KR101539822B1 - 줄기세포의 3차원 배양을 통한 고농축 배양액의 제조방법 및 고농축 배양액의 용도 - Google Patents

줄기세포의 3차원 배양을 통한 고농축 배양액의 제조방법 및 고농축 배양액의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 농축 배양액, 상기 농축 배양액을 유효성분으로 포함하는 골조직 재생용 조성물, 상기 배양액을 제조하는 단계 및 상기 제조된 배양액을 이식용 스캐폴드에 로딩하는 단계를 포함하는, 배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는, 골조직 재생용 이식체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 이식체에 관한 것이다.

Description

줄기세포의 3차원 배양을 통한 고농축 배양액의 제조방법 및 고농축 배양액의 용도{Method for preparing concentrated cell culture medium via 3D-culture and use thereof}
본 발명은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 농축 배양액, 상기 농축 배양액을 유효성분으로 포함하는 골조직 재생용 조성물, 상기 조성물을 이식용 스캐폴드에 로딩하는 단계를 포함하는 골조직 재생용 이식체의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 이식용 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 이식체에 관한 것이다.
골조직은 척추손상, 골절, 감염, 종양 등 여러 질환에 의해 손상을 입을 수 있다. 단순 골절 등의 경우에는 자연치료가 가능하나, 자연치료 한계를 넘어서는 골손실을 입을 경우 이를 치료 및/또는 재생시키기 위한 치료제가 필요하다. 아울러 치주질환이나 외상으로 인하여 발치를 하는 경우 치조골의 흡수가 일어나게 되어 보철치료와 임플란트 치료에 문제를 야기하게 된다. 특히 성공적인 임플란트를 위해서는 일정한 길이와 직경의 매식체가 식립되어야 하는데 치조골이 부족한 경우에는 임플란트 식립이 제한될 수 있다. 이와 같은 부위에는 치조골의 높이와 폭을 증가시키기 위한 골이식술이 필요하며, 이를 위해 여러 재생적 치료법이 발달되었다. 이와 같은 골결손에 가장 널리 사용되는 것은 골이식이며 골 재생을 위한 이식재료로는 자가골, 동종골, 이종골 또는 합성골이 사용되고 있다. 자가골은 직접 골형성을 할 수 있는 골세포를 포함하고 있으며 거부반응이 없는 최고의 골이식재로 높은 성공률을 보장하지만, 골채취를 위한 채취부위에 대한 추가적인 수술이 필요하고 이에 따른 수술 후 불편감이 수반되며 채취량이 한정적이어서 필요한 만큼 채취하는 것이 용이하지 못하다. 따라서, 임상에 있어서, 자가골을 대체하기 위한 골이식재의 개발에 대한 요구가 증가하고 있다. 동종골은 자가골 이식과 비교하여 다량의 골채취가 가능하고 한번의 수술로 이식가능한 장점이 있고 골 형성가능성이 높은 것으로 보고되어 있어 자가골의 대체재로 널리 사용되고 있다. 그러나, 조작이 쉽지 않고 일관된 골재생 결과를 보여주지 못하고 골재생에 있어서 실패를 초래하거나, 면역거부반응 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 질환보유자로부터 채취한 골을 사용한 경우 감염으로 인한 질병전파의 가능성이 있어 논란이 되고 있다. 이종골은 인간 이외의 동물로부터 채취한 골조직을 처리하여 이식재로 사용하는 것으로 우골이 널리 사용되고 있다. 이종골이 지니고 있는 항원성과 감염 가능성을 제거하기 위한 탈단백과정을 거치며, 이러한 탈단백과정을 거친 우골은 치과영역의 골이식술에 널리 사용되고 있다. 이 외에 합성골로 사용할 수 있는 다양한 합성재료들이 개발되고 있다. 합성골로 사용되기 위해서는 독성이 없고 생체 적합성을 가지며 다공성 이어서 재생되는 골세포의 침투가 가능하고 안정적으로 부착되어 증식할 수 있어야 하며 시간에 따라 체내에서 분해될 수 있는 재료여야 한다.
한편, 줄기세포 분리 및 배양기술이 발달함에 따라, 세포치료제로서 다양한 조직으로 분화할 수 있는 줄기세포를 환부에 이식하는 방법도 사용되고 있다. 세포치료제 또한 상기 골이식재와 유사한 조건을 만족시켜야 한다. 이식 후 인체 내에서 원하는 세포의 고유기능을 나타내어야 하며, 안전하고 면역거부반응이 없어야하며 이식치료에 이용할 수 있을 만큼 대량의 세포가 확보되어야 한다. 따라서, 자가이식을 전제로 하거나 동종이식의 경우 조직적합형태로 사용한다. 이와 같이 세포치료제는 세포의 유래에 따라 자가, 동종유래 및 이종 세포치료제로 분류될 수 있다. 자가 세포치료제는 환자에게서 세포를 분리하여 시험관 내에서 미분화상태로 단순 증식시키거나, 배양시키면서 분화 및 발달을 유도하거나 특정 기능을 부여하기 위하여 필요한 조작을 가하여 세포의 형질을 변화시킨 뒤 다시 환자 자신에게 이식한다. 반면, 동종유래 세포치료제는 자가세포와 유사한 과정을 거치나 다른 건강한 공여자에게서 세포를 분리하여 시험관 내에서 단순 증식시킨 후 이를 환자에 이식하는 세포치료제이며, 이종 세포치료제는 사람이 아닌 동물로부터 분리된 세포를 이용하는 것이다.
