KR101523841B1 - Composition for treatment or prevention of Vascular Dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient - Google Patents

Abstract

본 발명은 NADPH 산화효소 1의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 아포시닌 또는 NADPH 산화효소 1의 shRNA를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서는 NADPH 산화효소 군의 하나인 Nox1의 발현을 억제하면 혈관성 치매 환자의 해마 CA1 부위의 초과산화물 생성이 억제되고, DNA 손상이 억제되며, 신경세포 사멸이 억제되는 효과가 있고, 만성 대뇌 저관류를 유도한 동물모델에서 Nox1을 저해하는 물질을 투여한 결과, 공간 기억 능력과 후각 식별 기능이 향상되는 효과를 관찰한바, 본 발명에 의한 Nox1 억제제는 혈관성 치매의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. The present invention relates to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient, and more particularly to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising shRNA of aposinin or NADPH oxidase 1 as an active ingredient ≪ / RTI > In the present invention, inhibition of the expression of Nox1, which is one of the NADPH oxidase enzymes, inhibits the production of superoxide in the hippocampal CA1 region of vascular dementia patients, inhibits DNA damage, inhibits neuronal cell death, The inventors of the present invention observed the effect of enhancing the spatial memory ability and the olfactory identification function as a result of administration of a substance inhibiting Nox1 and the Nox1 inhibitor according to the present invention could be useful for the treatment or prevention of vascular dementia will be.

Description

NADPH 산화효소 1의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물{Composition for treatment or prevention of Vascular Dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient. The present invention relates to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1,

본 발명은 NADPH 산화효소 1의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더 상세하게는 아포시닌 또는 NADPH 산화효소 1의 shRNA를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient, and more particularly to a composition for treating or preventing vascular dementia comprising shRNA of aposinin or NADPH oxidase 1 as an active ingredient ≪ / RTI >

혈관성 치매는 고연령층 환자에게서 알츠하이머 병 다음으로 흔히 발병하는 가장 흔한 인지 장애 중 하나이다. 혈관성 치매는 인지 기능의 손상과 관계된 허혈성, 출혈성 뇌병변 장애에 이르는 심혈관 또는 뇌혈관 상태에 따라 발병한다. 이중에서도 만성 대뇌 저관류(Chronic cerebral hypoperfusion)는 급진적인 인지 능력 감소와 밀접하게 연관되어 있는데, 만성 대뇌 저관류는 혈관성 치매에 국한되지 않고, 알츠하이머 병의 발명의 초기 요소 중 하나에 불과하며, 만성 대뇌 저관류가 어떠한 기전에 의해 혈관성 치매의 인식 기능 저하에 관여하는지는 아직도 명확히 밝혀지지 않은 상태이다.Vascular dementia is one of the most common cognitive impairments in elderly patients often followed by Alzheimer's disease. Vascular dementia is caused by cardiovascular or cerebrovascular conditions leading to ischemic, hemorrhagic brain lesions associated with impaired cognitive function. Chronic cerebral hypoperfusion is closely related to radical cognitive decline. Chronic cerebral hypoperfusion is not limited to vascular dementia. It is only one of the early elements of the invention of Alzheimer's disease. Chronic cerebral hypoperfusion Is involved in the deterioration of cognitive function of vascular dementia.

만성 대뇌 저관류를 재현하기 위한 동물모델로, 랫트에서 총경동맥의 양측을 영구적으로 폐색하는 2 혈관 폐색(2VO) 모델이 구축되었고, 이러한 동물 모델은 만성 대뇌 저관류에서 관찰되는 인지 기능 손상, 백질 병변, 신경 손상의 분자적 기전과 치료법을 연구하기 위한 도구로 폭넓게 사용되어 오고 있다. 2 혈관 폐색 모델에서는 아밀로이드의 생성과 축적, 백질 무결성의 손상과 교세포 활성화가 관찰되는데, 본 발명자들은 2 혈관 폐색 수술 후 8 주가 경과된 랫트 모델의 대뇌 피질에서 대뇌 혈류 및 뇌 대사가 각각 74.5%, 80.3%까지 감소함을 확인하였다. 한편, 산화적 스트레스는 혈관성 치매와 알츠하이머의 병인에 관여하는 주요 요소 중 하나로, 단백질 산화, 지질 과산화 및 산화적 DNA 손상으로 나타나는 뇌 실질 조직에서의 증가된 산화적 스트레스는 혈관성 뇌질환 및 알츠하이머의 주요 특징이다. 산화적 스트레스는 혈관 저관류에 의해 유도되는 병리에 의한 인지 장애의 발달에 매우 중요한데, 수퍼옥사이드 이스뮤타아제(SOD), 카탈라아제(CAT), 글루타치온 퍼옥시다아제(GPx), 글루타치온 리덕타아제(GR), 헬 옥시제나아제/빌리베르딘 리덕타아제와 같은 항산화 효소의 활성은 알츠하이머 병과 혈관성 치매 환자에서 감소된다. Animal model to reproduce chronic cerebral hypoperfusion, a two-vessel occlusion (2VO) model was established that permanently obstructs both sides of the common carotid artery in rats. These animal models have been used to detect cognitive impairment, white matter lesions, Has been used extensively as a tool to study molecular mechanisms and treatments of nerve damage. In the vascular occlusion model, amyloid production and accumulation, loss of white matter integrity, and activation of glia are observed. The cerebral blood flow and cerebral metabolism in the cerebral cortex of the rat model, which has passed 8 weeks after the 2-vessel occlusion surgery, And 80.3%, respectively. Oxidative stress is one of the major factors involved in the pathogenesis of vascular dementia and Alzheimer's disease. Increased oxidative stress in brain parenchyma, which is manifested by protein oxidation, lipid peroxidation and oxidative DNA damage, is a major cause of vascular brain disease and Alzheimer's Feature. Oxidative stress is crucial for the development of cognitive impairment due to pathologic hypoxia induced by vascular hypoperfusion, including superoxide ismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) The activity of antioxidant enzymes such as Helioxygenase / Bilberry verdin reductase is reduced in Alzheimer's and vascular dementia patients.

한편, NADPH 산화효소군은 ROS 생성에 중요한 역할을 하는데, NADOH 산화효소 2(Nox2)는 식세포에서 처음 동정되었고, 상당한 양의 초과산화물을 식포로 방출하여 박테리아를 멸균하는 것으로 알려져 있다. 현재, NADPH 산화효소 군은 CNS를 포함하는 다양한 조직에서 Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1, Duox2의 7개의 동족체를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Nox는 알츠하이머의 발달에 있어서 염증성 신경세포 손상에 관여하며, 아연에 노출되거나 성장인자의 결손, 저혈당증 및 NMDA 활성화와 같은 조건에서 신경세포 사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, p47phox 서브유닛은 뇌졸중 후 신경세포 및 산화제의 생성과 관련이 있다고 알려져 있다. 또한, Nox4는 노졸중에 의한 산화적 스트레스와 신경퇴행과 관계되어 있음이 알려져 있다. 또한, Nox2도 CNS 질환과 밀접한 관련이 있다는 보고가 있으나, 아직까지 Nox1이 이러한 질병과 관련이 있다는 특별한 연구 결과가 발표되지는 않은 실정이다. 다만, 일부 연구에서 Nox1 입자가 신경세포 이외의 세포와 도파민 신경 세포에서 ROS-의존적 세포사멸과 관련이 있다는 연구 보고가 있다. On the other hand, the NADPH oxidase group plays an important role in ROS production. NADOH oxidase 2 (Nox2) is first identified in phagocytes and it is known to sterilize bacteria by releasing a significant amount of superoxide into the cells. Currently, the NADPH oxidase family is known to have seven homologues of Nox1, Nox2, Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 and Duox2 in various tissues including the CNS. Nox is involved in inflammatory neuronal damage in the development of Alzheimer's disease, and is known to be involved in neuronal cell death under conditions such as zinc exposure, growth factor deficiency, hypoglycemia and NMDA activation. In addition, the p47phox subunit is known to be involved in the production of neurons and oxidants after stroke. It is also known that Nox4 is associated with oxidative stress and neurodegeneration by nosocomial. In addition, although there is a report that Nox2 is closely related to CNS disease, there is no specific study result that Nox1 is related to this disease yet. However, some studies have shown that Nox1 particles are associated with ROS-dependent cell death in cells other than neurons and dopamine neurons.

본 발명자들은 종래 알려지지 않은 Nox1의 작용 기전에 대해 연구하던 중, 본 발명자들은 혈관성 치매 환자의 혈액 샘플에서는 항산화 효소의 수치가 감소되는 현상에 NADPH 산화효소가 깊이 관여할 것으로 예측하고 그 분자 기전을 면밀히 조사하였으며, NADPH 산화효소 군의 하나이 Nox1의 발현을 억제함으로써 혈관성 치매의 치료 효과가 있음을 최초로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. In studying the mechanism of action of Nox1 which is not known in the past, the inventors of the present invention predicted that NADPH oxidase deeply participates in the decrease of antioxidant enzyme levels in blood samples of patients with vascular dementia, The inventors of the present invention completed the present invention by first confirming the therapeutic effect of vascular dementia by inhibiting the expression of Nox1 by one of the NADPH oxidase enzymes.

한국공개특허 10-2008-0002904Korean Patent Publication No. 10-2008-0002904 한국공개특허 10-2013-0026949Korean Patent Publication No. 10-2013-0026949

따라서, 본 발명의 목적은 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) as an active ingredient.

본 발명의 또 다른 목적은 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for screening candidate substances for treatment or prevention of vascular dementia.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관성 치매는 만성 대뇌 저관류에 의해 유도되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the vascular dementia may be induced by chronic cerebral hypoperfusion.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 아포시닌(apocynin)일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be apocynin.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 아포시닌은 1 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the apoptinin may be administered at 1 to 100 mg / kg.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 상기 NADPH 산화효소 1의 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor may be any one selected from the group consisting of antisense nucleotides, siRNA, shRNA and ribozyme for the gene of NADPH oxidase 1.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1로 표시되는 DNA에 상보적인 염기서열일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the shRNA may be a nucleotide sequence complementary to the DNA of SEQ ID NO: 1.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 초과산화물(superoxide) 생성 또는 DNA 산화를 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) inhibits or reduces superoxide production or DNA oxidation in the CA1 region of the hippocampus of patients with vascular dementia Which may be a therapeutic effect.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 신경세포 사멸을 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) inhibits or reduces neuronal apoptosis in the CA1 region of the hippocampus of patients with vascular dementia .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 Rac1 활성을 저해하여 치료 효과를 나타내는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) may inhibit Rac1 activity of NADPH oxidase 1 (Nox1 oxidase 1, Nox1), thereby exhibiting a therapeutic effect.

또한, 본 발명은 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 세포주에서 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군 세포주에 비해 감소한 경우, 상기 피검물질을 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는, 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.The present invention also relates to a method for screening a test substance for NADPH oxidase 1 (NADPH oxidase 1, Nox1) protein; Measuring the expression level of NADPH oxidase 1 (Nox1) protein in the cell line; And judging the test substance as a candidate for treatment or prevention of vascular dementia when the degree of expression of the NADPH oxidase 1 (Nox1) protein is lower than that of the control cell line not treated with the test substance A method for screening a substance for treating or preventing vascular dementia.

