KR101537474B1 - 고효율 자가발광 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

고효율 자가발광 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양자점(quantum dot) 및 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 포함하는 자가발광 나노복합체 등에 관한 것으로서, 상기 자가발광 나노복합체, 표적 암 특이성 분자 및 친수성 고분자를 포함하는 표적 특이성 자가발광 나노복합체, 상기 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 항암제를 담지한 선형핵산 복합체와 결합한 금 나노입자를 포함하는 기능성 항암 신약 및 상기 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물, 그리고 양자점(quantum dot) 및 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 가교제와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 자가발광 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고효율 자가발광 나노복합체는 표적 지향성을 가지는 분자와 화학적으로 결합함으로써 높은 표적지향성을 가질 수 있기 때문에, 나노미터 크기의 레이저 광원을 이용한 암 치료에 효과적으로 사용될 수 있으므로, 나노광학치료 (Nonoptic therapeutics)의 새로운 패러다임을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고효율 자가발광 나노복합체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암용 조성물 {SELF-ILLUMINATIVE NANOCOMPLEXES, PREPARATION METHOD THEREOF AND ANTICANCER COMPOSITION COMPRISING THEREOF}
본 발명은 양자점(quantum dot) 및 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 포함하는 자가발광 나노복합체 등에 관한 것이다.
기존 의료 분야에서 이용되는 레이저 광원은 실험자의 숙련도에 지나치게 의존적일 뿐더러 생체 내 투과율이 상당히 떨어지는 단점이 존재한다. 다시 말해 오늘날 피부조직 등에 사용되는 레이저 요법은 레이저 광원 자체의 우수한 해상력에도 불구하고 레이저 조사 면적을 비교적 넓게 가져가야 하기 때문에, 치료가 필요한 표적 조직 주변의 정상세포에까지 손상을 입히는 부작용을 감수해야 한다.
또한 레이저의 생체 내 투과율이 상당히 미미하기 때문에, 대기와 접하는 상피 조직 및 점막 조직 외에 내부 장기에까지 레이저 요법을 적용하기에는 상당한 제약이 따르고 있다.
이러한 단점을 보완함과 동시에 레이저 광원의 우수성 (고해상도 및 고집적 에너지 전달능)을 활용하기 위한 방편으로, 오늘 날에는 컴퓨터를 이용하여 레이저 조사 부위를 조절하거나, 내부 장기에 직접 레이저를 조사하기 위하여 상피 조직을 국소 절개 후 다빈치 로봇 등을 이용해 레이저 광원부를 직접 표적 장기에 위치시키는 방법들이 이용되고 있다.
하지만 이러한 방법들은 각막과 같이 표적 부위가 고정된 상태에서만 가능 하거나 수술 후 외상 등이 남기 때문에, 앞서 언급한 문제점들을 원천적으로 극복하였다고 보기 힘들다.
따라서 이러한 문제점들을 해결하기 위해 현재 이용되는 방법들과는 상이한, 보다 원론적인 치료 방법의 개선이 요구되고 있는 상황이다.
이에 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여, 높은 표적 특이성을 가지는 핵산, 강한 발광 능력을 가지는 변형된 자가 발광 단백질, 비선택적 상호작용을 억제하는 폴리에틸렌글리콜 및 높은 형광 효율을 보이는 양자점으로 구성된 자가 발광 나노복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 양자점(quantum dot) 및 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 포함하는 자가발광 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 자가발광 나노복합체, 표적 암 특이성 분자 및 친수성 고분자를 포함하는 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제를 담지한 선형핵산 복합체와 결합한 금 나노입자를 포함하는 기능성 항암 신약, 및 상기 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 양자점(quantum dot) 및 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 가교제와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 자가발광 나노복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 포함하는 자가발광 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 자가발광 나노복합체는 800nm 근적외선 영역에서 발광하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자가발광 나노복합체, 표적 암 특이성 분자 및 친수성 고분자를 포함하는 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표적 특이성 분자는 표적 암 항원에 특이적으로 결합 할 수 있는 분자로서, 핵산 압타머, 항체, 효소, PNA, 리간드, 또는 화합물일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리바이닐알콜(PVA) 및 폴리바이닐아세테이트(PVAc)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 직장암, 담낭관암, 결장암, 췌장암, 난소암, 기관지암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암 또는 그 외 암 특이적 항원을 과발현하는 고형암일 수 있다.