이중 가장 용이하게 수행될 수 있는 것은 동종유래 세포치료제를 이용하는 동종이식(allogenic graft)이다. 그러나 동종이식에 있어서 최대의 단점은 타 개체의 세포를 이식함으로 발생하는 면역거부반응이다. 자가이식이 가능한 경우(골수, 상피, 조혈모 줄기세포)도 있으나, 이것이 불가능하거나 어려운 경우, 불가피하게 동종이식을 수행하지만 이에 있어 줄기세포의 응용을 가장 제한하는 요소이며, 세포치료제로서의 줄기세포의 적용을 확대하기 위해 반드시 해결해야할 과제이다. 그럼에도 불구하고 성체줄기세포의 동종이식은 자가이식의 문제점을 극복할 수 있는 대안으로 활용되고 있다. 자가이식을 위해 필요한 과정인 채취 후 체외 배양에 걸리는 시간의 제약 및 이에 수반되는 고부가 비용으로 인한 경제적 제약 및 반드시 선행되어야 하는 수술과정 등 환자의 부담을 덜어줄 수 있다. 미미하기는 하지만 발생할 수 있는 면역거부반응의 위험성을 제거하기 위한 연구개발이 진행중이며, 현재로서는 조직적합형태로의 이식을 전제로 주로 체외배양을 통해 분화시켜 분화된 상태로 주입하는 것을 기본으로 한다. 그러나, 이러한 분화된 세포형태로 이식하는 것은 줄기세포의 근본적인 장점인 다양한 세포로의 분화가능성을 차단함과 동시에 주변 숙주 시스템 내의 세포활성화를 유도할 수 있는 사이토카인의 분비가 현저히 저하되므로 숙주 시스템과의 융화나 활성화 능력이 저하된다.
이에 본 발명자들은 상기 골이식재 및 줄기세포치료제 이식의 장점을 조합하여 면역거부반응의 걱정 없이 효율적인 골조직을 재생시킬 수 있는 방법을 찾기 위해 예의 연구 노력한 결과, 줄기세포를 3D 다공성 스캐폴드에 부착시켜 배양하여 얻어지는 성장인자 및 사이토카인을 다량 함유한 배양액의 농축액을 로딩시킨 생분해성 스캐폴드를 이식함으로 직접 줄기세포를 로딩시켜 이식했을 때보다 높은 골재생 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법에 의해 제조된 농축 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 농축 배양액을 유효성분으로 포함하는 골조직 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법으로 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 배양액을 이식용 스캐폴드에 로딩하는 단계를 포함하는, 배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는, 골조직 재생용 이식체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조된 배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 이식체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "성체줄기세포"는 일반적인 줄기세포의 특징인 자가증식이 가능하고 적합한 환경 및 자극을 통해 다양한 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포, 즉 '미분화세포'로서, 특징적인 현상과 특화된 기능을 가지는 세포로 발달할 수 있는 잠재적인 능력을 가진 세포이며, 골수, 골격근, 지방조직, 제대혈, 제대, 피부, 양막, 태반 등으로부터 분리할 수 있다. 특히 중간엽 줄기세포는 연골, 뼈, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등의 조직을 형성하는데 원조가 되는 세포로서, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만, 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하여 이들로부터 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 바람직하게는 상기 성체줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 성체줄기세포를 얻는 방법은 종래 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으며, 본 발명의 실시예의 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 용어 "스캐폴드"는 일정한 골격을 갖는 고체 지지체를 의미하는 것으로 줄기세포가 상기 스캐폴드에 부착하여 증식, 배양될 수 있는 것이면 제한없이 포함한다. 바람직하게 상기 스캐폴드는 콜라겐 스캐폴드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 콜라겐 스캐폴드는 다공성 고체 지지체로 이용될 수 있다.
일반적인 세포 배양법에 있어서 3차원 배양은 배양접시에 부착되지 않고 액체배지에 부유상태로 배양하는 방법을 의미하지만, 본 발명의 용어 "3차원(3D) 배양"은 3차원 다공성 고체 지지체에 부착 배양시킴으로 세포가 증식함에 따라 지지체 내 기공을 채우면서 입체적으로 배양되도록 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 콜라겐 스캐폴드를 고체 지지체로 이용하였으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법은 이와 같은 3차원 배양을 통해, 기존의 줄기세포의 2차원 배양에서 얻을 수 없는 적은 양의 배양 배지를 이용하므로 적은 농축시간으로 고농도의 농축된 성장인자 또는 사이토카인을 수득할 수 있다.
본 발명의 용어 "성장인자(growth factor)"는 세포 성장, 증식 및 분화를 촉진시킬 수 있는 자연적으로 생성되는 물질을 의미한다. 일반적으로 단백질이나 스테로이드 호르몬이며 다양한 세포 과정의 조절에 중요한 역할을 한다. 세포 사이의 신호전달 분자로서의 역할을 하며, 그 예로는 표적 세포의 표면에 존재하는 특이적 수용체에 결합하는 사이토카인과 호르몬 등이 있다. 때로는 성장인자의 종류에 따라 분화 및 발달을 촉진한다. 예를 들어 골형성단백질(bone morphogenic protein)은 골세포분화를 촉진하는 반면, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 및 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)는 혈관분화(혈관신생; angiogenesis)를 촉진하다. 종종 사이토카인과 혼용되기도 하나, 사이토카인은 조혈세포 및 면역세포에 관여한다. 성장인자는 세포분열에 긍정적인 효과를 나타내는 반면, 사이토카인은 증식에 대한 분자의 효과에 대해 중립적인 용어이다. 바람직하게 상기 성장인자는 IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β1(transforming growth factor-beta 1), bFGF(basic fibroblast growth factor), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "사이토카인(cytokine)"은 많은 세포에서 분비되는 작은 세포-신호전달 단백질 분자로 세포 간 신호전달(communication)에 널리 쓰이는 신호전달 분자를 총칭한다. 단백질, 펩타이드 또는 당단백질(glycoprotein)으로 분류될 수 있으며, 사이토카인이라는 용어는 다양한 발생학상 기원의 세포에 의해 전 인체를 통해 생산되는 크고 다양한 패밀리의 조절인자를 모두 포함한다. 그러나 일반적으로 인터루킨(interleukin) 및 인터페론(interferon)과 같은 면역조절제(immunomodulating agent)를 지칭하는 용어로 사용되고 있다. 바람직하게 상기 사이토카인은 CXCL2(chemokine C-X-C motif ligand 2) 또는 IL-8(interleukin-8)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "배양액"은 분리된 줄기세포의 시험관 내에서 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 액체 배지에 줄기세포를 일정기간 배양한 후 세포를 제거하고 남은 용액을 의미하며, 배양기간동안 세포로부터 분비된 성장인자 및 사이토카인 등의 단백질 및 세포 배양시 소모되고 남은 영양성분 등도 모두 포함한다. 상기 배지는 성체줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함하며, 배지 및 배양 조건은 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이러한 세포 배양 최소 배지는 예를 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgows Minimal essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제 또는 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인간혈청알부민(human serum albumin) 등의 혈청첨가물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 배양액을 수거하여 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양액을 수거하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 예컨대 원심분리하여 수거할 수 있다. 이와 같이 수거된 배양액은 대부분이 액체성분으로 부피가 커서 보관이 용이하지 못하다. 따라서, 추가적으로 농축하는 단계를 수행할 수 있다. 농축한 배양액은 분주하여 냉동보관할 수 있고, 필요에 따라 해동시켜 원하는 농도로 희석하여 사용할 수 있다. 상기 단백질의 농축은 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 예컨대 단백질 농축 필터를 사용하여 농축할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 단백질 농축 필터를 사용하여 단백질 함량은 유지하면서 1.5 ml의 배양액을 30 μl로 부피를 줄임으로 성장인자 및 사이토카인의 농도를 현저히 증가시킨 농축 배양액을 확보할 수 있었다.