본 발명에서는 NADPH 산화효소 군의 하나인 Nox1의 발현을 억제하면 혈관성 치매 환자의 해마 CA1 부위의 초과산화물 생성이 억제되고, DNA 손상이 억제되며, 신경세포 사멸이 억제되는 효과가 있고, 만성 대뇌 저관류를 유도한 동물모델에서 Nox1을 저해하는 물질을 투여한 결과, 공간 기억 능력과 후각 식별 기능이 향상되는 효과를 관찰한바, 본 발명에 의한 Nox1 억제제는 혈관성 치매의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있을 것이다. In the present invention, inhibition of the expression of Nox1, which is one of the NADPH oxidase enzymes, inhibits the production of superoxide in the hippocampal CA1 region of vascular dementia patients, inhibits DNA damage, inhibits neuronal cell death, The inventors of the present invention observed the effect of enhancing the spatial memory ability and the olfactory identification function as a result of administration of a substance inhibiting Nox1 and the Nox1 inhibitor according to the present invention could be useful for the treatment or prevention of vascular dementia will be.

도 1은 2 VO 수술한 랫트 동물모델의 해마(HP)에서 초과산화물의 발생을 관찰한 결과이다. (A) 2 VO 수술 후 10주 경과시 해마, 내측 중경핵 및 대각섬유줄에서의 초과산화물 생성을 에티듐(ethidium) 형광(빨간색)으로 표시한 결과이다. (B) 2 VO 수술한 랫트와 허위 수술한 랫트에서 해마 CA1 부위의 Topro3(핵 마커) 염색(파란색)된 세포 중 DHE 염색(빨간색)된 신경세포의 수와 전체 세포 중 DHE 염색된 신경세포의 %를 정량화하여 표시한 결과이다. (C) 2 VO 수술 또는 허위 수술 후 10주 경과시 해마의 CA1으로부터 MDA, c-fos, 나이트로타이로신 발현을 관찰한 결과이다. (D) 2 VO 수술한 랫트와 허위 수술한 랫트에서 해마 CA1 부위의 NeuN+(녹색) 신경세포에서의 MDA(빨간색)의 발현 변화를 관찰한 결과이다. (E) 2 VO 수술한 랫트와 허위 수술한 랫트에서 해마 CA1 부위의 Topro3+(파란색) 신경세포에서의 c-fos(빨간색) 발현 변화를 관찰한 결과이다. (F) 2 VO 수술한 랫트와 허위 수술한 랫트에서 해마 CA1 부위의 NeuN+(녹색) 신경세포에서의 나이트로타이로신(빨간색) 발현 변화를 관찰한 결과이다.
도 2는 2 VO 수술한 랫트 해마에서의 신경세포 사멸 증가를 관찰한 결과이다. (A) 2 VO 수술 후 10주 경과한 랫트의 해마에서 8-oxo-dG 면역반응성(빨간색)을 이용하여 DNA 산화 정도를 관찰한 결과이다. (B) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 조직 절편에서 8-oxo-dG의 변화를 관찰한 결과이다. (C) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 신경세포에서 NeuN을 면역염색한 결과이다. (D) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 신경세포에서 NeuN의 발현 변화를 관찰한 결과이다. (E) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 신경세포를 Cresyl violet 염색한 결과이다. (F) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 Cresyl violet 염색된 신경세포의 변화를 관찰한 결과이다. (G) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 신경세포에서 절단된 caspase-3를 관찰한 결과이다. (H) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위의 신경세포에서 절단된 caspase-3의 발현 변화를 관찰한 결과이다. (I) 수술 후 10주가 경과한 허위 수술 또는 2 VO 수술된 랫트에서 NeuN, MAP-2, GFAP 발현양을 웨스턴 블라팅으로 관찰한 결과이다. (J) 웨스턴 블라팅으로 관찰된 NeuN, MAP-2, GFAP 발현양을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 3은 2 VO 수술한 랫트의 해마에서 Nox1의 mRNA 및 단백질의 발현 증가와 Rac1의 활성화 정도를 관찰한 결과이다. (A) 2 VO 수술 후 2주 경과한 랫트의 해마에서 Nox1의 mRNA 변화를 관찰한 PCR 결과이다. (B), (C) 허위수술 또는 2 VO 수술 후 2주 경과한 랫트의 해마와 선조체에서 Nox1, Nox2, Nox4 발현을 웨스턴 블라팅으로 관찰한 결과이다. NC: 음성 대조군, PC: 양성대조군 (D) 웨스턴 블라팅으로 관찰된 Nox1, Nox2, Nox4 발현양을 정량적으로 분석한 결과이다. (E) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마에서 Rac1의 활성화 정도를 활성 GTPase pull-down assay로 분석한 결과이다. (F) Rac1의 활성화 정도를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 4는 2 VO 수술한 랫트의 해마 조직 신경세포에서 Nox1 발현 증가를 관찰한 결과이다. (A), (D) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트에서 수술 후 10주 경과 한 랫트의 해마 CA1 조직을 Nox1(빨간색), NeuN(녹색)으로 염색한 결과이다. (B) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트에서 1, 2, 4, 10주 경과한 랫트의 해마 CA1 조직을 Nox1(빨간색), NeuN(녹색)으로 염색한 결과이다. (C) 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 조직에서 NeuN(녹색) 염색된 세포 중 Nox1(빨간색) 염색된 세포의 변화를 관찰한 결과이다. (D) Nox1 항체의 특이성을 확인한 결과이다. (E) 성상교세포 및 미세아교세포에서 Nox1(빨간색) 발현을 관찰한 결과이다.
도 5는 2 VO 수술한 랫트의 해마 신경세포에서 초과산화물 생성 및 DNA 산화에 아포시닌이 미치는 영향을 관찰한 결과이다. (A) 2 VO 수술 후 10주가 경과한 랫트의 초과산화물 생성을 에티듐 형광(DHE, 빨간색) 및 8-oxo-dG(빨간색)으로 확인하 결과이다. (B) 2 VO 수술한 랫트에 아포시닌을 처리한 경우 초과산화물 생성률 변화를 DHE(빨간색) 염색으로 관찰한 결과이다. (C) 2 VO 수술 랫트에 아포시닌을 처리한 경우 초과산화물 생성률 변화를 8-oxo-dG(빨간색)으로 관찰한 결과이다.
도 6은 2 VO 수술한 랫트의 해마 신경세포의 손상에 대한 아포시닌의 치료 효과를 관찰한 결과이다. (A) 허위수술 또는 2 VO 수술한 랫트에서 아포시닌 처리 후 해마 CA1을 NeuN(녹색) 및 Cresyl violet으로 염색한 결과이다. (B), (C) 2 VO 수술한 랫트에서 아포시닌 처리에 따른 NeuN과 Nissl 염색된 세포의 변화를 관찰한 결과이다.
도 7은 만성 대뇌 저관류를 유도한 랫트 동물모델에 아포시닌을 처리한 경우 모리스 수중 미로 실험에서 (A) 반응시간 (B) 탐색 오류 (C) 수영 속도 (D) 대상 사분면에 머무른 시간(%) (E) 보이는 플랫폼에 대한 반응시간에 미치는 영향을 관찰한 결과이다.
도 8은 2 VO 수술한 랫트에서 Nox1 넉다운이 초과산화물 생성에 미치는 영향을 관찰한 결과이다. (A) scb shRNA/AAV2 또는 Nox1 shRNA/AAV2 주입 후 4주 경과한 랫트의 해마 CA1 부위를 EGFP(녹색) 및 NeuN(빨간색) 항체로 염색한 결과이다. (B) U6 프로모터를 갖는 Nox1 shRNA/AAV 벡터맵과 EGFP 발현 정도를 측정한 결과이다. (C), (D), (E) AAV2 주입 12주가 경과한 후 해마 CA1 부위에서의 Nox1 넉다운 효율을 웨스턴 블라팅과 RT-PCR로 관찰한 결과이다. (F) scb shRNA 또는 Nox1 shRNA 주입한 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트 동물모델의 해마 CA1 부위에서 초과산화물 생성을 DHE(빨간색) 염색으로 관찰한 결과이다. (G) scb shRNA 또는 Nox1 shRNA 주입한 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트 동물모델의 해마 CA1 부위에서 DHE(빨간색)를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 9는 2 VO 수술한 랫트의 해마 신경세포에서 Nox1 넉다운이 DNA 산화와 신경세포 손상에 미치는 영향을 관찰한 결과이다. scb shRNA 또는 Nox1 shRNA를 주입한 허위 수술 또는 2 VO 수술한 랫트의 해마 CA1 부위 조직을 (A) 8-oxo-dG(파란색) (B) NeuN(빨간색) (C) Cresyl violet으로 염색하여 관찰하고, (D), (E), (F) 이를 각각 정량적으로 분석한 결과이다.
도 10은 2 VO 수술한 랫트에서 Nox1의 저해가 기억 손상에 미치는 영향을 관찰한 결과이다. 모리스 수중 미로 검사의 (A) 반응시간 (B) 수영속도 (C) 눈에 보이는 플랫폼 테스트에서의 반응시간 (D) 대상 사분면에 머무는 시간(%) (E) 플랫폼을 통과하는 수를 관찰하였다. (F) 새로운 물체 인식 검사에서 새로운 물체를 탐색하는 시간 및 판별비를 계산한 결과이다.
도 11은 2 VO 수술 후 13주 경과한 랫트의 후각 식별 기능을 검사한 결과이다. Figure 1 shows the results of observing the occurrence of excess oxides in the hippocampus (HP) of a rat animal model with 2 VO surgery. (A) 2 Ethoxylated (ethidium) fluorescence (red) in the hippocampus, medial chondrocytes, and diagonal fiber lines at 10 weeks postoperatively. (B) The number of DHE-stained (red) nerve cells in the stained (blue) cells of Topro3 (nuclear marker) in the hippocampal CA1 region and the number of DHE-stained nerve cells % Are quantified and displayed. (C) Observation of the expression of MDA, c-fos, and nitrotyrosine from CA1 in hippocampus at 10 weeks after 2 VO surgery or false operation. (Red) in NeuN + (green) neurons in the hippocampal CA1 region in rats treated with (VO 2) VO and falsely operated rats. (Red) expression in Topro3 + (blue) neurons in the hippocampal CA1 region in rats treated with 2 VO and falsely operated rats. (Red) expression in NeuN + (green) neurons in the hippocampal CA1 region in rats treated with 2 VO and falsely operated rats.
FIG. 2 shows the results of observing the increase in neuronal cell death in the hippocampus of a rat treated with 2 VO. (A) Observation of the degree of DNA oxidation using 8-oxo-dG immunoreactivity (red) in hippocampus of rats 10 weeks after 2 VO surgery. (B) 8-oxo-dG changes in tissue sections of the hippocampal CA1 region of rats subjected to false or 2 VO surgery. (C) NeuN immunoreactivity in neurons of the hippocampal CA1 region of rats subjected to a false operation or 2 VO surgery. (D) Observation of NeuN expression in neurons in the hippocampal CA1 region of rats subjected to false or 2 VO surgery. (E) Cresyl violet staining of neurons in the hippocampal CA1 region of rats subjected to fictitious surgery or 2 VO surgery. (F) Cresyl violet-stained nerve cell changes in the hippocampal CA1 region of rats subjected to fictitious surgery or 2 VO surgery. (G) Results of caspase-3 cleavage in neurons of the hippocampal CA1 region of rats subjected to false or 2 VO surgery. (H) The results of observing the expression of caspase-3 cleavage in neurons of CA1 region of hippocampus of rats subjected to false operation or 2 VO surgery. (I) Western blotting of NeuN, MAP-2, and GFAP expression in rats treated for 10 weeks after surgery or in 2 VO surgery. (J) Quantitative analysis of the amount of NeuN, MAP-2, and GFAP expressed by Western blotting.
FIG. 3 shows the results of observing the increase of mRNA and protein expression of Nox1 and the activation level of Rac1 in the hippocampus of 2 VO-operated rats. (A) 2 mRNA of Nox1 in hippocampus of rats 2 weeks after 2 VO surgery. (B), (C) Nox1, Nox2 and Nox4 expression in western blotting of hippocampus and striatum of rats 2 weeks after false operation or 2 VO surgery. NC: negative control, PC: positive control (D) Quantitative analysis of Nox1, Nox2 and Nox4 expression levels observed by Western blotting. (E) The activity of Rac1 in the hippocampus of rats subjected to false or 2 VO surgery was analyzed by an active GTPase pull-down assay. (F) Quantitative analysis of the degree of activation of Rac1.
FIG. 4 shows the increase in Nox1 expression in hippocampal neurons of 2 VO-operated rats. (Red) and NeuN (green) in the hippocampal CA1 tissues of rats 10 weeks after surgery in (A), (D) (B) The result of staining the hippocampal CA1 tissue of rats 1, 2, 4, and 10 weeks after the false or 2 VO surgery with Nox1 (red) and NeuN (green). (C) Observation of changes in Nox1 (red) stained cells in NeuN (green) stained cells in hippocampal CA1 tissue of rats subjected to false or 2 VO surgery. (D) the specificity of the Nox1 antibody. (E) Expression of Nox1 (red) in astrocytes and microglia.
FIG. 5 shows the results of observing the effect of apoptinin on hyperoxidation and DNA oxidation in hippocampal neurons of 2 VO-operated rats. (DHE, red) and 8-oxo-dG (red) in the rats over 10 weeks after (A) 2 VO surgery. (B) 2 Observed changes in excess oxide production rate in DHE (red) staining of apoptotic cells treated with 2 VO. (C) Observed 8-oxo-dG (red) in the excess oxide production rate when apoCinin was administered to 2 VO rats.
FIG. 6 shows the results of observing the therapeutic effect of apoptinin on injury of hippocampal neurons in rats treated with 2 VO. (A) Results of staining of hippocampal CA1 with NeuN (green) and Cresyl violet after apoptinin treatment in rats with false or 2 VO surgery. (B), (C) Observations of changes in NeuN and Nissl stained cells by apoptinin treatment in 2 VO operated rats.
FIG. 7 is a graph showing the results of (A) reaction time (B) search error (C) swimming speed (D) time remaining in the quadrant of the subject in the Morris water maze experiment when apoptinin was treated in a rat animal model inducing chronic cerebral hypoperfusion ) And (E) the effect of reaction time on the visible platform.
FIG. 8 shows the effect of Nox1 knockdown on the production of excess oxides in rats treated with 2 VO. (A) Results of staining CA1 region of hippocampus of rats 4 weeks after scb shRNA / AAV2 or Nox1 shRNA / AAV2 injection with EGFP (green) and NeuN (red) antibody. (B) Nox1 shRNA / AAV vector map with U6 promoter and EGFP expression level. (C), (D), and (E) After 12 weeks of AAV2 injection, the Nox1 knockdown efficiency in the hippocampal CA1 region was observed by Western blotting and RT-PCR. (F) Observation of DHO (red) staining of hyperoxidation in the hippocampal CA1 region of a rat model of rats injected with scb shRNA or Nox1 shRNA or 2 VO surgery. (Red) in the hippocampal CA1 region of a rat animal model with a false-operation or 2 VO-operated scaffold injected with either (G) scb shRNA or Nox1 shRNA.
FIG. 9 shows the effect of Nox1 knockdown on DNA oxidation and neuronal cell damage in hippocampal neurons of 2 VO-operated rats. (A) 8-oxo-dG (blue) (B) NeuN (red) (C) Cresyl violet staining of the hippocampal CA1 site tissues of rats treated with scb shRNA or Nox1 shRNA , (D), (E), and (F), respectively.
Figure 10 shows the effect of inhibition of Nox1 on memory impairment in rats with 2 VO surgery. (A) Reaction time (B) Swim speed (C) Reaction time in visible platform test (D) Time spent in the target quadrant (%). (F) The result of calculating the time and the discrimination ratio for searching for a new object in the new object recognition test.
FIG. 11 shows the result of examining the olfactory identification function of rats aged 13 weeks after 2 VO surgery.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing vascular dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) as an active ingredient.

