KR101544391B1

KR101544391B1 - Preparation method of micro hemisphere array plate, microfluidics chip comprising micro hemisphere array plate and culture method of cell spheroid using the same

Info

Publication number: KR101544391B1
Application number: KR1020130091065A
Authority: KR
Inventors: 오현직; 노다윤; 이상훈
Original assignee: (주) 마이크로핏
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2015-08-13
Also published as: KR20150015242A

Abstract

본 발명은마이크로 반구체어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 이용하여 세포를 3차원적으로 배양하게 되면 상태가 우수한 세포 집합체의 형성이 가능하다. 특히 인체 내의 환경에 보다 유사한 조건으로 세포를 배양하기 때문에 기존에 존재하던 세포 배양 방법들보다 우수한 상태로 세포 집합체를 형성하는 것이 가능하다.
이러한 본 발명을 통해 배양된 세포 집합체는 세포 치료에 직접적으로 쓰일 수 있으며, 인공적으로는 수득하기 어려운 세포를 배양하여 얻는 것이 가능하다. 또한 인체와 유사한 조건을 제공하여 배양하기 때문에 3차원적으로는 뭉쳐지기 어려운 세포의 세포 집합체 형성이 가능하다. 또한 두 가지 이상의 세포를 공동 배양하는 것이 가능하고, 이때에도 인체와 유사한 조건으로 배양하기 때문에 우수한 품질의 세포 집합체 형성이 가능하다. 결구 이러한 본 발명을 통해 약물 스크리닝이나 세포 독성, 그리고 각종의 테스트에 획기적 발전을 달성 할 수 있다.
The present invention relates to a method of manufacturing a microsphere array plate, a microfluidic device including a microsphere array plate, and a method of culturing cell aggregates using the same.
When the cells are three-dimensionally cultured using the microfluidic array plate according to the present invention, the microfluidic device including the microsphere array plate, and the method of culturing the cell aggregate using the microfluidic array plate, Lt; / RTI > In particular, since the cells are cultured under similar conditions to the environment in the human body, it is possible to form the cell aggregate in a better state than the existing cell culture methods.
The cell aggregate cultured through the present invention can be directly used for cell therapy and can be obtained by culturing cells that are difficult to obtain artificially. In addition, since it is cultured by providing conditions similar to human body, it is possible to form cell aggregates of cells which are difficult to be aggregated in three dimensions. In addition, it is possible to co-culture two or more cells, and at this time, it is possible to form a cell cluster of excellent quality because it is cultured under conditions similar to human body. CONCLUSION Through the present invention, dramatic improvements in drug screening, cytotoxicity, and various tests can be achieved.

Description

마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법{Preparation method of micro hemisphere array plate, microfluidics chip comprising micro hemisphere array plate and culture method of cell spheroid using the same}The present invention relates to a microfluidic device, a microfluidic device, a microfluidic device, a microfluidic device, a microfluidic device, and a method for manufacturing a microfluidic device. using the same}

본 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법에 관한 것이다.
A microfluidic device including the microfluidic array plate, and a method for culturing the cell aggregate using the microfluidic device.

인체 내에 있는 세포들은 주변에 있는 세포 및 세포 외 기질과의 상호작용을 통해 3차원 모양으로 집합체를 형성하고 있다. 이러한 3차원 모양은 생화학적으로, 기계적으로 세포 생리에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 특히 3차원 모양으로 형성된 세포의 집합체(cell aggregation)는 일반적인 조직을 구성하는 세포나 장기를 이루는 세포, 암세포 및 줄기세포에 대한 연구에서 임상적으로 신약개발을 위해서 또는 줄기세포를 이용한 분화에 대한 연구에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.Cells in the body form aggregates in three dimensions through interaction with surrounding cells and extracellular matrix. These three - dimensional shapes play a very important role in biochemistry and mechanically in cell physiology. Particularly, the cell aggregation formed in a three-dimensional shape can be used for the clinical development of new drugs or for the differentiation using stem cells in the study on cells constituting general tissues, cells constituting organs, cancer cells and stem cells And is playing a very important role in

그러나 일반적으로 세포를 3차원 모양으로 배양하는 것은 매우 어렵고, 특히 human primary cell을 3차원적으로 배양한다는 것은 더욱 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 문제로 인해 일반적으로는 2차원(2D)적으로 배양하여 약물 스크리닝이나 각종 실험에 사용하고 있다. 그러나 2차원적 배양을 할 경우 실제 생체 내에서와는 매우 다른 환경에 처해지기 때문에, 실험에 쓰일 세포가 가지고 있는 세포 자체의 특성이나 세포의 조직 특이성을 잃어버리고, 결과적으로는 원하는 실험 결과를 제대로 얻기가 매우 어렵다는 문제점이 있다. However, in general, it is very difficult to cultivate the cells in a three-dimensional shape. In particular, it is more difficult to cultivate human primary cells three-dimensionally. Due to these problems, it is generally cultured in 2D (2D) and used for drug screening and various experiments. However, when the two-dimensional culture is carried out, it is in a very different environment from that in the living body. Therefore, the characteristics of the cell itself or the tissue specificity of the cell used in the experiment are lost and as a result, There is a problem that it is very difficult.

그러므로 in vitro 상에서 세포를 3차원(3D) 모양으로 배양하는 것이 매우 중요하고 이에 대한 많은 연구들이 현재 진행 중에 있다. 이러한 3차원 배양방법으로 haning-drop culture, nonadhesive surface, spinner flask, fotary system 등이 있으나, 이들은 배양하는 방법이 간단하지 않고 대량 생산이 어려우며, 세포의 모양이나 크기 또는 개수를 적절하게 조절하기 어렵다는 문제점이 있다. Therefore, it is very important to cultivate cells in 3D (3D) shape in vitro, and many studies on this are underway. These three-dimensional culture methods include haning-drop culture, nonadhesive surface, spinner flask, and fotary system. However, these methods are not simple and difficult to mass-produce, and it is difficult to appropriately control the shape, .

이러한 문제점을 개선하기 위한 선행기술문헌으로 표면장력을 이용한 반구형 마이크로웰의 제조 및 이를 이용한 세포 집합체의 형성에 관한 대한민국 공개특허 제10-2013-0013537호(특허문헌 1)가 개시되어 있다. 하지만 이러한 특허문헌 1에서는 마이크로 반구체를 정교하게 제작하는 방법이 아니어서 완벽한 반구형을 이룰 수가 없기 때문에 세포 집합체가 형성되어도 수집하는 과정에서 마이크로웰에서의 분리가 완벽하지 못할 뿐만 아니라 약간의 충격에도 세포들이 마이크로웰 밖으로 분리된다는 점, 그리고 세포 및 세포 집합체의 모양이 파괴된 채로 수집된다는 문제점이 있었다. 또한 인체 내의 유체 흐름과 비슷한 환경을 조성하지 못한 채 배양하기 때문에 형성되는 세포 집합체의 상태가 우수하지 못하다는 문제점이 있다.
Korean Patent Laid-Open No. 10-2013-0013537 (Patent Document 1) discloses a prior art document for the improvement of these problems on the manufacture of hemispherical microwells using surface tension and the formation of cell aggregates using the same. However, in Patent Document 1, since the micro hemisphere is not a precise manufacturing method, it can not achieve a perfect hemispherical shape. Therefore, even if a cell aggregate is formed, separation in microwell is not perfect in the collecting process, Are separated from the microwell, and the shape of the cell and cell aggregate is collected while being destroyed. In addition, since the cells are cultured without forming an environment similar to the fluid flow in the human body, the state of the formed cell aggregate is not excellent.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2013-0013537호Patent Document 1. Korean Patent Publication No. 10-2013-0013537

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 세포 집합체가 보다 좋은 상태로 집합체를 형성할 수 있게 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트 및 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자를 제공하는 것이다. 특히 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자의 경우 일정한 유량의 흐름이 있어 인체 내의 환경과 유사한 환경을 조성하고, 이를 통해 세포를 배양함으로써 보다 우수한 세포 집합체를 형성하고 뿐만 아니라 기존에 세포의 집합체를 형성하기 어려운 초대세포들의 집합체 형성을 제공하는 것이다.
SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a microfluidic device and a microfluidic device, including a microsphere array plate and a microsphere array plate, which enable a cell aggregate to form an aggregate in a better state. . In particular, in the case of a microfluidic device including a microsphere array plate, there is a flow of a constant flow to form an environment similar to the environment in the human body, thereby culturing the cells to form a better cell aggregate, Lt; RTI ID = 0.0 > cell < / RTI >

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법은According to an aspect of the present invention, there is provided a method of manufacturing a microsphere array plate,

1) 실리콘 기판 위에 감광성 포토레지스트를 부착하는 단계;1) attaching a photosensitive photoresist on a silicon substrate;

2) 스핀 코팅을 통해 상기 감광성 포토레지스트의 높이를 조절하는 단계;2) adjusting the height of the photosensitive photoresist through spin coating;

3) 오버 큐어링을 통해 상기 포토레지스트를 반구형으로 식각하는 단계;3) hemispherically etching the photoresist through overcuring;

4) 상기 3)단계 이후 식각된 표면에 1차 금속층을 증착하는 단계;4) depositing a primary metal layer on the etched surface after step 3);

5) 상기 1차 금속층의 증착 후 그 위에 2차 금속층을 층착하는 단계;5) depositing a secondary metal layer on the primary metal layer after deposition;

6) 상기 2차 금속층 위에 금형코어층을 형성하는 단계;6) forming a mold core layer on the secondary metal layer;

7) 상기 6)단계 이후 상기 금형코어층의 상면을 평탄화 시키는 단계;7) planarizing the upper surface of the mold core layer after the step 6);

8) 상기 7)단계 이후 상기 금형코어층을 분리하는 단계;8) separating the mold core layer after step 7);

9) 상기 분리된 금형코어층을 주형으로 하여 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 사출성형하는 단계; 및9) injection molding the microsphere array plate using the separated mold core layer as a mold; And

10) 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 표면에 친수성 또는 소수성을 부여하는 단계;10) imparting hydrophilicity or hydrophobicity to the surface of the microsphere array plate;

를 포함한다.
.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자는A microfluidic device including a microsphere array plate according to another aspect of the present invention includes:

단일 또는 복수의 세포, 세포 배양액을 포함하는 시료가 주입되며, 상기 시료의 주입은 단일 또는 복수개의 채널을 통해 주입되는 시료주입부;A sample injection unit injecting a sample containing a single cell or a plurality of cells, a cell culture liquid, and injecting the sample through a single or a plurality of channels;