본 발명은 추가적으로 전기자극을 주어 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 과정은 성장인자 및 사이토카인의 분비를 촉진하기 위한 것으로 전기자극 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 세포배양접시에 전극을 설치하여 전극 상에서 세포가 부착 배양되도록 하고 전기를 흘려주어 자극을 가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상기 언급한 바와 동일하게 추가적으로 전기자극을 주어 배양한 세포의 배양액을 수거하여 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 콜라겐 스캐폴드에 부착시켜 3차원 배양하는 것만으로도 골재생 관련 성장인자 및 줄기세포 이동촉진 관련 사이토카인의 유전자 발현 및 분비가 눈에 띄게 증가하는 것을 확인하였다(실시예 2 내지 4, 도 4 및 도 5). 나아가 단백질 농축 필터를 이용하여 농축함으로 단백질의 손실은 거의 없이(표 2) 약 50배 더 높은 농도로 농축시킬 수 있고(실시예 5) 이와 같이 제조된 농축 배양액은 뛰어난 골세포로의 분화 유도능을 나타냄을 확인하였다(도 8 및 도 9).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법에 의해 제조된 농축 배양액을 제공한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 농축 배양액을 유효성분으로 포함하는 골조직 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "골조직(osseous tissue)"은 뼈를 형성하는 조직을 일컫는 용어이다. 뼈는 표면이 치밀골질로 이루어지며, 중심부나 장골의 양 끝은 그물눈 같이 연합된 해면골질로 되어 있다. 대부분의 뼈는 처음에 결합조직 중의 연골로서 발생하여 나중에 골조직으로 바뀌는데 일부는 결합조직 중에서 직접 생성된다. 말단에는 이웃 뼈와 접하는 부분에 관절면이 있고, 그 표면은 초자연골인 관절연골로 덮여있다. 해면질 가운데의 해면소주는 일정한 배열로 되어 있는 것이 특징이다. 골세포는 골층판 사이에 배열되어 있으며, 불규칙한 별모양으로 가는 원형질 돌기로 인접한 다른 골세포와 연결되어 있다. 뼈의 표면에는 질긴 결합조직성 골막이 있으며, 신경과 혈관이 분포되어 뼈의 보호와 영양을 맡고 있다. 골막이 결손되면 뼈의 생존, 신생, 재생 등의 곤란해진다. 골질의 성분은 수분 20%, 세포를 포함한 유기질 35%, 무기질 45%인데, 뼈가 일정한 탄력성을 유지하는 것은 유기질이 있기 때문이다. 연령이 증가함에 따라 무기질(주로 인산칼슘)이 증가하여 뼈의 경도도 증가한다.
본 발명의 용어 "재생"은 일반적으로 생물체에는 몸의 일부 또는 그 기능을 상실하였을 때, 그 부분의 조직이나 기관을 다시 만들어 원래 상태로 복구시키거나 그 기능을 회복하려는 작용을 일컫는다. 이러한 재생능력은 체계가 간단하고 계통적으로 진화의 정도가 낮은 것일수록 강하다. 본 발명은 구체적인 일 실시예에서 본 발명의 농축 배양액을 일반 골세포 분화 유도용 배양배지에 1 또는 5% 혼합한 배양액을 이용하여 일반 골세포 분화용 배지보다 높은 ALP 활성(도 8) 및 석회화(도 9)를 나타냄을 확인하여, 본 발명의 3차원 배양으로부터 획득한 배양액이 골조직을 효율적으로 재생하는 것을 확인하여, 골조직 재생용 조성물로 이용될 수 있음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하는 단계를 포함하는, 성장인자 또는 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 방법으로 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 배양액을 이식용 스캐폴드에 로딩하는 단계를 포함하는, 배양액을 로딩한 스캐폴드를 포함하는, 골조직 재생용 이식체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "이식(transplantation)"은 일반적으로 공여자의 세포, 조직 또는 장기 등을 수혜자의 손상 조직 또는 장기에 옮기는 과정을 의미한다. 공여자의 형태에 따라 자기 세포나 조직을 다른 곳에 이식하는 자가이식(autograft), 수혜자와 동일한 종인 공여자로부터의 세포, 조직, 장기 등을 이식하는(예컨대 인간에서 인간으로) 동종이식(allograft), 다른 종으로부터의 장기 등을 이식하는(예컨대 동물의 장기를 인간에게) 이종이식(xenograft)로 분류될 수 있다. 이식의 대상은 보다 넓게는 공여자의 세포, 조직 또는 장기 뿐 아니라 수혜자의 손상된 조직의 재생을 도울 수 있는 물질이면 제한없이 포함한다. 이식은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 본 발명의 실시예에 제한되지 않는다. 예를 들어 외과적 수술로 수행될 수 있고, 세포 등과 같은 물질은 환부에 직접 주사할 수 있다.
