KR101555016B1 - Nanoaggregates sensitive to pH and reduction, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition for treating malignant tumor comprising the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속 나노입자; 및
표면에 아미노기 도입된 양자점(quantum dot)에 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드가 펩티드 결합된 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기가 공유결합된 양자점을 포함하며,
상기 금속 나노입자 상의 아지도기와 양자점 상의 알킨기가 서로 클릭화학(click chemistry) 반응에 의해 고리화 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성함으로써, 상기 나노입자 및 양자점이 서로 응집하여 형성된 나노응집체를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체는 항암 효과를 증대시키면서 부작용의 우려를 해소할 수 있고, 동시에 암 치료의 개선여부를 확인해 볼 수 있는, 매우 스마트한 신개념의 화학요법제 및 암 진단용 형광 물질의 약물 전달체라고 할 수 있다. The present invention relates to a chemotherapeutic agent and a metal nanoparticle covalently bonded to the surface of a silver nanoparticle; And
A quantum dot in which an amino group is introduced on the surface thereof and a peptide capable of being degradable by MMP-2 is peptide-bonded to the quantum dot, and an alkyne group is covalently bonded to the amino group of the peptide,
The azido groups on the metal nanoparticles and the alkyne groups on the quantum dots are cyclized by a click chemistry reaction to form 1,2,3-triazole, whereby the nanoparticles formed by aggregation of the nanoparticles and the quantum dots, Lt; / RTI >
The nano-agglutination according to one aspect of the present invention is a very smart new-concept chemotherapeutic agent capable of improving the anticancer effect and resolving the problem of side effects, and at the same time, Drug delivery system.

Description

클릭화학 반응에 의해 형성된 나노 응집체, 그 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물{Nanoaggregates sensitive to pH and reduction, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition for treating malignant tumor comprising the same} TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nanocomposite formed by a click chemical reaction, a process for producing the nanocomposite, and a pharmaceutical composition for cancer diagnosis and / or cancer diagnosis including the nanocomposite thereof, malignant tumor comprising the same}

본 발명은 클릭화학 반응에 의해 형성된 나노 응집체, 그 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 화학요법제의 표적 지향성 전달에 의해 부작용을 유발하지 않은 항암요법이 가능할 뿐만 아니라, 형광물질의 암조직으로의 표적 전달에 의해 항광측정에 의한 암진단을 가능하게 하는, 클릭화학 반응에 의해 형성된 나노 응집체, 그 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a nano-aggregate formed by a click chemistry, a process for producing the nano-aggregate, and a nano-aggregate thereof, and more particularly, Nano-aggregates formed by click chemistry which enables cancer diagnosis by light measurement by target transfer of fluorescent substance to cancer tissues, a production method thereof, and nano-aggregates thereof And / or cancer diagnostic pharmaceutical compositions containing the same.

DDS 분야에서 nanotechnology(NT)를 이용한 나노입자는 나노약물전달체, 나노진단시약, 나노의료용물질, 나노바이오물질 등에 다양하게 활용되고 있다. 특히 나노약물전달체의 경우는 나노 수준의 제어가 가능한 지속성 약물전달 체제, 제어방출 시스템, 표적지향성 약물전달체제 등의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 나노입자를 이용한 DDS는 조만간 상업화가 가능한 차세대 기술로서 주목받고 있고, 화학요법제를 포함한 다양한 약물전달에 사용될 수 있다. In the field of DDS, nanoparticles using nanotechnology (NT) have been widely used for nanomaterials, nanodiagnostic reagents, nanomedical materials, and nanobio-biomaterials. Especially, in the case of nano drug delivery system, researches on persistent drug delivery system, controlled release system, and target-oriented drug delivery system capable of nano-level control are being actively researched. DDS using these nanoparticles is attracting attention as a next generation technology that can be commercialized soon, and can be used for various drug delivery including chemotherapeutic agents.

암 치료는 화학요법제의 종류, 암의 종류, 암 환자의 개인의 감수성에 따라, 그 효과가 달라질 수 있고, 화학요법제가 초기 사용 시에는 효과가 있더라도 내성의 획득에 의해 더 이상 항암 효과가 발휘되지 않을 수도 있으므로, 화학요법제 투여 하면서 암 조직의 변화를 계속적으로 모니터링할 필요가 있다. 따라서, 화학요법제의 개발뿐만 아니라 화학요법제 투여 후 암치료 효과를 모니터링 하는 진단방법 또한 계속적으로 연구되고 있다. Cancer treatment can be different depending on the kind of chemotherapeutic agent, kind of cancer, individual sensitivity of cancer patient, and even when chemotherapy agent is effective at the initial use, Therefore, it is necessary to monitor the change of cancer tissue continuously while administering the chemotherapeutic agent. Therefore, not only the development of a chemotherapeutic agent but also a diagnostic method for monitoring the cancer treatment effect after the administration of a chemotherapeutic agent has been continuously studied.

한편, FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)는 형광 공명 에너지 전이 현상으로서, 공여자(형광물질)와 수여자(quencher)의 사이에 생기는 에너지 트랜스퍼 현상이며, 공여자와 수여자가 서로 근접하고 있으면 양자간에서 FRET이 일어난다. 이 때, 공여자의 에너지는 수여자로 이동해 공여자는 기저 상태로 돌아오는 반면, 수여자는 여기 상태가 되어 수여자가 발하는 형광시그널이 검출된다. 또는, 수여자가 공여자의 여기 파장과 동일한 파장의 흡광파장을 갖는다면, FRET 현상에 의해 형광이 사라지게 된다. 이러한 FRET 현상은 세포 세포 간에 또는 세포 내에서 단백질간 상호 연관성이나 세포 내 신호전달 체계를 규명하는데 최근 각광을 받고 있다. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) is a phenomenon of energy transfer between a donor (fluorescent substance) and a recipient (quencher). When a donor and a recipient are close to each other, FRET This happens. At this time, the energy of the donor moves to the receiver and the donor returns to the ground state, while the receiver becomes the excited state and the fluorescence signal emitted by the receiver is detected. Alternatively, if the acceptor has an absorption wavelength of the same wavelength as the excitation wavelength of the donor, the fluorescence disappears due to the FRET phenomenon. This FRET phenomenon is recently attracting attention for identifying intercellular protein interactions or intracellular signal transduction pathways in or between cell cells.

특허문헌 1은 이러한 FRET 현상을 이용한 생체 이미징을 위한 나노입자를 개시하고 있다. 특허문헌 1은 입자크기가 균일한 실리카 나노입자의 표면 및 내부에 광스위치 역할을 수행하는 광변색 물질이 공유결합되고, 적어도 하나의 형광물질이 상기 광변색 물질과 형광공명에너지전이(FRET)를 수행할 수 있는 거리 이내에 위치되도록 상기 실리카 나노 입자의 표면 및 내부에 공유결합되는 구조를 갖는 균일한 크기의 실리카 나노입자에 기반한 고대비 생체 이미징을 위한 가역성 형광 스위치를 개시하고 있다. 상기 도입된 광변색 물질 및 형광물질 간의 FRET 현상으로 인해 높은 대비(contrast)로 형광신호의 온-오프(on-off) 스위칭이 가능하여 생체 이미징 시스템의 진단시약으로 사용될 수 있다. Patent Document 1 discloses nanoparticles for living body imaging using the FRET phenomenon. In Patent Document 1, a photochromic material serving as a light switch is covalently bonded to the surface and inside of silica nanoparticles having a uniform particle size, and at least one fluorescent material is mixed with the photochromic material and fluorescence resonance energy transfer (FRET) Discloses a reversible fluorescent switch for high-contrast biomedical imaging based on uniformly sized silica nanoparticles having a structure covalently bonded to the surface and inside of the silica nanoparticles so as to be located within a distance that can be performed. The on-off switching of the fluorescence signal can be performed with high contrast due to the FRET phenomenon between the introduced photochromic material and the fluorescent material, so that it can be used as a diagnostic reagent of a living body imaging system.

그러나, 상기 특허문헌 1이 개시하는 가역성 형광 스위치는 단순한 생체 이미징 시스템으로서 개시하고 있을 뿐이지, 화학요법제의 투여 및 암조직의 선택적인 형광 이미징에 의한 모니터링을 가능하게 하는 것은 아니다.However, the reversible fluorescent switch disclosed in Patent Document 1 only discloses a simple bioimaging system, and does not allow administration of a chemotherapeutic agent and monitoring by selective fluorescence imaging of cancer tissue.

1. 한국특허공개 2012-985121. Korea Patent Disclosure 2012-98512

본 발명의 목적은 화학요법제의 암조직으로의 선택적인 전달이 가능할 뿐만 아니라, 암조직에서만 선택적인 형광 발현이 가능한 나노응집체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a nano-aggregate capable of selectively delivering a chemotherapeutic agent to a cancer tissue as well as selectively expressing fluorescence only in a cancer tissue.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노응집체를 포함하는 항암 및/또는 암 진단용 약학 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the diagnosis of cancer and / or cancer comprising the nano-aggregate.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노응집체의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing the nano-aggregate.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은 In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is

화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속나노입자; 및 Metal nanoparticles covalently bonded to the surface of chemotherapeutic agents and aziridine metal nanoparticles; And

표면에 아미노기 도입된 양자점(quantum dot)에 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 분해가능한 펩티드가 펩티드 결합된 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기가 공유결합된 양자점을 포함하며, A quantum dot in which an amino group is introduced on the surface thereof and a peptide capable of being degraded by MMP-2 (matrix metalloproteinase-2) is peptide-bonded and an alkyne group is covalently bonded to the amino group of the peptide,

상기 금속 나노입자 상의 아지도기와 양자점 상의 알킨기가 서로 클릭화학(click chemistry) 반응에 의해 고리화 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성함으로써, 상기 나노입자 및 양자점이 서로 응집하여 형성된 나노응집체를 제공한다. The azido groups on the metal nanoparticles and the alkyne groups on the quantum dots are cyclized by a click chemistry reaction to form 1,2,3-triazole, whereby the nanoparticles formed by aggregation of the nanoparticles and the quantum dots, Lt; / RTI >

본 발명의 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 나노 응집체를 포함하는 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for anti-cancer and / or cancer diagnosis comprising the nano-aggregate according to the present invention.