상기 시료주입부와 연결되고 시료가 이동하면서 혼합되는 부위로서, 상기 시료의 이동은 단일 또는 복수개의 채널을 통해 이루어지고, 상기 단일 또는 복수개의 채널은 지그재그 형태이며, 상기 단일 또는 복수개의 채널은 피라미드 형태로 복수개의 단계를 통해 반복적으로 이루어지고, 상기 복수개의 단계는 하위 단계로 갈수록 상위 단계 보다 하나 이상의 채널을 더 포함하며, 상기 복수개의 단계를 연결하는 유동채널을 포함하는 시료혼합부; 및Wherein the sample is moved through a single or a plurality of channels, the single or plural channels are in a zigzag shape, and the single or plural channels are connected to the pyramid Wherein the plurality of steps include a flow channel connecting the plurality of steps and including at least one channel higher than the upper step, and the plurality of steps includes a flow channel connecting the plurality of steps. And

상기 시료혼합부와 연결되면서 상기 복수개의 단계 중 최하위 단계를 구성하는 채널과 연결되며, 상기 혼합된 시료 중 단일 또는 혼합된 복수의 세포가 3차원으로 배양되어 세포 집합체를 형성하는 복수의 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 세포 집합체 형성부;A plurality of microspheres, which are connected to the sample mixing unit and are connected to channels constituting the lowest stage among the plurality of steps, and in which a plurality of single or mixed cells in the mixed sample are cultured in three dimensions to form a cell aggregate A cell cluster forming section including an array plate;

로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
.

본 발명에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 이용하여 세포를 3차원적으로 배양하게 되면 상태가 우수한 세포 집합체의 형성이 가능하다. 특히 인체 내의 환경에 보다 유사한 조건으로 세포를 배양하기 때문에 기존에 존재하던 세포 배양 방법들보다 우수한 상태로 세포 집합체를 형성하는 것이 가능하다. 이러한 본 발명을 통해 배양된 세포 집합체는 세포 치료에 직접적으로 쓰일 수 있으며, 인공적으로는 수득하기 어려운 세포를 배양하여 얻는 것이 가능하다. 또한 인체와 유사한 조건을 제공하여 배양하기 때문에 3차원적으로는 뭉쳐지기 어려운 세포의 세포 집합체 형성이 가능하다. 또한 두 가지 이상의 세포를 공동 배양하는 것이 가능하고, 이때에도 인체와 유사한 조건으로 배양하기 때문에 우수한 품질의 세포 집합체 형성이 가능하다. 결국 이러한 본 발명을 통해 약물 스크리닝이나 세포 독성, 그리고 각종의 테스트에 획기적 발전을 달성 할 수 있다.
When the cells are three-dimensionally cultured using the microfluidic array plate according to the present invention, the microfluidic device including the microsphere array plate, and the method of culturing the cell aggregate using the microfluidic array plate, Lt; / RTI > In particular, since the cells are cultured under similar conditions to the environment in the human body, it is possible to form the cell aggregate in a better state than the existing cell culture methods. The cell aggregate cultured through the present invention can be directly used for cell therapy and can be obtained by culturing cells that are difficult to obtain artificially. In addition, since it is cultured by providing conditions similar to human body, it is possible to form cell aggregates of cells which are difficult to be aggregated in three dimensions. In addition, it is possible to co-culture two or more cells, and at this time, it is possible to form a cell cluster of excellent quality because it is cultured under conditions similar to human body. As a result, the present invention can achieve dramatic improvements in drug screening, cytotoxicity, and various tests.

도 1은 실시예 1에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조과정을 도식화한 그림이다.
도 2는 실시예 1에 따라 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 나타내는 사진이다.
도 3은 실시예 1에 따라 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 hADSC를 배양하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 실시예 1에 따라 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 3차원 공동배양을 나타내는 모식도이다.
도 5는 실시예 2에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함한 미세유체소자의 단면도이다.
도 6은 실시예 2에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함한 미세유체소자의 사진이다.
도 7은 실시예 1에 따라 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 세포 집합체를 형성하는 인간 세포의 3차원 배양을 보여주는 사진이다.
도 8은 비교예 1과 실시예 1의 경우 세포 집합체 형성을 비교한 사진이다.
도 9는 비교예 2와 실시예 1의 경우를 종합적으로 비교한 사진이다.
도 10은 실시예 2와 같은 유체의 흐름이 있는 경우와 없는 경우 인간 간세포를 이용한 세포 집합체 형성을 비교한 사진이다.
도 11은 실시예 2와 같은 유체의 흐름이 있는 경우와 없는 경우 human primary hepatocytes를 배양한 결과를 비교한 사진이다.
도 12는 비교예 2와 실시예 2의 경우를 종합적으로 비교한 사진이다.
도 13은 실시예 1에 따라 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 인간 간 세포와 hADSC를 3차원 공동배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 실시예 1에 따라 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 인간 간 세포와 hADSC를 3차원 공동 배양한 경우 기능성 측정 검사 결과를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 15는 실시예 1에 따라 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 3차원 공동 배양된 세포 집합체의 내부를 찍었을 때의 TEM 사진이다.
도 16은 실시예 1에 따라 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통해 3차원 공동 배양된 세포 집합체를 반구로부터 꺼내었을 때 우수한 상태를 나타냄을 보여주는 사진이다.
도 17은 human primary hepatocytes와 hADSC를 2D 상에서 공동 배양한 결과를 나타낸 사진이다.
도 18은 human primary hepatocytes와 hADSC를 2D 상에서 공동 배양한 후 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 human primary hepatocytes와 hADSC를 본 실시예 1의 3D 상에서 공동 배양한 경우 알부민의 분비가 활발함을 보여주는 사진이다.
도 20은 human primary hepatocytes와 hADSC를 2D 및 3D 상에서 공동 배양한 경우를 종합적으로 비교한 사진이다. FIG. 1 is a diagram illustrating a manufacturing process of the microsphere array plate according to the first embodiment. FIG.
2 is a photograph showing a microsphere array plate fabricated according to Example 1. Fig.
FIG. 3 is a schematic view showing a process of culturing hADSCs through a microsphere array plate fabricated according to Example 1. FIG.
FIG. 4 is a schematic view showing a three-dimensional co-culture through a microsphere array plate fabricated according to Example 1. FIG.
5 is a cross-sectional view of a microfluidic device including a microsphere array plate according to a second embodiment.
6 is a photograph of a microfluidic device including a microsphere array plate according to the second embodiment.
FIG. 7 is a photograph showing a three-dimensional culture of human cells forming a cell aggregate through a microsphere array plate fabricated according to Example 1. FIG.
Fig. 8 is a photograph showing cell aggregation formation in Comparative Example 1 and Example 1; Fig.
9 is a photograph comprehensively comparing the cases of Comparative Example 2 and Example 1. Fig.
FIG. 10 is a photograph showing the formation of cell aggregates using human hepatocytes in the case of fluid flow as in Example 2 and in the absence of fluid flow.
FIG. 11 is a photograph showing the results of culturing human primary hepatocytes with and without fluid flow as in Example 2. FIG.
12 is a photograph comprehensively comparing the cases of Comparative Example 2 and Example 2. Fig.
13 is a photograph showing the result of three-dimensional co-culture of human liver cells and hADSCs through a microsphere sphere array plate prepared according to Example 1. Fig.
FIG. 14 is a graph and a photograph showing the result of the functional measurement test when human liver cells and hADSC are three-dimensionally co-cultured through the microsphere sphere array plate prepared according to Example 1. FIG.
FIG. 15 is a TEM photograph of the inside of a three-dimensionally co-cultured cell cluster through a microsphere sphere array plate prepared according to Example 1. FIG.
16 is a photograph showing that a three-dimensional co-cultured cell aggregate is taken out from a hemisphere through a microsphere sphere array plate prepared according to Example 1, and shows excellent state.
17 is a photograph showing the result of co-culturing human primary hepatocytes and hADSC in 2D.
18 is a photograph showing the result of co-culturing human primary hepatocytes and hADSCs in 2D and then staining them.
FIG. 19 is a photograph showing albumin secretion when human primary hepatocytes and hADSCs were co-cultured on 3D in Example 1; FIG.
FIG. 20 is a photograph comprehensively comparing the cases where human primary hepatocytes and hADSC were co-cultured in 2D and 3D.

이에 본 발명자들은 보다 좋은 상태로 세포 집합체를 형성할 수 있으면서 인체와 유사한 환경으로 배양 조건을 제공할 수 있는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법 및 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함한 미세유체소자를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 마이크로 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have developed a microfluidic array plate manufacturing method capable of forming a cell aggregate in a better state while providing culture conditions in an environment similar to a human body, and a microfluidic device including a microsphere array plate As a result of intensive studies, the present inventors have discovered a microfluidic device array plate manufacturing method, a microfluidic device including a microsphere array plate, and a method of culturing a cell aggregate using the same.

구체적으로 본 발명에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법은 Specifically, a method of manufacturing a microsphere array plate according to the present invention includes:

를 포함한다. .

상기 1)단계에서 실리콘 기판은 상기 감광성 포토 레지스트를 부착시키기 용이하다.In the step 1), the silicon substrate is easy to adhere the photosensitive photoresist.

상기 감광성 포토레지스트는 일반적으로 자외선(UV, 350-400 nm)을 노광하면 빛을 받는 부위가 Cross-linked 되어 남는 것은 Negative 계열이고 빛을 받는 부위가 현상되는 것을 positive 계열이라고 지칭하는 것으로서, 식각 후 반구체를 형성하는데 용이하며, Negative와 Positive 두 가지 종류가 모두 포함될 수 있다.The photosensitive photoresist is generally referred to as a positive series in which a light-receiving portion is cross-linked when exposed to ultraviolet light (UV, 350 to 400 nm) is a negative series and a light-receiving portion is developed, It is easy to form a hemisphere, and both negative and positive types can be included.