본 발명의 용어 "이식용 스캐폴드"는 이식하고자 하는 물질과 함께 이식되는 구조체로 상기 이식하고자 하는 물질을 머물러 있도록 지지하는 역할을 하는 구조체이다. 따라서, 생체적합성을 갖는 물질이어야 하고, 세포나 조직의 생착률이 높아야 한다. 바람직하게 상기 이식용 스캐폴드는 생분해성 물질일 수 있고, 보다 바람직하게는 콜라겐일 수 있다.
본 발명의 용어 "로딩(loading)"은 상기 이식용 스캐폴드에 치료효과가 있는 물질을 함유시키는 과정을 의미한다. 이러한 기능을 충족시키는 방법이면 제한없이 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 골조직 재생에 효과가 있는 줄기세포 농축 배양액을 이식용 스캐폴드로 사용되는 콜라겐 스캐폴드에 도포하여 흡수시켰다.
본 발명의 용어 "이식체"는 손상된 부위를 외부로부터 격리하거나 이식된 세포나 분비된 치료물질을 포함하고 상기 세포나 치료물질이 머물러 있도록 하는 지지체로서, 인체 또는 포유동물에 이식될 수 있는 물질을 의미한다. 이와 같은 이식체는 조직공학용 지지체로서 생분해성을 가지는 합성고분자와 천연재료 등 당업계에 다양하게 사용되는 물질을 제한없이 포함한다. 바람직하게는 콜라겐일 수 있다. 본 발명의 이식체는 줄기세포 농축 배양액을 포함하는 콜라겐 스캐폴드로서 비자기 세포를 포함하고 있지 않으므로 면역거부반응이 없으며 염증반응을 야기하지 않음을 구체적인 실시예에서 확인하였다(도 11). 따라서, 다양한 이식체를 체내에 이식하였을 경우 발생할 수 있는 면역거부반응 또는 염증반응을 억제하기 위한 별도의 면역거부반응 억제제 또는 항염증제의 투여가 없어도 이식된 이식체가 생체 내에 면역거부반응이나 염증유발 없이 안정적으로 생착할 수 있다. 본 발명의 이식체는 줄기세포 농축 배양액을 포함하는 콜라겐 스캐폴드이며, 상기 농축 배양액을 포함하는 콜라겐 스캐폴드에 추가적으로 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조된 배양액을 로딩한 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 이식체를 제공한다.
본 발명의 줄기세포를 고체 지지체에 부착시켜 3차원 배양함으로 얻어진 성장인자 및 사이토카인을 다량 함유한 배양액을 농축시킨 농축배양액을 포함하는 콜라겐 스캐폴드로 구성된 이식체는 랫트 두개관 결손 동물모델에 이식되어(도 10) 염증반응 없이(도 11) 줄기세포의 이동을 촉진하고(도 12) 줄기세포를 이식한 대조군보다 더 높은 골재생능을 나타내었다(도 13 내지 15).
본 발명의 줄기세포를 고체 스캐폴드에 부착시켜 3차원 배양함으로 얻어진 배양액은 성장인자 및 사이토카인을 다량 함유하며 이를 농축한 농축 배양액을 콜라겐 스캐폴드에 로딩하여 골결손 부위에 이식하여 염증반응 없이 높은 골재생 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 농축 배양액은 세포를 포함하지 않으므로 면역거부반응이나 염증반응 걱정없는 골재생용 조성물로 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 전기 자극용 시험관 내 배양 시스템의 전기 자극장치(중간)와 이상 전류 자극기 내의 전기자극 세기 조절장치(좌) 및 전기자극 장치 내에 세포를 배양한 콜라겐을 로딩한 실제 모습(우)을 나타낸 도이다.
도 2는 스캐폴드에 대한 세포부착성 확인을 위한 전자현미경 사진을 나타낸 도이다. 좌로부터 각각 세포가 부착되지 않은 콜라겐 스캐폴드(collagen scaffold), 세포를 부착시킨 스캐폴드(control) 및 세포를 부착시키고 스캐폴드에 전기자극을 가한 실험군(EC)을 나타낸다.
도 3은 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR)을 통한 성장인자 및 사이토카인의 유전자 발현량을 나타낸 도이다. 2D 배양 및 3D 배양시 각 유전자의 발현량을 비교하여 나타내었다.
도 4는 3차원 배양시 전기자극 유무에 따른 유전자 발현량을 비교하여 배양일수에 대하여 나타낸 도이다.
도 5는 배양법에 따른 성장인자 및 사이토카인의 발현량 비교를 위한 효소면역측정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA) 결과를 나타낸 도이다. VEGF(vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 IL-8(interleukin-8)의 발현량을 측정하였으며, 2D 및 3D 배양에 따른 발현량 및 각각에 있어서 전기자극 유무에 따른 발현량을 측정하여 비교하였다.
도 6은 배양액의 농축에 사용된 단백질 농축필터를 나타낸 도이다.
도 7은 농축 배양액의 세포 독성 확인을 위한 MTT 분석 결과를 나타낸 도이다. 본 발명의 농축배양액을 1, 2.5 및 5%로 혼합시킨 일반 배양액에서 3일간 배양한 세포에 대한 세포생존률을 측정하였다.
도 8은 배양 조건에 따른 ALP(alkaline phosphatase) 활성을 나타낸 도이다. 줄기세포를 대조군(con; 아스코르브산, β-글리세로포스페이트), 골세포로 분화시키는 조건(dex; 덱사메타손) 및 골세포로 분화시키는 조건에 전기자극 존재 및 부재하에 3D 배양하여 제조한 농축 배양액을 표기한 농도로 첨가하여 배양한 실험군에 대하여 ALP 활성을 측정하여 골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다.
도 9는 골세포 분화에 대한 농축 배양액의 영향을 확인하기 위한 알리자린 레드 S(alizarin red S) 염색결과 및 이를 탈색시켜 수득한 알리자린 레드 S의 양을 정량한 결과를 나타낸 도이다. 알리자린 레드 S로 염색한 각 조건에서 배양한 줄기세포를 사진 촬영 후 탈색 용액으로 탈색시키고 595 nm의 파장에서 해당 용액의 흡광도를 측정하여 농도로 환산하였다.