본 발명의 또 다른 일 측면은 Another aspect of the present invention is

금속 나노입자 표면에 아지도기 및 화학요법제를 각각 도입하여, 화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속 나노입자를 제조하는 단계;Preparing a metal nanoparticle covalently bonded to the surface of the metal nanoparticle by introducing an azido group and a chemotherapeutic agent into the surface of the metal nanoparticle;

양자점(quantum dot)에 아미노기를 도입하고, MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드를 상기 아미노기와 펩티드 결합시킨 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기를 결합시켜, 펩티드 및 알킨기가 순차적으로 도입된 양자점을 제조하는 단계; 및 Introducing an amino group into a quantum dot, peptidically bonding a peptide degradable by MMP-2 to the amino group, and then bonding an alkyne group to the amino group of the peptide to prepare a quantum dot in which a peptide and an alkyne group are sequentially introduced step; And

상기 양자점 및 금속 나노입자를 구리 촉매 하에서 반응시켜 양자점 상의 알킨기를 금속 나노입자 상의 아자이드와 고리화반응에 의해 1,2,3-트리아졸을 형성시킴으로써 응집체를 형성시키는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 나노응집체의 제조방법을 제공한다. Reacting the quantum dot and the metal nanoparticle under a copper catalyst to form an aggregate by forming 1,2,3-triazole by cyclizing the alkyne group on the quantum dot with azide on the metal nanoparticle. The present invention also provides a method for producing nano-aggregates according to the present invention.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다. All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. In addition, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

본 발명자들은 보다 효과적인 화학요법제 전달 약물 전달체에 대해 연구하였다. 그 결과, 화학요법제 및 형광물질을 효과적으로 암 조직에 표적 지향적으로 전달할 수 있어 화학요법제의 부작용을 최소화하고 효과를 극대화 할 수 있을 뿐만 아니라, 형광물질이 암 부위에서만 형광을 나타낼 수 있어 암조직의 형광에 의한 모니터링을 가능하게 하는 나노응집체를 개발하게 되었다. 구체적으로는, 금속 나노입자 및 양자점를 포함한 나노응집체를 고안하였으며, 상기 금속 나노입자에는 클릭화학 반응에 필요한 아지도기 및 화학요법제를 나노입자의 표면에 결합시키고, 상기 양자점의 표면에는 암세포에서 과발현되는 MMP-2 효소에 의해 분해 가능한 펩티드(MMP-cleavable peptdie)를 결합시키고 그 펩티드의 아미노기 말단에 클릭화학 반응에 필요한 알킨기를 결합시킴으로써, 상기 금속 나노입자 및 양자점을 클릭화학 반응시켜 나노응집체를 형성하도록 하였다. 또한, 상기 양자점의 형광파장과 화학요법제의 흡광파장을 일치시켜, 혈중에서는 서로 FRET 현상에 의해 양자점의 형광이 나타나지 않도록 하였다. 상기 나노응집체가 암조직에 도달 시 암세포에서 과발현되는 MMP-2 효소에 의해 나노응집체를 연결하는 링커역할을 하는 MMP-2 효소에 의해 분해가능한 펩티드가 분해되어 나노응집체가 탈응집되어 금속 나노입자 및 양자점이 분리된다. 그러면, 분리된 양자점 및 금속 나노입자가 각각 암세포 내로 유입될 수 있으며, 유입된 금속 나노입자는 암세포 내의 환원적 환경에 의해 금속 나노입자에 결합되어 있던 화학 요법제의 분리가 일어나 화학요법제의 약효가 발휘될 수 있고, 유입된 양자점은 FRET 현상이 더 이상 일어나지 않아 양자점의 형광이 발현됨으로써 암세포 조직에 대한 형광을 나타낼 수 있으므로 형광에 의한 암조직의 모니터링을 가능하게 할 수 있다. The present inventors have studied more effective chemotherapeutic delivery drug delivery vehicles. As a result, the chemotherapeutic agent and the fluorescent substance can be effectively delivered to the cancer tissue in a targeted manner, minimizing the side effects of the chemotherapeutic agent and maximizing the effect, and the fluorescent substance can fluoresce only in the cancer site, To enable monitoring by fluorescence of the nanoparticles. Specifically, metal nanoparticles and nano-aggregates containing quantum dots are devised. The metal nanoparticles are bound to the surface of the nanoparticles with an azido group and a chemotherapeutic agent necessary for a click chemical reaction. The surfaces of the quantum dots are overexpressed in cancer cells (MMP-cleavable peptidie) is bound to the amino terminal of the peptide, and the alkyne group required for the click chemistry is bonded to the amino terminal end of the peptide. Thus, the metal nanoparticles and the quantum dots are chemically reacted with each other to form nano-aggregates Respectively. In addition, the fluorescence wavelength of the quantum dots was matched with the absorption wavelength of the chemotherapeutic agent, and fluorescence of the quantum dots was prevented from appearing due to the FRET phenomenon in the blood. When the nano-aggregate reaches the cancer tissue, the peptides degradable by the MMP-2 enzyme, which acts as a linker connecting the nano-aggregates by the MMP-2 enzyme overexpressed in the cancer cells, are degraded and the nano-aggregates are deagglomerated to form metal nanoparticles The quantum dots are separated. Then, the separated quantum dots and the metal nanoparticles can be introduced into the cancer cells, respectively, and the introduced metal nanoparticles are separated from the chemotherapeutic agent bound to the metal nanoparticles by the reducing environment in the cancer cells, And the introduced quantum dots do not cause the FRET phenomenon any longer, so that the fluorescence of the quantum dots can be expressed, so that the fluorescence can be displayed on the cancer cell tissue, so that it is possible to monitor the cancer tissue by fluorescence.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, Accordingly, in one aspect of the present invention,

화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속나노입자; 및 Metal nanoparticles covalently bonded to the surface of chemotherapeutic agents and aziridine metal nanoparticles; And

표면에 아미노기 도입된 양자점(quantum dot)에 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드가 펩티드 결합된 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기가 공유결합된 양자점을 포함하며, A quantum dot in which an amino group is introduced on the surface thereof and a peptide capable of being degradable by MMP-2 is peptide-bonded to the quantum dot, and an alkyne group is covalently bonded to the amino group of the peptide,

상기 금속 나노입자 상의 아지도기와 양자점 상의 알킨기가 서로 클릭화학(click chemistry) 반응에 의해 고리화 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성함으로써, 상기 나노입자 및 양자점이 서로 응집하여 형성된 나노응집체를 제공한다. The azido groups on the metal nanoparticles and the alkyne groups on the quantum dots are cyclized by a click chemistry reaction to form 1,2,3-triazole, whereby the nanoparticles formed by aggregation of the nanoparticles and the quantum dots, Lt; / RTI >

상기 금속 나노입자는 화학요법제가 결합되어 항암요법에 사용될 수 있는 임의의 금속 나노입자일 수 있으며, 예를 들어 백금, 금, 은, 철 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는, 백금 나노입자가 사용될 수 있다. The metal nanoparticles may be any metal nanoparticles that can be combined with a chemotherapeutic agent to be used in chemotherapy, for example, but are not limited to, platinum, gold, silver, and iron nanoparticles. Specifically, platinum nanoparticles can be used.

상기 화학요법제는 상기 금속 나노입자에 결합할 수 있으면서, 상기 양자점의 형광 파장과 동일한 파장의 흡광파장을 갖는 임의의 화학요법제가 사용될 수 있다. 상기 화학요법제의 예로는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 또는 이들의 조합 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. The chemotherapeutic agent may be any chemotherapeutic agent capable of binding to the metal nanoparticles and having an absorption wavelength of the same wavelength as the fluorescence wavelength of the quantum dot. Examples of such chemotherapeutic agents include, but are not limited to, doxorubicin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, dactinomycin, But are not limited to, daunorubicin, idarubicin, mitoxantron, plicamycin, mitomycin, or combinations thereof.

상기 양자점은 앞서 설명한 바와 같이, 상기 금속 나노입자에 공유 결합된 화학요법제의 흡광파장과 동일한 파장의 형광파장을 갖는 양자점이사용될 수 있다. 이러한 양자점은 직경이 1 nm 내지 100 nm 범위일 수 있다. 이러한 양자점은 당해 기술분야에 공지된 지식에 기초하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 구체적인 예로는 코어타입 QD(core-type QD), 코어-쉘 QD(core-shell QD), 또는 알로이드 QD(alloyed QD) 등이 있으며, Qdot^® Nanocrystal (Life Technologies Corporation), Trilite™ (Crystalplex Nanotech), Lumidot™ (Aldrich), Lumidot^TM 560, 또는 Lumidot^TM 590 로서 입수할 수 있다. As described above, the quantum dot may be a quantum dot having a fluorescent wavelength of the same wavelength as that of the chemotherapeutic agent covalently bound to the metal nanoparticle. Such quantum dots may range in diameter from 1 nm to 100 nm. Such quantum dots can be appropriately selected by those skilled in the art based on knowledge known in the art. Specific examples thereof include a core-type QD, a core-shell QD, this, and can be obtained as ^® Nanocrystal Qdot (Life Technologies Corporation), Trilite ™ (Nanotech Crystalplex), Lumidot ™ (Aldrich), Lumidot ^TM 560, ^TM 590 Lumidot or the like (alloyed QD).

상기 나노응집체에서 양자점은 화학요법제의 흡광 파장과 동일한 형광파장을 가지므로, 상기 나노응집체는 FRET 현상에 의해 양자점의 형광이 발현되지 않게 된다. 상기 나노응집체는 암 조직 주변에서 암세포가 과발현하는 MMP-2에 의해, 나노응집체의 링커 역할을 하는 펩티드(즉, MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드)가 분해되어, 나노응집체가 붕괴되어 금속 나노입자 및 양자점이 분리되며, 분리된 양자점은 암세포로 유입되고, 양자점 및 화학요법제 간의 거리가 멀어져서, FRET 현상이 더 이상 일어나지 않아, 양자점의 형광이 발현된다. 따라서, 상기 나노응집체는 암조직이 아닌 정상조직이나 혈액 중에서는 형광을 발현시키지 않고, 암조직 중에서만 형광을 발휘시킬 수 있어, 암조직에 대한 선택적인 형광 이미징을 형성시킬 수 있다. Since the quantum dots in the nano-aggregates have the same fluorescence wavelength as the absorption wavelength of the chemotherapeutic agent, fluorescence of the quantum dots is not expressed by the FRET phenomenon of the nano-aggregates. The nano-aggregate is decomposed by MMP-2, which is overexpressed by cancer cells in the vicinity of cancer tissues, so that the peptide functioning as a linker of nano-aggregates (that is, a peptide capable of degradation by MMP-2) is degraded, And the quantum dots are separated, the separated quantum dots are introduced into the cancer cells, the distance between the quantum dots and the chemotherapeutic agent is distant, and the FRET phenomenon no longer occurs, so that the fluorescence of the quantum dots is expressed. Therefore, the nano-aggregates can exert fluorescence only in cancer tissues without expressing fluorescence in normal tissues or blood, not in cancer tissues, and can form selective fluorescence imaging for cancer tissues.

상기 화학요법제 및 그 화학요법제의 흡광파장과 동일한 형광파장을 갖는 양자점의 조합으로는, 구체적으로 독소루비신, 및 독소루비신의 흡광파장에서 여기(excitation)하는 종류의 양자점인 Trilite^TM Yellow(Crystalplex Corp.), Qdot^®565(Invitrogen Corp.), Qdot^®585(Invitrogen Corp.), Lumidot^TM 560, 또는 Lumidot^TM 590 등이 있다. 이러한 화학요법제의 양자점의 조합은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 당해 기술분야의 공지된 지식에 기초하여 적절히 선택할 수 있다. Examples of combinations of quantum dots having fluorescence wavelengths that are the same as those of the chemotherapeutic agent and the chemotherapeutic agent include Trilite ^™ Yellow (Crystalplex Corp.), which is a kind of quantum dots excited at the extinction wavelength of doxorubicin and doxorubicin. ), Qdot ^® 565 (Invitrogen Corp.), Qdot ^® 585 (Invitrogen Corp.), Lumidot ^TM 560, or Lumidot ^TM 590. The combination of quantum dots of such a chemotherapeutic agent can be appropriately selected based on the knowledge of those skilled in the art by those skilled in the art.