상기 혈관성 치매는 만성 대뇌 저관류에 의해 유도되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. The vascular dementia may be induced by chronic cerebral hypoperfusion, but is not limited thereto.

상기 억제제는 아포시닌(apocynin)이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. The inhibitor is preferably, but not limited to, apocynin.

상기 아포시닌은 1 내지 100mg/kg으로 투여되는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The apoptinin is preferably administered at 1 to 100 mg / kg, but is not limited thereto.

상기 억제제는 상기 NADPH 산화효소 1의 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The inhibitor is preferably selected from the group consisting of antisense nucleotide, siRNA, shRNA and ribozyme for the gene of NADPH oxidase 1, but is not limited thereto.

서열번호 1로 표시되는 DNA에 상보적인 염기서열인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.But it is not limited to the base sequence complementary to the DNA represented by SEQ ID NO: 1.

상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 초과산화물(superoxide) 생성 또는 DNA 산화를 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타낼 수 있으나 이에 한정하지 않는다.The inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) may exhibit a therapeutic effect by inhibiting or reducing superoxide generation or DNA oxidation at the CA1 region of the hippocampus of a patient suffering from vascular dementia. I never do that.

상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 신경세포 사멸을 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타낼 수 있으나 이에 한정하지 않는다.The inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1) may exhibit a therapeutic effect by inhibiting or reducing neuronal apoptosis in the CA1 region of the hippocampus of a patient suffering from vascular dementia, but is not limited thereto.

상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 억제제는 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 Rac1 활성을 저해하여 치료 효과를 나타낼 수 있으나 이에 한정하지 않는다.The inhibitor of NADPH oxidase 1 (Nox1 oxidase 1, Nox1) may inhibit Rac1 activity of NADPH oxidase 1 (Nox1), but is not limited thereto.

본 발명자들은 2 VO 수술로 유도된 만성 대뇌 저관류 동물모델의 해마 조직을 면역조직화학법으로 염색해 본 결과, ROS 생성과 신경세포 사멸이 증가되는 것을 관찰하였다. 즉, 상기 동물모델의 해마 CA1 부위를 c-fos 및 나이트로타이로신으로 염색해 본 결과, 이들 산화환원 마커가 증가하는 것으로 확인되었다. 또한, 산화적 DNA 손상 마커인 8-oxo-dG로 상기 동물모델의 해마 CA1 부위를 염색해 본 결과, 8-oxo-dG도 증가하는 것으로 확인되었다. 그리고, NeuN 면역염색, Nissl 염색, 절단된 caspase-3 면역염색을 통하여 해마의 신경세포 사멸도 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조). The present inventors observed immunohistochemical staining of hippocampal tissues of an animal model of chronic cerebral hypoperfusion induced by 2 VO, and found that ROS production and neuronal apoptosis were increased. That is, it was confirmed that these redox markers were increased by staining the hippocampal CA1 region of the animal model with c-fos and nitrotylosin. In addition, 8-oxo-dG, an oxidative DNA damage marker, was also stained in the hippocampal CA1 region of the animal model. As a result, it was confirmed that 8-oxo-dG also increased. Neuronal death of the hippocampus was also confirmed by NeuN immunostaining, Nissl staining, and cleaved caspase-3 immunostaining (see FIGS. 1 and 2).

본 발명자들은 2 VO 수술로 유도된 만성 대뇌 저관류가 산화적 스트레스와 밀접한 상관관계가 있음을 확인하고, 이들의 분자적 기전을 좀 더 명확히 분석해 보고자 NADPH 산화효소의 발현을 분석해 보았다. 그 결과, 2 VO 수술로 유도된 만성 대뇌 저관류 동물모델에서 NADPH 산화효소 군인 Nox1, Nox2, Nox4 중 오직 Nox1의 발현이 증가하는 것을 RT-PCR, 웨스턴 블라팅, 조직면역화학법으로 확인할 수 있었고, 이러한 Nox1의 활성화에 필수적인 Rac1의 활성화도 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).The inventors of the present invention examined the expression of NADPH oxidase in order to clarify that the chronic cerebral hypoperfusion induced by 2 VO surgery has a close correlation with the oxidative stress and to more clearly analyze the molecular mechanism thereof. As a result, it was confirmed by RT-PCR, Western blotting and tissue immunochemistry that only Nox1 expression among Nox1, Nox2 and Nox4, which are NADPH oxidizing enzymes, was increased in a hypoxic animal model of chronic cerebral hypoxia induced by 2 VO surgery, The activation of Rac1, which is essential for the activation of Nox1, was also confirmed (see FIGS. 3 and 4).

이처럼 2 VO 수술로 유도된 만성 대뇌 저관류 동물 모델에서 Nox1가 특이적으로 발현이 증가하고 활성화되는 것을 확인한바, 본 발명자들은 Nox1을 억제하는 경우 만성 대뇌 저관류와 이에 의해 유도되는 혈관성 치매를 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 예상하고 추가 실험을 진행하였다. 이를 위하여, Nox1의 저해제인 아포시닌(apocynin)을 2 VO 수술한 날로부터 연속하여 8일간 10mg/kg의 농도로 복강주사하였다. 그 결과, 아포시닌은 초과산화물 생성, DNA 산화 및 신경세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었고(도 5 및 도 6 참조), 동물모델의 행동기능도 현저히 개선되는 것으로 확인하였다(도 7).As described above, when Nox1 is specifically expressed and activated in a chronic cerebral hypoperfusion animal model induced by 2 VO surgery, the present inventors have found that inhibition of Nox1 effectively treats chronic cerebral hypoperfusion and vascular dementia induced thereby And further experiments were carried out. For this purpose, apocynin, an inhibitor of Nox1, was intraperitoneally injected at a concentration of 10 mg / kg for 8 consecutive days from the day of 2 VO surgery. As a result, it was confirmed that aposinin effectively inhibited the production of superoxide, DNA oxidation and neuronal cell death (see FIGS. 5 and 6), and the behavioral function of the animal model was remarkably improved 7).

이에 본 발명자들은 추가적으로 Nox1을 선택적으로 저해할 수 있는 shRNA를 제작하고 이를 뇌에 특이적으로 전달할 수 있는 AAV2(adeno-associated virus 2)와 결합하여 동물모델의 해마 CA1 부위로 주입하였다(도 8 참조). 그 결과, 2 VO 수술한 만성 대뇌 저관류 동물 모델의 해마 CA1 부위에서 초과산화물 생성, DNA 산화 및 신경세포 사멸이 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 9 참조). 또한, Nox1 shRNA/AAV를 처리한 만성 대뇌 저관류 동물 모델에서 대조군에 비하여 기억 손상이 감소하여, 모리스 수중 미로 실험에서 효과적인 공간 기억 회복 양상을 나타내었고, 새로운 물체를 인식하고 위치를 확인할 수 있는 능력을 회복하였으며(도 10 참조), 후각 식별 기능도 향상되었음을 확인하였다(도 11 참조).The present inventors further prepared an shRNA capable of selectively inhibiting Nox1 and then injected it into the hippocampal CA1 region of an animal model in association with adeno-associated virus 2 (AAV2) capable of specifically delivering it to the brain (see FIG. 8 ). As a result, hyperoxidation, DNA oxidation and neuronal apoptosis were markedly reduced in the hippocampal CA1 region of the chronic hypothalamic animal model with 2 VO surgery (see FIG. 9). In addition, in the hypoxic animal model of chronic cerebral hypoperfusion treated with Nox1 shRNA / AAV, memory impairment was reduced compared to the control group, and the spatial memory recovery effect was demonstrated in the Morris water maze experiment, and the ability to recognize a new object and identify the location (See FIG. 10), and the olfactory identification function was improved (see FIG. 11).