도 10은 두개관 손상 실험동물 모델의 제작 및 이를 이용한 동물실험 과정을 나타낸 도이다.
도 11은 농축 배양액에 의한 염증반응을 확인하기 위한 H&E 염색결과를 나타낸 도이다.
도 12는 농축 배양액의 줄기세포 이동 촉진 실험결과를 나타낸 도이다. 두개관 손상 실험동물 모델에 각각 일반 배양액과 본 발명의 농축 배양액을 로딩한 콜라겐 스캐폴드를 삽입하고 형광 염료인 Dil이 표지된 인간 골수유래 줄기세포를 주입하고 4일 후 이식부위를 확인하였다. 비교실험군으로는 줄기세포 이동 촉진물질인 SDF-1(stromal cell-derived factor-1)을 로딩한 스캐폴드를 이용하였다.
도 13은 마이크로 CT 촬영으로 골형성 정도를 정량분석한 결과를 나타낸 도이다. 스캐폴드에 줄기세포를 로딩하여 이식한 대조군(cell), 3D 배양으로 제조한 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드를 이식한 실험군(media-C) 및 전기자극을 가하면서 3D 배양하여 제조한 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드를 이식한 실험군(media-EC)에 대한 골형성부피(bone volume; BV), 망상골의 수(trabecular number; Tb.N), 망상골의 분포(trabecular separation; Tb.Sp) 및 망상골의 두께(trabecular thickness; Tb.Th)를 측정하였다.
도 14는 마이크로 CT를 이용하여 측정한 신생 골조직의 이미지를 나타낸 도이다. 두개관 손상 동물모델에 각각의 이식체를 이식하고 4주 뒤에 마이크로 CT를 활영하여 새롭게 형성된 골조직을 이미지화 하였다.
도 15는 골형성 정도를 확인하기 위한 조직학적 염색 결과를 나타낸 도이다. 두개관에 5 mm 지름의 골결손을 유발한 골손상 동물모델에 각각의 이식체를 이식하고 4주 후 마송삼색 염색법을 이용하여 골형성 정도를 조직학적으로 평가하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인간 골수유래 중간엽 성체줄기세포의 분리 및 배양
본 발명의 성체줄기세포 공급원으로서의 인간 골수는 환자의 동의하에 장골(iliac bone)에서 흡입천자 기구로 획득하였으며, 소속대학의 윤리위원회(institutional review board; IRB)로부터 허가를 받았다. Vilamitjana-Amedee 등의 논문(In Vitro Cell Dev. Biol. Anim., 1993, 29A(9): 699-707)에 기술된 방법으로 골수기증자의 장골(iliac crest) 부위로부터 골수액을 추출하였다. 피콜용액(Ficoll-PaqueTM PLUS)을 첨가하여 밀도에 따라 층이 분리되면 상층액과 하층의 혈액층 사이에 형성된 유핵 세포층을 분리하였다. 분리된 유핵세포는 3 내지 4×104 세포/cm2의 밀도로 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 함유한 배지 조건에서 배양하고, 3 내지 4일에 한번씩 신선한 배지로 갈아주면서, 세포 군집(colony)이 형성되어 배양접시에 60 내지 70% 정도로 찰 때까지 증식시킨 후 계대배양을 시작하였다. 충분한 수의 세포를 확보하기 위하여 계대배양 횟수를 늘리고 두 번째 계대배양에서 실험을 수행하고 나머지 세포들은 냉동보관하였다.
실시예 2: 전기자극과 평면 또는 입체 세포 배양조건
분리된 줄기세포 배양시 성장인자 및 사이토카인의 분비를 촉진시키기 위한 방법으로 전기자극을 주면서 배양 및/또는 입체 스캐폴드에 부착시켜 3차원으로 배양하였다. 배양중 전기자극을 주기 위하여 고안된 장치를 도 1에 나타내었다. 전극으로는 금을 증착시킨 플레이트를 사용하였고 채널 전극 상에 세포가 부착배양 되도록 하였다. 전기자극은 입체배양 조건과 조합하여 적용하였다. 2D 평면배양은 일반적인 테플론 세포배양 접시(Teflon culture dish)에 배양한 반면, 3D 입체배양을 위해서는 콜라겐 스캐폴드를 도입하여 그 위에 부착하여 배양하는 방식을 이용하였다. 전기자극은 배양조건에 따라 다르게 주어졌는데, 2D 평면 배양시에는 1.7×103 세포/cm2의 세포밀도로 시딩(seeding)하고 다음날부터 1.5 μA, 250 μs, 100 Hz의 조건으로 4일 동안 자극하면서 배양하였고, 콜라겐 스캐폴드에 부착시켜 3D 배양시에는 5×105의 세포를 5 mm 크기의 콜라겐에 20 μl의 부피로 시딩하고 3 내지 4시간 동안 부착되도록 방치한 후 배양액을 첨가하고 다음날부터 20 μA, 250 μs, 100 Hz의 조건으로 4일 동안 자극하면서 배양하였다. 3D 입체배양을 위해 사용된 콜라겐 스캐폴드의 표면과 이에 인간 골수유래 성체줄기세포가 부착된 실험군 및 상기 콜라겐 스캐폴드에 성체줄기세포를 부착시키고 전기자극을 가한 실험군의 세포 형태를 배양 4일째에 주사전자현미경(scanning electron microscopy)으로 확인하였다.
주사전자현미경 관찰 결과, 콜라겐 스캐폴드의 표면은 세포가 증식하면서 침입해 들어갈 수 있는 다공성 표면을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었고, 본 발명의 줄기세포는 이러한 다공성 콜라겐 스캐폴드 상에 용이하게 부착되어 배양, 증식되었으며, 전기자극을 가한 경우에도 안정적으로 부착되어 배양, 증식되는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예 3: 실시간 역전사효소 -중합효소연쇄반응( real time reverse transcriptase-polymerase chain reaction ; real time RT - PCR )을 이용한 유전자 발현 분석
먼저, 입체 세포배양에 따른 유전자 발현량을 비교하였다. real time RT-PCR은 공지의 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 2D 평면배양시보다 콜라겐 스캐폴드에 부착 배양시킨 3D 배양의 경우 유전자 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로 3D 배양시 2D 배양에 비해 IGF-1(insulin-like growth factor-1)은 74배, BMP2(bone morphogenetic protein 2)는 59.4배, CXCL2(chemokine C-X-C motif ligand 2)는 13.1배, IL-8(interleukin-8)은 149배 및 VEGF(vascular endothelial growth factor)는 1.2배 증가하였다(도 3).