상기 1)단계에서 부착되는 감광성 포토레지스트는그 길이가 100-1,000 ㎛인 것이 바람직하다. 상기 감광성 포토레지스트의 길이가 100 ㎛ 미만인 경우에는 지름과 깊이가 너무 작아 식각 후 반구체를 형성하기 어려워 바람직하지 않으며, 상기 감광성 포토레지스트의 길이가 1,000 ㎛를 초과하는 경우에는 식각 후의 반구체가 너무 커져 배양되는 세포가 집합체를 형성 및 세포의 본래의 기질을 극대화하기 힘들어 바람직하지 않다. 또한 감광성 포토레지스트의 길이가 상기 범위에 해당하여야 세포 집합체가 최적의 조건으로 우수하게 형성되게 하여 바람직하다. 또한 상기 길이 범위 이내에서 상기 감광성 포토레지스트의 코팅 높이, 온도 조건을 조절하여 반구의 깊이를 조절하는 것이 가능하다. The photosensitive photoresist to be attached in the step 1) preferably has a length of 100-1,000 mu m. When the length of the photosensitive photoresist is less than 100 탆, the diameter and depth are too small to form a hemisphere after etching. If the length of the photosensitive photoresist exceeds 1,000 탆, It is not preferable that the cells to be grown are difficult to aggregate and maximize the original substrate of the cells. Also, the length of the photosensitive photoresist should fall within the above-mentioned range, so that the cell aggregate is formed in an optimum condition to be excellent. It is also possible to adjust the depth of the hemisphere by adjusting the coating height and temperature condition of the photosensitive photoresist within the length range.

또한 상기 2)단계와 같이 스핀 코팅을 실시하게 되면 감광성 포토레지스트의 높이를 조절하는 것이 가능하다.If the spin coating is performed as in step 2), it is possible to control the height of the photosensitive photoresist.

상기 감광성 포토레지스트는 상기 3)단계와 같이 오버 큐어링을 통해 감광성 포토레지스트를 식각하여 반구체를 형성할 수 있다. 이때 시행하는 상기 오버 큐어링은 감광성 포토레지스트에 적합한 온도조건 이상을 가열하게 되면 엣지 부분의 모서리가 라운드 형태로 변하면서 곡면을 이루는 현상이 나타난다. 이렇게 오버 큐어링을 통해 반구체를 형성하게 되면 기존 반구형 마이크로웰 제조방법에 비해 보다 정교한 반구의 형성이 가능하여 세포 집합체를 우수하게 형성할 수 있으며, 배양 후에도 집합체의 상태를 훼손함이 없이 세포 집합체를 마이크로 반구체 어레이 플레이트로부터 분리할 수 있다. The photosensitive photoresist can form a hemisphere by etching the photosensitive photoresist through overcuring as in step 3). In the overcuring performed at this time, when the temperature or more suitable for the photosensitive photoresist is heated, the edges of the edge portions are rounded to form a curved surface. When the hemisphere is formed through the overcuring, the hemispheres can be more precisely formed as compared with the conventional hemispherical microwell manufacturing method, so that the cell aggregate can be formed well, and even after the culturing, Can be separated from the microsphere array plate.

상기 4)단계에서는 식각된 감광성 포토레지스트의 표면에 1차 금속층을 증착하게 되는데, 상기 증착의 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 화학기상증착, 물리기상증착 등의 방법을 사용하여 증착할 수 있다. 상기 증착되는 1차 금속층은 금형코어층을 보다 용이하게 분리하기 위한 것으로서 그 재질은 Cr, Ti, Au, Ni, Cu, Al 및 Fe 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 1차 금속층을 증착하는 높이는 100-500 Å인 것이 바람직한데, 상기 1차 금속층의 높이가 100 Å 미만인 경우 2차 금속층의 박막 접착도를 약하게 하여 2차 금속층을 높게 올리는데 바람직하지 않으며, 상기 1차 금속층의 높이가 500 Å를 초과하는 경우 시드 금속층이 일어나는 필링 현상이 발생하여 바람직하지 않다. In the step 4), the primary metal layer is deposited on the surface of the etched photosensitive photoresist. Although there is no particular limitation on the method of the deposition, the deposition is preferably performed using chemical vapor deposition, physical vapor deposition, can do. Preferably, the primary metal layer to be deposited is one or more selected from the group consisting of Cr, Ti, Au, Ni, Cu, Al, and Fe for easier separation of the mold core layer. When the height of the primary metal layer is less than 100 ANGSTROM, it is not preferable to increase the secondary metal layer by decreasing the degree of adhesion of the secondary metal layer, If the height of the secondary metal layer exceeds 500 ANGSTROM, peeling phenomenon in which the seed metal layer occurs may be undesirable.

상기 5)단계와 같이 1차 금속층의 증착 후 그 위에 2차 금속층을 증착하는 것이 바람직한데, 상기 2차 금속층은 금형코어의 전주도금을 용이하게 하기 위한 위한 것으로서 금형코어와 같은 재질이거나 전기전도성이 우수한 Au, Ag, Pt, Ni 및 Cu로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 1차 금속층과 상기 2차 금속층을 따로 증착하는 이유는 2차 금속층 자체 만으로는 박막 접착도가 떨어지기 때문에 전주도금 과정에서 원하는 높이까지 금형코어를 올리기 어렵기 때문이다. 상기 2차 금속층의 증착 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 화학기상증착, 물리기상증착 등의 방법을 사용하여 증착할 수 있다. 상기 2차 금속층의 증착 높이는 1,000-2,000 Å인 것이 바람직한데, 상기 2차 금속층의 증착 높이가 1,000 Å 미만인 경우에는 박막 자체의 응력이 약해서 도금을 하기에 바람직하지 않으며, 상기 2차 금속층의 높이가 2,000 Å를 초과하는 경우에는 표면의 거칠기(RMS) 값이 높아져서 6)단계에서 금형코어층을 형성하는 데 있어 균일도에 영향을 미칠 수 있으므로 바람직하지 않다. After the deposition of the primary metal layer, it is preferable to deposit the secondary metal layer on the secondary metal layer. The secondary metal layer is for facilitating the electroplating of the metal core, and may be made of the same material as the metal core, It is preferably at least one selected from the group consisting of Au, Ag, Pt, Ni and Cu. The reason for depositing the primary metal layer and the secondary metal layer separately is that it is difficult to raise the mold core up to a desired height in the electroplating process because the secondary metal layer itself deteriorates the thin film adhesion. There is no particular limitation on the method of depositing the secondary metal layer, but the deposition can be preferably performed by chemical vapor deposition, physical vapor deposition, or the like. When the deposition height of the secondary metal layer is less than 1,000 ANGSTROM, the stress of the thin film itself is weak, which is not preferable for plating, and the height of the secondary metal layer is preferably not less than 1,000 ANGSTROM If it exceeds 2,000 A, the surface roughness (RMS) value becomes high, which is undesirable because it may affect the uniformity in forming the mold core layer in step 6).

상기 6)단계에서는 상기 2차 금속층 위에 금형코어층을 형성하게 되는데, 이때 상기 금형코어층을 형성하는 바람직한 방법은 전주도금(Electro-plating)의 방법이 금속층을 높게 올릴 수 있으므로 바람직하다. 상기 금형코어층의 재질은 바람직하게는 니켈, 티타늄 및 알루미늄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직한데, 이들은 금형코어로 사용할 정도의 강도를 가지고 있어 바람직하다. In the step 6), a mold core layer is formed on the secondary metal layer. At this time, a preferable method of forming the mold core layer is a method of electroplating because the metal layer can be raised to a high level. The material of the mold core layer is preferably at least one selected from the group consisting of nickel, titanium and aluminum, and they are preferable because they have a strength enough to be used as a mold core.

상기 7)단계에서는 상기 6)단계에 의해 형성된 상기 금형코어층의 상면을 평탄화시킨다. 상기 금형코어층을 평탄화시킴으로써 상기 9)단계에 의해 사출되는 마이크로 반구체 어레이 플레이트가 금형에 평탄하게 장착할 수 있으며, 나아가 제조되는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 사출성형도를 높일 수 있어 바람직하다. 상기 평탄화는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 수평을 달성할 수 있게 상기 금형코어층을 평탄화시키는 방법이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 CMP(Chemical Mechanical Planarization), 광택 침지(Bright dipping), 바렐 연마(Tumbling barreling), 버프 연마(Buffing), 벨트 연마법(Belt sanding), 산세법(Picking) 등으로 평탄화시키는 것이 바람직하다.In the step 7), the upper surface of the mold core layer formed by the step 6) is planarized. By flattening the mold core layer, the microsphere array plate injected by the step 9) can be mounted flat on the mold, and further, the injection moldability of the microsphere array plate to be manufactured can be improved. The planarization can be used without limitation as long as it is a method of planarizing the mold core layer so as to achieve the level of the microsphere array plate. Preferably, the planarization is performed by chemical mechanical planarization (CMP), bright dipping, Tumbling barreling, buffing, belt sanding, picking, and the like.

상기 8)단계에서는 상기 금형코어층을 분리하게 되는데, 상기 금형코어층을 분리하는 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 KOH, TMAH 등으로 실리콘 기판을 녹여 제거하고, 나머지 남아있는 1차 금속층을 에칭용액으로 제거하여 분리하는 것이 바람직하다. 또한 이 과정에서 특별히 제한된 것은 아니지만 2차 금속층이 금형코어와 다를 경우 상기 2차 금속층도 같이 분리될 수 있다. In the step 8), the mold core layer is separated. The method of separating the mold core layer is not particularly limited. Preferably, the silicon substrate is melted and removed with KOH, TMAH, Is removed with an etching solution and separated. Also, although not particularly limited in this process, if the secondary metal layer is different from the mold core, the secondary metal layer can be also separated.

상기 9)단계에서는 상기 금형코어층을 주형으로 하여 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 사출성형하게 된다. 상기 사출성형의 방법은 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 사출성형하는데 적합한 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다.In the step 9), the microsphere array plate is injection-molded using the mold core layer as a mold. The injection molding method can be used without particular limitation, as long as it is suitable for injection molding of the microsphere array plate.

상기 사출성형의 소재는 사출성형이 가능한 소재라면 특별한 제한 없이 모두 사용될 수 있지만, 바람직하게는 P.C(Polycarbonate), PMMA(Polymethylmethacrylate), P.S(Polystyrene) 및 COC(Cyclic olefin copolymer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. The material for the injection molding may be any material that can be injection-molded, and is preferably selected from the group consisting of polycarbonate (PC), polymethylmethacrylate (PMMA), polystyrene (PS), and cyclic olefin copolymer It can be any one or more.