상기 양자점에 결합되는 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있으며, 일 구현예에 따르면 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드 결합인 Gly-Leu 펩티드 결합을 포함하는 5 내지 10 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드일 수 있다. 예를 들면, 상기 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드는 Asp-Gly-Phe-Leu-Gly-Val-Cys이다. Peptides degradable by MMP-2 bound to the quantum dots can be appropriately selected by those of ordinary skill in the art and include, according to one embodiment, a Gly-Leu peptide bond that is a peptidic bond that is degradable by MMP-2 A peptide consisting of 5 to 10 amino acids. For example, the peptide degradable by MMP-2 is Asp-Gly-Phe-Leu-Gly-Val-Cys.

상기 펩티드에 결합된 알킨기는 C_2-6알킨기일 수 있으며, 보다 구체적으로는 C_2-4알킨기, 더욱 구체적으로는 C_2-3알킨기이다. The alkynyl group bonded to the peptide may be a C _2-6 alkynyl group, more specifically a C _2-4 alkynyl group, more specifically a C _2-3 alkynyl group.

상기 금속 나노입자와 상기 양자점을 함께 반응시키면, 상기 양자점의 알킨기는 상기 금속 나노입자의 표면에 존재하는 아지도기와 함께 클릭화학 반응에 의해 고리화 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성하게 된다. 이러한 클릭화학 반응에 의해, 상기 나노입자와 상기 양자점이 서로 결합하여 응집되므로, 나노응집체가 형성된다. When the metal nanoparticles and the quantum dots are reacted together, the alkyne groups of the quantum dots are cyclized by a click chemical reaction together with azido groups present on the surface of the metal nanoparticles to form 1,2,3-triazole do. By such a click chemical reaction, the nanoparticles and the quantum dots are bound to each other and aggregated, so that nano-aggregates are formed.

상기 나노응집체의 크기는 약 10 nm ~ 1um일 수 있으며, 더 구체적으로는 약 10 내지 500 nm일 수 있고, 더욱 구체적으로는 직경이 약 50 내지 400 nm, 더 바람직하게는 약 100 내지 300 nm 일 수 있다. 상기 범위보다 클 경우에는 혈관을 막는 등의 부작용이 발생할 수 있고, 상기 범위보다 작을 경우에는 정상세포에 유입되는 등의 문제가 발생할 수 있다. 또한, 상기 나노응집체는 MMP-2에 의한 암세포 타겟팅 효과 뿐만 아니라, 상기 크기에서는 EPR(Enhanced Permeability and Retention effect) 효과에 의한 암세포로의 타겟팅의 효과를 더욱 얻을 수 있으므로, 암세포의 타겟팅의 효과를 더욱 증대시킬 수 있다. 이러한 나노 응집체의 크기 범위를 갖기 위해서는 상기 금속 나노입자의 양자점에 대한 몰비는 1:50~200 일 수 있다. The size of the nano-aggregate can be about 10 nm to 1 um, more specifically about 10 to 500 nm, and more specifically about 50 to 400 nm in diameter, more preferably about 100 to 300 nm in diameter . If it is larger than the above range, adverse effects such as clogging the blood vessel may occur. If it is smaller than the above range, there may occur a problem such that it flows into normal cells. In addition, since the nano-aggregate can further enhance the targeting effect of cancer cells by the effect of EPR (Enhanced Permeability and Retention Effect) in addition to the effect of targeting cancer cells by MMP-2, Can be increased. The molar ratio of the metal nanoparticles to the quantum dots may be in the range of 1:50 to 200 in order to obtain the size range of the nano-aggregates.

본 발명은 다른 측면에 있어서, According to another aspect of the present invention,

금속 나노입자 표면에 아지도기 및 화학요법제를 각각 도입하여, 화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속 나노입자를 제조하는 단계;Preparing a metal nanoparticle covalently bonded to the surface of the metal nanoparticle by introducing an azido group and a chemotherapeutic agent into the surface of the metal nanoparticle;

양자점(quantum dot)에 아미노기를 도입하고, MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드를 상기 아미노기와 펩티드 결합시킨 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기를 결합시켜, 펩티드 및 알킨기가 순차적으로 도입된 양자점을 제조하는 단계; 및 Introducing an amino group into a quantum dot, peptidically bonding a peptide degradable by MMP-2 to the amino group, and then bonding an alkyne group to the amino group of the peptide to prepare a quantum dot in which a peptide and an alkyne group are sequentially introduced step; And

상기 양자점 및 금속 나노입자를 구리 촉매 하에서 반응시켜 양자점 상의 알킨기를 금속 나노입자 상의 아자이드와 고리화반응에 의해 1,2,3-트리아졸을 형성시킴으로써 응집체를 형성시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노응집체의 제조방법을 제공한다. Reacting the quantum dot and the metal nanoparticles under a copper catalyst to form an aggregate by forming 1,2,3-triazole by cyclizing the alkyne group on the quantum dot with azide on the metal nanoparticle, The present invention also provides a method for producing nano-aggregates according to one aspect of the present invention.

상기 제조방법에서의 금속 나노입자, 화학요법제, 양자점, MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드, 및 알킨기 등은 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체에 대한 설명이 그대로 적용된다.The metal nanoparticles, the chemotherapeutic agent, the quantum dot, the peptide capable of being degraded by MMP-2, and the alkyne group in the above production method are applied to the description of the nano-aggregate according to one aspect of the present invention.

상기 금속 나노입자 제조단계에서 금속 나노입자 표면에 아지도기의 도입은, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 금속 나노입자의 종류에 따라 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 나노입자는 백금 나노입자이고, 3-APTS(3-아미노프로필-트리에톡시실란)를 반응시켜 아미노기를 도입한 다음, 4-아지도-L-페닐알라닌과 반응시켜 아지도를 도입할 수 있다. The introduction of the azido group to the surface of the metal nanoparticles in the step of preparing the metal nanoparticles can be appropriately performed according to the type of the metal nanoparticles having the ordinary knowledge in the art. In one embodiment, the metal nanoparticles are platinum nanoparticles, which are reacted with 3-APTS (3-aminopropyl-triethoxysilane) to introduce an amino group and then react with 4-azido-L- Maps can be introduced.

상기 금속 나노입자의 제조단계에서 금속 나노입자의 표면에 화학요법제의 도입은, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 금속 나노입자의 종류에 따라 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 나노입자는 백금 나노입자이고, 화학요법제가 독소루비신인 경우 독소루비신의 아민기를 티올기로 치환시키고 금속 나노입자와 반응시킴으로써 독소루비신을 금속 나노입자의 표면에 결합시킬 수 있다. The introduction of the chemotherapeutic agent onto the surface of the metal nanoparticles in the step of preparing the metal nanoparticles can be suitably performed according to the type of the metal nanoparticles having the ordinary knowledge in the art. In one embodiment, the metal nanoparticles are platinum nanoparticles and when the chemotherapeutic agent is doxorubicin, doxorubicin can be bound to the surface of the metal nanoparticles by replacing the amine group of doxorubicin with a thiol group and reacting with metal nanoparticles.

상기 양자점을 제조하는 단계에서 MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드를 양자점에 결합시키는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 상기 양자점 및 펩티드의 종류에 따라 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에서, MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드의 카르복실산기를 EDC 및 술포-NHS와 함께 활성화시켜 아민기가 노출된 양자점과 반응시킴으로써, MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드를 양자점에 결합시킬 수 있다. 그런 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기를 결합시키는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 상기 알킨기 및 펩티드의 종류에 따라 적절히 수행할 수 있다. 일 구현예에서, 펩티드가 도입된 양자점을 알킨-PEG-MAL (α-Alkynyl-ω-Maleimidyl-Poly(ethyleneglycol))과 반응시켜 펩티드기의 아미노말단에 알킨기를 결합킬 수 있다. Binding of peptides capable of degradation by MMP-2 to the quantum dots in the step of preparing the quantum dots can be suitably performed according to the types of quantum dots and peptides by those skilled in the art. In one embodiment, peptides capable of degradation by MMP-2 can be bound to the quantum dots by activating the carboxylic acid groups of the peptides degradable by MMP-2 with EDC and Sulfo-NHS to react the amine groups with exposed Qdots have. Then, the amino group of the peptide can be bound to an alkyne group by those skilled in the art according to the kind of the alkyne group and the peptide. In one embodiment, an alkyne group may be attached to the amino terminus of the peptide group by reacting the quanta point into which the peptide has been introduced with an alkyne-PEG-MAL (alpha-Alkynyl-omega-Maleimidyl-Poly (ethyleneglycol)).

상기 응집체를 형성시키는 단계에서는 상기 양자점 및 금속 나노입자를 클릭화학 반응에 의해 서로 결합시킴으로써 나노응집체를 형성할 수 있다. 상기 양자점 상의 알킨기 및 상기 금속 나노입자 상의 아자이드는 구리 촉매 하에서 고리화반응을 수행하여 1,2,3-트리아졸을 형성시킬 수 있으며, 그리하여 금속 나노입자 및 양자점은 서로 공유결합이 이루어져 나노응집체를 형성할 수 있다. 상기 구리 촉매는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 황산구리(CuSO₄)가 사용될 수 있다. In the step of forming the aggregates, the nanoparticles may be formed by bonding the quantum dots and the metal nanoparticles to each other by a click chemical reaction. The alkyne group on the quantum dot and the azide on the metal nanoparticle may undergo a cyclization reaction under a copper catalyst to form 1,2,3-triazole. Thus, the metal nanoparticles and the quantum dots are covalently bonded to each other, Aggregates can be formed. The copper catalyst may be appropriately selected by those skilled in the art, for example, copper sulfate (CuSO ₄ ) may be used.

상기 본 발명에 따른 나노응집체의 제조방법의 일 실시예의 반응 모식도를 도 1a 내지 1c에 나타내었다. 도 1a 내지 1c의 반응 모식도에 따른 구체적인 제조방법은 하시 실시예에서 설명하였다. 1A to 1C show a reaction scheme diagram of one embodiment of the method for producing nano-aggregates according to the present invention. Specific production methods according to the reaction scheme diagrams of Figs. 1A to 1C are described in the following Examples.

도 1c는 아지도기 및 화학요법제가 표면에 공유결합된 금속 나노입자 및, MMP-2에 의해 분해 가능한 펩티드 및 그 펩티드에 알킨기가 공유결합된 양자점을 반응시켜 클릭화학 반응에 의해 나노응집체가 형성되는 단계 (a), 그 나노응집체가 MMP-2 존재 하에서 붕괴하여 금속 나노입자 및 양자점으로 분리되는 단계 (b), 및 분리된 금속 나노입자 및 양자점이 각각 암세포 내에 유입될 경우 암세포 중의 환원 조건 하에서 화학요법제가 금속 나노입자로부터 분리되는 단계 (c)를 나타낸 모식도이다. FIG. 1C is a graph showing the results of a reaction between metal nanoparticles covalently bonded to the surface of an azotriot and a chemotherapeutic agent, peptides degradable by MMP-2, and quantum dots covalently bonded with an alkyne group to the peptides, (B) separating the nanoparticles into nanoparticles and quantum dots by collapsing in the presence of MMP-2, and separating the nanoparticles and quantum dots into the cancer cells, (C) wherein the therapeutic agent is separated from the metal nanoparticles.