나아가, 3D 배양시 유전자 발현에 대한 전기자극의 영향을 확인하기 위하여 전기자극 부재시 및 존재시 3D 배양 2일차와 4일차에 유전자 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 골재생 관련 성자인자의 유전자 발현은 정도와 시기의 차이는 있으나 전기자극에 의해 증가함을 확인하였다. 즉, IGF-1 유전자는 배양 2일차에 1.6배로 증가하였으며, BMP2, VEGF, TGF-β 및 bFGF 유전자는 4일차에 각각 4.2배, 2.3배(데이터 보이지 않음), 2.3배 및 2.5배로 증가하였다. 한편, 줄기세포 및 초기 면역반응 관련 세포 이동촉진에 기여하는 사이토카인인 CXCL2와 IL-8 유전자의 발현도 4일차에 각각 2.8배와 2.5배로 증가하였다(도 4).
실시예 4: ELISA ( enzyme - linked immunosorbent assay )을 이용한 단백질 발현 분석
상기 실시예 3으로부터 3D 배양시 및/또는 전기자극을 적용시켜 배양시 골재생 관련 성장인자 및 줄기세포 및 초기 면역반응 관련 세포 이동촉진 사이토카인 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다. 이에 ELISA를 이용하여 상기 단백질들의 발현량을 비교 분석하였다.
구체적으로 세포를 3일간 배양한 후 배양액을 수거하여 배양액 중 골형성에 요구되는 혈관내피 성장인자(VEGF; vascular endothelial growth factor), 세포증식 및 발달에 중요한 역할을 하는 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 줄기세포 이동에 관여하는 사이토카인인 IL-8(interleukin-8)의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 혈관생성에 중요한 역할을 하는 VEGF의 경우 2D 평면배양시보다 콜라겐 스캐폴드를 이용한 3D 배양시 19배 더 높은 농도로 존재하였고, 2D와 3D로 배양하면서 전기자극(EC)을 주었을 때는 전기자극에 의해 각각 1.37배 및 1.13배 증가하였다. 한편 bFGF는 2D 배양시보다 3D 배양조건에서 약 2배 더 높은 농도로 존재하였으나 2D 배양에서는 전기자극에 의한 효과가 관찰된 반면 3D 배양에서는 관찰되지 않았다(데이터 보이지 않음). 마지막으로 사이토카인 IL-8은 3D 입체배양 만으로 2D 평면배양시보다 26.5배 높은 농도로 분비됨이 확인되었고, 전기자극에 의해 각각 1.38배 및 2.02배 더 증가하였다(도 5).
결론적으로 콜라겐 스캐폴드를 이용하여 3D 입체배양하는 것만으로 고농도의 성장인자 및 사이토카인(IGF-1, VEGF, BMP2, bFGF, CXCL2, IL-8)이 포함된 배양액을 얻을 수 있었고, 추가적인 전기자극으로 VEGF, bFGF 및 IL-8의 발현이 증가된 배양액을 확보할 수 있었다.
실시예 5: 줄기세포 배양액의 농축 및 농축된 배양액의 활성 평가
상기 실시예 2의 방법으로 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액을 단백질 농축필터(sartorius, vivaspin 2)를 이용하여 농축하였다. 상기 필터를 이용하여 1.5 ml의 배양액을 30 μl로 고농축시킬 수 있다. 표 1에는 2D 및 3D 배양시 배양액의 총 부피 및 이를 컬럼을 이용하여 농축하는데 소요되는 시간을 요약하였다.
그 결과, 콜라겐 스캐폴드에 세포를 부착시켜 배양하는 3D 배양조건을 이용할 경우, 1×106개의 세포 배양에 단지 3 ml의 배양액이 사용되는 반면, 배양접시에 평면(2D) 배양하는 경우 동일한 수의 세포를 배양하기 위해 14 ml의 배양액이 요구되고 따라서, 농축시간 역시 3.5배 이상 소요되었다. 이와 같은 결과는 본 발명의 3D 배양방법은 적은 양의 배지 및 짧은 시간으로 배양액을 농축할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
상기 실시예 3 및 4를 통해서 2D 배양으로부터 얻어진 배양액보다 3D 배양으로 얻어진 배양액에 성장인자 및 사이토카인이 보다 높은 농도로 존재함을 확인하였고, 동일한 수의 세포 배양에 사용되는 배양액의 부피 차로 인해 예상되는 농축 시간의 차를 감안하여 이후 단백질 농축필터를 이용한 배양액의 농축은 3D 배양액에 대해서만 실시하였다.
Figure 112012038503387-pat00001
표 2에는 여과 전과 여과 후 필터 내/외부에서 측정한 단백질의 농도를 열거하여 농축여부를 확인하였다. 약 10% 이내의 손실은 있으나 여과 전의 농도와 여과 후 필터 내부에 농축된 단백질의 농도가 유지되는 것으로 미루어 대부분의 배양액 중에 존재하는 발현이 증가된 성장인자 및 사이토카인이 필터 외부로 손실되지 않고 농축이 성공적으로 이루어졌음을 확인하였다.
Figure 112012038503387-pat00002
농축한 배양액은 분주하여 냉동보관 하였다가 이후 실험에서 필요에 따라 해동하여 사용하였다.