이에 더하여, 본 발명은 항암제를 담지한 선형핵산 복합체와 결합한 금 나노입자를 포함하는 기능성 항암 신약, 및 상기 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 마이토잔트론(mitoxantrone) 및 에피루비신(Epirubicin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항암제 또는 그 외 방향족 고리를 가짐으로써 핵산에 물리적으로 담지되어 세포대사경로를 파괴하는 항암제일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 선형핵산은 5' 말단에 티올기를 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 선형핵산은 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 금 나노입자는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)가 제거된 것일 수 있다.
나아가 본 발명은 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 가교제와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 자가발광 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 양자점 및 변형된 자가발광 단백질은 1:80 내지 1:600의 비율로 혼합하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 가교제는 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 반응은 상온에서 60분 내지 120분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 고효율 자가발광 나노복합체는 고효율의 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)이 487nm 파장대에서 강한 발광 능력을 보임과 동시에 나노 스케일의 근접 거리에 위치하고 있는 양자점과의 생물학적 발광에너지 공명 전이 현상 (Bioluminescence resonance energy transfer, BRET)을 통해 양자점에서 800nm 에서의 강력한 빛을 발산하게 되는데, 이는 레이저를 이용한 항암 치료에서 자주 사용되는 근적외선 영역의 빛 에너지로써, 기능성 항암 신약과 같이 800nm 빛에 특이적으로 반응하는 항암 신약과의 상호 작용에 의해 목표 암세포를 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 고효율 자가발광 나노복합체 표면에 폴리에틸렌글리콜 및 그 위에 표적 지향성을 가지는 핵산 압타머를 화학적으로 결합시킴으로써 해당 나노복합체가 표적이 아닌 정상 세포에 미치는 영향을 최소화하여 높은 표적지향성을 가질 수 있다. 이는 나노미터 크기의 레이저 광원 및 이와 상호작용하는 기능성 항암 신약 자체를 표적 암세포 내로 이입시켜 표적 암세포 내에서 일련의 레이저 치료 과정이 모두 일어남으로써 기존 레이저 치료의 문제점들을 근본적으로 해결할 수 있을 것으로 기대되며, 나노광학치료 (Nonoptic therapeutics)의 새로운 패러다임을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 야생형(wild type) 루시페라아제에 돌연변이를 준 변형된 자가발광 단백질 (m-Rluc8)의 아미노산 서열(서열번호 1)을 나타낸 것이다.
도 2는 변형된 자가발광 단백질 (m-Rluc8)이 야생형의 루시페라아제보다 5.65배 강한 발광 능력을 나타냄을 보여주는 그래프로서, 빨간 원이 변형된 자가발광 단백질을 나타내며 파란색 원이 야생형의 루시페라아제 단백질을 나타낸다.
도 3은 양자점에 변형된 자가발광 단백질 (m-Rluc8) 을 여러 당량비로 반응 시켰을 때, (a) 발광 능력을 확인 한 그래프 및 (b) 분자량 변화에 따른 아가로스 젤 전기영동 사진이다.
도 4는 자가발광 나노복합체의 표적 특이적 세포 내 이입 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 독소루비신이 선형핵산에 담지 되는 정도에 따라 변화하는 자가형광 (autofluorescence) 세기를 측정한 결과이다.
도 6은 금 나노 입자체 표면에 독소루비신을 담지하고 있는 선형 핵산을 결합 시키기 전 후의 금 입자체 표면 특성 변화를 측정한 결과이다.
도 7은 자가발광 나노복합체 및 이와 상호작용하는 기능성 신약에 의한 독소루비신 방출 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 자가발광 나노복합체 및 이와 상호작용하는 기능성 신약의 작용 경로를 간략히 나타낸 모식도이다.