상기 본 발명에 따른 나노응집체는 나노응집체 상태에서는 응집체의크기로 인해 세포 내로 유입되지 못한다. 그리고, 이 상태에서는 양자점이 금속 나노입자에 결합되어 있는 화학요법제와 서로 FRET 현상을 나타내어, 양자점의 형광이 발현되지 못한다. 그러나, 도 1c의 단계 (b)에서와 같이, 암세포에서 과발현되는 MMP-2에 의해 나노응집체를 연결하는 링커 역할을 하는 펩티드(즉, MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드)가 분해되어 응집체가 붕괴되어, 금속 나노입자 및 양자점이 분리되면, 금속 나노입자 및 양자점 각각이 암세포 내로 유입될 수 있다. 암세포에 유입된 금속 나노입자는 단계 (c)에와 같이 환원 상태에 놓이게 되며, 그 금속 나노입자에 결합되어 있는 화학요법제가 암세포 내의 환원 조건 하에서 분리되어 화학요법제가 암세포 내에서 그 효과를 발휘할 수 있게 된다. 암세포에 유입된 양자점은 화학요법제와 더 이상 FRET 현상을 나타내지 않게 되므로, 형광을 나타낼 수 있고, 따라서 암세포가 형광으로서 표시될 수 있도록 할 수 있다. The nano-aggregate according to the present invention can not enter the cell due to the size of the aggregate in the nano-aggregate state. In this state, the quantum dots exhibit a FRET phenomenon with the chemotherapeutic agent bound to the metal nanoparticles, and the fluorescence of the quantum dots can not be expressed. However, as in step (b) of FIG. 1 (c), peptides that act as linkers connecting the nano-aggregates by MMP-2 overexpressed in cancer cells (that is, peptides degradable by MMP-2) When the metal nanoparticles and the quantum dots are separated, each of the metal nanoparticles and the quantum dots can be introduced into cancer cells. The metal nanoparticles introduced into the cancer cells are placed in a reduced state as shown in step (c), and the chemotherapeutic agent bound to the metal nanoparticles is separated under the reducing conditions in the cancer cells, so that the chemotherapeutic agent can exert its effect in cancer cells . Since the quantum dots introduced into the cancer cells do not show any further FRET phenomenon with the chemotherapeutic agent, they can exhibit fluorescence, and thus cancer cells can be displayed as fluorescence.

이러한 기전에 의해, 상기 본 발명에 따른 나노응집체는 정상세포에서는 화학요법제의 항암 효과 및 형광을 나타내지 못하지만, 암세포에서는 화학요법제에 의한 항암 효과를 발휘할 수 있음과 동시에, 암 진단에 필요한 형광을 발현시킬 수 있다. In accordance with this mechanism, the nano-aggregate according to the present invention can not exhibit the anticancer effect and fluorescence of the chemotherapeutic agent in the normal cells, but it can exhibit the anticancer effect by the chemotherapeutic agent in the cancer cell, Lt; / RTI >

따라서, 본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노응집체를 포함하는 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물을 제공한다. Accordingly, in another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for anti-cancer and / or cancer diagnosis comprising the nano-aggregate according to one aspect of the present invention.

상기 약학 조성물은 화학요법제에 의한 항암 목적을 위해서만 사용될 수도 있고, 암 진단 목적을 위해서만 사용될 수도 있으며, 암 진단과 동시에 화학요법제에 의한 항암 치료에 사용될 수도 있다. 특히 항암 치료를 수행하면서, 암 조직의 크기 및/또는 분포를 형광 측정에 의해 확인해 볼 수 있어 화학요법제에 의한 암 치료의 진행 상황을 모니터링 할 수 있어 유익하다. 본 발명에서 암 진단은 암이 존재여부를 최로로 확인하는 것 뿐만 아니라, 형광 측정에 의한 암조직의 크기, 분포 등을 모니터링 하여 암의 진행 정도를 모니터링하는 것을 포함한다.The pharmaceutical composition may be used only for the purpose of chemotherapeutic agent, for cancer diagnosis purposes, or for chemotherapeutic agent as well as for cancer diagnosis. In particular, the size and / or distribution of cancer tissue can be confirmed by fluorescence measurement while performing chemotherapy, and it is advantageous to monitor progress of cancer treatment by chemotherapeutic agent. In the present invention, cancer diagnosis includes monitoring the progress of cancer by monitoring the size, distribution, and the like of cancer tissue by fluorescence measurement, as well as confirming the presence of cancer to the maximum.

상기 약학 조성물이 함유하는 나노응집체는 암세포에서 과분비되는 MMP-2에 의해 나노응집체가 나노입자의 형태로 붕괴되고, 비로소 암세포 내로 유입될 수 있는 반면에, 암세포가 아닌 정상세포에서는 MMP-2에 의한 나노응집체의 붕괴가 거의 일어나지 않으므로, 암조직 중의 암세포에 대해서만 비로소 작용할 수 있다. 따라서, 화학요법제의 암세포에 대한 타겟팅이가능하므로, 화학요법제를 부작용을 최소화 하면서 투여할 수 있다는 점에서 매우 큰 장점이 있다. The nano-aggregates contained in the pharmaceutical composition can be broken down into nanoparticles in the form of nanoparticles by MMP-2, which is hypersecreted in cancer cells, and then can be introduced into cancer cells. On the other hand, in normal cells that are not cancer cells, Collapse of the nano-aggregate hardly occurs, and therefore, it can act only on cancer cells in cancer tissues. Therefore, since the chemotherapeutic agent can be targeted to cancer cells, there is a great advantage in that the chemotherapeutic agent can be administered while minimizing side effects.

상기 항암용 및/또는 암진단용 약학 조성물의 투여량은 포함하는 나노 응집체의 금속 나노입자에 결합된 화학요법제 및/또는 양자점의 종류에 따라 달라 질 수 있을 뿐만 아니라, 조성물의 투여경로, 환자의 성별, 나이, 인종, 질병이 심각한 정도에 따라 달라질 수 있으며, 통상의 기술자가 통상적인 임상실험에 의해 투여량을 결정할 수 있다.The dose of the anti-cancer and / or cancer diagnostic pharmaceutical composition may be varied depending on the type of the chemotherapeutic agent and / or quantum dot bound to the nanoparticulate metal nanoparticles contained therein, Sex, age, race, or disease may vary depending on the severity and the dosage can be determined by routine experimentation by a typical practitioner.

상기 나노 응집체를 포함하는 약학 조성물은 임의의 투여경로를 통해 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 주사제로서 투여될 수 있다. 상기 나노 응집체를 포함하는 약학 조성물을 주사제로서 투여하기 위해서는, 나노응집체의 직경의 크기가 50 내지 400 nm 의 범위인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 100 nm 내지 300 nm 이다. The pharmaceutical composition comprising the nano-aggregate may be administered through any route of administration, but may preferably be administered as an injection. In order to administer the pharmaceutical composition containing the nano-aggregate as an injection, the diameter of the nano-aggregate is preferably in the range of 50 to 400 nm, more preferably 100 to 300 nm.

상기 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 상기 약학 조성물의 제제화 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라 당업자가 적절한 제조할 수 있으며, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania 19042 (Chapter 87; Blaug, Seymour) 을 참조할 수 있다. The injection may be prepared according to a conventional injection preparation method known in the art. The injectable preparation may be dispersed in a sterile medium so that the injectable solution can be used as it is when administered to a patient, or may be prepared by adding distilled water for injection and dispersing the solution at an appropriate concentration. The pharmaceutical composition may be prepared by a person skilled in the art according to conventional methods known in the art and may be prepared according to the methods described in Remington ' s Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania 19042 (Chapter 87; Blaug, Seymour ) Can be referred to.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노 응집체는 화학요법제의 암세포에 대한 표적지향성 전달이 가능할 뿐만 아니라, 형광을 나타내는 양자점에 대해서도 암세포에 대한 표적지향성 전달이 가능하므로 부작용을 최소화 하면서 화학요법제를 투여할 수 있을 뿐만 아니라, 정확한 암진단도 가능하게 한다. 또한, 화학요법제의 암세포에 대한 전달과 동시에 형광을 나타내는 양자점을 동시에 전달할 수 있으므로, 하나의 약물을 투여함으로써 항암 치료 및 항암 치료에 의한 암 질환의 개선 여부를 모니터링 할 수 있다는 점에 있어서 매우 바람직하다. As described above, the nano-aggregate according to the present invention not only enables a chemotherapeutic agent to deliver target-directed radiation to cancer cells, but also can transfer target-directed radiation to cancer cells to quantum dots showing fluorescence, In addition, it is possible to diagnose cancer accurately. In addition, since a quantum dots representing fluorescence can be simultaneously transmitted to a cancer cell of a chemotherapeutic agent, it is very preferable to monitor the improvement of cancer disease by chemotherapy and chemotherapy by administering one drug Do.

따라서, 본 발명에 따른 나노 응집체는 항암 효과를 증대시키면서 부작용의 우려를 해소할 수 있고, 동시에 암 치료의 효과여부를 확인해 볼 수 있는, 매우 스마트한 신개념의 화학요법제 및 암 진단용 형광 물질의 약물 전달체라고 할 수 있다. Therefore, the nano-agglutination according to the present invention is a very smart new-concept chemotherapeutic agent capable of enhancing the anticancer effect and solving the fear of side effects, It can be said to be a carrier.