그러므로, 본 발명의 NADPH 산화효소 1의 억제제는 2 VO에 의해 유발되는 만성 대뇌 저관류와 이에 의해 유발되는 혈관성 치매를 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.Therefore, it has been confirmed that the inhibitor of NADPH oxidase 1 of the present invention can be effectively used as a pharmaceutical composition capable of preventing or treating chronic hypoperfusion induced by 2 VO and vascular dementia caused thereby.

본 발명에 따른 조성물은 NADPH 산화효소 1의 억제제를 단독 또는 복합 투여할 수 있다.The composition according to the present invention may be administered alone or in combination with an inhibitor of NADPH oxidase 1.

상기 조성물은 임상 투여시에 비경구로 투여가 가능하고 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.The composition can be administered parenterally at the time of clinical administration and can be administered parenterally by intraperitoneal injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine injection, intracerebral injection or intrathoracic injection And can be used in the form of conventional pharmaceutical preparations.

상기 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.The composition may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.

상기 조성물의 일일 투여량은 약 0.0001 내지 1000 ㎎/㎏이고, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.The daily dose of the composition may be about 0.0001 to 1000 mg / kg, and may be administered once or several times a day. However, the daily dose of the composition may vary depending on the body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, The range varies depending on the severity.

본 발명의 shRNA를 포함하는 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 보다 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며,본 발명의 shRNA를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 10³~10¹²IU(10 내지 10¹⁰PFU)를 함유하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서 상기 shRNA를 포함하는 벡터는 U6-CMV-EGFP/AAV 벡터가 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.If the vector containing the shRNA of the invention More specifically, it contains 0.01 to 500 mg, and more particularly containing 0.1 to 300 mg, for a recombinant virus containing the shRNA of the invention, in particular 10 ³ to 10 ¹² IU (10 to 10 ¹⁰ PFU), but is not limited thereto. In the present invention, the shRNA-containing vector is preferably a U6-CMV-EGFP / AAV vector, but is not limited thereto.

또한, 본 발명의 shRNA를 포함하는 세포의 경우, 구체적으로 10³ 내지 10⁸개를 함유하고, 보다 구체적으로 10⁴ 내지 10⁷개를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.In addition, the cells containing the shRNA of the present invention specifically include 10 ³ to 10 ⁸ , more specifically 10 ⁴ to 10 ⁷ , but are not limited thereto.

또한, 본 발명의 shRNA를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵내지 10⁹ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸IU)/㎏, 세포의경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.In addition, the effective dose of the vector containing shRNA of the present invention or a composition containing cells as an active ingredient is 0.05 to 12.5 mg / kg in the case of a vector per 1 kg of body weight, 10 ⁷ to 10 ¹¹ viral particles in the case of a recombinant virus (10 ⁵ to 10 ⁹ IU) / kg in the case of cells, 10 ³ to 10 ⁶ cells / kg in the case of cells, specifically 0.1 to 10 mg / kg in the case of vectors and 10 ⁸ to 10 ¹⁰ particles 10 ⁶ to 10 ⁸ IU) / kg, in the case of cells, 10 ² to 10 ⁵ cells / kg, and can be administered 2 to 3 times a day. Such composition is not necessarily limited to this, and may vary depending on the condition of the patient and the severity of the disease.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 "치료하는"이란 용어는 "치료"가 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. In the present invention, "treatment ", as used herein, unless otherwise indicated, refers to reversing, alleviating, inhibiting, or preventing the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or disorder , And the term "treating ", as used herein, refers to the act of treating when" treatment "is defined as above.

따라서 포유동물에 있어서 혈관성 치매 질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:Thus, "treatment" or "treatment " of vascular dementia disease in a mammal may include one or more of the following:

(1) 혈관성 치매 관련 질환의 발달을 저지시킴,(1) inhibiting the development of vascular dementia-related diseases,

(2) 혈관성 치매 관련 질환의 확산을 예방함, (2) prevent the spread of vascular dementia-related diseases,

(3) 혈관성 치매 관련 질환을 경감시킴,(3) alleviate vascular dementia-related diseases,

(4) 혈관성 치매 관련 질환의 재발을 예방함 및(4) preventing recurrence of vascular dementia-related diseases and

(5) 혈관성 치매 관련 질환의 증상을 완화함(palliating)(5) palliating symptoms of vascular dementia-related diseases

상기 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물일 수 있다.The composition of the present invention may be a pharmaceutical composition or a food composition.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable adjuvants in addition to the above-mentioned active ingredients. Examples of the adjuvants include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coating agents, swelling agents, lubricants, A lubricant or a flavoring agent can be used.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.The pharmaceutical composition may be formulated into a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-described active ingredients for administration.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.The pharmaceutical composition may be in the form of granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, liquids, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions. For example, for formulation into tablets or capsules, the active ingredient may be combined with an oral, non-toxic pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like. Also, if desired or necessary, suitable binders, lubricants, disintegrants and coloring agents may also be included as a mixture. Suitable binders include, but are not limited to, natural sugars such as starch, gelatin, glucose or beta-lactose, natural and synthetic gums such as corn sweeteners, acacia, tracker candles or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium Benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like. Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum and the like. Acceptable pharmaceutical carriers for compositions that are formulated into a liquid solution include sterile solutions suitable for the living body such as saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added. In addition, diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to formulate into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Further, it can be suitably formulated according to each disease or ingredient, using the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA as an appropriate method in the field.

또한, 본 발명은 Nox1의 발현 프로파일을 이용하여 혈관성 치매에 대한 예방 또는 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for screening a candidate for a prophylactic or therapeutic agent for vascular dementia using the expression profile of Nox1.

구체적으로 본 발명은, NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 세포주에서 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및 상기 NADPH 산화효소 1(NADPH oxidase 1, Nox1) 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군 세포주에 비해 감소한 경우, 상기 피검물질을 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 후보물질로 판단하는 단계를 포함하는, 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. Specifically, the present invention relates to a method for screening a test substance for NADPH oxidase 1 (NADPH oxidase 1, Nox1) protein; Measuring the expression level of NADPH oxidase 1 (Nox1) protein in the cell line; And judging the test substance as a candidate for treatment or prevention of vascular dementia when the degree of expression of the NADPH oxidase 1 (Nox1) protein is lower than that of the control cell line not treated with the test substance A method for screening a substance for treating or preventing vascular dementia.

본 발명에 있어서 Nox1은 만성 대뇌 저관류에 의한 혈관성 치매에서 과발현되고, 동물모델을 통하여 Nox1의 발현을 억제하는 물질은 혈관성 치매의 조직학적 특성 및 행동학적 특성이 개선되는 것을 확인한바, 본 발명에 의한 스크리닝 방법은 혈관성 치매의 예방 및 치료제 후보물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
In the present invention, Nox1 is overexpressed in vascular dementia due to chronic cerebral hypoperfusion, and the inhibitory effect of Nox1 on the expression of Nox1 in animal models has improved the histological and behavioral characteristics of vascular dementia. The screening method may be useful for screening candidate substances for the prevention and treatment of vascular dementia.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 상기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples illustrate the present invention in detail, and the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1>  1>

재료준비Material preparation

래빗 Nox1, 고트 Nox1, 래빗 Nox2, 래빗 Nox-4, 래빗 Noxo1, 래빗 Noxa1 항체는 Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, 랫트 CD11b 항체는 Serotec(Raleigh, NC, USA)에서 구입하였으며, 항-고트 IgG, 항-랫트 IgG, 항-래빗 IgG 항체는 Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA)에서 구입하였다. ECL 키트는 Pierce(Rockford, IL, USA)에서, Taq 폴리머라아제는 Roche Applied Science(Indianapolis, IN, USA)에서 구입하였다. Vectastain ABC kit와 바이오티닐화된 항-래빗 IgG, 항-마우스 IgG는 Vector Laboratories (Burlingame, CA; USA)에서 구입하였다. 트리졸 시약, 디하이드로데티듐(DHE), 수퍼스크립트 II 역전사효소, 10~20% SDS-PAGE 겔, 10~20% 트리신 겔은 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, Rac1 활성화 키트는 Cell Biolab (New York, NY; USA)에서 구입하였다. Apocynin, 프로테아제 저해제 칵테일(AEBSF, aprotinin, bestatin hydrochloride, E-64-[N-(trans-Epoxysuccinyl)-L-leucine 4-guanidinobutylamide], leupeptin, pepstatin A)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; USA)에서 구입하였고, 그 밖의 모든 다른 화학물질은 Sigma Chemicals 또는 Merck (Rahway, NJ, USA)에서 구입하였다.
Rabbit Nox1, Goth Nox1, Rabbit Nox2, Rabbit Nox-4, Rabbit Noxo1 and Rabbit Noxa1 antibodies were purchased from Santa Cruz biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) and rat CD11b antibodies were purchased from Serotec (Raleigh, NC, USA) Anti-rat IgG, and anti-rabbit IgG antibodies were purchased from Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). ECL kit was purchased from Pierce (Rockford, IL, USA) and Taq polymerase was purchased from Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Vectastain ABC kit and biotinylated anti-rabbit IgG, anti-mouse IgG were purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA; USA). 10% -20% SDS-PAGE gel, 10-20% tricine gel was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) and the Rac1 Activation Kit Were purchased from Cell Biolab (New York, NY; USA). Apocynin, a protease inhibitor cocktail (AEBSF, aprotinin, bestatin hydrochloride, E-64- [N- (trans-Epoxysuccinyl) -L-leucine 4-guanidinobutylamide], leupeptin, pepstatin A) was purchased from Sigma-Aldrich (St. USA), and all other chemicals were purchased from Sigma Chemicals or Merck (Rahway, NJ, USA).

<< 실시예Example 2> 2>

만성 대뇌 Chronic cerebral 저관류Low-pass 동물모델의 제작 Production of animal models

모든 동물실험 절차는 건국대학교 실험동물 연구센터의 동물실험 검토위원회의 승인 하에 진행하였다. 일반적으로 남성이 뇌졸중과 혈관성 치매와 같은 뇌 혈관 합병증에 더 취약한 것으로 나타나는 연구 결과에 근거하여, 만성 대뇌 저관류는 수컷 위스타 랫트(Wistar rats, 10 주령, 몸무게 200-250 g, Samtako BioKorea. Co. Ltd., Korea)에 유도하였다. 우선, 랫트를 70% 질소와 30% 아이소플루레인으로 마취시키고, 중앙 경부 절개를 통해 양측 총경동맥을 노출시킨 후, 실크 봉합사를 이용하여 이중 결합하였다(2 혈관 폐색, 2VO). 허위 수술 동물군(sham-opearated animals)은 총경동맥 폐색을 제외하고 실험 동물군과 유사하게 처치하였다. 수술 과정 동안 직장 온도를 모니터링 하였고, 히팅 패드(Homeothermic blanket system; Harvard Apparatus Inc., Holliston, MA)를 이용하여 직장 온도를 37 ± 0.5°C로 유지시켰다. 수술 후, 랫트는 음식과 식수에 자유로운 접근이 가능하도록 하였으며, 수술 후 1, 2, 4, 10주에 안락사시켰다(n=6~7/그룹).
All animal testing procedures were conducted under the approval of the Animal Experimental Review Committee of Konkuk University Laboratory Animal Research Center. Based on the results of a study in which men were generally more susceptible to cerebral vascular complications such as stroke and vascular dementia, chronic cerebral hypoperfusion was induced by male Wistar rats (10 wk, weight 200-250 g, Samtako BioKorea. Ltd., Korea). First, the rats were anesthetized with 70% nitrogen and 30% isoflurane, exposed bilaterally to the common carotid artery via central incision, and then double-bonded (2 vascular occlusion, 2VO) using a silk suture. Sham-opearated animals were treated similar to experimental animals except for total carotid occlusion. Rectal temperature was monitored during the surgical procedure and rectal temperature was maintained at 37 ± 0.5 ° C using a heating pad (Homeothermic blanket system; Harvard Apparatus Inc., Holliston, Mass.). After surgery, rats were allowed free access to food and drinking water and euthanized at 1, 2, 4, and 10 weeks postoperatively (n = 6-7 / group).

