibiting the expression of the subtilisincexin 9 (PCSK9) gene is a nucleic acid construct which silences the expression of PCSK9 It is. The nucleic acid construct may be, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of DNA, Oligonucleotide, Aptamers, RNA, Ribozymes, shRNA, siRNA, miRNA and dsRNA.

PCSK9 발현을 사일런싱(silencing)시키는 "PCSK9"는 프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9 유전자 또는 단백질(FH3,HCHOLA3, NARC-1, NARC1로도 공지됨)을 지칭한다. PCSK9에 대한 mRNA 서열은 사람: NM_174936; 마우스:NM_153565 및 랫트: NM_199253으로서 제공된다. "사일런싱시키다" 또는 "~의 발현을 억제하다"란 용어는, 본원에서 이들 용어가 PCSK9 유전자를 지칭하는 한, PCSK9 유전자가 전사되고 PCSK9 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 제1 세포 또는 세포 그룹으로부터 분리될 수 있는 PCSK9 유전자로부터 전사된 mRNA 양이 상기 제1 세포 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 이러한 처리를 받지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹(대조군 세포)와 비교하여 감소된 것으로 나타나는 PCSK9 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제를 지칭한다."PCSK9" which silences PCSK9 expression refers to the proprotein-converting subtilis nephexine 9 gene or protein (also known as FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1). The mRNA sequence for PCSK9 is human: NM_174936; Mouse: NM_153565 and rat: NM_199253. The term "silencing" or "inhibiting the expression of ", as used herein, refers to a first cell or cell group treated with a PCSK9 gene transcribed and inhibited to express the PCSK9 gene, (PCSK9 gene), which appears to be reduced compared to a second cell or cell group (control cell) that is substantially identical to the first cell cell or cell group but is not subjected to such treatment, RTI ID = 0.0 &gt; of &lt; / RTI &gt;

본 발명에서 사용되는 바와 같이 PCSK9 발현과 관련하여, "치료하다", "치료"란 용어 등은 PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정의 경감 또는 완화를 지칭한다. 본 발명의 범주에서 하기에 언급된 다른 임의의 상태(PCSK9 유전자를 하향 조절함에 의해 매개될 수 있는 병리학적 과정이 아닌 과정)와 관련되는 한, "치료하다", "치료"란 용어 등은 이러한 상태와 연관된 하나 이상의 증상을 경감 또는 완화시키거나 이러한 상태의 진행을 늦추거나 역전시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 고지혈증, 고지혈증, 죽상동맥경화반, 급성심근경색, 뇌졸중 또는 뇌경색의 범주에서, 치료는 혈청 지질 수준의 감소와 관련될 것이다.As used herein, with respect to expression of PCSK9, the terms "treat "," treatment ", etc. refer to alleviation or alleviation of pathological processes mediated by down-regulation of the PCSK9 gene. The term "treating "," treatment ", and the like, as far as it relates to any of the other conditions mentioned below under the scope of the present invention (a process which is not a pathological process that can be mediated by downregulating the PCSK9 gene) Alleviating or alleviating one or more symptoms associated with a condition, or slowing or reversing the progression of such condition. For example, in the category of hyperlipidemia, hyperlipidemia, atherosclerosis, acute myocardial infarction, stroke or cerebral infarction, treatment will be associated with a decrease in serum lipid levels.

PCSK9의 발현을 하향 조절함에 의해 조정될 수 있는 질환, 예를 들면, LDL-콜레스테롤 관련 질환, 즉 고지혈증, 고지혈증, 죽상동맥경화반, 급성심근경색, 뇌졸중, 뇌경색 등을 의미할 수 있다. For example, LDL-cholesterol-related diseases such as hyperlipidemia, hyperlipidemia, atherosclerotic plaques, acute myocardial infarction, stroke, cerebral infarction, and the like, which can be regulated by downregulating the expression of PCSK9.