본 발명자들은 고효율의 발광능력을 보이는 자과발광 나노복합체 및 이와 상호작용하는 기능성 항암신약에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 포함하는 자가발광 나노복합체를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 강한 자가발광 능력을 가지는 광원을 얻기 위하여 야생형 레닐라 루시페라아제(Renilla luciferase) 단백질에 인위적 돌연변이를 8군데 일으켜, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는, 야생형에 비해 약 5.6 배 발광 능력이 뛰어난 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 생산하였으며, 이때, 돌연변이를 일으킨 위치는 아미노산 서열상 55번, 124번, 130번, 136번, 143번, 185번, 253번, 및 287번이다(도 1 참조). 이로써 루시페라아제 단백질과 기질(coelenterazine-h) 간의 결합 부위를 강하게 유도함과 동시에 단백질 구조상 열역학적으로 불안정한 소수성 부위를 친수성 아미노산으로 치환하여 보다 안정적인 단백질 구조를 형성하도록 했다(실시예 1 참조). 그리고 상기 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 양자점에 결합시킴과 동시에 양자점에서의 최대한 고효율의 발광 능력을 얻기 위하여 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)과 양자점의 당량비를 다르게 하여 실험한 결과, 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)과 양자점을 500 : 1 비율로 반응 시킨 나노복합체가 800nm 파장에서 가장 강한 빛을 발산함을 확인하였다(실시예 2 참조).
상기에서, 양자점과 자가발광 단백질은 가교제에 의해 화학적 결합을 형성하기 때문에 양자점의 종류는 어느 하나에 제한되지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 자가발광 나노복합체에 적용할 수 있는 양자점의 형광능력은 특정 파장대에 국한되지 않는다. 바람직하게는 800nm 의 근적외선 영역의 빛을 발산하는 양자점을 사용 할 수 있으며, 근적외선 영역의 빛은 생물학적 환경 내에서 노이즈가 적기 때문에 빛을 이용한 선택적 치료가 용이한 장점이 있다.
상기로부터 본 발명은 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 가교제와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 자가발광 나노복합체의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 양자점 및 변형된 자가발광 단백질은 1:80 내지 1:600의 비율로 혼합하는 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 가교제는 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)일 수 있으나 양자점과 자가발광 단백질의 화학적 결합을 가교 역할할 수 있는 물질이라면 이에 한정되지 않고 사용할 수 있다.
상기 자가발광 나노복합체는 양자점, 자가발광 단백질 및 가교제를 상온에서 60분 내지 120분 동안 반응시킴으로써 제조될 수 있으며, 가장 바람직하게는 본 발명의 일실시예와 같이 90분 동안 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 양자점 또는 가교제의 종류 등 조건에 따라 당업자에 의해 적절하게 조절될 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 상기 m-Rluc8 단백질에 양자점을 결합시킨 자가발광 나노복합체의 비특이적 반응성을 지양하기 위해, 친수성 고분자로 말단에 -NHS 작용기를 지닌 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용하여 m-Rluc8 표면의 일차 아민기(-NH2)와 반응시킴으로써 펩타이드 결합(-CONH-)을 형성하도록 했다. 그리고 자가발광 나노복합체의 표적 특이성을 부여하기 위해, 폴리에틸렌글리콜의 또 다른 말단에 존재하는 말레이미드(maleimide) 작용기와 표적 암 특이성 분자인 핵산 압타머의 5’ 말단에 존재하는 티올기(-SH)를 반응시켜, 핵산 압타머를 나노 복합체에 화학적으로 결합시켰다(실시예 3 참조).