도 1a는 DOX/azide@AuNP를 합성의 반응 모식도이다.
도 1b는 알킨-MMP@Qdot를 합성의 반응 모식도이다.
도 1c는 DOX/azide@AuNP 및 알킨-MMP@Qdot의 나노응집체가 클릭화학 반응에 의해 합성되고(a), MMP-2에 의해 붕괴되고(b), 환원 조건 하에서 AuNP로부터 DOX가 분리(c)되는 반응의의 모식도이다.
도 2a는 AuNP (1, blue) 및 azide@AuNP (2, red)의 FT-IR 스펙트럼이다.
도 2b는 DOX/azide@AuNP (2*, pink), DOX@AuNP (1*, sky blue), azide@AuNP (2, red)와 AuNP (1, blue), azide@AuNP (2, red)의 Raman 스펙트럼으로서, 2*, 1* 과 2 샘플은 785nm의 레이저를 사용하였고, 1 과 2 샘플은 633nm의 레이저를 사용하였다.
도 2c는 AuNP에 부가된 티올화 독소루비신의 농도에 변화에 따른 합성된 DOX/azide@AuNP 0.76 pmol에서의 표면에 부착된 DOX의 정량 그래프이며, 이와 함께 상기 합성된 DOX가 부착된 AuNP의 SEM 사진을 함께 나타내었다. scale bar의 크기는 100 nm이다.
도 2d는 AuNP(1, blue), DOX@AuNP(1*, sky blue), 및 10 mM의 DTT 존재 하에서의 DOX@AuNP(1**, dark blue)을 Raman scattering으로 분석(A: 785 nm의 레이저 사용, B: 633 nm의 레이저 사용)한 Raman 스펙트럼이다.
도 3a는 Alkyne-MMP@Qdot (1, blue)와 Qdot (2, black)의 Raman 스펙트럼이다.
도 3b는 Qdot, MMP@Qdot, Alkyne-MMP@Qdot를 티올에 반응하는 형광 또는 알킨에 반응하는 형광과 반응시킨 후 측정한 형광이미지이다.
도 4a는 AuNP(CuSO4(+))(●), azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(+))(△), DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(-))(▽), DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(+))(○)의 반응시간의 변화에 따른 응집체의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체의 ESI-TEM 과 IVIS로 관찰된 Elemental mapping 이미지와 Qdot 형광 이미지(삽입 이미지)이다.
도 5a는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재(●)하에서 또는 MMP-2의 부존재(○)하에서 실온에서 3 시간동안 반응하면서 변화되는 나노응집체의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체의 MMP-2 존재 하에서 붕괴된 나노응집체의 TEM-elemental mapping 이미지와 Qdot 형광 이미지(삽입 이미지)이다.
도 6은 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 유입된 Au 함량을 정량한 결과를 나노응집체 중의 AuNP의 농도의 변화에 따라 나타낸 그래프이다.
도 7은 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 처리하여 1.5 시간 배양한 후 세포 내로 유입된 나노응집체의 Multi-photon CLSM 이미지이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 처리하여 배양 후 1.0 %의 포름알데히드 용액에 고정 후 live-dead assay kit를 통하여 염색 후 형광 현미경을 통해 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.FIG. 1A is a reaction scheme diagram of the synthesis of DOX / azide @ AuNP. FIG.
FIG. 1B is a schematic diagram showing the reaction of synthesizing alkyne-MMP @ Qdot.
FIG. 1c shows that nano-aggregates of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot are synthesized by a click chemistry (a), collapsed by MMP-2 (b), and DOX is separated from AuNP under reducing conditions (c ). ≪ / RTI >
2A is an FT-IR spectrum of AuNP (1, blue) and azide @ AuNP (2, red).
FIG. 2B is a schematic view showing the structure of AuNP (2, red) and AuNP (1, blue), DOX / azide @ AuNP (2 *, pink), DOX @ AuNP (1 *, sky blue) Raman spectra of 2 *, 1 * and 2 samples used a 785 nm laser, and 1 and 2 samples used a 633 nm laser.
FIG. 2C is a graph of quantitation of surface-attached DOX at 0.76 pmol of synthesized DOX / azide @ AuNP according to the concentration of thiolated doxorubicin added to the AuNP, and SEM photographs of the synthesized DOX- Respectively. The size of the scale bar is 100 nm.
Figure 2d shows the Raman scattering of DOX @ AuNP (1 **, dark blue) in the presence of AuNP (1, blue), DOX @ AuNP (1 *, sky blue) and 10 mM DTT (A: 785 nm Laser, B: 633 nm laser) is a Raman spectrum.
3A is a Raman spectrum of Alkyne-MMP @ Qdot (1, blue) and Qdot (2, black).
FIG. 3B is a fluorescence image obtained by reacting Qdot, MMP @ Qdot, Alkyne-MMP @ Qdot with fluorescence reacting with thiol or fluorescence reacting with alkyne.
Figure 4a is AuNP (CuSO4 (+)) ( ●), azide @ AuNP and _{Alkyne-MMP @ Qdot (CuSO 4} (+)) (△), DOX / azide @ AuNP and _{Alkyne-MMP @ Qdot (CuSO 4} (- ), (VI), DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot (CuSO ₄ (+)) (O).
FIG. 4B is an elemental mapping image and Qdot fluorescence image (inset image) observed with ESI-TEM and IVIS of nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ in DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot.
Figure 5a shows the reaction of nano-aggregates produced in the presence of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot in the presence of CuSO ₄ under room temperature (~) or without MMP-2 (○) at room temperature for 3 hours The size of the nano-agglomerates being varied.
5B is a TEM-elemental mapping image and Qdot fluorescence image (inset image) of collapsed nano-aggregates in the presence of nano-aggregate MMP-2 produced in the presence of CuSO ₄ of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot.
FIG. 6 shows the results of quantifying the amount of Au introduced into NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP-2 in the presence of CuSO _{4 in} the presence of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot. Is a graph showing a change in concentration.
FIG. 7 shows that nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot were treated with NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP-2 and incubated for 1.5 hours. It is a multi-photon CLSM image.
FIG. 8 is a graph showing the effect of the nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ on DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot according to an embodiment of the present invention on NIH3T3 cells treated with NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP- Of formaldehyde solution and then stained with live-dead assay kit and observed with fluorescence microscope.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<약어에 대한 설명> <Abbreviation Explanation>

AuNP: 백금 나노입자, Qdot: 양자점AuNP: Platinum nanoparticles, Qdot: Qdot

DOX: 독소루비신, NHS: N-히드록시숙신이미드, DOX: doxorubicin, NHS: N-hydroxysuccinimide,

EDC: 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide,

RT:실온, h: 시간, RT: room temperature, h: time,

azide@AuNP: 아자이드 결합 AuNPazide @ AuNP: Azide bond AuNP

DOX/azide@AuNP: 독소루비신 및 아자이드 결합 AuNPDOX / azide @ AuNP: doxorubicin and azide-bound AuNP

Alkyne-MMP@Qdot: 알킨-(MMP-2 분해 가능한 펩티드) 결합 QdotAlkyne-MMP @ Qdot: Alkyne (MMP-2 degradable peptide) Binding Qdot

Alkyne-PEG-MAL: 알킨-폴리에틸렌글리콜-말레이미드Alkyne-PEG-MAL: Alkyne-polyethylene glycol-maleimide

APTS: 3-아미노프로필-트리에톡시실란APTS: 3-aminopropyl-triethoxysilane

TEA: 트리에탄올아민TEA: triethanolamine

TBTA: Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine TBTA: Tris [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amine

DLS: 동적광산란광도계(Dynamic Light Scattering Spectrometer) DLS: Dynamic Light Scattering Spectrometer

TEM: 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy)TEM: transmission electron microscopy (Transmission Electron Microscopy)

ICP-OES: Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry
ICP-OES: Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometry

실시예 1: DOX/azide@AuNP 합성Example 1: Synthesis of DOX / azide @ AuNP

아지도기로 표면 개질된 AuNP를 합성하기 위하여 AuNP 표면에 APTS와 4-아지도-L-페닐알라진을 순서대로 반응시켰다. 구체적으로는 84.0 ng/ml의 농도의 APTS 용액 0.2 ml과 0.6 mg/ml의 농도의 AuNP 용액 1.8ml을 상온에서 12 시간동안 반응하여 표면에 아민 그룹이 표출된 AuNP를 합성하였다. 이어서 78.5 ng/ml의 농도의 4-아지도-L-페닐알라닌 용액 0.2 ml와 아민 그룹이 표출된 AuNP용액을 18.2 ng의 EDC의 존재 하에서 상온에서 12 시간동안 반응시켜 아지도기가 표출된 AuNP(azide@AuNP)를 합성하였다.APTS and 4-azido-L-phenylalanine were reacted on the AuNP surface in order to synthesize AuNP surface-modified with azido. Specifically, 0.2 ml of APTS solution at a concentration of 84.0 ng / ml and 1.8 ml of an AuNP solution at a concentration of 0.6 mg / ml were reacted at room temperature for 12 hours to synthesize AuNP having an amine group on the surface. Subsequently, 0.2 ml of a solution of 4-azido-L-phenylalanine at a concentration of 78.5 ng / ml and AuNP solution in which an amine group was expressed were reacted for 12 hours at room temperature in the presence of 18.2 ng of EDC to prepare AuNP @AuNP) was synthesized.

DOX를 AuNP 표면에 연결시키기 위하여 DOX의 아민기를 티올기로 치환시켰다. 구체적으로는, 0.52 mg의 Traut's 시약과 0.2 mg의 TEA를 DOX 1.0 mg과 DMSO 상에서 1 시간동안 반응시켜 티올화 DOX를 합성하였다. 아자이드@AuNP와 티올화 DOX를 상온에서 30 분동안 반응시키고 원심분리를 통해 반응하지 않은 물질들을 워싱하여 DOX/azide@AuNP를 합성하였다. To link DOX to the AuNP surface, the amine group of DOX was replaced with a thiol group. Specifically, thiolated DOX was synthesized by reacting 0.52 mg of Traut's reagent and 0.2 mg of TEA on DOX 1.0 mg and DMSO for 1 hour. Azide @ AuNP and thiolated DOX were reacted at room temperature for 30 minutes and the unreacted materials were washed by centrifugation to synthesize DOX / azide @ AuNP.

DOX/azide@AuNP 합성의 반응 모식도를 도 1a에 나타내었다. The reaction scheme of DOX / azide @ AuNP synthesis is shown in FIG.

azide@AuNP의 아자이드 그룹을 FTIR로 확인하였으며, 그 결과를 도 2a에 나타내었다. The azide group of azide @ AuNP was identified by FTIR and the results are shown in FIG.

DOX/azide@AuNP의 DOX 그룹을 Raman scattering으로 분석하였으며, 그 결과를 도 2b에 나타내었다. The DOX group of DOX / azide @ AuNP was analyzed by Raman scattering, and the result is shown in FIG. 2B.

합성된 DOX/azide@AuNP의 DOX 양을 484 nm에서 DOX의 흡광을 측정하여 정량하였으며, 그 결과를 도 2c에 나타내었다. 또한, 합성된 DOX/azide@AuNP의 SEM 사진을 함께 나타내었다. SEM 사진에서 scale bar 의 크기는 100 nm 이다. The amount of DOX of the synthesized DOX / azide @ AuNP was determined by measuring the absorption of DOX at 484 nm, and the result is shown in FIG. 2c. Also, SEM photographs of synthesized DOX / azide @ AuNP are shown together. The size of the scale bar in the SEM image is 100 nm.

도 2a는 AuNP (1, blue), 아자이드@AuNP (2, red)의 FT-IR 스펙트럼이다. 도 2a에 따르면, 아자이드기에서 나타내는 특정 파장대인 2100 cm^-1 부근에서 피크가 검출되어 아자이드 연결이 확인되었다. 2A is an FT-IR spectrum of AuNP (1, blue) and azide @ AuNP (2, red). According to Fig. 2A, a peak was detected at about 2100 cm &lt; ^-1 &gt; at a specific wavelength band indicated by the azide group and azide linkage was confirmed.

도 2b는 아자이드/DOX@AuNP (2*, pink), DOX@AuNP (1*, sky blue), azide@AuNP (2, red)와 AuNP (1, blue), azide@AuNP (2, red)의 Raman 스펙트럼으로서, 2*, 1* 과 2 샘플은 785nm의 레이저를 사용하였고, 1 과 2 샘플은 633nm의 레이저를 사용하였다. 도 2b에 따르면, DOX의 피크들이 600-1800 cm-1에서 검출되어 DOX의 연결이 확인되었다.FIG. 2B is a schematic view showing the structure of AuD (Au) (2 *, pink), DOX @ AuNP (1 *, sky blue), azide @ AuNP ), 2 *, 1 * and 2 samples used 785nm lasers, and 1 and 2 samples used 633nm lasers. According to Fig. 2B, peaks of DOX were detected at 600-1800 cm &lt; -1 &gt; and the connection of DOX was confirmed.