<< 실시예Example 3> 3>

만성 대뇌 Chronic cerebral 저관류Low-pass 동물모델의  Animal model 해마에서In the sea horse ROSROS 증가와 신경세포 사멸 관찰 Increase and neuronal cell death

<3-1> <3-1> ROSROS 증가 increase

상기 실시예 2를 통하여 2 혈관 폐색(2 VO)한 만성 대뇌 저관류 동물 모델의 뇌에 초과산화물(superoxide)이 발생하는지 확인해 보고자, 초과산화물과 이로부터 유도된 산화 물질의 제자리 시각화(in situ visualisation)를 위하여 하이드로에티다인(hydroethidine) 조직화학법을 시행하였다. In situ visualization of superoxide and its derived oxidants was carried out to investigate the superoxide generation in the cerebral brain of hypothalamic hypoperfusion animals with 2 vascular occlusion (2 VO) Hydro- tyidine histochemistry was carried out.

이를 위하여, 상기 실시예 2에서 허위 수술 또는 2 혈관 폐색 수술한 랫트에 1㎍/㎕의 하이드로에티다인(hydroethidine)과 1%의 디메틸설폭사이드를 포함하는 PBS를 2ml 복강 주입하고, 60분 후에 실험동물을 안락사시킨 후, 뇌를 적출하여 드라이 아이스에 동결하였다. 전두엽 피질(prefrontal cortex)과 해마(hippocampal) 절편(40㎕ 두께)을 젤라팅 코팅된 글라스 슬라이드에 마운팅시키고, 하이드로에티다인 산화물인 에티듐(ethidium)을 형광 현미경으로 관찰한 후, 정량 분석하였다.To this end, 2 ml of PBS containing 1 μg / μl of hydroethidine and 1% dimethyl sulfoxide was injected intraperitoneally into rats subjected to a false operation or two-vessel occlusion surgery in Example 2, and after 60 minutes After the animals were euthanized, the brains were harvested and frozen on dry ice. Prefrontal cortex and hippocampal slices (40 쨉 l thickness) were mounted on gelatin-coated glass slides and ethidium oxide, hydroethidium oxide, was observed by fluorescence microscopy and quantitatively analyzed .

그 결과, 2 혈관 폐색(2 VO) 수술 후 10주 경과한 동물 모델에서 전두엽 피질(내측 중경핵 및 대각섬유줄)과 해마의 CA1 부위의 ROS 수치가 증가되는 것으로 확인되었다(도 1A 및 1B 참조). 또한, 지질 과산화 마커인 말론다이알데하이드(MDA)의 면역반응성도 허위 수술한 랫트 동물모델에 비해 2 혈관 폐색 수술한 랫트 동물모델의 해마 CA1 부위에서 증가하는 것으로 나타났다(도 1C 참조). 또한, 산화 환원 개량 마커인 c-fos 전사 인자와 나이트로타이로신 수치의 면역 반응성도 허위 수술한 동물 모델에 비해 2 혈관 폐색 수술한 동물모델의 해마 CA1 부위에서 증가하는 것으로 나타났다(도 1C 참조). 한편, 수술 10주 후 콜린성 신경세포에서의 ChAT 면역반응성은 내측 중경핵과 대각 섬유줄에서 모두 감소하였다. As a result, it was confirmed that ROS levels in the frontal cortex (inner median nucleus and diagonal fiber line) and CA1 region of the hippocampus were increased in animal models 10 weeks after the operation of 2-vessel occlusion (2 VO) (refer to FIGS. 1A and 1B ). In addition, the immunoreactivity of malondialdehyde (MDA), a lipid peroxidation marker, was also found to increase in the hippocampal CA1 region of a rat animal model with two-vessel occlusion, compared to a rat animal model with a false operation (see FIG. In addition, the immunoreactivity of c-fos transcription factor and nitotyrosine levels, which are redox-improving markers, was also increased in the hippocampal CA1 region of the animal model with 2-vessel occlusion compared to the animal model with the false operation (see FIG. On the other hand, ChAT immunoreactivity in cholinergic neurons declined in the medial chondrocytes and diagonal fiber lines 10 weeks after surgery.

또한, 산화적 DNA 손상은 증가된 8-oxo-dG 면역 반응성으로 실험해 본 결과, 2VI 수술한 동물모델 해마의 CA1 부위에서 증가되는 것으로 나타났다(도 2A 및 2B 참조)
In addition, oxidative DNA damage was found to be increased in the CA1 region of the hippocampus of an animal model with 2VI surgery as a result of an experiment with increased 8-oxo-dG immunoreactivity (see Figures 2A and 2B)

<3-2> 신경세포 사멸<3-2> Neuronal death

2 VO 수술 10주 후 해마 신경세포의 사멸을 NeuN 면역염색과 Nissl 염색으로 관찰하였고, 해마 조직 절편에서 절단된 caspase-3를 면역염색으로 관찰하였다. 또한, NeuN과 MAP-2 및 GFAP의 발현량을 웨스턴 블라팅으로 관찰해 보았다. After 2 weeks of VO surgery, hippocampal neuronal death was observed with NeuN immunostaining and Nissl staining, and caspase-3 cleaved in hippocampal tissue sections was immunostained. In addition, we observed the expression levels of NeuN, MAP-2 and GFAP by Western blotting.

면역염색을 위하여, PBS에 녹인 살린(Saline)과 4% 파라포름알데하이드를 뇌에 수액하고 뇌를 적출한 후, 전뇌와 중뇌 블록을 4% 파라포름알데하이드로 침수 고정하고 수크로오즈 상에서 동결방지 하였다. 저온유지장치에서 순차적으로 두정 절편(40㎛)을 절단하여 -20℃에 보관하였다. 면역표지를 위하여 절편을 블라킹 용액(5 % horse serum and 0.3 % Triton X-100 in PBS, pH 7.5)에 반응시키고, 1차 항체(rabbit anti-NeuN antibody (1:2000))로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 마지막으로, 절편을 블라킹 용액에 용해된 2차 항체(Alexa Fluor 564 conjugated anti-rabbit IgG (1:200))로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 공초점 현미경(Olympus, USA)로 관찰하였으며, 정량 분석을 실시하였다,For immunostaining, saline dissolved in PBS and 4% paraformaldehyde were infused into the brain and the brain was extracted. The whole brain and midbrain blocks were submerged in 4% paraformaldehyde and frozen on sucrose . The parietal slices (40 μm) were sequentially cut from the cryostat and stored at -20 ° C. The sections were reacted with blocking solution (5% horse serum and 0.3% Triton X-100 in PBS, pH 7.5) and incubated with primary antibody (rabbit anti-NeuN antibody (1: 2000) The reaction was carried out overnight. Finally, the sections were reacted with secondary antibodies (Alexa Fluor 564 conjugated anti-rabbit IgG (1: 200)) dissolved in blocking solution for 1 hour at room temperature and observed with confocal microscopy (Olympus, USA) , And quantitative analysis was performed.

Nissl 염색을 위하여, 샘플을 0.1% Cresyl violet 용액과 상온에서 5분간 반응시키고 증류수로 신속하게 헹구어 낸 후, 희석된 에탄올로 단계별 건조하고 자일렌(xylee)으로 세척하였다. 이후 샘플을 영구적 마운팅 배지를 이용하여 글라스 슬라이드에서 단계적으로 마운팅하고, 마운팅된 절편을 광학 현미경으로 관찰한 후, 정량 분석을 수행하였다. For Nissl staining, the samples were reacted with 0.1% Cresyl violet solution at room temperature for 5 minutes, rinsed quickly with distilled water, and then stepwise dried with diluted ethanol and washed with xylene. The samples were then mounted stepwise on a glass slide using a permanent mounting medium and the mounted sections were observed with an optical microscope and quantitated.

웨스턴 블라팅은 조직을 차가운 PBS로 세척하고, 프로테아제 저해제와 포스파타아제 저해제(Sigma-Aldrich)를 포함하는 RIPA 버퍼(50mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP40, 0.25% Na-deoxycholate, and 0.1% SDS)를 이용하여 용해한 후, 30㎍의 용해성 단백질을 SDS-PAGE에 전기영동한 후, PVDF 멤브레인으로 이동하였다. 단백질 밴드는 단백질 특이적 항체(anti-NeuN, anti-MAP-2 및 anti-GFAP 항체)와 Enhanced Chemiluminescence (Pierce, Rockford, IL)로 감지하였다.Western blotting was performed by washing the tissue with cold PBS and incubating the cells with RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.25% Na-deoxycholate, Sigma-Aldrich) containing protease inhibitor and phosphatase inhibitor and 0.1% SDS), and 30 μg of the soluble protein was electrophoresed on SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Protein bands were detected with protein-specific antibodies (anti-NeuN, anti-MAP-2 and anti-GFAP antibodies) and Enhanced Chemiluminescence (Pierce, Rockford, IL).

그 결과, NeuN⁺ 및 Nissl-염색된 세포는 2 VO 수술한 랫트의 CA1 부위에서 각각 21.5±4.11%(P<0.05 vs 허위 대조군) 및 31.2±4.05%(P<0.05 vs 허위 대조군)까지 감소하는 것으로 나타났다(도 2C ~ 2F 참조). 또한, 절단된 caspase-3 염색된 세포는 2 VO 수술한 랫트 동물모델에서 증가하는 것으로 나타났다(도 2G 및 2H 참조). 한편, NeuN와 MAP-2의 발현양은 2 VO 수술한 동물모델의 해마에서 모두 현저히 감소하였으며, GFAP는 2VO 수술한 동물모델의 해마에서 증가하는 것으로 나타나 성상교세포증(astroglosis)이 나타나는 것으로 확인되었다(도 2H 및 2I 참조).
As a result, NeuN ⁺ and Nissl-stained cells were reduced to 21.5 + 4.11% (P <0.05 vs false control) and 31.2 + 4.05% (P <0.05 vs false control), respectively, in the CA1 region of 2 VO operated rats (See Figs. 2C to 2F). In addition, truncated caspase-3 stained cells were found to increase in 2 VO operated rat animal models (see Figures 2G and 2H). On the other hand, the expression levels of NeuN and MAP-2 were markedly decreased in the hippocampus of the animal model with 2 VO, and GFAP was increased in the hippocampus of the animal model with 2 VO, indicating astroglossia 2H and 2I).

<< 실시예Example 4> 4>

만성 대뇌 Chronic cerebral 저관류Low-pass 동물모델의  Animal model 해마에서In the sea horse Nox1Nox1 발현 증가 및  Increased expression and Rac1Rac1 의 활성화 관찰Activation observation of

<4-1> <4-1> Nox1Nox1 mRNAmRNA 변화 관찰 -  Change observation - RTRT -- PCRPCR 법method

2 VO 유도된 만성 대뇌 저관류 동물 모델의 신경 세포 퇴화가 Nox에 의한 산화적 스트레스와 연관되어 있는지 확인해 보고자 하였다. Nox는 촉매 서브유닛(Nox isoform), 조절 서브유닛, small GTPase Rac1으로 구성된 효소로, 각 Nox 동형 단백질을 인코딩하는 mRNA(Nox1, Nox2 및 Nox4)와 이들의 조절 서브유닛(Noxo1 및 Noxa1)을 RT-PCR로 확인하였다. To investigate whether neuronal degeneration in 2 VO induced chronic cerebral hypoperfusion animal models is associated with oxidative stress induced by Nox. Nox is an enzyme composed of catalytic subunit (Nox isoform), regulatory subunit, small GTPase Rac1, and mRNA encoding each Nox homologous protein (Nox1, Nox2 and Nox4) and their regulatory subunits (Noxo1 and Noxa1) -PCR.