상기 10)단계에서는 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 표면에 친수성 또는 소수성을 부여할 수 있으며, 이러한 친수성 또는 소수성을 부여하는 방법에는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 플라즈마 방식 또는 화학적 표면 처리를 통해서 표면의 친수성과 소수성의 정도를 조절하게 된다. 또한 이러한 표면 개질을 통하여 최종 제조되는 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 통한 세포 집합체 배양시 반구 내에서 공기 방울이 생기는 현상을 최소화하여 세포의 3차원적인 집합체의 형성을 극대화할 수 있어 바람직하다. In step 10), the surface of the microsphere array plate may be hydrophilized or hydrophobically imparted. There is no particular limitation on the method of imparting hydrophilicity or hydrophobicity to the surface of the microsphere array plate. Preferably, And the degree of hydrophobicity and hydrophobicity of the hydrophilic polymer. Also, it is preferable to minimize the occurrence of air bubbles in the hemisphere when the cell aggregate is cultured through the microsphere array plate which is finally produced through such surface modification, thereby maximizing the formation of a three-dimensional aggregate of cells.

상기 제조방법에 의해 제조되는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구는 직경이 100-1000 um 것이 바람직한데, 상기 범위에 해당하는 경우에 보다 우수하게 3차원적인 세포 집합체의 형성을 가능하게 하여 바람직하다. The hemisphere of the microsphere array plate manufactured by the above-described method preferably has a diameter of 100-1000 μm, and it is preferable to allow the formation of a three-dimensional cell cluster in the above range.

본 발명에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법은 기존 반구형 마이크로 웰 제작방법에 비해 보다 정교하게 반구체 그리고 반구체 어레이 모양을 형성하게 된다. 그러므로 보다 3차원에 가깝게 세포 집합체를 형성하게 된다. The method of manufacturing the microsphere array plate according to the present invention forms a more hemispherical and semi-spherical array shape than the conventional hemispherical microwell manufacturing method. Therefore, it forms a cell cluster closer to three dimensions.

또한 본 발명에 따른 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법에 의해 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 이용하여 세포 집합체를 배양하게 되면 기존 방법에 비해 세포 집합체의 형성이 보다 우수하다. 또한 형성된 세포 집합체를 마이크로 반구체 어레이 플레이트로부터 분리하는 과정에서도 세포 집합체의 손상 없이 분리할 수 있다. 이는 기존에 2차원적으로 배양하던 방법에 비해 세포 집합체의 형성 상태가 월등히 우수한 것에 해당한다.
Also, when the cell aggregate is cultured using the microsphere array plate manufactured by the method of manufacturing the microsphere sphere array plate according to the present invention, the formation of the cell aggregate is superior to the conventional method. Also, separation of the formed cell aggregate from the microsphere array plate can be performed without damage to the cell aggregate. This corresponds to a much better formation of the cell aggregate than the conventional two-dimensional culture method.

단일 또는 복수의 세포, 세포 배양액을 포함하는 시료가 주입되며, 상기 시료의 주입은 단일 또는 복수개의 채널(4)을 통해 주입되는 시료주입부(1);A sample injection unit 1 for injecting a sample containing a single cell or a plurality of cells, a cell culture liquid, and injecting the sample through a single or a plurality of channels 4;

상기 시료주입부와 연결되고 시료가 이동하면서 혼합되는 부위로서, 상기 시료의 이동은 단일 또는 복수개의 채널을 통해 이루어지고, 상기 단일 또는 복수개의 채널은 지그재그 형태이며, 상기 단일 또는 복수개의 채널은 피라미드 형태로 복수개의 단계를 통해 반복적으로 이루어지고, 상기 복수개의 단계는 하위 단계로 갈수록 상위 단계 보다 하나 이상의 채널을 더 포함하며, 상기 복수개의 단계를 연결하는 유동채널(5)을 포함하는 시료혼합부(2); 및Wherein the sample is moved through a single or a plurality of channels, the single or plural channels are in a zigzag shape, and the single or plural channels are connected to the pyramid And a flow channel (5) connecting the plurality of steps, wherein the plurality of steps further include one or more channels higher than the upper step in a lower step, (2); And

상기 시료혼합부와 연결되면서 상기 복수개의 단계 중 최하위 단계를 구성하는 채널과 연결되며, 상기 혼합된 시료 중 단일 또는 혼합된 복수의 세포가 3차원으로 배양되어 세포 집합체를 형성하는 복수의 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 세포 집합체 형성부(3);A plurality of microspheres, which are connected to the sample mixing unit and are connected to channels constituting the lowest stage among the plurality of steps, and in which a plurality of single or mixed cells in the mixed sample are cultured in three dimensions to form a cell aggregate A cell cluster forming section 3 including an array plate;

로 이루어지는 것을 특징으로 한다. .

본 발명에 따른 미세유체소자는 단일 또는 복수의 세포가 3차원적으로 세포 집합체를 형성할 수 있게 하며, 상기 세포 집합체의 형성시 인체내 환경과 유사한 조건으로 유체를 통과시켜 세포 집합체를 형성하게 된다. 인체를 구성하는 가장 주요한 물질로서 성인의 경우 평균적으로 약 60 %는 물이기 때문에 인체 내에서 세포는 혈류 등 액체의 유동적 운동이 존재하는 상태에서 집합체를 형성하게 된다. 그러므로 본 발명은 이러한 인체 내의 환경과 유사한 조건을 제공하여 보다 우수한 품질의 세포 집합체를 형성하게 된다. The microfluidic device according to the present invention enables a single cell or a plurality of cells to form a cell cluster in a three-dimensional manner, and when the cell cluster is formed, a fluid is passed under conditions similar to the environment in the human body to form a cell cluster . As the most important constituent of the human body, about 60% of adults are water, so the cells in the body form aggregates in the presence of fluid motion such as blood flow. Therefore, the present invention provides conditions similar to those in the human body to form a cell cluster of higher quality.

상기 시료주입부에는 세포 및 세포 배양액을 주입할 수 있다. 상기 세포는 단일 또는 복수의 세포일 수 있으며, 주입된 세포는 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트 내에서 세포 집합체를 형성하게 된다. 상기 세포 및 세포 배양액을 포함한 시료를 상기 시료주입부에 주입할 때 유속은 10 nL/min - 10 uL/min 의 범위에서 주입하는 것이 바람직한데, 상기와 같은 범위의 유속으로 시료를 주입하는 것이 인체 내 환경과 유사하며, 특히 10 nL/min 미만으로 주입하는 경우에는 인체와 유사한 조건에서 크게 벗어남과 동시에 반구 주위의 불필요한 세포 제거를 달성하기 어려워 바람직하지 않으며, 10 uL/min을 초과하는 경우에는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구에 세포가 가라앉기 어려워 바람직하지 않다. 상기 시료주입부에 주입되는 세포 배양액은 세포를 배양할 수 있으면서 유체로서 흐를 수 있는 물질이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 상기 시료주입부에서 시료가 주입되는 입구는 단일 또는 복수개의 채널일 수 있으며, 이를 통해 시료는 단일 또는 복수의 경로로 주입될 수 있다. The sample and the cell culture liquid may be injected into the sample injection unit. The cells may be single or multiple cells, and the injected cells form a cell aggregate in the microsphere array plate. When injecting the sample including the cell and the cell culture liquid into the sample injection unit, it is preferable to inject the sample at a flow rate in the range of 10 nL / min to 10 uL / min. Injecting the sample at the flow rate in the above- In particular, when injected at a rate of less than 10 nL / min, it is not desirable to remove unnecessary cells around the hemisphere at the same time, and it is difficult to remove unnecessary cells around the hemisphere. The cells are difficult to sink into the hemisphere of the hemispherical array plate, which is not preferable. The cell culture fluid injected into the sample injecting section can be used without any particular limitation as long as it is a substance capable of culturing cells and flowing as a fluid. In addition, the inlet for injecting the sample in the sample injecting unit may be a single channel or a plurality of channels through which the sample can be injected in a single or multiple paths.

한편 상기 시료혼합부는 상기 시료가 이동하면서 혼합되는 부위이다. 이때 상기 시료의 이동은 단일 또는 복수개의 채널을 통해 이루어지는 것이 시료를 보다 용이하게 혼합할 수 있어 바람직하다. 상기 채널의 직경은 500 um - 2.0 mm인 것이 바람직한데, 상기 채널의 직경이 500 um 미만이면 마이크로 반구체 어레이의 개수가 적어지고 채널의 유체압력이 높아져서 바람직하지 않으며, 상기 채널의 직경이 2.0 mm를 초과하면 인체와 비슷한 조건으로 시료를 이동시키기 어렵고, 마이크로 반구체 어레이를 제어하기가 쉽지 않기 때문에 바람직하지 않다. 또한 상기 시료의 혼합을 보다 활발하게 달성하기 위해 상기 단일 또는 복수개의 채널은 지그재그 형태인 것이 바람직하다. 이렇게 지그재그 형태인 단일 또는 복수개의 채널은 피라미드 형태로 복수개의 단계를 통해 반복적으로 놓여지게 된다. 이렇게 복수개의 단계를 피라미드 형태로 반복하게 되면 시료의 혼합과 챔버에 따른 농도 구배가 활발하게 이루어질 수 있다. 또한 피라미드 형태를 구현하기 위해 상기 복수개의 단계는 하위 단계로 갈수록 상위 단계보다 하나 이상의 채널을 더 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 복수개의 단계는 이들을 연결하는 유동채널에 의해 모두 연결된다. 이러한 시료혼합부는 상기와 같은 구성을 통해 시료를 혼합(Mixed)하는 효과를 우수하게 달성하게 된다. Meanwhile, the sample mixing portion is a portion where the sample is mixed while moving. At this time, the movement of the sample is performed through a single channel or a plurality of channels because the sample can be more easily mixed. If the diameter of the channel is less than 500 μm, the number of microspherical arrays becomes small and the fluid pressure of the channel becomes high, which is undesirable. When the diameter of the channel is 2.0 mm , It is difficult to move the sample under conditions similar to the human body, and it is not preferable to control the microsphere array. In order to more actively mix the samples, the single or plural channels are preferably zigzag. The single or plural channels in the zigzag form are repeatedly placed in the form of a pyramid through a plurality of steps. If the plural steps are repeated in the form of pyramid, the mixing of the sample and concentration gradient depending on the chamber can be actively performed. In addition, in order to implement the pyramid shape, the plurality of steps preferably further include one or more channels in a higher level as it goes to a lower level. And the plurality of steps are all connected by a flow channel connecting them. Such a sample mixing section achieves excellent effects of mixing samples through the above-described structure.