또한, AuNP에서 나타나는 OH 기의 피크링 3200-3400 cm-1 부근의 피크가 azide@AuNP에서는 사라지는 것으로 보아 AuNP 표면에 아지도기가 잘 연결된 것으로 확인되었다. In addition, the peak near the peak ring of 3200-3400 cm-1 of the OH group in the AuNP disappears in the azide @ AuNP.

도 2c는 AuNP에 부가된 티올화 독소루비신의 농도에 변화에 따른 합성된 DOX/azide@AuNP 0.76 pmol에서의 표면에 부착된 DOX의 정량 그래프이며, 이와 함께 상기 합성된 DOX가 부착된 AuNP의 SEM 사진을 함께 나타내었다. FIG. 2C is a graph of quantitation of surface-attached DOX at 0.76 pmol of synthesized DOX / azide @ AuNP according to the concentration of thiolated doxorubicin added to the AuNP, and SEM photographs of the synthesized DOX- Respectively.

도 2c의 SEM 사진에 따르면, AuNP의 표면이 DOX가 결합됨에 따라 거칠어지는 것으로 확인되었고, DOX의 결합량이 2237.2 mol/mol 인 것으로 확인되었다. According to the SEM photograph of FIG. 2C, it was confirmed that the surface of the AuNP became rough as the DOX was bonded, and the binding amount of DOX was found to be 2237.2 mol / mol.

합성된 DOX@AuNP의 DTT 환경 하에서 DOX가 AuNP에서 분리되는지 여부를 확인하기 위해, AuNP(1, blue), DOX@AuNP(1*, sky blue), 및 10 mM의 DTT 존재 하에서의 DOX@AuNP(1**, dark blue)을 Raman scattering으로 분석(A: 785 nm의 레이저 사용, B: 633 nm의 레이저 사용)하였으며, 그 결과를 도 2d에 나타내었다. AuNP (1, blue), DOX @ AuNP (1 *, sky blue), and DOX @ AuNP (1 *, blue blue) in the presence of 10 mM DTT to confirm whether the DOX was isolated from the AuNP under the DTT environment of synthesized DOX @ AuNP 1 **, dark blue) were analyzed by Raman scattering (A: 785 nm laser, B: 633 nm laser). The results are shown in FIG.

도 2d에 따르면, DOX@AuNP의 Raman 스펙트럼에서는 감춰져 있던 3200-3400 cm-1의 피크가 DTT 존재 하에서는 다시 나타나는 것으로 보아 DTT 존재 하에서는 DOX@AuNP로부터 DOX의 방출이 잘 이루어진 것으로 확인되었다. 방출된 용액을 484 nm에서 DOX의 흡광을 측정하여 정량한 결과, 약 77.5%의 DOX가 AuNP로부터 방출된 것으로 확인되었다.According to Fig. 2d, the peak of 3200-3400 cm-1 hidden in the Raman spectrum of DOX @ AuNP appears again in the presence of DTT, confirming that DOX was successfully released from DOX @ AuNP in the presence of DTT. The released solution was quantitatively determined by measuring the absorption of DOX at 484 nm, and it was confirmed that about 77.5% of DOX was released from AuNP.

실시예 2: 알킨-MMP@Qdot 합성Example 2 Synthesis of Alkyne-MMP @ Qdot

알킨-MMP@Qdot을 합성하기 위하여 MMP-2-분해 가능한 펩티드인 Asp-Gly-Phe-Leu-Gly-Val-Cys와 C₃알킨-PEG-MAL을 순서대로 아민기가 노출된 Qdot (Trilite^TM Yellow, Crystalplex Corp.) 표면에 연결시켰다. 구체적으로는 0.7 mg의 MMP-분해가능 펩티드의 카르복실산기를 EDC, sulfo-NHS와 함께 반응하여 활성화시켜 아민기가 노출된 Qdot과 상온에서 2 시간동안 반응시켜 MMP@Qdot를 형성시켰다. 반응하지 않은 물질들을 투석막으로 제거하고, 5.0 mg의 MMP@Qdot을 1.2 mg의 알킨-PEG-MAL과 실온에서 12 시간동안 반응시키고 반응하지 않은 물질을 투석막으로 제거하여 알킨-MMP@Qdot을 합성하였다. Alkynyl -MMP @ a to synthesize 2- Qdot MMP-cleavable peptide is Asp-Gly-Phe-Leu- Gly-Val-Cys and C ₃ alkynyl -PEG-MAL the order amine groups exposed Qdot ^(TM Yellow Trilite , Crystalplex Corp.). Specifically, a carboxylic acid group of 0.7 mg of MMP-degradable peptide was reacted with EDC and sulfo-NHS to activate Qdot with an amine group at room temperature for 2 hours to form MMP @ Qdot. Unreacted materials were removed by dialysis membrane and 5.0 mg of MMP @ Qdot was reacted with 1.2 mg of alkyne-PEG-MAL at room temperature for 12 hours, and unreacted material was removed by dialysis to synthesize alkyne-MMP @ Qdot .

알킨-MMP@Qdot를 합성의 반응 모식도를 도 1b에 나타내었다. The reaction scheme of synthesizing alkyne-MMP @ Qdot is shown in FIG.

Alkyne-MMP@Qdot의 알킨기를 532nm의 레이저를 사용하여 Raman scattering으로 분석하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다. Alkyne-MMP @ Qdot alkyne groups were analyzed by Raman scattering using a 532 nm laser. The results are shown in Fig.

도 3a는 Alkyne-MMP@Qdot (1, blue)와 Qdot (2, black)의 Raman 스펙트럼이다. 도 3a에 따르면, 알킨기로 인한 특정 피크인 2400 cm-1에서 피크가 검출되어, 알킨의 연결이 확인되었다. 3A is a Raman spectrum of Alkyne-MMP @ Qdot (1, blue) and Qdot (2, black). According to Fig. 3A, a peak was detected at a specific peak of 2,400 cm &lt; -1 &gt; due to the alkyne group, and the linkage of the alkyne was confirmed.

또한, 상기 Qdot, MMP@Qdot, Alkyne-MMP@Qdot의 형광 이미지를 측정하였다. 티올에 반응하는 Alexa Fluor (Alexa Fluor^® 546 Maleimide, Invitrogen Corp.) 또는 알킨에 반응하는 Alexa Fluor (Alexa Fluor^® 555 Azide, Invitrogen Corp.)를 각각의 Qdot와 반응하여 MMP-cleavable peptide와 일킨기를 나타내도록 하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다. Further, fluorescence images of Qdot, MMP @ Qdot and Alkyne-MMP @ Qdot were measured. Alexa Fluor (Alexa Fluor ^® 546 Maleimide, Invitrogen Corp.) or Alexa Fluor (Alexa Fluor ^® 555 Azide, Invitrogen Corp.) in reaction with thiol reacted with each Qdot to produce MMP - cleavable peptides Respectively. The results are shown in FIG. 3B.

도 3b는 Qdot, MMP@Qdot, Alkyne-MMP@Qdot를 티올에 반응하는 형광 또는 알킨에 반응하는 형광과 반응시킨 후 측정한 형광이미지이다. 도 3b에 따르면, MMP@Qdot과 Alkyne-MMP@Qdot의 용액에서 각각 thiol에 반응하는 형광물질과 alkyne에 반응하는 형광물질이 연결되어 형광을 나타낸 것으로 보아 MMP-분해 가능 펩타이드 및 Alkyne이 Qdot 표면에 잘 결합된 것으로 확인되었다.
FIG. 3B is a fluorescence image obtained by reacting Qdot, MMP @ Qdot, Alkyne-MMP @ Qdot with fluorescence reacting with thiol or fluorescence reacting with alkyne. According to FIG. 3B, fluorescence reacting with thiol and fluorescence reacting with alkyne in the solution of MMP @ Qdot and Alkyne-MMP @ Qdot, respectively, showed fluorescence, indicating that MMP-degradable peptide and Alkyne bind to Qdot surface It was confirmed that they were well combined.

실시예 3: DOX/아자이드@AuNP 및 알킨-MMP@Qdot로 이루어진 나노응집체의 응집 및 붕괴Example 3: Agglomeration and collapse of nano-aggregates composed of DOX / azide @ AuNP and alkyne-MMP @ Qdot

DOX/azide@AuNP와 Alkyne-MMP@Qdot의 입자들을 나노응집체로 응집하기 위하여 클릭화학 반응을 수행하였다. TBTA, (+)-소듐 L-아스코르베이트와 CuSO₄를 DOX/azide@AuNP, 알킨-MMP@Qdot와 함께 처리하여 3 시간동안 반응시켜 나노클러스터를 형성시켰다(molar ratio of DOX/azide@AuNP: Alkyne-MMP@Qdot: TBTA: (+)-sodium L-ascorbate: CuSO₄=1:100:100:1,000:100). 형성된 나노응집체에 2.8 nM의 MMP-2를 처리하여 3 시간동안 반응시켜 나노응집체를 작은 단위의 나노입자로 붕괴시켰다. DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot were agglomerated into nano-aggregates. The molar ratio of DOX / azide @ AuNP (+) - sodium L-ascorbate and CuSO ₄ were treated with DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot for 3 hours to form a nanocluster : Alkyne-MMP @ Qdot: TBTA : (+) - sodium L-ascorbate: CuSO 4 = 1: 100: 100: 1,000: 100). The formed nano-aggregates were treated with 2.8 nM of MMP-2 and reacted for 3 hours to disrupt the nano-aggregates into small-sized nanoparticles.

DOX/azide@AuNP 및 알킨-MMP@Qdot의 나노응집체가 클릭화학 반응에 의해 합성되고(a), MMP-2에 의해 붕괴되고(b), 환원 조건 하에서 AuNP로부터 DOX가 분리(c)되는 반응 모식도를 도 1c에 나타내었다.
DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot were synthesized by click chemistry and collapsed by (a) MMP-2 (b) and (c) separation of DOX from AuNP under reducing conditions A schematic diagram is shown in Fig. 1C.

나노응집체의 응집과 붕괴 과정은 시간단위로 DLS를 이용하여 그 크기를 측정하였으며, 응집 및 붕괴된 나노응집체의 모양은 TEM을 사용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.The agglomeration and collapse process of nano - aggregates were measured by DLS in time units. The shape of agglomerated and collapsed nano - aggregates was observed by TEM. The results are shown in Figs.

도 4a는 실온에서 3 시간동안 반응하면서 변화되는 나노응집체의 크기를 나타낸 그래프로서, AuNP(CuSO4(+))(●), azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(+))(△), DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(-))(▽), DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot (CuSO₄(+))(○)의 반응시 시간의 변화에 따른 응집체의 크기를 나타낸 그래프이다.FIG. 4A is a graph showing the sizes of nanoproducts changed during 3 hours of reaction at room temperature. The graphs of AuNP (CuSO ₄ (+)), azide @ AuNP and Alkyne-MMP Qdot (CuSO ₄ ), DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot (CuSO ₄ (-)) (∇), DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot (CuSO ₄ Fig. 3 is a graph showing the size of agglomerates according to changes. Fig.

도 4b는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체의 ESI-TEM 과 IVIS로 관찰된 Elemental mapping 이미지와 Qdot 형광 이미지(삽입 이미지)이다. FIG. 4B is an elemental mapping image and Qdot fluorescence image (inset image) observed with ESI-TEM and IVIS of nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ in DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot.