해마 조직으로부터의 총 RNA는 Trizol 시약으로 추출하였다. 역전사 반응은 총 RNA 1㎍을 1 unit/㎕의 superscript II reverse transcriptase를 이용하여 42℃에서 40분간 반응하여 진행하였다. 프라이머는 oligo(dT)와 임의의 프라이머를 사용하였고, 94℃에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다. 총 RNA 1㎍에서 수득한 cDNA를 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였고, PCR을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 1과 같다.Total RNA from hippocampal tissue was extracted with Trizol reagent. The reverse transcription reaction was performed by reacting 1 μg of total RNA with 1 unit / μl of superscript II reverse transcriptase at 42 ° C for 40 minutes. Oligo (dT) and any primer were used as the primer, and the reaction was terminated by heating at 94 ° C for 5 minutes. The cDNA obtained in 1 占 퐂 of total RNA was used as a template for PCR amplification and the primers used for PCR are shown in Table 1 below.

프라이머명Primer name 염기서열Base sequence rat Nox1 senserat Nox1 sense 5'-TGACAGTGATGTATGCAGCAT-3'5'-TGACAGTGATGTATGCAGCAT-3 ' rat Nox1 antisenserat Nox1 antisense 5'-CAGCTTGTTGTGTGCACGCTG-3'5'-CAGCTTGTTGTGTGCACGCTG-3 ' rat Nox2 senserat Nox2 sense 5'-ACTCGAAAACTTCTTGGGTCAG-3'5'-ACTCGAAAACTTCTTGGGTCAG-3 ' rat Nox2 antisenserat Nox2 antisense 5'-TCCTGTGATGCCAGCCAACCGAG-3'5'-TCCTGTGATGCCAGCCAACCGAG-3 ' rat Nox4 senserat Nox4 sense 5'-GCCGGCGGTATGGCGCTGTC-3'5'-GCCGGCGGTATGGCGCTGTC-3 ' rat Nox4 antisenserat Nox4 antisense 5'-CCACCATGCAGACACCTGTCAGG-3'5'-CCACCATGCAGACACCTGTCAGG-3 ' rat Noxa1 senserat Noxa1 sense 5'-TCTAGGGGATCAGATACGGGAC-3'5'-TCTAGGGGATCAGATACGGGAC-3 ' rat Noxa1 antisenserat Noxa1 antisense 5'-CCAAGGAAATCCATGGGCTCCAG-3'5'-CCAAGGAAATCCATGGGCTCCAG-3 ' rat Noxo1 senserat Noxo1 sense 5'-ACCCAGTATCAGCCCATGCTG-3'5'-ACCCAGTATCAGCCCATGCTG-3 ' rat Noxo1 antisenserat Noxo1 antisense 5'-ATGGAGCATCAGGAAGCTTGG-3'5'-ATGGAGCATCAGGAAGCTTGG-3 ' rat GAPDH senserat GAPDH sense 5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3'5'-ATCACCATCTTCCAGGAGCG-3 ' rat GAPDH antisenserat GAPDH antisense 5'-GATGGCATGGACTGTGGTCA-3'5'-GATGGCATGGACTGTGGTCA-3 '

PCR은 10㎕의 2x PCR 버퍼, 1.25 mM의 각각의 dNTP, 10 pmol의 각각의 프 라이머, 2.5 units의 Taq polymerase를 혼합 2하여 최종 20㎕로 반응시켰다. Nox1은 95℃에서 40 3초, 62℃에서 30초, 72℃에서 2분으로 32주기, 4 GAPDH는 95℃에서 40초, 58℃에서 30초, 72℃에 5서 2분으로 27 주기 반응시켰다. 마지막 주기 6후, 각 샘플은 72℃에서 추가 7분간 반응시켰고, PC 7R 산물은 EtBr을 포함하는 1% 아가로오스 겔에 8서 확인하였으며, 샘플의 양은 증폭된 GAPDH로 정상 9화하였다. For PCR, 10 μl of 2 × PCR buffer, 1.25 mM of each dNTP, 10 pmol of each primer, and 2.5 units of Taq polymerase were mixed and reacted in a final volume of 20 μl. Nox1 was subjected to 27 cycles of 32 cycles of 40 sec at 95 ° C, 30 sec at 62 ° C, 2 min at 72 ° C, 40 sec at 95 ° C, 30 sec at 58 ° C, and 5 min at 2 min for 4 GAPDH . After the last cycle 6, each sample was reacted at 72 ° C for an additional 7 min. The PC 7R product was identified on 8% agarose gel containing EtBr and the amount of sample was normalized to 9 with amplified GAPDH.

그 결과, Nox 동형 단백질인 No10x1, Nox2 및 Nox4와 조절 서브유닛 Noxo1 및 Noxa111 중에서 오직 Nox1만이 만성 대뇌 저관류에12서 2 VO 수술 후 2주 동안 그 mRNA 발현이 증가되는 것으로 나타났다(도 3A 참조).
As a result, only Nox1 among the Nox homologous proteins No10x1, Nox2 and Nox4 and the regulatory subunits Noxo1 and Noxa111 showed that mRNA expression was increased in chronic cerebral hypoperfusion at 12 weeks after 2 VO surgery for 2 weeks (see FIG. 3A).

<4-2> <4-2> Nox1Nox1 단백질 발현 관찰 -  Observation of protein expression - 웨스턴Western 블라팅법Blasting method

또한, 2 VO 수술 후 2주가 경과하였을 때, 해마와 선조체에서의 Nox1, Nox2, Nox4 단백질 발현을 웨스턴 블라팅으로 분석하였다(실험방법은 상기 실시예 3-2 참조. 이 경우, SN 조직의 총 용해물에 양성 대조군 또는 음성 대조군으로 각각 6-OHDA 또는 운반체를 주입하였다. 그 결과, Nox2 및 Nox4는 해마와 선조체에서 모두 발현양 변화가 관찰되지 않았고, Nox1의 경우 해마에서만 단백질 발현이 증가하는 것으로 나타났다(도 3B ~ 3D 참조).
The expression of Nox1, Nox2, and Nox4 proteins in the hippocampus and striatum was analyzed by Western blotting at 2 weeks after 2 VO surgery (see Experimental Example 3-2 above). In this case, As a result, the expression levels of Nox2 and Nox4 were not observed in the hippocampus and striatum, whereas the expression of Nox1 was increased only in the hippocampus (See Figures 3B-3D).

<4-3> <4-3> Rac1Rac1 활성화 분석 Activation analysis

Rac1의 활성화는 Nox1 및 Nox2의 활성화에 불가결한 요소인바, 본 발명자들은 2 VO 수술 후 2주가 경과하여 해마 조직으로부터 Rac1의 활성화 정도를 분석하여 보았다.Activation of Rac1 is an indispensable factor for activation of Nox1 and Nox2, and the present inventors analyzed the degree of activation of Rac1 from hippocampal tissue 2 weeks after 2 VO surgery.

이를 위하여, 해마 조직에서 추출한 단백질 1mg을 활성화된 Rac의 반응기인 PAK1(p21-activated protein kinase)의 PBD(p-21 binding domain)를 포함하는 아가로오즈 비드 20㎕와 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 비드는 원심분리기로 분리하고 용해 버퍼로 2번 세척한 후, 샘플 버퍼에 재현탁하여 5분간 가열하였다. 단백질을 10~20% 트리신 겔을 이용한 SDS-PAGE로 전기영동하고 PVDF 멤브레인으로 이동시킨 후, 랫트 Rac1 항체와 ECL로 시각화하였다. 양성 대조군으로는 GTPgS(가수분해할 수 없는 GTP 유사체)를 제조자 방식(Cell Biolabs, New York, NY)에 따라 사용하였다.To this end, 1 mg of protein extracted from hippocampal tissue was reacted with 20 μl of agarose beads containing PBD (p-21 binding domain) of p21-activated protein kinase (PAK1) . The beads were separated by centrifuge, washed twice with dissolution buffer, resuspended in sample buffer and heated for 5 minutes. Proteins were electrophoresed by SDS-PAGE with 10-20% tricine gel and transferred to PVDF membrane and visualized with rat Rac1 antibody and ECL. As a positive control, GTPgS (a non-hydrolyzable GTP analog) was used according to the manufacturer's protocol (Cell Biolabs, New York, NY).

그 결과, 2 VO 수술한지 2주가 경과한 랫트의 해마 조직에서 특이적으로 GTP에 결합한 활성화된 Rac1이 관찰되었다. 이 경우, Nox1도 활성화된 Rac1과 함께 침강하는 것으로 나타나, 본 발명자들은 2 VO에 의해 유도된 만성 대뇌 저관류에 의해 해마의 Nox1/Rac1 시스템이 활성화되는 것을 알 수 있었다(도 3E 및 3F 참조).
As a result, activated Rac1 specifically bound to GTP was observed in hippocampal tissues of rats 2 weeks after 2 VO operation. In this case, Nox1 also appeared to precipitate with activated Rac1, and we found that the hypoxia-induced chronic hypothalamus induced activation of the hippocampal Nox1 / Rac1 system (see Figures 3E and 3F).

<4-4> <4-4> Nox1Nox1 단백질 발현 관찰 -  Observation of protein expression - 면역조직화학법Immunohistochemistry

한편, 본 발명자들은 2 VO 수술에 의해 Nox1 단백질 발현이 증가하는 것을 다시 한 번 확인하고자, 면역조직화학법을 실시하였다. 면역조직화학법은 상기 실시예 3-2에 기재된 방법으로 실시하였고, 사용된 1차 항체는 rabbit anti-NeuN antibody (1:2000), rabbit anti-Nox1(1:500), goat anti-Nox1 (1:500), rabbit anti-Nox2 (1:500), rabbit anti-Nox4 (1:500), anti-Noxo1 (1:500), anti-Noxa1 (1:500), rat anti-CD11b (1:500), mouse anti- glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:1000), and mouse anti-8-oxo-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG, 1:500)이고, 사용된 2차 항체는 Alexa Fluor 488 conjugated antimouse IgG 또는 Alexa Fluor 564 conjugated anti-rabbit IgG (1:200)이며, 샘플은 Topro3 (1:1000 in PBS)로 염색하고 공초점 현미경(Olympus, USA)로 관찰하였으며, 정량 분석을 실시하였다,항체 블라킹을 위하여 Nox1 항체는 500㎕의 PBS에 blocking peptide (Santa Cruz Biotechnology)를 5배 고농도로 하여 상온에서 1시간 동안 전반응시켰다. Meanwhile, the present inventors performed immunohistochemistry to confirm the increase of Nox1 protein expression by 2 VO surgery. Immunohistochemistry was performed as described in Example 3-2. The primary antibodies used were rabbit anti-NeuN antibody (1: 2000), rabbit anti-Nox1 (1: 500), goat anti-Nox1 1: 500), rabbit anti-Nox2 (1: 500), rabbit anti-Nox4 (1: 500), anti-Noxo1 (1: 500) (8-oxo-dG, 1: 500), mouse anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1: 1000) and mouse anti-8-oxo-2'-deoxyguanosine Fluor 488 conjugated antimouse IgG or Alexa Fluor 564 conjugated anti-rabbit IgG (1: 200). The samples were stained with Topro3 (1: 1000 in PBS) and observed with a confocal microscope (Olympus, USA) For antibody blotting, the Nox1 antibody was pre-reacted at room temperature for 1 hour at a high concentration of blocking peptide (Santa Cruz Biotechnology) in 500 μl of PBS at a high concentration of 5 times.