한편 상기 세포 집합체 형성부는 상기 시료혼합부와 연결되면서 상기 복수개의 단계 중 최하위 단계와 연결되어 있다. 또한 상기 혼합된 시료 중 단일 또는 혼합된 복수의 세포가 복수의 마이크로 반구체 어레이 플레이트에서 3차원으로 배양되어 세포 집합체를 형성하게 된다. 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트는 복수개인 것이 단일의 마이크로 반구체 어레이 플레이트인 경우에 비해 배양액의 유속을 저하시키지 않으면서 인체 내의 환경과 보다 유사한 환경을 제공하여 우수한 세포 집합체를 형성할 수 있으므로 바람직하다. 또한 특별히 제한되는 것은 아니지만 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 개수는 바람직하게는 상기 복수개의 단계 중 최하위 단계에 포함된 채널의 개수와 같은 것이 바람직하다. 이는 상기 최하위 단계를 구성하는 각각의 채널에 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트가 곧바로 연결되어 세포 집합체를 형성하는 것이 이전 단계까지의 시료 이동을 방해하지 않으면서 인체와 보다 유사한 환경에서 우수한 품질의 세포 집합체를 형성할 수 있기 때문이다. Meanwhile, the cell aggregate forming unit is connected to the lowest mixing stage among the plurality of stages while being connected to the sample mixing unit. A plurality of single or mixed cells in the mixed sample are cultured three-dimensionally on a plurality of microsphere array plates to form a cell aggregate. It is preferable that a plurality of the microsphere array plates have a similar microbial sphere array plate so as to provide a similar environment to the environment in the human body without lowering the flow rate of the culture liquid to form a good cell aggregate. Also, although not particularly limited, the number of microsphere array plates is preferably equal to the number of channels included in the lowest stage among the plurality of steps. This is because the formation of the cell aggregate by directly connecting the microsphere array plates to each channel constituting the lowest stage does not interfere with the sample movement up to the previous stage, As shown in FIG.

상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 본 발명의 또 다른 특징에 따른 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법에 의해 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트인 것이 보다 우수한 품질의 세포 집합체를 형성할 수 있으며, 기존 방법에 비해 반구체 형성의 재현상이 매우 높게 나타난다. 또한 형성된 세포 집합체를 마이크로 반구체 어레이 플레이트로부터 분리하는 과정에서도 세포 집합체의 손상 없이 분리할 수 있다. 이는 기존에 2차원적으로 배양하던 방법에 비해 세포 집합체의 형성 상태가 월등히 우수한 것에 해당한다. Although the microsphere array plate has no particular limitation, the microsphere array plate manufactured by the method of fabricating the microsphere array plate according to another aspect of the present invention can form a cell aggregate of higher quality And the reproducibility of the hemispherical formation is much higher than the conventional method. Also, separation of the formed cell aggregate from the microsphere array plate can be performed without damage to the cell aggregate. This corresponds to a much better formation of the cell aggregate than the conventional two-dimensional culture method.

한편 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구 내에는 단일 또는 혼합된 복수의 세포가 가라앉아 세포 집합체를 형성하게 되며, 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구 주위에 존재하는 불순물 및 불필요한 세포는 반구 위를 흐르는 나머지 시료의 유속에 의해 제거되게 된다. 이러한 과정을 수차례 반복하여 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구 내에서 세포 집합체가 형성 및 배양되게 된다. Meanwhile, a plurality of single cells or mixed cells are submerged to form a cell aggregate within the hemispheres of the microsphere array plate. The impurities and unnecessary cells around the hemispheres of the microsphere array plate are separated from the hemisphere It is removed by the flow rate of the sample. This process is repeated several times to form and cultivate the cell aggregate within the hemisphere of the microsphere sphere array plate.

이렇게 본 발명에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자는 주요한 기능으로서 세 가지가 존재하는데, 첫째로는 세포 및 세포 배양액 등을 포함하는 시료를 함께 넣어서 농도별로 각각의 세포 집합체 형성부까지 흐르게 할 수 있는 농도 구배 기능이 존재하며, 둘째로 기능성 배양액 등을 포함하여 둘 이상의 시료를 함께 주입할 수 있으면서 동시에 이들을 혼합(Mixed)하는 기능이 우수하다. 셋째로 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구체 내에서 단일 또는 혼합된 복수의 세포가 세포 집합체를 형성하면서 배양되어 다양한 세포를 인체 내의 환경과 유사한 조건 아래 3차원 구형으로 만들 수 있다.
The microfluidic device according to the present invention includes three types of microfluidic devices including a microfluidic array plate. First, a sample containing cells and cell culture fluids is put in the microfluidic device, And secondly, it is capable of injecting two or more samples together including a functional culture solution and mixing them at the same time. Thirdly, a plurality of single or mixed cells in a hemisphere of a microsphere array plate can be cultured while forming a cell aggregate, and various cells can be made into a three-dimensional spherical shape under conditions similar to the environment in the human body.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. The present invention may, however, be embodied in many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein.

실시예Example

실시예Example 1: 마이크로 1: Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트의 제작 및 세포 집합체의 배양 Fabrication of array plates and incubation of cell aggregates

<마이크로 <Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트의 제작> Fabrication of array plate>

500 um 크기의 마이크로 반구체 패턴을 구현하기 위해서 감광성 포토레지스트를 사용하였으며, 이때 사용한 감광성 포토레지스트는 Negative와 Positive 두 가지 종류를 다 사용할 수 있지만 Negative 형태를 사용하였다. A photosensitive photoresist was used in order to realize a microsphere pattern having a size of 500 .mu.m. Negative and positive photosensitive photoresists were used.

마이크로 반구체의 높이는 300um 영역에서 감광성 포토레지스를 스핀코팅하여 조절할 수 있으며, 코팅된 포토레지스는 150℃ 온도에서 Over curing을 통해 마이크로 반구체로 형상화 할 수 있다.The height of the microsphere can be adjusted by spin-coating the photosensitive photoresist in the region of 300 μm, and the coated photoresist can be formed into a microsphere by over curing at a temperature of 150 ° C.

실리콘 기판 위에 형상된 마이크로 반구체 어레이 패턴 위에 1차 시드(seed) 금속층을 박막 증착 장비로 올리는데 이 때 사용하는 시드 금속은 티타니움(Titanium)을 사용하였으며, 그 높이는 300 Å 를 올렸다. 2차 금속층은 Nickel을 사용하게 되며 높이는 1,500 Å 를 올렸다. 1차와 2차 금속박막증착에 사용되는 장비는 E-beam evaporator 와 D.C magnetic sputter를 각각 사용하였다.A seed metal layer was deposited on a microsphere array pattern formed on a silicon substrate using a thin film deposition apparatus. Titanium was used as a seed metal, and the height of the seed metal was increased by 300 Å. The secondary metal layer was made of Nickel and its height was raised to 1,500 Å. E-beam evaporator and D.C magnetic sputter were used for deposition of primary and secondary metal films.

2차 금속박막층 위에 전주도금(Electro-plating) 방법을 사용하여 니켈층을 높게 올리게 되는데 이 때 올리는 니켈 금속 층의 높이는 0.8 mm 이었으며, 전주도금이 완료된 이후 후면을 CMP(Chemical Mechanical Planarization) 공정을 진행하여 균일한 편평도가 나올 수 있도록 연마하였다.The nickel layer was raised to a height of 0.8 mm by electro-plating on the secondary metal thin film layer. After the electroplating was completed, the rear surface was subjected to a CMP (Chemical Mechanical Planarization) process And polished so as to have a uniform flatness.

연마가 완료된 2차 금속박막층을 포함한 니켈층을 분리하여 금형코어로 사용하였으며, 사출성형(Injection molding)을 할 수 있도록 이를 금형에 장착하여 성형을 진행하였다.The nickel layer including the polished secondary metal thin film layer was separated and used as a mold core. The mold was mounted on a mold so as to perform injection molding.

사출성형에 사용되는 플라스틱 소재는 P.S.(Polystyrene)을 이용하여 사출성형을 진행하였다.The plastic material used for injection molding was injection-molded using P.S. (Polystyrene).

완료된 마이크로 반구체 플레이트는 산소 플라즈마 처리 및 화학적 표면 처리를 통해서 표면의 친수성과 소수성 정도를 조절하였으며, 이러한 표면 개질을 통해서 마이크로 반구체 어레이 플레이트 및 마이크로 반구체 어레이 미세유체소자 내에 공기방울이 생기는 현상을 최소화하며 세포의 3차원 반구체 형성을 극대화 하였다.The completed microsphere plate controlled the hydrophilicity and hydrophobicity of the surface through oxygen plasma treatment and chemical surface treatment. Through such surface modification, the phenomenon of air bubbles in the microsphere array plate and the microsphere array microfluidic device was minimized And maximized the formation of three-dimensional hemispheres of the cells.

하기 도 1은 이러한 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조과정을 나타내는 모식도이고, 하기 도 2a는 이렇게 제조된 마이크로 반구체 어레이를 나타내는 사진이며, 하기 도 2b는 최종 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 나타낸 사진이다.
FIG. 1 is a schematic view showing a manufacturing process of the microsphere array plate. FIG. 2A is a photograph showing the microsphere array thus manufactured, and FIG. 2B is a microsphere array plate .

<마이크로 <Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트를 이용한 세포 집합체의 배양> Culture of cell aggregates using array plates>

1) hADSC의 분리1) Isolation of hADSC

성형수술이나 지방 흡입술을 시행한 환자로부터 제거된 지방조직으로부터 hADSC를 분리해낸다. hADSC의 분리는 우선, 분리된 지방 조직으로부터 blood fraction을 제거한다. 깨끗한 PBS 용액을 이용해, blood fraction이 투명해질 때까지 반복해서 세포를 씻어낸다. 그 후 Type1 collagenase를 PBS에 0.2 %로 녹여 씻어낸 세포와 섞어줌으로써 세포간 결합을 끊고 조직을 세포 단위로 분리해낸다. 만들어 진 collagenase 용액을 씻어낸 지방조직과 섞어 한 시간 동안 흔들면서 incubation한다. 유화된 조직을 모아서, 600 g 10 min centrifugation을 한 뒤, pellet만 모아 100μm strainer에 걸러낸다. 걸러낸 세포는 배지에 넣고 여러 번 씻어낸 뒤에, T-75 플라스크에 배양하였고, passage 3-4 가 되었을 때, 3차원 배양을 위해 떼어내어 사용하였다.
The hADSC is isolated from adipose tissue removed from patients who underwent plastic surgery or liposuction. Isolation of hADSC first removes the blood fraction from the separated adipose tissue. Using a clean PBS solution, wash the cells repeatedly until the blood fraction is clear. After that, Type1 collagenase is dissolved in PBS at 0.2% and mixed with the washed cells, thereby breaking the intercellular junction and separating the tissue into cells. Mix the prepared collagenase solution with the washed fat tissue and shake for one hour. Collect the emulsified tissues, centrifuge at 600 g for 10 min, collect only the pellet, and filter them on 100 μm strainer. The filtered cells were washed three times in a T-75 flask. After passage 3-4, the cells were removed and used for 3-D culture.