도 4a 및 4b에 따르면, DOX/azide@AuNP와 Alkyne-MMP@Qdot를 구리 촉매 하에서 azide기와 알킨기 간의 클릭화학 반응을 이용하여 반응시켜 나노응집체를 제작한 결과, AuNP 표면에 결합된 DOX의 유무에 관계없이 약 750 nm 크기의 나노응집체가 형성하는 것으로 확인되었다. 반면, 구리 촉매가 없는 조건 하에서는 나노응집체를 형성하지 못하여 그 크기가 약 60nm를 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, DOX/azide@AuNP와 Alkyne-MMP@Qdot가 화학요법제의 소수성 성질과 같은 다른 원동력으로 나노응집체를 형성하는 것이 아니라, 클릭화학 반응을 통해 나노응집체가 형성되고, 그 크기가 약 750 nm 정도인 것으로 확인되었다. 4A and 4B, nano-agglutinates were formed by reacting DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot using a click chemistry between an azide group and an alkyne group under a copper catalyst. As a result, the presence or absence of DOX It was confirmed that nano aggregates having a size of about 750 nm were formed. On the other hand, under the conditions without copper catalyst, it was found that the size was maintained at about 60 nm due to the failure to form nano-aggregates. Thus, DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot do not form nano-aggregates with other forces such as the hydrophobic nature of the chemotherapeutic agent, but they form nano-aggregates through click chemistry, Respectively.

도 5a는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재(●)하에서 또는 MMP-2의 부존재(○)하에서 실온에서 3 시간동안 반응하면서 변화되는 나노응집체의 크기를 나타낸 그래프이다. Figure 5a shows the reaction of nano-aggregates produced in the presence of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot in the presence of CuSO ₄ under room temperature (~) or without MMP-2 (○) at room temperature for 3 hours The size of the nano-agglomerates being varied.

도 5b는 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체의 MMP-2 존재 하에서 붕괴된 나노응집체의 TEM-elemental mapping 이미지와 Qdot 형광 이미지(삽입 이미지)이다. 5B is a TEM-elemental mapping image and Qdot fluorescence image (inset image) of collapsed nano-aggregates in the presence of nano-aggregate MMP-2 produced in the presence of CuSO ₄ of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot.

도 5a에 따르면, DLS를 통하여 크기를 확인해 본 발명의 일 실시예에 따른 나노응집체는 MMP-2를 처리하지 않았을 경우, 나노응집체의의 크기를 유지하였고, MMP-2를 처리하였을 경우 약 220nm의 크기로 그 크기가 감소하는 것으로 관찰되는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 나노응집체는 MMP-2의 처리에 의해 붕괴되는 것으로 확인되었으며 이는 도 5b로부터 더욱 뒷받침된다. 이러한 나노응집체의 붕괴는 MMP-2를 처리하였을 때 Qdot의 표면에 연결된 MMP-분해가능 펩티드가 끊어져서, 나노응집체가 작은 단위의 나노입자로 붕괴되기 때문이다. According to FIG. 5A, the size of the nano-aggregate according to one embodiment of the present invention was confirmed by DLS. When the MMP-2 was not treated, the size of the nano-aggregate was maintained. When MMP-2 was treated, And the size is observed to decrease in size. Therefore, it was confirmed that the nano-aggregates were disrupted by the treatment of MMP-2, which is further supported by Fig. 5b. This disruption of the nano-aggregates is due to the breakdown of the MMP-degradable peptides linked to the surface of Qdot when treated with MMP-2, resulting in the collapse of the nano-aggregates into smaller nanoparticles.

도 4b 및 5b에 따르면, IVIS 통하여 Qdot의 형광을 490nm에서 관찰한 결과, 나노응집체가 형성되었을 때 Qdot의 형광이 감소하고 나노응집체가 붕괴되었을 때 Qdot의 형광이 다시 나타나는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 나노응집체를 형성할 경우 Qdot과 DOX의 거리가 가까워져 FRET작용으로 인하여 Qdot의 형광이 DOX의 흡광으로 작용하여 Qdot의 형광이 나타나지 않게 되는 반면, 나노응집체가 붕괴되었을 경우 Qdot과 DOX의 거리가 다시 멀어져 Qdot의 형광이 다시 나타나게 되는 것으로 해석될 수 있으며, 본 발명에 따른 나노응집체는 FRET이 잘 일어나는 것을 확인할 수 있다.
According to Figures 4b and 5b, Qdot fluorescence through IVIS was observed at 490 nm, indicating that fluorescence of Qdot was reduced when nano-aggregates were formed and fluorescence of Qdot was reappearing when nano-aggregates were collapsed. These results indicate that when the nano-aggregates are formed, the distance between Qdot and DOX becomes close to each other. Due to the FRET action, fluorescence of Qdot acts as absorbance of DOX and fluorescence of Qdot does not appear. On the contrary, It can be interpreted that the fluorescence of Qdot reappears due to the distance away, and the nano-aggregates according to the present invention can confirm that the FRET occurs well.

실시예 4: 세포 내로 유입된 나노응집체의 정량Example 4: Quantification of nano-aggregates introduced into cells

NIH3T3 세포에 나노응집체를 처리하여 세포 내로 들어간 나노응집체의 양을 측정하기 위하여 5x10⁴ cells/ml의 농도의 세포에, 상기 실시예 3에서와 같이 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 각각 처리하여 37℃에서 6 시간동안 배양하였다. 배양한 세포를 PBS로 2 회 워싱 후, 3.0%의 HCl용액 5 ml에 분해 후 ICP-OES를 통하여 Au의 원소를 분석하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. In order to measure the amount of nano-aggregates entering the cells by treating the nano-aggregates with NIH3T3 cells, cells at a concentration of 5 x 10 ⁴ cells / ml were infected with DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot CuSO ₄ were treated in the presence or absence of MMP-2 and cultured at 37 ° C for 6 hours, respectively. The cultured cells were washed twice with PBS, and then decomposed into 5 ml of 3.0% HCl solution. The elements of Au were analyzed through ICP-OES. The results are shown in Fig.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 유입된 Au 함량을 정량한 결과를 나노응집체 중의 AuNP의 농도의 변화에 따라 나타낸 그래프이다. FIG. 6 is a graph comparing the amount of Au introduced into NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP-2 in the presence of CuSO ₄ in DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot according to an embodiment of the present invention And the results are shown in accordance with a change in the concentration of AuNP in the nano-aggregate.

도 6에 따르면, MMP-2를 처리하지 않은 샘플의 경우 나노응집체가 세포로 유입되지 않아서 Au 원소가 측정되지 않았으며 MMP-2를 처리한 샘플의 경우 붕괴된 나노응집체가 세포로 유입되어 Au 원소가 검출되었고 그 양이 처리된 나노응집체의 양에 비례하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 나노응집체는 MMP-2에 의해 붕괴되어 그 크기가 작아져야만 비로소 세포 내로 유입된다는 것을 알 수 있다.According to FIG. 6, in the case of the sample not treated with MMP-2, the nano-aggregate did not flow into the cell and the Au element was not measured. In the case of the sample treated with MMP-2, the collapsed nano- Was detected and its amount was found to be proportional to the amount of treated nanoaggregate. From these results, it can be seen that the nano-aggregates according to the present invention are not destroyed by MMP-2 and are reduced in size before they are introduced into cells.

실시예 5: 세포 내로 유입된 나노입자의 관찰Example 5: Observation of nanoparticles introduced into cells

Multi-photon CLSM을 통하여 세포 내로 유입된 나노응집체를 관찰하였다. NIH3T3 세포를 커버글라스 위에 1x10⁵ cells/ml의 농도로 배양 후, 2.8 nM의 MMP-2의 부존재 및 또는 존재 하에서의 나노응집체를 AuNP 기준 30 ug/ml의 농도로 각각 처리하여 1.5 시간동안 배양하였다. 배양한 세포를 2.5%의 포름알데히드 용액으로 40 분동안 반응시켜 고정 후 관찰하였다. 여기 파장 800 nm로 세포 내로 들어간 응집체를 관찰하였다. DOX의 형광이 약하여 같은 파장의 흡광을 가지는 형광물질인 ATTO(티올화 ATTO 488, Sigma-aldrich Corp.)를 대신 사용하여 실험하기도 하였다. 참고로 DIC(Differential interference contrast) 이미지도 함께 관찰하였다. Multi-photon CLSMs were used to observe the nano-aggregates introduced into the cells. NIH3T3 cells were cultured on cover glasses at a concentration of 1 × 10 ⁵ cells / ml, treated with 2.8 nM MMP-2 absent or nano-aggregates in the presence or absence of AuNP at a concentration of 30 μg / ml and incubated for 1.5 hours. Cultured cells were fixed with 2.5% formaldehyde solution for 40 min. The agglutinates that entered the cells at an excitation wavelength of 800 nm were observed. ATTO (thiolated ATTO 488, Sigma-aldrich Corp.), which is a fluorescent material having a weak fluorescence of DOX and having an absorption at the same wavelength, was used instead. For reference, a differential interference contrast (DIC) image was also observed.

그 결과를 도 7에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 처리하여 1.5 시간 배양한 후 세포 내로 유입된 나노응집체의 Multi-photon CLSM 이미지이다. FIG. 7 shows that nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ of DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot according to an embodiment of the present invention were treated with NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP-2 and incubated for 1.5 hours This is a multi-photon CLSM image of nano-agglutinates introduced into posterior cells.

도 7에 따르면, multi-photon CLSM을 통하여 나노응집체가 MMP-2의 존재 하에서 세포로 유입되는 것으로 확인되었다. 나노응집체의 경우 그 크기가 1㎛에 육박하여 세포 내로의 유입이 어려워 세포에서 관찰이 어려운 것으로 확인되었다. 반면, 붕괴된 나노응집체의 경우 그 크기가 세포로의 유입이 가능한 크기여서 세포내에서 AuNP, Qdot, 및 ATTO의 형광이 잘 관찰되는 것으로 확인되었다. 특히, ATTO의 경우 세포내의 GSH로 인하여 ATTO가 방출되어 그 형광이 세포질에서 나타나는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로부터, 붕괴되지 않은 나노응집체의 경우 세포로의 유입이 어렵고 MMP-2에 의해 붕괴된 나노응집체의 경우 세포로 잘 유입되는 것으로 확인되므로, 나노응집체는 MMP-2를 거의 발현하지 않는 정상세포로의 유입이 어렵고 MMP-2를 과발현하는 암세포 주변에서는 붕괴되어 암세포로 유입될 수 있을 것으로 기대된다.
7, it was confirmed that nano-aggregates were introduced into cells through the multi-photon CLSM in the presence of MMP-2. In the case of nano - aggregates, its size was close to 1 ㎛ and it was confirmed that it was difficult to observe in cells because it was difficult to flow into cells. On the other hand, the size of collapsed nano - aggregates was large enough to enter into the cells, indicating that AuNP, Qdot, and ATTO fluorescence were well observed in the cells. In particular, it was confirmed that ATTO was released due to GSH in the cells, and the fluorescence appeared in the cytoplasm. From these results, it is confirmed that the undifferentiated nano-aggregates are difficult to infiltrate into the cells and that the nano-aggregates collapsed by MMP-2 flow well into the cells. Therefore, And MMP-2 overexpression is expected to collapse in the vicinity of cancer cells and to enter cancer cells.