실시예 6: 세포 증식에 대한 줄기세포 농축 배양액의 영향
농축 배양액의 세포독성 및 세포증식에 대한 영향을 확인하기 위하여 대조군(con) 및 전기자극(EC)을 주어 배양하여 수득한 배양액을 농축하여 일반 배양액에 1, 2.5 및 5%의 비율로 혼합한 배양액으로 3일간 배양하고 세포 계수 키트-8(cell counting kit-8; CCK-8)을 이용하여 확인하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 농축 배양액 혼합물로 배양한 실험군들이 대조군보다 증가된 흡광도를 나타내는 것으로 미루어 농축 배양액으로 인한 세포독성은 나타나지 않는 것으로 확인되었다. 나아가, 1% 및 2.5%의 농축 배양액이 첨가된 실험군에서 각각 1.17배와 1.23배 높은 세포증식이 관찰되었다. 반면, 전기자극을 주어 배양하여 수득한 배양액의 농축액의 첨가가 세포증식에 미치는 영향은 유사하였다.
실시예 7: 골세포로의 분화에 대한 줄기세포 농축 배양액의 영향
본 발명의 줄기세포 농축 배양액이 줄기세포의 골세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ALP(alkaline phosphatase; 알칼리성 인산분해효소) 활성 및 알리자린 레드 S 염색(alizarin red S stain) 정도를 확인하였다. ALP는 신체의 여러 부위 특히 뼈와 간에 다량 존재하는 효소로 골형성세포인 골모세포(osteoblast)에 다량 존재하며, 알리자린 레드 S는 금속이온과 결합하는 성질이 있어 체내의 칼슘침착부 즉, 석회화(mineralization) 부위에 염색된다. 따라서, 상기 ALP 활성 및 알리자린 레드 S 염색의 정도로 골형성정도를 판단할 수 있다.
먼저 줄기세포를 대조군(con)과 골세포 분화조건(dex)으로 처리하였다. 대조군은 아스코르브산 및 β-글리세로포스페이트를 첨가한 배지에 배양하였고, 양성대조군인 골세포 분화조건으로는 대조군 배지에 덱사메타손(dexametasone)을 추가로 첨가하여 배양하였다. 실험군은 전기자극 존/부재하에 3D 배양하여 얻은 배양액을 농축한 것을 1% 또는 5% 함유한 배지를 사용하여 배양하였다.
도 8에는 상기 대조군 및 실험군들의 ALP 활성 측정 결과를 도시하였다. 그 결과, 대조군 배지에 덱사메타손만을 첨가한 골세포 분화조건에 비해 농축 배양액을 1% 또는 5% 함유한 배지를 사용한 경우 골세포로의 분화능이 16 내지 37% 증가하였다. 그러나 전기자극으로 인한 추가적인 증가는 관찰되지 않았다.
도 9에는 알리자린 레드 S 염색 결과를 나타내었다. 우선, 일반적인 배양배지를 이용한 음성대조군(con)을 제외한 양성대조군(Dex) 및 농축 배양액을 첨가한 배양액을 이용(3D-con 1%, 3D-EC 1%, 3D-con 5% 및 3D-EC 5%)하여 골세포로 분화를 유도한 후 21일째에 10% 포르말린(formalin)으로 세포를 고정한 후 증류수로 고정액을 제거하였다. 이어 알리자린 레드 S 염색 용액을 넣고 5 내지 10분간 반응시킨 후 증류수로 염색용액을 제거하고 PBS에서 15분 정도 방치하였다. 염색된 골세포로 분화시킨 줄기세포는 사진을 촬영하여 육안으로 골세포로의 분화정도를 확인하고 이어서 정량하기 위하여 탈색과정을 수행하였다. 탈색용액(de-stain solution)과 15분간 반응시킨 후 수득한 용액을 가지고 595 nm에서 ELISA를 수행하여 알리자린 레드 S 염색 정도를 정량적으로 비교하였다. 정량하여 수치로 나타낸 염색된 알리자린 레드 S의 농도는 앞선 육안으로 평가한 결과와 일치하였다. 즉, 양성대조군(Dex) 및 전기자극 없이 3D 배양하여 얻은 농축 배양액을 1% 함유한 배양액으로 분화시킨 실험군(3D-con 1%)에서는 골세포로 분화정도가 미미하였으나, 전기자극 과 함께 3D 배양하여 얻은 농축 배양액을 1% 또는 5% 함유한 배양액으로 분화시킨 실험군(3D-EC 1%, 3D-EC 5%) 및 전기자극 없이 3D 배양하여 얻은 농축 배양액을 5% 함유한 배양액으로 분화시킨 실험군(3D-con 5%)에서는 골세포로의 분화가 활발하게 이루어진 것을 확인하였다.
실시예 8: 동물실험모델을 이용한 농축 배양액의 골형성 활성 평가
농축하여 냉동보관한 배양액을 해동시켜 랫트 두개관 결손 모델에 이식하여 생체 내 골형성 활성 정도를 확인하였다. 랫트의 두개골 좌우에 천공기(trephine bar)를 이용하여 지름 5 mm의 두개관 결손을 형성한 후, 성체줄기세포, 3D 배양으로 수득한 농축 배양액(media-C) 및 전기자극을 주어 3D 배양하여 수득한 농축 배양액(media-EC)을 생분해성 고체 지지체인 콜라겐 스캐폴드에 로딩시켜 손상부위에 이식한 후 2주 및 4주에 치사시켜 골재생 정도를 확인하였다. 도 10에는 두개관 결손 모델 제작과정 및 이식체의 이식과정을 나타내었다.
실시예 9: 농축 배양액의 염증반응 유발 여부 확인
이식된 농축 배양액에 의해 염증반응이 유발되는지 여부를 확인하기 위하여 이식 2주 후 이식받은 랫트를 치사시켜 조직 절편을 제작하여 H&E 염색으로 염증세포를 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 줄기세포를 이식한 그룹(Cell) 및 농축 배양액(Media-Con 및 Media-EC) 이식군에서 염증세포로 보이는 세포는 확인되지 않았다. 즉, 이식된 줄기세포 및 농축 배양액으로 인한 염증반응은 유발되지 않았다. 그러나, 이식된 콜라겐은 아직 일부 남아있는 것으로 확인되었다.