그 결과, 2 VO 수술한지 10주가 경과한 동물 모델의 해마 CA1에서 Nox1의 발현은 허위 수술한 대조군에 비해 현저히 증가하였고, 이는 2 VO 수술 후 1주가 경과한 때부터 꾸준히 증가한 것으로 나타났다(도 4A ~ 4C 참조). 그리고, 대부분의 Nox1(빨간색)은 피라미드 신경세포(NeuN, 녹색)과 함께 위치하는 것으로 나타났다. 한편, 본 실험의 양성 대조군으로 SN 조직의 도파민작동성 신경세포에 6-OHDA를 주입한 경우 Nox1의 발현이 증가하였으며, Nox1 항체의 특이성은 Nox1 블라킹 단백질과 함께 1시간 동안 전반응한 후에는 Nox1을 감지할 수 없음을 확인함으로써 평가하였다(도 4D 참조). 또한, Nox1은 성상교세포(마커: NeuN, GFAP), 미세아교세포(마커: CD11b)에서는 발현되지 않은 것으로 확인되어(도 4E 참조), 본 발명자들은 Nox1이 해마 신경세포 특이적으로 발현되고, 특히 만성 대뇌 저관류에 의한 해마 신경세포에서 특이적으로 발현된다는 확인하였다.
As a result, the expression of Nox1 in the hippocampal CA1 of the animal model after 10 weeks of 2 VO operation was significantly increased compared with that of the false-positive control, which was steadily increased from 1 week after 2 VO surgery (FIGS. 4C). Most Nox1 (red) was found to be located with pyramidal neurons (NeuN, green). On the other hand, as a positive control for this experiment, the expression of Nox1 was increased when 6-OHDA was injected into dopaminergic neurons of SN tissue, and the specificity of Nox1 antibody was pretreated with Nox1 blocking protein for 1 hour (See Fig. 4D). &Lt; tb &gt;&lt; TABLE &gt; Further, it was confirmed that Nox1 was not expressed in astrocytes (marker: NeuN, GFAP) and microglia (marker: CD11b) (see FIG. 4E), and the inventors of the present invention found that Nox1 is specifically expressed in hippocampal neurons, It was confirmed that it was expressed specifically in hippocampal neurons by chronic cerebral hypoperfusion.

<< 실시예Example 5> 5>

아포시닌에Aposinin 의한 만성 대뇌  Chronic cerebral by 저관류Low-pass 치료효과 분석 Analysis of treatment effect

<5-1> <5-1> 아포시닌에Aposinin 의한  by 산화적Oxidative 스트레스 감소 효과 분석 Stress reduction effect analysis

상기 실시예들을 통하여 본 발명자들은 만성 대뇌 저관류 동물모델에서 Nox1에 의한 산화적 스트레스가 증가함을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 Nox1의 저해제로 추정되는 아포시닌(apocynin)이 만성 대뇌 저관류에 의한 해마 신경세포 손상에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보았다. Through the above examples, the present inventors confirmed that Nox1-induced oxidative stress is increased in an animal model of chronic cerebral hypoperfusion. Therefore, the present inventors have examined how apocynin, which is presumed to be an inhibitor of Nox1, affects hippocampal neuronal cell damage caused by chronic cerebral hypoperfusion.

이를 위하여 허위 수술 또는 2 VO 수술한 날부터 8주 동안 매일 운반체(1% DMSO in saline) 또는 아포시닌(10mg/kg)을 복강 투여하였다(n=6/그룹). For this purpose, daily intraperitoneal (1% DMSO in saline) or apoptinin (10 mg / kg) was intraperitoneally administered (n = 6 / group) for 8 weeks from the day of false surgery or 2 VO surgery.

그 결과, 아포시닌을 처리한 2 VO 수술 랫트에선 초과산수소 생성이 현저히 감소하였고(도 5A, 5B 참조), 8-oxo-dG 면역반응성으로 확인된 산화적 DNA 손상도 현저히 감소하였다(도 5A, 5C 참조). As a result, the production of excess oxygen in the 2-VO operated rats treated with aposinin was markedly reduced (see FIGS. 5A and 5B), and the oxidative DNA damage confirmed by 8-oxo-dG immunoreactivity was also markedly decreased , 5C).

또한, NeuN 면역염색 및 Nissl 염색으로 확인해 본 결과, 2 VO 수술에 의해 해마의 CA1 부위에서 증가된 신경세포 손상도 아포시닌의 처리에 의해 현저히 감소하였다(도 6 참조). 2 VO 수술 후 감소된 NeuN+ 세포 및 Nissl 염색된 세포수는 아포시닌 처리에 의해 각각 17.13±5.46% 및 32.31±5.21%까지 회복되었다. 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, 본 발명자들은 Nox1의 활성화가 만성 대뇌 저관류에 의한 해마의 ROS 생성 및 신경세포 손상에 중요한 인자로 작용하고 있음을 확인할 수 있었다.
In addition, as confirmed by NeuN immunostaining and Nissl staining, increased neuronal cell damage in the CA1 region of the hippocampus by 2 VO surgery was significantly reduced by apoptinin treatment (see FIG. 6). The number of NeuN + and Nissl stained cells after 2 VO surgery was recovered to 17.13 ± 5.46% and 32.31 ± 5.21% by apocrine treatment, respectively. Taken together, these results indicate that the activation of Nox1 plays an important role in ROS generation and neuronal cell damage caused by hypothalamic hypoxia in the hippocampus.

<5-2> <5-2> 아포시닌에Aposinin 의한 기억 손상 감소 효과 - 모리스 수중 미로 검사 Reduction of memory impairment by Morris water maze test

한편, 본 발명자들은 2 VO 수술 후 인식 기능 회복에 아포시닌이 미치는 효과를 분석해 보고자, 모리스 수중 미로(MWM) 검사를 통하여 학습과 기억력 평가에 의한 공간 기억 검사를 실시하였다. Meanwhile, the present inventors conducted a spatial memory test by learning and memory evaluation through the Morris Underwater Maze (MWM) test in order to analyze the effect of apoptinin on recovery of recognition function after 2 VO surgery.

모리스 수중 미로 검사는 탈출용 플랫폼을 찾아 물에서 탈출하고자 시도하는 동물의 행동기능을 검사하는 것이다. 모리스 수중 미로 검사를 위하여 본 발명자들은 커다란 원형 수조(150cm 반경, 45cm 깊이)에 30cm 높이가 되도록 물을 채우고, 수온은 28±1℃를 유지하며 실험하였다. 물은 무독성의 흰색 염색을 통해 불투명하게 하였고, 수조에는 가장자리에 서로 직각으로 고정된 2 개의 칸막이를 이용하여 4개의 동일한 사분면으로 분할하였다. 흰색으로 색칠한 플랫폼(10cm²)은 수면 1cm 아래 잠수되도록 하여, 대상 사분면 내부에 위치시켰다. 플랫폼의 위치는 각 훈련기간(training session) 동안 바꾸지 않았고, 항상 남동쪽 사분면에 위치시켰다. 훈련은 4번의 연속된 훈련기간(training session)으로 구성되었고, 각 훈련기간(training sesseion)은 2일에 걸친 5번의 시행(2/day&3/day 교대로 실시)으로 구성되었으며, 이를 총 8일 동안 연속하여 실시하였다. 각 시행(trial)에서, 랫트는 얌전히 수조의 사분면 사이의 입수시키되, 랫트가 마주보는 벽면과 입수되는 위치는 매 시행(trial)마다 변경하였다. 랫트는 90초간 침수된 플랫폼의 위치를 찾을 수 있었고, 플랫폼을 찾으면 플랫폼에서 30초간 머물 수 있었다. 90초 안에 플랫폼을 찾지 못하면, 랫트가 플랫폼을 찾을 수 있도록 조심스럽게 유도하여 플랫폼에 오를 수 있도록 하고, 플랫폼에서 30초간 머물 수 있도록 하였다. 각 시행(trial) 사이의 간격은 1분으로 하였다. 수행 정확도(performance accuracy)는 모든 시행(trial)의 탐색 오류(search error) 및 반응시간(time latency)에 기초하여 평가하였다. 탐색 오류는 시행(trial) 중 동안 플랫폼으로부터 평균 거리를 계산하여 측정하였으며, 랫트와 플랫폼 사이의 거리는 각 시행(trial) 중 10 times/sec로 표본화하였고, 이들 거리는 1-sec bins으로 평균화하였다. 누적된 탐색 오류는 근접 측정(proximity measurements)의 이들 1-sec 평균의 합으로 나타내었고, 이 경우 특정 플랫폼의 위치와 시작 위치는 시험에서 완벽한 수행에 의한 근접 점수를 감하여 보정되었다. 검사시행(probe trial)는 매 10번의 훈련시행(trianing trial)이 끝나고 1분 후에 실시하였다. 전체의 훈련 과정은 2 번의 검사시행(probe trial)을 포함하고 있으며, 30초 동안 랫트는 수조의 바닥에 있는 플랫폼으로 수영하도록 하였다. 수영 경로를 기록한 후, 플랫폼은 시행의 완성을 위해 정상적인 위치로 올려 놓았으며, 가라앉은 플랫폼이 있는 대상 사분면에서 수영할 때 소요된 시간을 공간 기억 검사를 유지하는 척도로 사용하였다. 눈에 보이지 않는 플랫폼을 사용하는 모리스 수중 미로 검사를 완료한 후 1주가 경과하여, 모든 랫트는 수면 위에 떠오른 눈에 보이는 플랫폼을 사용하여 실험하였다(cued behavior). 이 경우, 보이는 플랫폼의 위치는 매 시행마다 변화시키며 실험하였다. The Morris Underwater Maze Test is an examination of the behavioral function of animals attempting to escape from the water in search of an escape platform. For the Morris Underwater Maze test, the present inventors filled a large circular water bath (150 cm radius, 45 cm deep) to a height of 30 cm, and the water temperature was maintained at 28 ± 1 ° C. The water was made opaque through non-toxic white dyeing, and the water tanks were divided into four identical quadrants using two partitions fixed at right angles to each other on the edge. The platform (10 cm ² ) painted white was submerged under 1 cm of water, and placed inside the target quadrant. The location of the platform was not changed during each training session and was always located in the southeast quadrant. The training consisted of four consecutive training sessions. Each training session consisted of 5 sessions (2 / day & 3 / day alternation) over 2 days, . In each trial, the rats were gently received between quadrants of the tank, with the rats facing the wall and the location at which they were taken changed every trial. The rats were able to locate the submerged platform for 90 seconds, and when they found the platform, they could stay on the platform for 30 seconds. If the platform can not be found in 90 seconds, the rats are carefully guided to find the platform, allowing them to climb the platform, and allowing the platform to stay for 30 seconds. The interval between trials was 1 minute. Performance accuracy was evaluated based on search errors and time latency of all trials. Navigation errors were measured by calculating the mean distance from the platform during the trial and the distance between the rat and the platform was sampled at 10 times / sec during each trial, and these distances were averaged to 1-sec bins. The cumulative search error is represented by the sum of these 1-sec averages of proximity measurements, in which case the position and start position of a particular platform are calibrated by subtracting the proximity score from the complete run in the test. The probe trial was performed one minute after the end of each trianing trial. The entire training course included two probe trials and allowed the rats to swim to the platform on the bottom of the tank for 30 seconds. After recording the swim path, the platform was placed in a normal position for the completion of the run, and the time spent swimming in the quadrant with the sinking platform was used as a measure to maintain the spatial memory test. One week after completing the Morris water maze test using an invisible platform, all rats were exposed to water The cued behavior was tested using a visible platform. In this case, the position of the visible platform was experimented by changing every experiment.