따라서 본 발명은 상기 자가발광 나노복합체, 표적 암 특이성 분자 및 친수성 고분자를 포함하는 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 제공할 수 있으며, 상기 표적 특이성 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기에서 표적 암 특이성 분자와 친수성 고분자의 결합은 화학적 결합으로 표적 암 특이성 분자의 종류와 무관하기 때문에 사용할 수 있는 암 세포 표적지향성을 가지는 분자의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 특정 항원에 특이적으로 결합 할 수 있는 분자를 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 표적 암 특이성 핵산 압타머, 항체, 효소, PNA, 리간드, 또는 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 핵산 압타머 분자의 예로 A10 핵산 압타머를 사용하였는데, A10 핵산 압타머는 전립선 암세포 중에서 전립선 특이적 막항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)이 과발현되는 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이를 이용하여 A10 압타머가 결합된 자가발광 나노복합체가 전립선암에 특이적으로 이입될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한, 표적 암 특이성 분자의 종류에 제한이 없기 때문에 본 발명의 자가발광 나노복합체를 포함하는 조성물을 이용하여 치료할 수 있는 암의 종류에도 제한이 없으나, 바람직하게는 전립선암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 직장암, 담낭관암, 결장암, 췌장암, 난소암, 기관지암 또는 방광암 등의 암 특이적 항원을 과발현하는 고형암을 치료할 수 있다.
상기에서 친수성 고분자는 가리움 효과(screening effect)를 통해 나노복합체와 세포의 비특이적 상호작용을 억제할 수 있는 물질이라면 어느 하나에 제한되지 않고 사용할 수 있으나, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리바이닐알콜(PVA), 또는 폴리바이닐아세테이트(PVAc) 등의 물질을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 본 발명의 일실시예에 따라 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 사용할 수 있다.
이에 더하여, 본 발명자들은 자가발광 나노복합체와 상호작용 하는 기능성 항암신약을 개발하기 위해, 5' 말단에 티올기 (-SH) 를 가지고 있는 선형핵산에 항암제를 물리적으로 포획시킨 후, 금 나노입자를 화학적으로 결합시킨 기능성 항암 신약을 제조하였다. 즉, 본 발명의 일실시예에서는, 서열번호 2와 서열번호 3의 염기 서열로 구성되는 선형핵산과 항암제 독소루비신(doxorubicin)을 결합시켜 항암제를 담지한 선형핵산 복합체를 제조(실시예 4-1 참조)하였다.
이때, 항암제의 방향족 고리(aromatic ring)는 선형핵산의 서열 사이에 끼어들어가며, 특히, 선형핵산의 특정서열(5'-CG-3', 5'-GC-3')을 선호한다. 따라서 본 발명의 선형핵산에 결합할 수 있는 항암제의 종류에는 방향족 고리를 가지고 있는 항암제, 다시 말해, 방향족 고리를 가짐으로써 핵산에 물리적으로 담지되어 세포대사경로를 파괴하는 종류의 항암제라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 마이토잔트론(mitoxantrone), 또는 에피루비신(Epirubicin) 등의 항암제를 결합시킬 수 있다.
또한, 상기 항암제를 담지하는 선형핵산의 5' 말단에는 티올기(-SH)가 붙어있어 금 나노입자와 공유결합에 의해 쉽게 결합되기 때문에, 본 발명의 일실시예에서는 항암제를 담지한 선형핵산에 금 나노입자를 결합시켜 기능성 항암신약을 제조하였다(실시예 4-2 참조). 금 나노입자에 근적외선(near infrared rays)을 조사하면 금 나노입자의 표면온도가 증가되기 때문에 선형핵산에 결합되어 있는 항암제의 방출을 촉진시킬 수 있다.
상기와 같이, 본 발명의 자가발광 나노복합체는 800nm 의 빛을 발산하고 기능성 항암 신약은 800nm 의 특정 빛에 반응하여 항암 효과를 나타내기 때문에, 외부 레이저 광원이 없이도 두 가지 나노입자체의 상호작용에 의한 항암제 방출이 가능하다.
이와 관련하여, 본 발명의 일실시예에서는 자가발광 나노복합체와 기능성 항암 신약의 상호작용에 의해 항암제인 독소루비신의 방출량이 증가되는 것을 확인하였으며(실시예 5 참조), 자가발광 나노복합체가 전립선 특이적 막 항원이 과발현하는 세포에 특이적으로 결합하는 핵산 압타머와 결합하여 표적 암인 전립선암 특이성을 가짐을 확인하였다(실시예 3 참조). 즉, 본 발명에 따른 상기 자가발광 나노복합체는 표적 특이성을 지니기 때문에, 상기 암 치료의 모든 기작은 표적 세포 특이적으로 이루어지며, 자가발광 나노복합체 및 기능성 항암신약의 기작에 대한 개략적인 모식도는 도 8에 나타낸 바와 같다.