본 발명에 따른 조성물은 의약품 제조될 수 있으며, 의약품으로 제조할 경우 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등에 비경구적으로 투여된다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.The composition according to the present invention can be manufactured into medicines. When the medicines are manufactured, they are administered orally or intravenously, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally. Oral administration also includes sublingual administration. Parenteral administration includes injection and drip, such as subcutaneous, intramuscular, and intravenous.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 각종 제형의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 이외에도 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.The composition according to the present invention can be manufactured and administered in the form of various formulations by further comprising a pharmaceutically acceptable carrier. The term &quot; pharmaceutically acceptable &quot; as used herein refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness, or the like when administered to a human. The pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a coloring matter and a perfume in the case of an oral administration, and a buffering agent, a preservative, , A solubilizing agent, an isotonic agent and a stabilizing agent may be mixed and used. In case of a preparation for topical administration, a base, an excipient, a lubricant and a preservative may be used. Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc. in the case of oral administration, and in the case of injections, . In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared according to a conventional technique in the form of various formulations.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기'약학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
The pharmaceutical composition according to the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount. The 'pharmaceutically effective amount' as used herein means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment. Effective dose levels are well known to those skilled in the art, including the type of disease, severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, Can be determined according to the element. The composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents, sequentially or concurrently with conventional therapeutic agents. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the scope of the present invention is not limited by the following examples.

실시예Example 1: 포화 지방산을 이용한 고민감도 자성 나노입자의 제조 1: Preparation of highly sensitive magnetic nanoparticles using saturated fatty acids

6 nm의 망간페라이트(MnFe2O4)는 벤질에테르 용매에서 도데실산(6mmol)과 도데실 아민(6 mmol) 및 철 트리아세틸아세토네이트(2 mmol)와 망간 투아세틸아세토네이트(1 mmol)를 290 ℃에서 열분해 화학반응(thermal decomposition)시켜 30 분간 합성하였다. 제조된 망간페라이트는 에틸알콜(Ethyl acochol)을 이용하여 세척 후 원심분리를 이용하여 침전물을 회수한 후, 2 mL 노르말 헥산(n-hexane)에 재분산시키고 다시 원심분리를 거쳐 상층액을 회수하였다. 상기 과정을 총 2회 반복하였다. (6 mmol), dodecylamine (6 mmol), iron triacetylacetonate (2 mmol), and manganese acetylacetonate (1 mmol) in a benzyl ether solvent were added to the 6 nm manganese ferrite (MnFe 2 O 4 ) Thermal decomposition at 290 ° C was carried out for 30 minutes. The produced manganese ferrite was washed with ethyl alcohol and then centrifuged to recover the precipitate. The precipitate was redispersed in 2 mL of n-hexane, centrifuged again, and the supernatant was recovered . This process was repeated twice in total.

세척된 망간페라이트의 투과전자현미경 사진을 도 1a에 도시하였다. 상기 망간페라이트의 자기적 특성은 VSM(Vibrating Sample Magnetometer)을 이용하여 측정하였으며, 이를 실선으로 표시하여 도 1b에 도시하였다.
A transmission electron micrograph of the washed manganese ferrite is shown in FIG. The magnetic properties of the manganese ferrite were measured using a VSM (Vibrating Sample Magnetometer), which is indicated by a solid line in FIG. 1B.

실시예Example 2: 핵산 구조체의 간세포 및 생체 내 간장 전달을 위한 자성나노전달체의 제조 2: Preparation of magnetic nanotransporter for hepatocyte and in vivo hepatic transfer of nucleic acid construct