실시예 6: Live-dead assayExample 6: Live-dead assay

나노응집체의 독성을 확인하기 위하여 AuNP 및 Qdot의 혼합용액, 상기 실시예 3에서의 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot 나노응집체를 MMP-2의 부재 또는 존재 하에서 각각 NIH3T3 세포에 처리하였다. To confirm the toxicity of the nano-agglutinates, a mixed solution of AuNP and Qdot, DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot nano-aggregates in Example 3 were treated with NIH3T3 cells in the absence or presence of MMP-2, respectively.

1x10⁵ cells/ml의 농도의 NIH3T3 세포에 나노응집체를 AuNP 기준 186.5 ug/ml의 농도로 혈청-프리 배지 중에서 각각 처리하여 6 시간동안 배양하였다. 6 시간 후 배양된 세포를 혈청이 포함된 배지로 12 시간동안 추가 배양시켰다. 배양된 세포를 1.0 %의 포름알데히드 용액에 고정 후 live-dead assay kit를 통하여 염색 후 형광 현미경을 통하여 독성을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. The nano-aggregates were cultured in NIH3T3 cells at a concentration of 1 × 10 ⁵ cells / ml in a serum-free medium at a concentration of 186.5 μg / ml based on AuNP, respectively, for 6 hours. After 6 hours, the cultured cells were further incubated with serum-containing medium for 12 hours. The cultured cells were fixed in 1.0% formaldehyde solution, stained with live-dead assay kit, and then confirmed by fluorescence microscopy. The results are shown in Fig.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 DOX/azide@AuNP 및 Alkyne-MMP@Qdot의 CuSO₄의 존재 하에서 생성된 나노응집체를 MMP-2의 존재 또는 부존재 하에서 NIH3T3 세포에 처리하여 배양 후 1.0 %의 포름알데히드 용액에 고정 후 live-dead assay kit를 통하여 염색 후 형광 현미경을 통해 관찰한 결과를 촬영한 사진이다. FIG. 8 is a graph showing the effect of the nano-aggregates produced in the presence of CuSO ₄ on DOX / azide @ AuNP and Alkyne-MMP @ Qdot according to an embodiment of the present invention on NIH3T3 cells treated with NIH3T3 cells in the presence or absence of MMP- Of formaldehyde solution and then stained with live-dead assay kit and observed with fluorescence microscope.

도 8에 따르면, AuNP, MMP-2를 처리하지 않은 나노응집체, MMP-2를 처리한 나노응집체, 및 대조군의 샘플에서 각각 1.0±1.7%, 7.1±4.7%, 93.2±3.4% 및 0%의 죽은세포 %가 측정되었다. 이러한 결과로부터 AuNP 및 나노응집체 자체의 독성은 낮지만, 나노응집체가 MMP-2로 인하여 붕괴될 경우 나노입자가 세포 내로 유입되어 DOX를 방출하여 독성이 높게 나타내는 것임을 알 수 있다. According to FIG. 8, the values of 1.0 ± 1.7%, 7.1 ± 4.7%, 93.2 ± 3.4% and 0% in the samples of AuNP, the nano-aggregate without MMP-2, the nano-aggregate with MMP- % Of dead cells were measured. From these results, it can be seen that the toxicity of AuNP and nano-aggregate itself is low, but when the nano-aggregate collapses due to MMP-2, the nanoparticles enter the cell and release DOX, indicating high toxicity.

Claims (19)

화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속나노입자; 및
표면에 아미노기 도입된 양자점(quantum dot, QD)에 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)에 의해 분해가능한 펩티드가 펩티드 결합된 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기가 공유결합된 양자점을 포함하며,
상기 금속 나노입자 상의 아지도기와 양자점 상의 알킨기가 서로 클릭화학(click chemistry) 반응에 의해 고리화 반응하여 1,2,3-트리아졸을 형성함으로써, 상기 나노입자 및 양자점이 서로 응집하여 형성된 나노응집체로서,
상기 화학요법제는 독소루비신, 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 또는 이들의 임의의 조합이고,
상기 금속 나노입자는 백금, 금, 은, 또는 철의 나노입자이고,
상기 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드는 Gly-Leu 펩티드 본드를 포함하는 5 내지 10 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 나노응집체. Metal nanoparticles covalently bonded to the surface of chemotherapeutic agents and aziridine metal nanoparticles; And
A quantum dot (QD) in which an amino group is introduced on the surface thereof, a peptide capable of being degraded by MMP-2 (matrix metalloproteinase-2) is peptide-bonded and an alkyne group is covalently bonded to the amino group of the peptide,
The azido groups on the metal nanoparticles and the alkyne groups on the quantum dots are cyclized by a click chemistry reaction to form 1,2,3-triazole, whereby the nanoparticles formed by aggregation of the nanoparticles and the quantum dots, as,
The chemotherapeutic agent may be selected from the group consisting of doxorubicin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, dactinomycin, daunorubicin, ), Idarubicin, mitoxantron, plicamycin, mitomycin, or any combination thereof,
The metal nanoparticles are nanoparticles of platinum, gold, silver, or iron,
Wherein the peptide degradable by MMP-2 is a peptide consisting of 5 to 10 amino acids comprising a Gly-Leu peptide bond. 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 양자점은 코어타입 QD(core-type QD), 코어-쉘 QD(core-shell QD), 또는 알로이드 QD(alloyed QD)인 나노응집체. The nanoglobulin of claim 1, wherein the quantum dot is a core-type QD, a core-shell QD, or an alloyed QD. 제 1 항에 있어서, 상기 화학요법제는 독소루비신이고, 상기 양자점은 Trilite^TM Yellow, Qdot^®565, Qdot^®585, Lumidot^TM 560 또는 Lumidot^TM 590인 나노응집체.The nano-agglutination of claim 1, wherein the chemotherapeutic agent is doxorubicin and the quantum dot is Trilite ^™ Yellow, Qdot ^® 565, Qdot ^® 585, Lumidot ^™ 560 or Lumidot ^™ 590. 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드는 Asp-Gly-Phe-Leu-Gly-Val-Cys인 나노응집체.The nano-aggregate according to claim 1, wherein the peptide capable of degradation by MMP-2 is Asp-Gly-Phe-Leu-Gly-Val-Cys. 제 1 항에 있어서, 상기 알킨기는 C_2-6알킨기인 나노응집체.The nano-aggregate of claim 1, wherein the alkyne group is a C _2-6 alkyne group. 제 1 항에 있어서, 상기 금속 나노입자의 양자점에 대한 몰비는 1: 50~200인 나노응집체.The nano-aggregate according to claim 1, wherein the molar ratio of the metal nanoparticles to the quantum dots is 1: 50-200. 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 나노응집체를 포함하는 항암용 약학 조성물. 9. A pharmaceutical composition for anti-cancer comprising the nano-aggregate according to any one of claims 1, 4, 5, and 7 to 9. 제 10 항에 있어서, 화학요법제로 항암요법을 수행함과 동시에 암의 진행상황을 모니터링할 수 있는 약학 조성물.[Claim 11] The pharmaceutical composition according to claim 10, wherein the chemotherapeutic agent is capable of performing chemotherapy and monitoring progress of the cancer. 제 10 항에 있어서, 주사제인 약학 조성물. 11. The pharmaceutical composition according to claim 10, which is an injection. 금속 나노입자 표면에 아지도기 및 화학요법제를 각각 도입하여, 화학요법제 및 아지도기가 금속 나노입자의 표면에 공유결합된 금속 나노입자를 제조하는 단계;
양자점(quantum dot)에 아미노기를 도입하고, MMP-2에 의해 분해가능한 펩티드를 상기 아미노기와 펩티드 결합시킨 다음, 상기 펩티드의 아미노기에 알킨기를 결합시켜, 펩티드 및 알킨기가 순차적으로 도입된 양자점을 제조하는 단계; 및
상기 양자점 및 금속 나노입자를 구리 촉매 하에서 반응시켜 양자점 상의 알킨기를 금속 나노입자 상의 아자이드와 고리화반응에 의해 1,2,3-트리아졸을 형성시킴으로써 응집체를 형성시키는 단계를 포함하는, 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 나노응집체의 제조방법.Preparing a metal nanoparticle covalently bonded to the surface of the metal nanoparticle by introducing an azido group and a chemotherapeutic agent into the surface of the metal nanoparticle;
Introducing an amino group into a quantum dot, peptidically bonding a peptide degradable by MMP-2 to the amino group, and then bonding an alkyne group to the amino group of the peptide to prepare a quantum dot in which a peptide and an alkyne group are sequentially introduced step; And
Reacting the quantum dot and the metal nanoparticles under a copper catalyst to form an aggregate by forming 1,2,3-triazole by cyclizing an alkyne group on the quantum dot with azide on the metal nanoparticle. 9. A method of producing a nano-agglutinant according to any one of claims 4, 5, and 7 to 9. 제 13 항에 있어서, 상기 금속 나노입자 제조단계에서 금속 나노입자 표면에 아지도기의 도입은, 상기 금속 나노입자는 백금 나노입자이고, 아지도기의 도입은 3-APTS(3-아미노프로필-트리에톡시실란)를 반응시켜 아미노기를 도입한 다음, 4-아지도-L-페닐알라닌과 반응시켜 아지도기를 도입하는 것인 나노응집체의 제조방법.14. The method of claim 13, wherein the introduction of an azido group to the surface of the metal nanoparticles in the step of preparing the metal nanoparticles comprises: introducing an azido group into the 3-APTS (3-aminopropyl- To introduce an amino group, followed by reaction with 4-azido-L-phenylalanine to introduce an azido group. 제 13 항에 있어서, 상기 양자점을 제조하는 단계에서 펩티드의 아미노기에 알킨기를 결합시키는 것은, 펩티드가 도입된 양자점을 알킨-PEG-MAL (α-Alkynyl-ω-Maleimidyl-Poly(ethyleneglycol))과 반응시켜 알킨기를 결합시키는 것인 나노응집체의 제조방법.14. The method according to claim 13, wherein the binding of the alkyne group to the amino group of the peptide in the step of producing the quantum dot is carried out by reacting a quantum dot into which the peptide has been introduced with an alkyne-PEG-MAL (alpha-Alkynyl-omega-Maleimidyl- Wherein the alkynyl group is bonded to the alkyne group. 제 13 항에 있어서, 상기 응집체를 형성시키는 단계에서 상기 구리 촉매는 황산구리(CuSO₄)인 제조방법.The method of claim 13, wherein the copper catalyst in the step of forming the agglomerate manufacturing method of copper sulfate (CuSO _4). 제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 및 제 7 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 나노응집체를 포함하는 암진단용 약학 조성물.9. A pharmaceutical composition for diagnosing cancer, comprising the nano-aggregate according to any one of claims 1, 4, 5, and 7 to 9. 제 17 항에 있어서, 암의 진행상황을 모니터함과 동시에 화학요법제로 항암요법을 수행할 수 있는 것인 약학 조성물.18. The pharmaceutical composition according to claim 17, wherein the chemotherapeutic agent is capable of performing chemotherapy while monitoring the progress of the cancer. 제 17 항에 있어서, 주사제인 약학 조성물. 18. The pharmaceutical composition according to claim 17, which is an injection.

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