따라서 본 발명은 항암제를 담지한 선형핵산 복합체와 결합한 금 나노입자를 포함하는 기능성 항암 신약, 및 상기 자가발광 나노복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 선형핵산은 5' 말단에는 티올기(-SH)가 붙어있는 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 5' 말단 특정 염기서열(5'-CG-3', 5'-GC-3')을 가지는 것을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 선형핵산을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 금 나노입자는 항암제를 담지한 선형핵산 복합체와 반응시키기 전에 금 나노입자 용액에서 계면활성제인 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)을 제거하고 세척한 것을 사용할 수 있으나, 순수한 금 나노입자라면 이에 한정되지는 않고 사용할 수 있다.
상기로부터 본 발명의 자가발광 나노복합체는 표적 특이성을 가지며 기존 광학 치료의 난점을 획기적으로 개선 가능하기 때문에, 나노 광학 치료 (Nonoptic therapeutics)의 새로운 기준을 제시할 것으로 기대된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
변형된 자가발광 단백질(m- Rluc8 )의 발현
고효율의 자가발광 광원을 얻기 위하여, 야생형(wild type)의 루시페라아제(Luciferase) 아미노산 서열에 인위적 돌연변이를 일으킨 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 대장균 내에서 발현시킨 후 정제하였다. 즉, 도 1에 나타낸 아미노산 서열(서열번호 1)로 구성되는 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 삽입한 발현벡터(m-Rluc8_pPAL7)를 제조한 다음, 상기 벡터를 대장균(E.coli) BL21 균주 세포 내로 도입(transformation)시켜 발현시키고, 정제 과정을 거쳐 고순도의 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)을 얻었다.
동일 방법으로 정제한 야생형 루시페라아제와 발광 능력을 비교한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 5.65 배 이상 높은 발광 효율을 나타냄을 확인하였다.
자가발광 나노복합체의 제조
변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)과 양자점(quantum dot)의 결합을 통해, 800nm 영역에서 자가발광 능력을 가지는 나노복합체를 제조하였다. 자과발광 나노복합체는 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)과 양자점 간의 생물학적 발광에너지 공명 전이 현상(Bioluminescence resonance energy transfer, BRET)을 통해서 자가발광하게 된다.
800nm 근적외선 영역에서의 최고효율의 발광 능력을 보이는 자가발광 나노복합체를 제작하기 위하여, 본 발명자들은 양자점과 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)의 당량비를 서로 다르게 하여 나노복합체를 제작하였는데, 양자점 20 pmole 당 자가발광 단백질의 비율을 각각 80, 120, 160, 200, 240, 280, 320, 400, 500 및 600배로 다르게 하여, 2 mM 의 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide 가교제와 함께 상온에서 90분 동안 반응시켰다. 상기 가교제는 양자점 표면에 있는 카르복실기(-COOH)와 변형된 자가발광 단백질 표면의 1차 아민기(-NH2)를 화학적으로 결합시켜 펩타이드 결합(-CONH-)을 형성하게 함으로써, 양자점 주변에 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)이 다층 구조를 형성하게 되고, 자가발광 단백질이 발광할 때 양자점에서의 생물학적 발광에너지 전이 현상에 의해 800nm 의 빛을 함께 발산하게 된다. 이때, 양자점 주위의 변형된 단백질(m-Rluc8)의 다층 구조가 심해져 최외곽 단백질과 양자점간의 거리가 멀어지게 되면, 더 많은 변형된 단백질(m-Rluc8)이 결합된다 해도 양자점의 발광 효율에 영향을 미치지 못하는 임계점이 존재한다. 즉, 이 임계점 이후로는 단백질이 더 많이 결합 되더라도 800nm 파장에서의 발광 효율은 증가하지 않지만, 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8) 발광 영역인 487nm 파장에서의 발광량은 계속 증가하게 된다.