2) hADSC 배양2) hADSC culture

3차원 배양을 위해, 배지에 hADSC 세포를 풀고, 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트에 세포용액을 seeding 하였다. 세포가 반구 안에 가라앉은 뒤 표면에 남아있는 세포들은 배지를 이용한 washing 과정으로 제거 되었고, 새로운 배지를 다시 넣어 인큐베이터에서 3차원 배양을 하였다. 하기 도 3은 이러한 배양 과정을 나타내는 모식도이다.
For three-dimensional culture, the hADSC cells were uncoated in the medium, and the cell solution was seeded on the microsphere array plate. After the cells had settled in the hemisphere, the remaining cells on the surface were removed by washing with the medium, and the new medium was re-inserted and cultured in an incubator in three dimensions. Fig. 3 is a schematic diagram showing such a culturing process.

3) 3차원 공동배양3) Three-dimensional co-cultivation

하기 도 4에서는 복수개의 세포를 공동배양하여 3차원 세포 집합체를 형성하는 모습을 나타낸 모식도이다. 즉 두 종류의 세포를 원하는 비율로 섞은 뒤 앞에서의 과정과 마찬가지로 세포를 반구체 안에서 배양한다. 배양한지 하루가 지나면 두 세포가 밀접하게 연결되어 하나의 구 모양으로 합쳐지고, 이로 인해 완벽하게 직접 결합된 3차원 공동배양 모델이 만들어진다.
4 is a schematic diagram showing a state in which a plurality of cells are co-cultured to form a three-dimensional cell cluster. In other words, after mixing two kinds of cells at the desired ratio, the cells are cultured in the hemisphere as in the previous procedure. After one day of incubation, the two cells are closely connected and integrated into a single sphere, resulting in a fully coupled, three-dimensional co-culture model.

실시예Example 2: 마이크로 2: Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트를 포함하는 미세 유체소자를 이용한 세포 집합체의 배양 Culture of cell aggregates using microfluidic devices including array plates

<마이크로 <Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자의 개발> Development of a microfluidic device including an array plate >

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자를 제작하였다. 이러한 미세유체소자는 시료주입부, 시료혼합부 및 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 세포 집합체 형성부로 나뉘어질 수 있다. 하기 도 5는 이의 단면도이다. 또한 하기 도 6는 이렇게 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자의 사진이다.
A microfluidic device including the microsphere array plate manufactured by the method of Example 1 was fabricated. Such a microfluidic device may be divided into a cell aggregation section including a sample injection section, a sample mixing section, and a microsphere array plate. 5 is a cross-sectional view thereof. 6 is a photograph of a microfluidic device including the microsphere array plate thus fabricated.

1) 인간유래 간세포의 분리1) Isolation of human-derived hepatocytes

인간 간세포는 간 부분절제술을 받은 환자에게서 제거된 간 조직으로부터 기존의 collagenase-two-step 방법을 이용하여 분리되었다. 간략히 설명하면, 분리된 간 조직은 먼저 EGTA perfusion을 통해, 혈액 등을 제거 하였고, 그 다음 type2 collagenase 용액을 perfusion함으로써, 조직 구석구석에 collagenase가 들어가 간 조직을 유화시켰다. 그 후, 두 번의 washing 과정을 통해 간세포가 조직으로부터 분리되었고 분리된 간세포는 분리된 직후 바로 사용되었다.
Human hepatocytes were isolated from hepatic tissue removed from patients who underwent hepatic resection using the conventional collagenase-two-step method. Briefly, the isolated liver tissue was first removed from the blood through EGTA perfusion, and then perfused with a type 2 collagenase solution to emulsify the collagenase into liver tissues. Thereafter, the hepatocytes were separated from the tissue through two washing steps, and the separated hepatocytes were immediately used immediately after separation.

2) 마이크로 반구체 어레이 플레이트 미세유체소자에서의 세포배양2) Cell culture in microfluidic array plate microfluidic device

간세포를 배지와 섞어, 미세유체소자 내에서 유속(flow rate)을 1uL/min 에서 초대세포와 배지가 chip을 천천히 지나가게 함으로써 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구 내에 세포가 가라앉게 하였고, 이 유속을 이용해 마이크로 반구체 어레이 주변의 세포들도 효과적으로 제거하였다. 이 과정을 수 차례 반복하여 미세유체소자 내에서 세포가 3차원 구형으로 자랄 수 있도록 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자에서 인간유래 초대세포를 배양하였다.
The hepatocytes were mixed with the medium and the cells were allowed to slowly pass through the chip at a flow rate of 1 uL / min in the microfluidic device so that the cells were submerged in the hemisphere of the microsphere array plate, Cells around the microsphere array were also effectively removed. This process was repeated several times to cultivate human-derived mammalian cells in a microfluidic device including a microsphere array plate so that the cells could grow into a three-dimensional sphere in the microfluidic device.

3) 3차원 공동배양 3) Three-dimensional co-cultivation

앞서 설명한 방법과 똑같은 방법으로, 세포를 loading 하되, 두 가지 혹은 그 이상의 세포를 원하는 비율로 섞어서 배지와 함께 넣으면 된다. 이 방법으로 유속이 있는 미세유체소자 내에서의 3차원 공동 배양을 할 수 있다.
In the same way as described above, the cells are loaded, but two or more cells can be mixed with the medium in the desired ratio. In this way, three-dimensional co-cultivation can be performed in a microfluidic device having a flow rate.

한편 이러한 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자의 주요한 기능은 아래의 3가지이다. On the other hand, the main functions of the microfluidic device including such a microsphere array plate are as follows.

첫번째 세포를 배양할 수 있는 배양액과 세포분화유도 및 세포의 특성 변형이나 기능 극대화를 할 수 있는 시료를 함께 넣어서 농도 별로 각각의 챔버에 흐르게 할 수 있는 농도구배기능과,A concentration gradient function capable of flowing into each chamber by concentration of a culture medium capable of culturing the first cell, a sample capable of inducing cell differentiation and characteristic transformation or function of the cell,

두번째 배양액과 기능성 시료를 함께 넣어줘야 하기 때문에 두 개 또는 그 이상의 용액을 일정하게 섞어줄 수 있는 마이크로 믹서 기능과, Since the second culture medium and the functional sample must be put together, a micromixer function capable of uniformly mixing two or more solutions,

세번째는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 반구 내에 집적화하여 다양한 세포를 3차원 구형 (cell spheroid)으로 만들 수 있는 기능이다.The third is the ability to integrate various hemocytes into the hemispheres of the microsphere sphere plate to make a three-dimensional cell spheroid.

그리하여 마이크로 채널 내에서 10nL/min ~ 10uL/min 영역의 유체를 자유롭게 변경하여 3차원 세포배양의 최적화 미세유체환경을 제공할 수 있다.
Thus, a fluid of 10 nL / min to 10 uL / min can be freely changed in the microchannel to provide an optimized microfluidic environment for three-dimensional cell culture.

비교예Comparative Example

비교예Comparative Example 1 One

기존에 존재하는 방법으로 제작된 반구형 마이크로웰에서 세포를 배양한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 세포를 배양하였다.
Cells were cultured in the same manner as in Example 1, except that cells were cultured in hemispherical microwells prepared by existing methods.

비교예Comparative Example 2 2

시료의 주입 및 이동 없이 기존에 존재하는 방법을 통해 이차원적(2D)으로 세포 집합체를 배양한 것을 본 비교예 2로 하였다.
The cell aggregate was cultured in a two-dimensional (2D) manner by the existing method without injecting and moving the sample.

실험예Experimental Example

실험예Experimental Example 1: 마이크로 1: Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트에서 배양된 세포 집합체의 관찰 Observation of cell aggregates cultured on array plates

상기 실시예 1의 마이크로 반구체 어레이 플레이트에서 배양된 세포 집합체및 비교예 1에 의해 배양된 세포 집합체를 관찰하였다. 이의 결과는 하기 도 7 및 도 8에서 확인할 수 있다.
The cell aggregate cultured in the microsphere sphere array plate of Example 1 and the cell aggregate cultured by Comparative Example 1 were observed. The results are shown in FIGS. 7 and 8.

하기 도 7의 A에서 상기 실시예 1에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트에 hADSC를 넣은지 하루 만에 동그랗게 뭉쳐진 세포 구가 잘 만들어졌음을 확인 할 수 있다. 또한 도 7의 B에서 만들어진 세포 구를 9일간 키운 뒤 Live/Dead assay로 viability를 보았을 때, 대부분의 세포가 건강하게 살아있음을 확인 할 수 있었다. 또한 도 7의 C에서 만들어진 세포구를 9일 째에 모아 SEM 사진을 통해 미세구조를 확인해 보았더니 hADSC의 특징인 microvilli가 잘 나타나는 것을 확인 할 수 있었고, 여러 개의 세포가 모여 완벽히 하나의 구 모양을 형성했음을 확인할 수 있었다. 이러한 마이크로 반구체 어레이 플레이트는 원하는 개수대로, 대면적으로도 만들 수 있으므로, 대량생산에 용이하고, 방법 또한 매우 쉬우므로 건강한 상태의 hADSC세포구를 빠르고 쉽게 대량생산하기에 매우 적합함을 확인하였다.In FIG. 7A, it can be confirmed that the rounded cell spheres were well formed within one day after placing the hADSC in the microsphere array plate according to Example 1 above. In addition, when viability was observed by the Live / Dead assay after incubating the cells prepared in Fig. 7B for 9 days, it was confirmed that most of the cells were alive and well. In addition, when the microsphere was collected on the 9th day by collecting the cell sphere formed in C in FIG. 7, it was confirmed that microvilli, which is a characteristic of hADSC, appeared well, and several cells gathered to form a complete sphere . Since such a microsphere array plate can be produced in a desired number of areas and in a large area, it is easy to mass-produce, and the method is also very easy, and thus it is confirmed that it is very suitable for mass production of hADSC cells in a healthy state quickly and easily.