상기 실시예 1에서 제조된 고민감성 자성나노입자(망간페라이트) 20 mg을 에틸알콜을 이용하여 2회 세척 후, 30 mL 에틸알콜에 분산시켰다. 상기 용액에 초순수 2 mL, 30% 수산화암모늄(ammonium hydroxide) 1.5 mL, 3-아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 1.0 mmol(179.3 mg)을 첨가한 후, 8시간 동안 초음파를 가하여 반응시켰다. 반응이 끝난 혼합물은 자석을 이용하여 자성 나노입자만을 분리해 낸 후, 초순수를 이용하여 세척하였다. 세척된 자성 나노입자는 다시 인산완충식염수(phosphate buffered saline) 20 mL에 분산시킨 후, 2.0 mmol(200.2 mg) 글루타알데하이드(glutaraldehyde)가 분산되어 있는 20 mL 인산완충식염수와 혼합하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 결과물은 인산완충식염수를 이용하여 세척하고 재분산하였다. 유전체 전달을 위한 양이온성 고분자인 가지형(branched) 폴리에틸렌이민(MW 25,000) 11.4 μmol(285.6 mg)을 인산완충식염수에 분산시킨 후, 상기 반응물과 혼합하여 1시간 동안 반응시킨 다음, 다시 인산완충식염수로 수회 세척하였다. 세척이 완료된 반응물은 다시 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 분산시키고 n-하이드록시숙신이미드(n-hydroxysuccinimide)와 다이사이클로핵실카보다이이미드(dicyclohexylcarbodiimide)의 결합반응을 이용하여 락토바이오닉 산(lactobionic acid)을 반응물 표면에 존재하는 폴리에틸렌이민의 1차 아민기와 결합시켰다. 4시간 동안 결합반응을 시킨 후 디메틸설폭사이드를 이용하여 수회 세척 후 다시 인산완충식염수로 수회 세척, 분산시켰다. 최종적으로 얻어진 자성 나노전달체의 수용상 콜로이드 크기를 도 2에 도시하였으며, 자성 나노전달체의 구조는 도 3a에 나타내었다. 자성나노전달체의 크기 및 모양 확인을 위해 투과전자현미경 사진을 도 3b에 도시하였다.
20 mg of the sensitive magnetic nanoparticles (manganese ferrite) prepared in Example 1 was washed twice with ethyl alcohol and dispersed in 30 mL of ethyl alcohol. To the solution was added 2 mL of ultrapure water, 1.5 mL of 30% ammonium hydroxide, and 1.0 mmol (179.3 mg) of 3-aminopropyltrimethoxysilane, followed by reaction with ultrasonic waves for 8 hours . After the reaction, the magnetic nanoparticles were separated using a magnet, and then washed with ultrapure water. The washed magnetic nanoparticles were dispersed in 20 mL of phosphate buffered saline, mixed with 20 mL of phosphate buffered saline containing 2.0 mmol (200.2 mg) of glutaraldehyde, . The reaction product was washed with phosphate buffered saline and redispersed. 11.4 μmol (285.6 mg) of branched polyethylenimine (MW 25,000), a cationic polymer for dielectric transmission, was dispersed in phosphate buffered saline, mixed with the reaction mixture for 1 hour, and further washed with phosphate buffered saline . The washed reactant is again dispersed in dimethyl sulfoxide and reacted with n-hydroxysuccinimide and dicyclohexylcarbodiimide to form lactobionic acid ) Was bound to the primary amine group of the polyethyleneimine present on the reaction surface. After binding reaction for 4 hours, it was washed several times with dimethylsulfoxide, and then washed and dispersed with phosphoric acid buffered saline several times. The colloidal size of the finally obtained magnetic nanotransporter is shown in FIG. 2, and the structure of the magnetic nanotransporter is shown in FIG. 3A. A transmission electron micrograph is shown in FIG. 3B to confirm the size and shape of the magnetic nanotransporter.

실시예Example 3: 세포 및 생체 내  3: Cell and in vivo 트랜스펙션용For transfection 자성나노벡터의 제조 Manufacture of magnetic nano-vectors