변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8) 비율에 따른 임계점을 확인한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 양자점 대비 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)의 당량비를 500배 이상 반응 시켜도 더 이상 800nm 에서의 발광능력은 증가하지 않음을 확인하였다.
또한, 0.5% 아가로스 젤, 0.5X TAE 러닝 버퍼 및 100V 전기영동 조건에서 전기영동한 결과, 도 3(b)에 나타낸 바와 같이, 변형된 자가발광 단백질(m-Rluc8)이 양자점에 결합되는 정도에 따라 전기영동도에 차이를 보이는 것으로 나타났다.
자가발광 나노복합체의 표적 특이성 확인
자가발광 나노복합체의 무작위적 세포 내 이입을 방지하고 표적 특이성을 향상시키기 위하여, 자가발광 나노복합체 표면에 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol) 및 A10 핵산 압타머를 화학적으로 결합시켰다. 폴리에틸렌글리콜은 고친수성 물질로써 가리움 효과(screening effect)를 통해 나노복합체와 세포의 비특이적 상호작용을 억제할 수 있기 때문에, 옥시에틸렌(oxyethylene) 단량체 24개로 구성된, 양단에 -NHS 작용기와 말레이미드 작용기를 모두 가진 폴리에틸렌글리콜을 사용하였으며, 상기 작용기들은 상온에서 각각 1차 아민 (-NH2) 및 카르복실기 (-COOH) 와 반응하여 화학결합을 빠르게 형성한다. 이에, 자가발광 나노복합체 : 폴리에틸렌글리콜 : A10 핵산 압타머의 비율을 1 : 100 : 100 으로 혼합한 후 25 ℃ 에서 90분 동안 반응시켜, 표적 특이성을 지닌 자가발광 나노복합체를 형성하였다. 상기 자가발광 나노복합체가 세포 내 특이적으로 전달되는지 확인하기 위하여, 전립선 암세포(LNCaP cell line) 및 대조군 전립선 암세포(PC3 cell line)를 1×105 cells 가 되도록 24 well plate 에 담고 37 ℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 cell line 당 A10 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 자가발광 나노복합체 또는 폴리에틸렌글리콜만이 결합된 자가발광 나노복합체를 각 10 nM 조건에서 2시간 동안 반응시킨 후, 새로운 RPMI 1640 배지로 교환하여 세포 외부에 잔류하는 자가발광 나노복합체를 제거하고 유세포분석장치를 통해 세포 내로 이입된 자가발광 나노복합체의 형광세기를 측정 하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, A10 핵산 압타머를 가지고 있는 자가발광 나노복합체는 A10 핵산 압타머를 가지고 있지 않은 자가발광 나노 복합체 보다 현저하게 높은 표적 세포 특이성을 보임을 확인하였다.
상기 결과는 자가발광 나노복합체의 A10 압타머가 전립선암세포 특이적 막항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)에 결합하여 자가발광 나노복합체를 세포 내로 전달하였으며, 자가발광 나노복합체를 효과적으로 원하는 암세포 내부로 전달할 수 있다는 것을 의미한다.
기능성 항암신약의 제조
<4-1> 독소루비신 항암제를 담지하고 있는 선형 핵산의 제조
핵산 기반 기능성 항암신약에 독소루비신을 담지하기 위하여, 서열번호 2 (5'-CGAGTAGGTACGGATCTGGCTGTACTGATGTGCCTGCGAC-3') 및 서열번호 3 (5'-/티올/GTCGCAGGCACATCAGTACAGCCAGATCCGTACCTACTCG-3') 의 선형핵산을 사용하였다. 독소루비신이 결합되어 있는 선형핵산을 제조하기 위하여, 상기 선형핵산과 독소루비신을 다양한 농도(선형핵산 : 독소루비신 = 1 : 1 내지 1 : 20)로 혼합하고 실온에서 24시간 반응시킨 후 독소루비신의 자가형광(autofluorescence)을 측정하였다. 선형핵산 내에 독소루비신이 포획되면, 용액 내에 잔류하는 독소루비신의 농도가 감소되어 독소루비신에 의한 자가형광도 함께 감소하게 된다.