한편 하기 도 8의 A에서 비교예 1로 hADSC 를 키울 경우, 세포구가 생성 된지 10일이 넘어가면 hADSC가 표면에 달라붙는 adherent cell이 되므로, 그 영향으로 만들어진 세포구가 마이크로 구멍에서 튀어나와, 바닥에 퍼져 붙어버리게 됨을 확인하였다. 그러나 실시예 1의 경우 도 8의 B에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시예 1의 경우에는 깊이 조절이 가능하기 때문에 좀 더 깊게 제작한 칩에서는 세포 구가 시간이 지나도 그 자리에 그대로 머물러 있으며 안정된 상태로 long-term 보관이 가능함을 보여준다. 이는 aggregation하는 특성을 가지지 않은 세포라 할지라도, 세포가 잘 뭉치게 할 수 있고, 깊이 조절을 통해 세포를 구상태로 오랫동안 키울 수 있음을 보여준다.
On the other hand, when the hADSC is raised as shown in FIG. 8A to Comparative Example 1, since the hADSC becomes an adherent cell adhering to the surface after 10 days from the generation of the cell spheres, It was confirmed that it spreads on the floor. However, in the case of Example 1, as shown in FIG. 8B, since the depth of the film can be adjusted in the case of Example 1, the cell structure remains intact even after the elapse of time in a chip made deeper, Long-term storage is possible. This shows that cells that do not have the aggregating properties can clump well and can regulate the depth of cells for long periods of time.

한편 도 9는 상기 hADSC를 배양하는 경우 비교예 2와 같은 2D(도 9 A, B)와 실시예1과 같은 3D(도 9 C, D), Optical(도 9 A, C)과 GFP(도 9 B, D) 및 SEM(도 9 E)을 나타내는 것이다.
On the other hand, FIG. 9 is a graph showing the relationship between the 2D (FIGS. 9A and 9B) and the 3D (FIGS. 9C and 9D) 9 B, D) and SEM (Fig. 9E).

실험예Experimental Example 2: 마이크로 2: Micro 반구체Hemisphere 어레이 플레이트를 포함한 미세유체소자에서 배양된 세포 집합체의 관찰 Observation of cell aggregates cultured in microfluidic devices including array plates

인간 간(humam liver) 세포 및 시료를 실시예 2의 미세유체소자를 통해 주입하여 유체의 흐름이 있는 상태로 세포 집합체(도 10 B)와 유체의 흐름 없이 상태로 마이크로 반구체 어레이 플레이트에서 배양된 세포 집합체(도 10 A)를 관찰하는 실험을 진행하였다.
Humam liver cells and samples were injected through the microfluidic device of Example 2 and cultured in a microfluidic array plate with no flow of fluid with the cell cluster (Figure 10B) in the flow of fluid Experiments were conducted to observe the cell aggregate (Fig. 10A).

human liver의 경우, partial hepatectomy로부터 세포를 얻으면 세포의 상태가 매우 좋지 않기 때문에, 어떤 방식으로 키워도 aggregation이 잘 되지 않는다.In the case of human liver, aggregation does not work well in some ways, since the cell state is not very good when cells are obtained from partial hepatectomy.

하기 도 10의 A에서 확인할 수 있는 바와 같이 인체와 비슷한 조건의 유속이 존재하지 않는 상태에서 인간 간 세포 집합체를 형성하는 경우에는 aggregation이거의 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. As can be seen from FIG. 10A, aggregation did not occur when a human liver cell aggregate was formed in a state where there was no flow rate similar to a human body.

반면에 도 10의 B에서 확인할 수 있는 바와 같이 실시예 2의 미세유체소자를 통해 유체의 흐름을 이용할 경우 상태가 좋지 않은 세포도 aggregation 시킬 수 있다. 따라서, 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 포함하는 미세유체소자에서는 좋은 상태로 얻기 어려운 human primary 세포를 효과적으로 3차원으로 배양할 수 있고, 꼭 상태가 좋지 않은 세포뿐만 아니라 일반 세포의 경우에도 지속적인 흐름과 shear stress를 줌으로써 좋은 영향을 줄 수 있다. 이는 인체 내와 비슷한 환경을 만들어줌으로써, 세포의 정상 기능을 극대화 할 뿐만 아니라, 지속적인 유체의 흐름으로 계속해서 신선한 배지를 공급해줄 수 있기 때문이기도 하다. 그리고 미세유체소자의 세가지 특성을 활용하면 세포 분화유도 및 기능분석을 위한 약물을 흘려 보내 지속적인 약물 스크리닝 등에도 이용할 수 있다.
On the other hand, as can be seen from FIG. 10B, when a fluid flow is used through the microfluidic device of Example 2, cells having poor quality can be aggregated. Therefore, in a microfluidic device including a microsphere array plate, human primary cells, which are difficult to obtain in a good state, can be effectively cultured in three dimensions. In addition, Can give a good effect. By creating an environment similar to that of the human body, it not only maximizes the normal function of the cells, but also provides a continuous supply of fresh media through continuous fluid flow. By utilizing the three characteristics of microfluidic device, it is possible to use drugs for cell differentiation induction and functional analysis to continuously screen drug.

또한 도 11은 이러한 세포 배양을 3일 유지한 후 염색하여 활성을 나타내는 인간 간세포를 확인하는 실험을 측정한 결과를 나타내는 사진이다. 도 11의 A에서 볼 수 있다시피, 유체의 흐름이 없는 비교예 2에서 상태가 좋지 않은 human primary hepatocytes를 배양하면, Live/Dead assay를 통해 볼 수 있듯이 반이 넘는 세포가 죽어있고, 잘 뭉쳐있지도 않으며 염색자체도 잘 되지 않는 결과를 볼 수 있다. 반면 유체의 흐름이 있는 실시예 2(도 11 B) 에서는 세포 viability가 flow가 없는 비교예 2에서의 결과와 고무적으로 다른 것을 확인 할 수 있다. 처음 human liver 세포를 분리해냈을 때의 viability가 40-60 % 정도 였던 것을 감안하면, flow가 있는 실시예 2에서 오히려 시간이 지날 수록 viability가 좋아지는 것을 확인 함으로써, 살아있는 세포들이 남아 더 단단히 뭉치고 전체적 생활력을 높이는 것을 확인 할 수 있다. 이를 통해, 상태가 좋지 않은 세포를 flow가 있는 실시예 2에서 배양하였을 때, 상태가 좋아지는 것을 증명했고 이는 상태가 좋지 않으나 가장 얻기 쉬운 세포원천인 human primary 세포를 실험에 이용할 수 있게 해주는 가능성을 보여준다.
Fig. 11 is a photograph showing the result of measuring an experiment for confirming the activity of human hepatocytes by maintaining the cell culture for 3 days and staining them. As can be seen from FIG. 11A, when human primary hepatocytes, which are not in good condition, are cultured in Comparative Example 2 in which there is no fluid flow, more than half of the cells are dead, as seen from the Live / Dead assay, The result is that the dye itself is not good. On the other hand, in Example 2 (FIG. 11B) in which the flow of the fluid is observed, it can be seen that the cell viability is encouragingly different from the result in Comparative Example 2 in which there is no flow. Considering that the viability of the first human liver cell was about 40-60%, confirming that viability improves with time in Example 2 with flow, the living cells remain more firmly, Can be confirmed. This demonstrated that when poorly conditioned cells were cultured in Example 2 with flow, the condition was improved and this showed the possibility of making human primary cells, which are the poorest but most accessible cell source, available for experimentation .

한편 도 12는 인간 간 세포를 배양하는 경우 비교예 2와 같은 2D(도 12 A, B)와 실시예 2와 같은 3D(도 12 C, D), Optical(도 12 A, C)과 ALB(도 12 B, D), Live/Dead(도 12 E) 및 SEM(도 12F)을 나타내는 것이다.
On the other hand, FIG. 12 shows a comparison between 2D (FIGS. 12A and 12B) and Comparative Example 2 (FIGS. 12C and 12D) (Fig. 12B, D), Live / Dead (Fig. 12E) and SEM (Fig. 12F).

실험예Experimental Example 3: 3: 복수개의Plural 인간 세포를 직접적으로 결합시킨 3차원 공동배양( Three-dimensional co-culture with direct binding of human cells ( CoCo -- cultureculture ))

인간 간 세포와 hADSC를 섞어 실시예 1에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트에 넣고 키웠을 때, 이들 세포가 직접적으로 결합하여 3차원 공동배양이 가능함을 확인하는 실험을 진행하였다. 이의 결과는 하기 도 13에서 확인할 수 있었다. 하기 도 13의 A에서는 두 종류의 세포가 하나가 되어 뭉쳐있음을 보여준다. 또한 도 13의 B에서는 초록색으로 나타내어지는 생활력도 매우 높아 두 세포로 이루어진 하나의 구가 매우 건강한 상태로 반구 안에서 배양되고 있음을 보여준다. 또한 도 13의 C에서는 배양한지 3 일째에 찍은 SEM 사진으로서 두 세포가 딱히 경계나 구분 없이 완벽하게 하나로 뭉쳐 있음을 확인할 수 있었다. 또한 도 13의 D에서는 배양한지 9 일째의 사진으로서 3 일째 보다도 더 단단하게 하나로 뭉쳤으며 겉으로 보이는 경계가 완전히 없어졌음을 확인 할 수 있다. 이는 두 가지 세포가 직접적으로 결합하여 완전한 하나의 단위체를 이루었음을 보여주고 있고, 기존에는 없었던 새로운 직접적 결합에 의한 3차원 공동배양 모델이라고 할 수 있다.
When human liver cells and hADSC were mixed and incubated in a microsphere array plate according to Example 1, experiments were carried out to confirm that these cells could be directly coupled and three-dimensional co-culture was possible. The results are shown in FIG. FIG. 13A shows that two kinds of cells are united together. Also, in FIG. 13B, the vitality expressed in green is also very high, suggesting that one sphere composed of two cells is cultured in the hemisphere in a very healthy state. In Fig. 13C, SEM photograph taken on the third day after culturing showed that the two cells were completely united with each other without any boundary or discrimination. In Fig. 13D, the photograph of the ninth day after the incubation showed that they were more tightly packed together than the third day, and that the apparent boundary completely disappeared. This shows that the two cells are directly coupled to each other to form a complete unit, and it can be said that it is a new three-dimensional co-cultivation model by direct coupling.