상기 실시예 2에서 제조된 자성나노전달체의 트랜스팩션 용도로서의 최적 사용량을 확인하기 위하여, 0.6 ㎍/㎕부터 48 ㎍/㎕까지 다양한 농도로 준비한 후 PCSK9 유전자의 발현 억제를 위한 siRNA (염기 서열: sence: 5'-GCCUGGAGUUUAUUCGGGAATT-3': 서열번호 1, antisence 5'-UUCCGAAUAAACUCCAGGCTT-3' 서열번호 2) 0.15 ㎍(12.5 pmol)와 혼합한 후 상온에서 20 분간 반응시켰다. 그 후 siRNA의 담지 여부를 확인하기 위하여, siRNA를 염색할 수 있는 자외선영역의 빛에서 발광하는 염료를 각 반응물과 염료는 5 : 1의 부피비율로 혼합하였다. 각 반응물은 2% 아가로스 겔을 사용한 전기영동법을 적용한 후, 해당 겔에 자외선을 조사하여 siRNA의 담지 여부를 확인하였다. 확인한 결과와 각 혼합물을 배치한 레인의 혼합물 조성을 도 4에 도시하였다. 1번 레인은 전기영동 실험의 대조군으로 siRNA만 배치하였고, 2,3번 레인은 또 다른 대조군으로 폴리에틸렌이민과 siRNA의 혼합물을 배치하여 자성나노벡터의 폴리에틸렌이민의 포함량을 간접적으로 비교하기 위하여 배치하였고, 4번~8번 레인은 다양한 농도의 자성나노전달체를 siRNA와 혼합하여 최적 혼합 비율을 확인하기 위해 배치하였다. In order to confirm the optimum use amount of the magnetic nanotransporter prepared in Example 2 as a transfection use, siRNAs for inhibiting the expression of PCSK9 gene (base sequence: sence (5'-GCCUGGAGUUUAUUCGGGAATT-3 ': SEQ ID NO: 1, antisense 5'-UUCCGAAUAAACUCCAGGCTT-3' SEQ ID NO: 2) and reacted at room temperature for 20 minutes. Then, in order to confirm whether or not the siRNA was carried, the dyes emitting light in the ultraviolet region where the siRNA could be stained were mixed at a volume ratio of 5: 1 for each reactant and dye. Each of the reactants was subjected to electrophoresis using 2% agarose gel, and the gel was irradiated with ultraviolet light to confirm whether or not the siRNA was carried. The result of the confirmation and the composition of the mixture of the lanes in which the respective mixtures are arranged is shown in Fig. The lane 1 was placed only as a control group of the electrophoresis experiment, and the lanes 2 and 3 were placed in a mixture of polyethyleneimine and siRNA as another control group to indirectly compare the amount of polyethyleneimine contained in the magnetic nano vector , And lane 4 to 8 were prepared by mixing various concentrations of magnetic nanotransporter with siRNA to confirm the optimal mixing ratio.

나노전달체의 양이 충분하지 않은 반응물의 경우, 담지되지 못한 siRNA가 정전기적 인력에 의하여 아래쪽으로 끌려 내려온 것이 확인되었고(하얀 띠), 자성 나노전달체 36 ㎍과 siRNA 0.15 ㎍의 혼합비율에서 하얀 띠가 나타나지 않은 것을 통하여 모두 담지됨을 확인하였고 해당 비율은 폴리에틸렌이민 0.3 ㎍의 siRNA 담지능력과 동일한 수준임을 확인하였다.
In the case of a reactant in which the amount of nanoreversors was insufficient, it was confirmed that the unsupported siRNA was dragged downward (white band) by the electrostatic attraction, and a white band was observed at a mixing ratio of 36 자 of magnetic nanotransporter and 0.15 si of siRNA And the ratio was confirmed to be the same as that of the polyethyleneimine 0.3.

실시예Example 4: 자성나노벡터의 세포 독성 평가 4: Evaluation of cytotoxicity of magnetic nano vector

실시예 2에서 확인된 유전자 전달을 위한, 나노전달체와 siRNA의 혼합비율에서 세포 독성을 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 세포독성 조사방법을 진행하고, 이를 도 5에 도시하였다. 자성나노전달체의 농도는 5.6 ug/mL ~ 1.4 mg/mL 범위 조건으로 실험하였으며 각 조건당 2.0 ×104 개의 세포와 함께 37 ℃에서 24시간 배양 후 독성 여부를 확인해보았다. 실시예 2에서 확인한 자성나노전달체의 siRNA 담지 가능 농도의 4배 농도에서도 유의한 세포독성이 나타나지 않았다.
(4- (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) to confirm the cytotoxicity at the mixing ratio of nanotransporter and siRNA for gene transfer identified in Example 2, The cytotoxicity investigation method is proceeded, which is shown in Fig. Magnetic nanotransporter concentrations were ranged from 5.6 ug / mL to 1.4 mg / mL and 2.0 × 10 4 cells were incubated at 37 ℃ for 24 hours. No significant cytotoxicity was observed even at a concentration of 4 times the siRNA-carrying concentration of the magnetic nanotransporer identified in Example 2. [