측정결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 용액 내 잔류하는 독소루비신의 농도가 감소됨에 따라 형광강도가 감소되는 것으로 나타났으며, 1:10 이하의 농도비율에서는 거의 동일한 형광강도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 1μM의 선형핵산당 최대 10μM의 독소루비신이 결합될 수 있으며, 선형핵산/독소루비신 복합체를 제조하기 위한 최적의 혼합 비율이 1:10임을 의미한다.
<4-2> 독소루비신 항암제를 담지하고 있는 선형 핵산과 금 나노 입자 복합체의 제조
상기 서열번호 3의 선형핵산은 5' 말단에 티올기(-SH)를 가지고 있어서 금 나노입자와의 공유결합이 용이하다. 금 나노입자와 상기 항암제를 담지한 핵산 구조체를 결합시키기 위해, 금 나노입자를 원심분리기로 1회 세척하여 세틸트리메틸암모늄브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)를 제거한 다음 세척된 금 나노입자와 상기 항암제를 담지한 핵산 구조체를 혼합하여 실온에서 16 시간 반응시켰다. 제조된 다기능성 핵산 기반 항암제는 원심분리방법을 통하여 결합되지 않은 항암제를 담지한 핵산 구조체 및 금 나노입자와 분리하였다. 제조된 금 나노입자와 항암제를 담지한 선형 핵산 복합체를 확인하기 위하여 금 나노입자체의 표면 전위를 Electrophoresis light scattering 장비를 이용하여 측정하였다. 선형 핵산 구조체와 반응시키기 전의 금 나노입자는 CTAB 이중층으로 인해 +표면 전위를 띄고, 선형 핵산 구조체는 강한 -전하를 띄고 있다.
측정결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자와 항암제를 담지한 선형 핵산 복합체는 -전하를 띄는 것을 확인할 수 있었다.
상기와 같이, 기능성 항암신약으로 금 나노입자와 항암제를 담지한 선형 핵산 복합체를 제조하였다.
자가발광 나노복합체 및 이와 상호작용하는 기능성 항암 신약에 의한 독소루비신 방출 효과 확인
고효율 자가발광 나노복합체와 상호작용하여 기능성 항암 신약으로부터 독소루비신이 방출되는지 확인하기 위해, 10 pmole 의 자가발광 나노복합체, 7.4 nM 의 기능성 항암신약 및 5 mg 의 실렌테라진-h(coelenterazine-h)을 반응시킨 후, 형광강도를 측정함으로써 독소루비신의 방출 효과를 확인 하였다.
형광강도를 측정한 결과, 도 7 (a)에 나타낸 바와 같이, 실렌테라진-h 에 의해 빛이 방출되는 시점으로부터 약 90초 동안 독소루비신의 형광강도가 증가하는 것을 확인 하였다. 이는 독소루비신이 방출됨에 따라 용액 내에 잔류하는 독소루비신의 농도가 증가하여 독소루비신에 의한 자가형광 세기가 증가한 결과이다
상기 결과는 자가발광 나노복합체 10 pmole 과 실렌테라진-h 만을 반응시켰을 때, 도 7 (b)에 나타낸 바와 같이, 약 90초 이후 발광량이 평형상태를 이루는 결과와 강한 인과관계가 있음을 확인 할 수 있다.