실시예 10: 농축 배양액의 줄기세포 이동촉진 효과
실시예 9와 동일한 방법으로 랫트 두개골에 두 개의 결손을 제작하고 한쪽에는 일반 배양액을 로딩한 스캐폴드를, 다른 한쪽에는 3D 배양으로 얻은 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드를 이식하였다. 이식한 다음날 랫트의 꼬리 정맥을 통해 형광염료인 Dil이 표지된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포(hBMSC) 5×106 개를 주입하고 4일 후 관류하여 치사시켰다. 양성대조군은 동일한 실험동물모델에 농축 배양액 대신 줄기세포 이동촉진 물질로 알려진 SDF-1(50 μg/ml)을 이용하여 제작하였다. 줄기세포의 이동 확인은 랫트를 치사시킨 후 스캐폴드를 회수하여 냉동절단하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 일반 배양액을 주입한 대조군에서는 꼬리로부터 주입한 인간 골수유래 줄기세포의 형광을 관찰할 수 없었으나, 양성 대조군 및 실험군에서는 관찰되었다. 결론적으로, 줄기세포의 농축 배양액은 줄기세포 이동촉진 효과를 갖는 물질을 다량 함유하여 줄기세포 이동촉진 물질인 SDF-1을 주입하였을 때와 유사하게 줄기세포 이동을 촉진시킬 수 있음을 확인하였고, 이는 조직으로 직접 분화할 수 있는 줄기세포의 이식 없이 배양액만을 이식함으로써 상처부위로의 생체 내 자가 줄기세포의 이동을 촉진하여 조직 재생을 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 11: 농축 배양액의 골재생 효과
<11-1> 마이크로 CT 를 이용한 골형성 정도의 정량 분석
3차원 마이크로 CT 촬영을 통해 이식된 줄기세포 또는 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드로부터의 골형성 정도를 정량적으로 분석하였다(도 13). 대조군으로는 줄기세포를 3D 콜라겐 스캐폴드에 부착시켜 4일간 배양시킨 후 이식한 Cell 그룹을 이용하였다. 실험군(Media-C 및 Media-EC)으로는 세포가 없는 동일한 스캐폴드에 농축 배양액을 로딩하여 이식하였고, 이는 Cell 그룹보다 각각 219 및 277% 증가된 신생 골형성 부피(BV; bone volume)를 나타내었다. 망상골의 수(trabecular bone number) 또한 202 및 270% 증가하였으나, 형성된 망상골의 분포 및 두께(trabecular separation and thickness)는 모든 그룹에서 비슷하게 형성되었다. 전기자극을 주어 배양하여 수득한 농축 배양액에서 전기자극에 의한 시너지 효과는 나타나지 않았으나, 전기자극 유무와 상관없이 3D 배양하여 얻은 농축 배양액을 이식한 실험군이 줄기세포를 이식한 대조군보다 뛰어난 골재생 효과를 나타내었다. 도 14에는 마이크로 CT 촬영으로 얻은 3차원 이미지를 나타내었다. 골결손 모델에 줄기세포 또는 농축 배양액을 로딩한 후 4주 뒤에 새롭게 형성된 골(노란색)의 형태를 이미지로 제작하였다. 신생 골조직(노란색)이 줄기세포를 이식한 대조군(Cell)에서 보다 농축 배양액을 이식한 실험군(Media-C 및 Media-EC)에서 더 많이 관찰되었고, 이는 앞선 마이크로 CT 분석 결과와 일치하였다.
<11-2> 조직학적 염색을 이용한 골형성 평가
줄기세포 또는 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드로부터의 신생 골조직을 분석하기 위하여 마송 삼색 염색법(Masson trichrome stain)을 이용하여 조직학적으로 확인하였다. 실시예 8에 기술된 방법으로 제조된 랫트 두개관 결손 모델에 줄기세포 또는 농축 배양액을 로딩한 스캐폴드를 이식하고 4주 후 치사시켜 염색하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, 신생 골조직은 상기 마이크로 CT 정량적인 분석 결과 및 3차원 이미지와 일치하게 줄기세포를 이식한 대조군(Cell)보다 농축 배양액을 이식한 실험군(Media-C 및 Media-EC)에서 보다 많이 관찰되었다. 구체적으로 줄기세포를 이식한 그룹은 신생 골조직은 거의 확인되지 않고 고체 지지체로 함께 이식한 콜라겐 스캐폴드만이 관찰되었다. 반면, 농축 배양액을 이식한 경우 신생 골조직이 상당량 관찰되었고 이와 비례하여 콜라겐 스캐폴드는 분해되어 감소한 것을 확인할 수 있었다.

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  10. 골수유래 중간엽 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하여 제조한 IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β1(transforming growth factor-beta 1), bFGF(basic fibroblast growth factor), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 성장인자 또는 CXCL2(chemokine C-X-C motif ligand 2) 또는 IL-8(interleukin-8)인 사이토카인을 포함하는 농축 배양액을 유효성분으로 포함하는 골조직 재생용 조성물.
  11. (a) 골수유래 중간엽 성체줄기세포를 스캐폴드에 부착하여 3차원 배양하여 제조한 IGF-1(insulin-like growth factor-1), TGF-β1(transforming growth factor-beta 1), bFGF(basic fibroblast growth factor), BMP2(bone morphogenetic protein 2) 또는 VEGF(vascular endothelial growth factor)으로 이루어진 군에서 선택되는 성장인자 또는 CXCL2(chemokine C-X-C motif ligand 2) 또는 IL-8(interleukin-8)인 사이토카인을 포함하는 배양액을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 배양액을 이식용 스캐폴드에 로딩하는 단계를 포함하는,
    배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는, 골조직 재생용 이식체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 이식용 스캐폴드는 생분해성 물질인 것인 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 생분해성 물질은 콜라겐인 것인 제조방법.
  14. 제11항의 방법으로 제조된 배양액을 로딩한 이식용 스캐폴드를 포함하는 골조직 재생용 이식체.
  15. 제10항에 있어서, 상기 배양은 추가적으로 골수유래 중간엽 성체줄기세포에 전기자극을 주어 배양하는 것인, 골조직 재생용 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 상기 스캐폴드는 콜라겐 스캐폴드인 것인, 골조직 재생용 조성물.
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권구한, 단국대학교 대학원, 석사학위논문 (2006.12.) *
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