실시예Example 5: 자성나노벡터의 간세포  5: Hepatocytes of magnetic nano vector 표적화Targeting 기능 및 핵산 전달 효능 평가 Evaluation of function and nucleic acid transfer efficiency

해당 실시예는 자성나노전달체의 핵산전달 유효성을 평가하기 위한 것으로, siRNA는 기본적으로 음전하를 띠고 있는 것과, 단위 핵산의 개수가 20개에서 21개로 큰 차이가 없기 때문에, 보통 전달체의 전달능력을 볼 때는 비특이적 siRNA을 사용하고, 실질적인 형질도입 효율을 확인할 때, 비특이적 siRNA와 특이적 siRNA(본 실시예에서는 siPCSK9)를 동시에 실험하여 차이를 나타내었다. This example is for evaluating nucleic acid delivery effectiveness of magnetic nanotransporter. Since siRNA basically has a negative charge and the number of unit nucleic acids is not so large as 20 to 21, When non-specific siRNAs were used, and when the actual transfection efficiency was confirmed, nonspecific siRNA and specific siRNA (siPCSK9 in this example) were tested at the same time.

자성나노전달체의 핵산전달 유효성을 평가하기 위해, 녹색 형광 염료가 결합되어 있는 비특이적 siRNA (scrambled siRNA-FITC)[염기서열 sence: 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU(dTdT)-3':서열번호 3, antisence: 5'-ACGAAAUUGGUGGCGUAGG(dTdT)-3':서열번호 4]가 담지된 자성나노벡터 (자성 나노전달체 36 ㎍과 siRNA 0.15 ㎍의 비율로 혼합)를 상온에서 20분간 세포배양 배지 500 ?에 분산시켜 준비하였다. 4 well 세포배양판에 2.0 ×104 cells/well의 조건으로 배양된 세포에 기존 배지를 제거하고 자성나노벡터가 분산되어 있는 배지로 교체한 후 37 ℃에서 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 인산완충식염수를 이용하여 3회 세척한 후 암시야현미경, 형광현미경을 이용하여 세포 내 전달여부를 확인한 결과를 각각 도 6a와 도 6b에 도시하였다. 세포는 실험군으로 ASGPr이 고발현 되어있는 HepG2(human liver cancer cell line) 세포를, 대조군으로 ASGPr 발현이 적은 MCF7(human breast cancer cell) 세포를 이용하였다. 도 6a에서 자성나노전달체만 세포에 처리한 실험은 ASGPr의 발현 정도와 상관없이 HepG2 세포와 MCF7 세포에 모두 붙어있는 것으로 확인되었다. 이는 자성나노전달체의 양이온성 때문에 음이온성을 지닌 세포 표면에 비특이적으로 부착된 것으로 생각된다. 반면, siRNA를 포함하고 있는 자성나노벡터를 세포에 처리한 실험에서는 ASGPr 발현이 높은 HepG2 세포에만 결합하는 것을 확인할 수 있다. 도 6b는 자성나노벡터에 siRNA가 실제로 포함되어 결합하는지 확인하기 위하여 형광 현미경을 통해 비특이적 siRNA를 자성나노전달체와 혼합한 자성나노벡터를 준비한 후, 이를 HepG2 세포에 처리하여 형광 유무를 판단하였다. 자성나노벡터를 처리한 HepG2 세포에서 녹색 형광이 발현되는 것으로 보아 자성나노벡터가 HepG2 세포 잘 부착되고, siRNA을 잘 담지하고 있음이 확인되었다.In order to evaluate the nucleic acid delivery effectiveness of the magnetic nanotransporter, a scrambled siRNA-FITC (5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU (dTdT) -3 ') having a green fluorescent dye bonded thereto: SEQ ID NO: 3, antisence: 5 (36 占 퐂 of magnetic nanotransporter and 0.15 占 퐂 of siRNA) carrying the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 4) was dispersed in a cell culture medium (500 20) at room temperature for 20 minutes . The cells were cultured on a 4-well culture plate at a cell density of 2.0 × 10 4 cells / well, and the culture medium was replaced with a culture medium in which magnetic nano-vectors were dispersed. Then, the cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours. After the cultivation was completed, the cells were washed three times with phosphate-buffered saline, and the results of confirming intracellular delivery using a dark-field microscope and a fluorescence microscope are shown in FIGS. 6A and 6B, respectively. Cells were treated with HepG2 (human liver cancer cell line) cells in which ASGPr was highly expressed and MCF7 (human breast cancer cell) cells in which ASGPr expression was low as a control group. In FIG. 6A, only the magnetic nanotransporter-treated cells were found to be attached to HepG2 cells and MCF7 cells regardless of the degree of expression of ASGPr. This is thought to be due to the cationic nature of the magnetic nanotransporter, which is nonspecifically attached to the anionic cell surface. On the other hand, in the experiment in which the magnetic nano vector containing siRNA was treated with the cells, it can be confirmed that it binds only to HepG2 cells having high ASGPr expression. FIG. 6B shows a magnetic nano vector prepared by mixing a nonspecific siRNA with a magnetic nanocarrier through a fluorescence microscope in order to confirm whether siRNA is actually included in the magnetic nano-vector. Then, it was treated with HepG2 cells to determine fluorescence. Green fluorescence was expressed in HepG2 cells treated with magnetic nanoparticles. As a result, the magnetic nanoparticles were well adhered to HepG2 cells and were well loaded with siRNA.