즉, 상기 결과는 자가발광 나노복합체 및 이와 상호작용하는 기능성 항암 신약의 상호작용에 의해 독소루비신이 효과적으로 방출 되고 있음을 명백히 보여주는 것이며, 더불어 본 발명의 목적인 나노복합체와 기능성 항암 신약 간에 능동적 상호작용이 가능함을 확인해 주는 결과이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> SELF-ILLUMINATIVE NANOCOMPLEXES, PREPARATION METHOD THEREOF AND ANTICANCER COMPOSITION COMPRISING THEREOF <130> PB14-11938 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Renilla luciferase <400> 1 Met Ala Ser Lys Val Tyr Asp Pro Glu Gln Arg Lys Arg Met Ile Thr 1 5 10 15 Gly Pro Gln Trp Trp Ala Arg Cys Lys Gln Met Asn Val Leu Asp Ser 20 25 30 Phe Ile Asn Tyr Tyr Asp Ser Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val Ile 35 40 45 Phe Leu His Gly Asn Ala Thr Ser Ser Tyr Leu Trp Arg His Val Val 50 55 60 Pro His Ile Glu Pro Val Ala Arg Cys Ile Ile Pro Asp Leu Ile Gly 65 70 75 80 Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser Tyr Arg Leu Leu Asp 85 90 95 His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu Leu Asn Leu Pro Lys 100 105 110 Lys Ile Ile Phe Val Gly His Asp Trp Gly Ala Ala Leu Ala Phe His 115 120 125 Tyr Ala Tyr Glu His Gln Asp Arg Ile Lys Ala Ile Val His Met Glu 130 135 140 Ser Val Val Asp Val Ile Glu Ser Trp Asp Glu Trp Pro Asp Ile Glu 145 150 155 160 Glu Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ser Glu Glu Gly Glu Lys Met Val Leu 165 170 175 Glu Asn Asn Phe Phe Val Glu Thr Val Leu Pro Ser Lys Ile Met Arg 180 185 190 Lys Leu Glu Pro Glu Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Glu Pro Phe Lys Glu 195 200 205 Lys Gly Glu Val Arg Arg Pro Thr Leu Ser Trp Pro Arg Glu Ile Pro 210 215 220 Leu Val Lys Gly Gly Lys Pro Asp Val Val Gln Ile Val Arg Asn Tyr 225 230 235 240 Asn Ala Tyr Leu Arg Ala Ser Asp Asp Leu Pro Lys Leu Phe Ile Glu 245 250 255 Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala Ile Val Glu Gly Ala Lys Lys 260 265 270 Phe Pro Asn Thr Glu Phe Val Lys Val Lys Gly Leu His Phe Leu Gln 275 280 285 Glu Asp Ala Pro Asp Glu Met Gly Lys Tyr Ile Lys Ser Phe Val Glu 290 295 300 Arg Val Leu Lys Asn Glu Gln 305 310 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand linear DNA <400> 2 cgagtaggta cggatctggc tgtactgatg tgcctgcgac 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> single strand linear DNA <400> 3 gtcgcaggca catcagtaca gccagatccg tacctactcg 40

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (a) 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 포함하는 자가발광 나노복합체; 및
    (b) 항암제를 담지한 선형핵산과 결합한 금 나노입자 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물로,
    상기 선형핵산은 서열번호 3의 염기서열로 구성되고 5' 말단에 티올기를 가지는 것이고,
    상기 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(Daunorubicin), 마이토잔트론(mitoxantrone) 및 에피루비신(Epirubicin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 직장암, 담낭관암, 결장암, 췌장암, 난소암, 기관지암 및 방광암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 자가발광 나노복합체는 800nm 근적외선 영역에서 발광하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 삭제
  11. 제7항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)가 제거된 것을 특징으로 하는, 조성물.
  12. 하기 단계를 포함하는 암 치료용 조성물의 제조방법:
    (a) 양자점(quantum dot) 및 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 변형된 자가발광 단백질을 가교제와 함께 혼합하여 자가발광 나노복합체를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 3의 염기서열로 구성되고 5' 말단에 티올기를 가지는 선형핵산과 항암제를 1:10 내지 1: 20의 몰비로 혼합하여 항암제를 담지한 선형핵산을 제조하는 단계;
    (c) 상기 항암제를 담지한 선형핵산과 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB)가 제거된 금 나노입자를 혼합하여 금 나노입자 복합체를 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 자가발광 나노복합체 및 금 나노입자 복합체를 혼합하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 양자점 및 변형된 자가발광 단백질은 1:80 내지 1:600의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 가교제는 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 혼합은 상온에서 60분 내지 120분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
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