또한 도 14는 이러한 직접적 결합에 의한 3차원 공동 배양 모델을 가지고 기능 검사를 시행한 결과를 나타낸 것이다. 하기 도 14의 A 및 B에서는 일반 간세포만 가지고 한 것과 마찬가지로 활성화된 알부민(도 14 A)과Urea(도 14 B) 분비를 보임으로써, 뭉쳐진 세포가 섞인 상태에서도 자기기능을 잘 하고 있음을 확인할 수 있다. 또한 도 14의 C 및 D에서 빨간색으로 나타내어지는 Cytochrome P450 reductase 염색에서도 높은 레벨을 보였고, 도 14의 E에서 나타난 CYP3A4 activity를 정량화한 그래프에서도 지속적으로 높은 레벨의 결과를 보여 이 세포구가 간 특유의 metabolism 관련 기능까지도 잘 해내고 있음을 확인 할 수 있었다. 이렇게 뭉쳐진 새로운 단위체의 세포가 기능적으로도 제 역할을 할 수 있음을 보임으로써, 실제 장기에서의 여러가지 세포간의 결합과 유사한 상태를 구현했으며 이 단위체를 in vitro, in vivo 상에서 유용하게 사용할 수 있음을 보여주고 있다.
Fig. 14 shows the result of performing the functional test with the three-dimensional co-culture model by direct coupling. In FIGS. 14A and 14B, secretion of activated albumin (FIG. 14A) and Urea (FIG. 14B) was secreted similarly to that of normal hepatocytes alone, have. Also, the level was also high in the Cytochrome P450 reductase staining indicated by red in C and D of FIG. 14, and the graph showing quantitative CYP3A4 activity in E of FIG. 14 showed a high level continuously, metabolism-related functions. By demonstrating that the cells of this new unitary mass can function in a functional way, we have realized a similar state to that of various intercellular junctions in actual organs and have shown that this unit can be used in vitro and in vivo Giving.

또한 하기 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이 TEM으로 공동배양 된 세포구의 내부를 찍어보았을 때, 도 15에서 볼 수 있다시피 여러가지 활성화된 세포의 특성을 나타내고 있음을 확인할 수 있다. 많은 미토콘드리아와 건강한 핵상, 간세포 특유의 tight junction이나 bile canaliculi등도 관찰이 되고 있고, glycogen과 ECM인 Collagen도 관찰 할 수 있다. Peroxisome, rough ER도 확인이 되었고 endocytosis를 하고 있는 모습도 보여짐으로써, 세포가 형태적, 기능적으로 매우 건강한 상태임을 확인 하였다.
As can be seen from FIG. 15, when the inside of the cell co-cultured by TEM is taken, it can be seen that various activated cell characteristics are shown as shown in FIG. Many mitochondria, healthy vasculature, tight junctions specific to hepatocytes and even bile canaliculi are observed, and glycogen and collagen, ECM, are also observed. Peroxisome and rough ER were also confirmed and endocytosis was observed, confirming that the cells were in a very healthy state, morphologically and functionally.

또한 도 16에서 상태가 좋지 않은 간세포 구(도 16 A)와 직접적 결합에 의해 3차원 공동 배양된 세포구(도 16 B)를 꺼내어 Live/Dead assay를 하여, 세포의 viability를 본 사진이다. 도 16에서 알 수 있듯이 대부분의 세포가 살아있고 죽은 세포의 개수는 매우 적은데, 이를 통해, 실시예 1에 따른 마이크로 반구체 어레이 플레이트에서 세포를 꺼내는 과정이 세포에게 손상을 입히지 않는 다는 사실을 알 수 있고, 이는 곧 세포를 단지 반구체 안에서 3차원으로 배양하는 것을 넘어서 그것을 꺼내어 원하는 다른 곳에 다른 방법으로 사용할 수 있음을 알려준다.
FIG. 16 is a photograph showing the viability of a cell by performing a Live / Dead assay by taking out a three-dimensionally co-cultured cell population (FIG. 16B) by direct binding with a poorly sorted hepatocyte (FIG. 16A). As can be seen in FIG. 16, the number of living and dead cells in most of the cells is very small. Thus, it can be seen that the process of taking out the cells from the microsphere array plate according to Example 1 does not damage the cells , Which suggests that cells can be taken out of the cell only in three dimensions in a hemisphere, taken out and used in different ways elsewhere.

또한 도 17에서 human primary hepatocyte(도 17 A)와 Hadsc(도 17 B), 그 두 세포를 2D 상에서 공동 배양한 것(도 17 C)이다. 직접적인 결합이 있는 상태이긴 하지만 두 세포가 하나의 단위체가 되거나 하는 등의 효과는 볼 수 없고 그저 두 세포가 한 공간에 붙어 있는 정도 수준으로만 공동배양이 되고 있음을 알 수 있다. 이렇게 2차원으로 공동 배양된 모델을 가지고 알부민이 분비되는 부분을 염색해 봄으로써 세포의 활성을 확인해 보면(도 18), 빨간색으로 나타내어지는 거의 활성이 없는 상태를 보임을 확인할 수 있었다.
Also shown in FIG. 17 are human primary hepatocytes (FIG. 17A) and Hadsc (FIG. 17B), and those cells were co-cultured in 2D (FIG. Although there is direct binding, it can not be seen that the two cells become a single unit, and it can be seen that they are co-cultured only to the extent that two cells are attached to one space. When the two-dimensional co-cultured model was used to stain albumin-secreted regions, the activity of the cells was confirmed (FIG. 18), indicating that the cells exhibited almost no activity in red.

반면에 실시예 1에 의해 제작된 마이크로 반구체 어레이 플레이트에서 공동 배양된 경우(도 19) 초록색으로 나타내어지는 알부민의 분비가 매우 활발하고 세포의 활성이 훨씬 더 좋은 상태임을 알 수 있다. 한편 도 20은 2D 환경인 경우(도 20 A, B), 본 발명의 실시예와 같은 3D인 경우(도 20 C, D, E, F)를 종합적으로 보여주는 사진이다.
On the contrary, when co-cultured in the microsphere array plate prepared according to Example 1 (FIG. 19), albumin expressed in green is very active and the activity of the cells is much better. FIG. 20 is a photograph showing the 3D case (FIGS. 20C, 20D, 20F, and 20F) in a 2D environment (FIGS. 20A and 20B), which is the same as the embodiment of the present invention.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed exemplary embodiments, but, on the contrary, is intended to cover various modifications and equivalent arrangements included within the spirit and scope of the appended claims. It is natural.

1. 시료주입부
2. 시료혼합부
3. 세포 집합체 형성부
4. 채널
5. 유동채널1. Sample injection section
2. Sample mixing section
3. Cell aggregation forming part
4. Channel
5. Flow channel

Claims

1) 실리콘 기판 위에 감광성 포토레지스트를 부착하는 단계;
2) 스핀 코팅을 통해 상기 감광성 포토레지스트의 높이를 조절하는 단계;
3) 오버 큐어링을 통해 상기 포토레지스트를 반구형으로 식각하는 단계;
4) 상기 3)단계 이후 식각된 표면에 1차 금속층을 증착하는 단계;
5) 상기 1차 금속층의 증착 후 그 위에 2차 금속층을 층착하는 단계;
6) 상기 2차 금속층 위에 금형코어층을 형성하는 단계;
7) 상기 6)단계 이후 상기 금형코어층의 상면을 평탄화 시키는 단계;
8) 상기 7)단계 이후 상기 금형코어층을 분리하는 단계;
9) 상기 분리된 금형코어층을 주형으로 하여 마이크로 반구체 어레이 플레이트를 사출성형하는 단계; 및
10) 상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 표면에 친수성 또는 소수성을 부여하는 단계;
를 포함하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
1) attaching a photosensitive photoresist on a silicon substrate;
2) adjusting the height of the photosensitive photoresist through spin coating;
3) hemispherically etching the photoresist through overcuring;
4) depositing a primary metal layer on the etched surface after step 3);
5) depositing a secondary metal layer on the primary metal layer after deposition;
6) forming a mold core layer on the secondary metal layer;
7) planarizing the upper surface of the mold core layer after the step 6);
8) separating the mold core layer after step 7);
9) injection molding the microsphere array plate using the separated mold core layer as a mold; And
10) imparting hydrophilicity or hydrophobicity to the surface of the microsphere array plate;
&Lt; / RTI >

제 1항에 있어서,
상기 감광성 포토레지스트는 그 길이가 100-1,000 ㎛로 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the photosensitive photoresist has a length of 100-1,000 占 퐉.

제 1항에 있어서,
상기 1차 금속층의 재질은 Cr, Ti, Au, Ni, Cu, Al 및 Fe로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the material of the primary metal layer is at least one selected from the group consisting of Cr, Ti, Au, Ni, Cu, Al and Fe.

제 1항에 있어서,
상기 2차 금속층의 재질은 Au, Ag, Pt, Ni 및 Cu로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the material of the secondary metal layer is at least one selected from the group consisting of Au, Ag, Pt, Ni, and Cu.

제 1항에 있어서,
상기 금형코어층의 재질은 니켈, 티타늄 및 알루미늄로 이루어지는 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the material of the mold core layer is at least one selected from the group consisting of nickel, titanium, and aluminum.

제 1항에 있어서,
상기 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 사출성형은 P.C(Polycarbonate), PMMA(Polymethylmethacrylate), P.S(Polystyrene) 및 COC(Cyclic olefin copolymer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the injection molding of the microsphere array plate is performed using at least one selected from the group consisting of polycarbonate (PC), polymethylmethacrylate (PMMA), polystyrene (PS), and cyclic olefin copolymer (COC) A method of manufacturing a sphere array plate.

제 1항에 있어서,
상기 제조방법에 의해 제조되는 마이크로 반구체 어레이의 반구는 직경이 100-1000 um인 것을 특징으로 하는 마이크로 반구체 어레이 플레이트의 제조방법.
The method according to claim 1,
Wherein the hemispheres of the microsphere array fabricated by the above manufacturing method have a diameter of 100-1000 μm.

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제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 마이크로 반구체 어레이 플레이트로부터 세포 집합체를 배양하는 세포 집합체의 배양방법.
A method for culturing a cell aggregate in which a cell aggregate is cultured from a microsphere sphere array plate produced by the production method according to any one of claims 1 to 7.

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