자성나노전달체의 형질도입(transfection) 유효성을 평가하기 위해, 웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 PCSK9과 LDL 수용체의 양을 확인하였다(도 7). 단백질 발현은 HepG2 세포에서 확인하였으며, 비특이적 siRNA[서열번호 3,4]와 PCSK9 발현 저해용 siRNA[서열번호 1,2]를 이용하여 형질도입 효과를 비교 확인하였다. GAPDH 단백질의 경우 그 양의 변화가 없으므로, 자성나노벡터는 유의한 세포독성을 가지지 않는 것으로 판단되고, PCSK9 단백질의 경우 단백질의 발현율이 대조군에서도 낮아 siPCSK9의 단백질 발현 억제는 확연하게 보이지는 않으나, LDLR의 발현이 증가하였으므로, PSCK9 발현 저하에 따른 LDLR의 발현 증가로 판단되었다.
To evaluate the transfection efficacy of the magnetic nanotransporter, the amount of PCSK9 and LDL receptor was determined using western blot (Fig. 7). Protein expression was confirmed in HepG2 cells, and the transfection effect was compared and confirmed using nonspecific siRNA [SEQ ID NO: 3, 4] and siRNA for inhibiting PCSK9 expression [SEQ ID NO: 1, 2]. In the case of GAPDH protein, there is no change in the amount of the protein. Therefore, the magnetic nano-vector does not have significant cytotoxicity. In the case of PCSK9 protein, the protein expression rate is also low in the control group and the suppression of protein expression of siPCSK9 is not apparent. And the expression of LDLR was increased due to the decrease of PSCK9 expression.

실시예Example 6: 생채 내 자성나노벡터의 자기공명영상 조영 효과 및 확인 6: Magnetic resonance imaging effect and confirmation of magnetic nano vector in living body

C57BL/6 마우스를 동물모델로 하여 생체 내 실험을 진행하였다. 4 주령의 마우스에 자성나노벡터(자성나노전달체 36 ㎍과 비특이적 siRNA 0.15 ㎍)를 주사용 식염수 200 ㎕에 분산시킨 혼합액을 꼬리정맥을 통해 주입하였다. 주입 전 후의 자기공명영상을 도 8에 도시하였다. 상기 자성나노벡터 주입 전, 주입 후 2시간 자기공명영상이 도 8a이고, 영상 직 후 간을 적출하여 조직 절편을 제작하여 H&E 염색한 후 현미경, 형광현미경으로 관찰한 영상이 도 8b이다. 자기공명영상에서는 자성나노벡터의 망간 페라이트의 존재로 인한 간의 조영 효과(검게 변하는 현상)이 발견되었고, 조직 절편에서는 자성나노벡터가 있는 조직부위에서 형광이 발견되어, 생체 내에서 자성나노벡터가 간에 특이적으로 전달되었음을 확인할 수 있었다.
In vivo experiments were carried out using C57BL / 6 mice as animal models. Four-week-old mice were injected with a mixture of magnetic nano-vectors (36 쨉 g of magnetic nanotransporter and 0.15 쨉 g of nonspecific siRNA) in 200 쨉 l of saline solution for injection through the tail vein. The magnetic resonance images before and after the injection are shown in Fig. FIG. 8a shows the magnetic resonance image for 2 hours after the injection of the magnetic nano-vector, FIG. 8b shows the image of the tissue section prepared by H & E staining after microscopic and fluorescence microscopy. Magnetic resonance imaging revealed a liver contrast effect (blackening phenomenon) due to the presence of manganese ferrite in magnetic nano-vectors. In tissue sections, fluorescence was found in the tissue region with magnetic nano-vectors, And it was confirmed that it was transmitted specifically.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> MAGNETIC NANO-VECTOR FOR TRANSFERRING NUCLEIC ACIDS SPECIFIC TO LIVER CELL AND MAGNATIC RESONANCE IMAGING <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 1 gccuggaguu uauucgggaa tt 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 2 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> n=dT <400> 3 ccuacgccac caauuucgun n 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <221> modified_base <222> (20)..(21) <223> n=dT <400> 4 acgaaauugg uggcguaggn n 21 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> MAGNETIC NANO-VECTOR FOR TRANSFERRING NUCLEIC ACIDS SPECIFIC TO          LIVER CELL AND MAGNATIC RESONANCE IMAGING <160> 4 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 1 gccuggaguu uauucgggaa tt 22 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <400> 2 uuccgaauaa acuccaggct t 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <221> modified_base &Lt; 222 > (20) <223> n = dT <400> 3 ccuacgccac caauuucgun n 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <221> modified_base &Lt; 222 > (20) <223> n = dT <400> 4 acgaaauugg uggcguaggn n 21

Claims (25)

ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 당류 또는 이의 유도체인 ASGPr 결합성 리간드;
상기 ASGPr 결합성 리간드와 결합하는 자성나노입자; 및 가지형(branched) 폴리에틸렌이민을 포함하되,
상기 자성나노입자 상에 아민기를 가지는 기능성 실란 화합물의 가수분해 반응에 의해 형성되며,
상기 자성나노입자는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy(M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 식 0 < x 3 및 0 < y 5을 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이며, 상기 실란은 아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 및 아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane)에서 선택된 하나 이상인,
간세포 특이적 siRNA 전달용 자성나노전달체.
 A SGPr (asialoglycoprotein receptor) binding sugar or ASGPr binding ligand derivatives thereof;
Magnetic nanoparticles binding to the ASGPr binding ligand; And branched polyethylene imines,
Wherein the magnetic nanoparticles are formed by a hydrolysis reaction of functional silane compounds having amine groups on the magnetic nanoparticles,
The magnetic nanoparticles are Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM '2 O 4, and MxOy (M and M' each independently represents a Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, or Cr , x and y each satisfy the formula 0 <x 3 and 0 <y 5), and the silane is at least one selected from the group consisting of aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane) and aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltriethoxysilane), &lt; / RTI &gt;
Magnetic nanotransporter for hepatocyte-specific siRNA delivery.
삭제delete 제 1 항에 있어서,
상기 ASGPr 결합성 리간드는 갈락토오즈(galactose)을 포함하는 이당류 또는 이의 유도체인 자성 나노전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the ASGPr binding ligand is a disaccharide comprising galactose or a derivative thereof.
제 3 항에 있어서,
상기 이당류는 락토오즈(lactose), 락툴로오즈(lactulose), 멜리비오즈(melibiose) 또는 멜리빌로오즈(melibiulose); 및 갈락토오즈(galactose)을 포함하며, 상기 유도체는 갈락토실글루코닉 산 (galactosylgluconic acid) 또는 락토바이오닉 산(lactobionic acid)인 자성 나노전달체.
The method of claim 3,
The disaccharide may be selected from the group consisting of lactose, lactulose, melibiose or melibiulose; And a galactose, wherein the derivative is galactosylgluconic acid or lactobionic acid. The present invention also relates to a method for producing a nanocrystal carrier.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서,
상기 폴리에틸렌이민은 10,000 내지 50,000의 중량평균 분자량을 가지는 자성 나노전달체.
The method according to claim 1,
Wherein the polyethyleneimine has a weight average molecular weight of 10,000 to 50,000.
삭제delete 삭제delete 제 1 항의 자성 나노전달체; 및
프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 siRNA
를 포함하는 간세포 특이적 siRNA 전달 및 자기공명영상(MRI)용 자성 나노벡터.
The magnetic nanotransporter of claim 1; And
SiRNAs for the inhibition of the expression of the pro-protein signaling subtilisincexin 9 (PCSK9) gene
(Magnetic Resonance Imaging). &Lt; / RTI &gt;
삭제delete 제 16 항에 있어서,
자성 나노전달체와 siRNA는 30 내지 145 : 0.15의 중량 비율로 혼합하는 자성 나노벡터.
17. The method of claim 16,
Wherein the magnetic nanotransporter and the siRNA are mixed at a weight ratio of 30 to 145: 0.15.
제 1 항의 자성 나노전달체; 및
프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신 9(PCSK9) 유전자의 발현 억제를 위한 siRNA
를 포함하는 고지혈증, 죽상동맥경화반, 급성심근경색, 뇌졸중 또는 뇌경색 예방 및 치료용 조성물.
The magnetic nanotransporter of claim 1; And
SiRNAs for the inhibition of the expression of the pro-protein signaling subtilisincexin 9 (PCSK9) gene
Atherosclerosis, acute myocardial infarction, stroke, or cerebral infarction.
삭제delete 자성 나노입자에 기능성 실란화합물과 초순수를 반응시켜 기능성 실란층을 형성시키는 단계;
상기 기능성 실란층이 형성된 자성 나노입자를 가교물질로 가지형(branched) PEI와 반응시켜 PEI층을 형성시키는 단계; 및
상기 PEI층이 형성된 자성 나노입자에 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 리간드를 결합시키는 단계
를 포함하되,
상기 ASGPr 결합성 리간드는 ASGPr(asialoglycoprotein receptor) 결합성 당류 또는 이의 유도체이며,
상기 기능성 실란층은 자성나노입자 상에 아민기를 가지는 기능성 실란 화합물의 가수분해 반응에 의해 형성되며,
상기 자성나노입자는 Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4, 및 MxOy(M 및 M'는 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, x 및 y는 각각 식 0 < x 3 및 0 < y 5을 만족한다.)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이며, 상기 실란은 아미노프로필트리메톡시실란(3-aminopropyltrimethoxysilane) 및 아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane)에서 선택된 하나 이상인,
간세포 특이적 siRNA 전달용 자성 나노전달체의 제조방법.Reacting the magnetic nanoparticles with a functional silane compound and ultrapure water to form a functional silane layer;
Reacting the magnetic nanoparticles formed with the functional silane layer with a branched PEI as a crosslinking material to form a PEI layer; And
Binding an ASGPr (asialoglycoprotein receptor) -binding ligand to the magnetic nanoparticle formed with the PEI layer
, &Lt; / RTI &
The ASGPr binding ligand is an ASGPr (asialoglycoprotein receptor) binding sugar or derivative thereof,
The functional silane layer is formed by a hydrolysis reaction of a functional silane compound having an amine group on magnetic nanoparticles,
The magnetic nanoparticles are Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM '2 O 4, and MxOy (M and M' each independently represents a Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, or Cr , x and y each satisfy the formula 0 <x 3 and 0 <y 5), and the silane is at least one selected from the group consisting of aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltrimethoxysilane) and aminopropyltrimethoxysilane (3-aminopropyltriethoxysilane), &lt; / RTI &gt;
A method for producing magnetic nanocrystals for siRNA-specific siRNA delivery. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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