그 결과, 허위 수술한 동물모델에서는 숨겨진 플랫폼의 위치를 점진적으로 학습하여, 반응시간이 점차 감소하고, 탐색 오류도 점차 감소하는 것으로 확인되었다. 그러나, 2 VO 수술에 의해 만성 대뇌 저관류를 유도한 동물모델에서는 공간 학습에서 상당한 손상이 있는 것으로 확인되었다(반응 시간 F(3, 20)=22.19; 탐색오류 F(3, 20)=24.17). 한편, 아포시닌을 처리한 2 VO 수술에 의해 만성 대뇌 저관류를 유도한 동물 모델에서는 반응시간이 감소하고, 탐색 오류도 감소하는 것으로 나타났다(도 7A 및 7B 참조). 상기와 같은 결과를 통해 본 발명자들은 초과산화물이 공간 기억의 손상을 유도하고, 학습과 기억력에 Nox에 의한 정상적인 초과산화물 생성이 중요하게 작용함을 알 수 있었다. 한편, 모든 군에서 수영 속도에 차이가 있지는 않은 것으로 확인되었다(도 7C 참조). 최초 검사시행(probe trial)에서, 대상 사분면에서 보내는 시간은 모든 군에서 별다른 차이가 없었으나, 두번째 검사시행(probe trial)에서는 대상 사분면에서 보내는 시간이 그룹에 따라 차이가 있는 것으로 나타났다(F(3, 29)=18.10). 한편, 사후 검증 분석(post-hoc analysis)에서는 대상 사분면에서 보내는 시간이 2 VO 수술한 랫트 실험군에서 현저히 감소하는 것으로 나타났으며, 2 VO 수술한 랫트 실험군에 아포시닌을 처리하면 대상 사분면에서 보내는 시간이 다시 증가하는 것으로 나타났다(도 7D 참조). 그러나, 눈에 보이는 플랫폼에 도달하기 위해 소요되는 시간은 각 그룹간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(F(3, 20)=1.642, 도 7E 참조).
As a result, it was confirmed that in the case of the false animal model, the position of the hidden platform was gradually learned, the reaction time gradually decreased, and the search error gradually decreased. However, in the animal model that induced chronic cerebral hypoperfusion by 2 VO surgery, it was confirmed that there was considerable damage in spatial learning (response time F (3, 20) = 22.19; search error F (3, 20) = 24.17). On the other hand, in the animal models that induced chronic cerebral hypoperfusion by apoptinin-treated 2 VO surgery, the response time decreased and the search error decreased (see FIGS. 7A and 7B). From the above results, the inventors of the present invention found that the excess oxide induces the damage of spatial memory, and the normal superoxide generation by Nox plays an important role in learning and memory. On the other hand, it was confirmed that there was no difference in swimming speed in all groups (see FIG. 7C). In the probe trials, the time spent in the target quadrant was not significantly different in all groups, but in the second trial (probe trial), the time spent in the target quadrant varied from group to group (F , 29) = 18.10). In the post-hoc analysis, the time spent in the target quadrant was significantly reduced in the rats treated with 2 VO, and apoptinin treatment in the 2 rd VO-treated rats resulted in a significant decrease Time again (see FIG. 7D). However, the time required to reach the visible platform was not significantly different between the groups (F (3, 20) = 1.642, see FIG. 7E).

<< 실시예Example 6> 6>

Nox1Nox1 넉다운에In knockdown 의한 만성 대뇌  Chronic cerebral by 저관류Low-pass 치료효과 분석 Analysis of treatment effect

<6-1> <6-1> Nox1Nox1 유전자의  Gene 넉다운Knockdown (( KnockKnock -- downdown ) )

Nox1 shRNA/AAV 또는 스크램블 shRNA/AAV(scb shRNA/AAV)를 포함하는 AAV 입자를 동물 모델의 수술 4주 전 해마 CA1 부분에 정위 방법으로 주입하여 Nox1 특이적 저해가 만성 대뇌 저관류에 미치는 효과를 분석해 보고자 하였다. AAV particles containing Nox1 shRNA / AAV or scrambled shRNA / AAV (scb shRNA / AAV) were injected into the hippocampal CA1 region of the animal model 4 weeks before surgery to determine the effect of Nox1-specific inhibition on chronic cerebral hypoperfusion I would like to see.

이를 위하여, 랫트는 랫트 정위 장치에 위치시키고 ketamine과 xylazine mixture(30 mg/kg, 복강 주사)로 마취시킨 후, Nox1 shRAN/AAV 또는 스크램블 shRNA/AAV(scb shRAN/AAV)를 양측 해마의 CA1 부분[anteroposterior (AP), -3.3 mm; mediolateral (ML), + 2.0 mm; dorsoventral (DV), -3.5 mm]에 주입하였다(n=20/그룹). Nox1 shRNA 또는 scb shRNA를 인코딩하는 재조합 AAV 입자 총 1×10¹¹ genome/ml을 2㎕의 멸균된 차가운 PBS에 희석하여 각 동물에 주입하였는데, 이 때 주입 속도는 0.5㎕/min으로 하였고, 주사기를 제거하기 전 5분간 추가적으로 주사기를 더 방치한 후, 주사기를 서서히 제거하였다. 랫트는 shRNA를 주입한 후 4 주가 경과하고, 허위 수술 또는 2 혈관 폐색 수술을 실시하였다. 랫트는 scb shRNA/AAV를 주입한 허위 수술 그룹(scbRNA control, n=10), Nox1 shRNA/AAV를 주입한 허위 수술 그룹(Nox1shRNA control, n=10), sbcRNA/AAV를 주입한 2 혈관 폐색 수술 그룹(scbRNA 2VO, n=10), Nox1 shRNA/AAV를 주입한 2 혈관 폐색 수술 그룹(Nox1 shRNA 2VO, n=10)의 4 그룹으로 분류하였다.
For this purpose, rats were placed in a rat stereotaxis and anesthetized with ketamine and xylazine mixture (30 mg / kg, ip), and Nox1 shRNA / AAV or scrambled shRNA / AAV (scb shRNA / AAV) [anteroposterior (AP), -3.3 mm; mediolateral (ML), +2.0 mm; dorsoventral (DV), -3.5 mm] (n = 20 / group). A total of 1 × 10 ¹¹ genome / ml of recombinant AAV particles encoding Nox1 shRNA or scb shRNA was diluted in 2 μl of sterile cold PBS and injected into each animal at a rate of 0.5 μl / An additional syringe was left for 5 minutes before removal, and the syringe was slowly removed. Rats underwent false or two vessel occlusion after 4 weeks of shRNA injection. Rats were randomly divided into two groups: scbRNA control (n = 10) injected with scb shRNA / AAV, false surgical group (nox1shRNA control, n = 10) injected with Nox1 shRNA / AAV, (ScbRNA 2VO, n = 10), and 2-vessel occlusion group (Nox1 shRNA 2VO, n = 10) injected with Nox1 shRNA / AAV.

<6-2> 조직학적 검사<6-2> Histological examination

각 그룹 중 4마리의 랫트에서 조직학적 검사를 실시하였다. AAV의 신경세포에 대한 향성(neuronal tropism)에 기인하여 shRNA는 뇌의 신경세포로 이동하여 Nox1의 발현을 효과적으로 넉다운시킴을 알 수 있었다. 벡터들이 효과적으로 형질도입되었는지 확인해 보고자, 형질도입 효율성 마커인 EGFP를 발현을 확인해 본 결과, 해마 CA1 부위에서 NeuN+ 피라미드 뉴런 세포의 약 60% 가량에 AAV2 입자가 형질도입된 것으로 확인되었다(도 8A 및 8B 참조). 또한, Nox1 넉다운 효율은 AAV2를 주입한지 12주 후 웨스턴 블라팅과 RT-PCR을 이용하여 확인할 수 있었다(도 8C ~ 8E). 한편, Nox1 shRNA/AAV2를 주입한 경우 해마의 CA1에서 2 VO 수술에 의해 유도된 초과산화물 생성이 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 8F 및 8G 참조). 8-oxo-dG 면역반응성(도 9A 및 9D 참조)과 NeuN 면역염색된 세포(도 9B 및 9E 참조)와 Nissl 염색된 신경세포의 수도 현저히 감소하였는데, 이를 통하여 본 발명자들은 Nox1/Rac1 활성화를 저해함으로써, 2 VO에 의해 유도된 해마에서의 신경세포 손상을 억제할 수 있음을 확인하였다(도 9C 및 9F 참조). 또한, Nox1 shRNA가 형질도입된 효율과 유사한 양상으로 2 VO에 의해 유도된 ROS 생성, DNA 산화, 신경세포 손상이 감소하는 것으로 나타났다(도 8F, 9A~9C 참조).
Histological examinations were performed in 4 rats of each group. The neuronal tropism of AAV induced neuronal tropism, indicating that shRNA migrated to neurons in the brain, effectively knocking down Nox1 expression. In order to confirm whether vectors were effectively transduced, it was confirmed that AAV2 particles were transduced in about 60% of NeuN + pyramidal neuron cells in the hippocampal CA1 region (FIGS. 8A and 8B Reference). In addition, the Nox1 knockdown efficiency was confirmed by Western blotting and RT-PCR after 12 weeks of injection of AAV2 (FIGS. 8C to 8E). On the other hand, when Nox1 shRNA / AAV2 was injected, the production of excess oxides induced by 2 VO surgery in hippocampal CA1 was significantly reduced (see Figs. 8F and 8G). The numbers of 8-oxo-dG immunoreactivity (see FIGS. 9A and 9D) and NeuN immunostained cells (see FIGS. 9B and 9E) and Nissl-stained neurons were significantly reduced, thereby inhibiting Nox1 / Rac1 activation (Fig. 9C and 9F). In addition, it is possible to inhibit 2-VO-induced neuronal damage in the hippocampus. In addition, 2 VO-induced ROS production, DNA oxidation, and neuronal cell damage were reduced in a manner similar to the transduction efficiency of Nox1 shRNA (see Figures 8F, 9A-9C).

<6-3> 공간 기억 능력 검사<6-3> Spatial memory ability test

상기 실시예 <6-1>의 각 그룹당 10마리의 랫트에서 공간 기억 능력를 실시하였다. 우선, 상기 실시예 실시예 <5-2>에 기재된 실험방법으로 모리스 수중 미로(MWM) 검사를 실시하였는데, 허위 수술하고 scb shRNA/AAV를 주입한 랫트 그룹에서는 훈련 기간(trianing session)동안 빠르게 잠수된 플랫폼의 위치를 탐색할 수 있었다. 그러나, 2 VO 수술하고 scb shRNA/AAV를 주입한 랫트 그룹에서는 잠수된 플랫폼의 위치를 빠른 시간 내에 탐색하지 못하는 것으로 나타났다. 한편, 2 VO 수술하고 Nox1 shRNA/AAV2를 주입한 랫트 그룹에서는 공간 기억 능력이 현저히 회복되는 것으로 나타났다(F(3, 36)=18.9)(도 10A 참조). 그러나, 훈련시행 및 눈에 보이는 플랫폼을 탐색하는 검사에서 이들 랫트 실험군의 수영 속도를 분석한 결과에서는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다(F(3,36)=2.645)(도 10B 참조). 그리고, 눈에 보이는 플랫폼을 탐색하는데 소요된 시간은 모든 실험군에서 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다(F(3,24)=2.473)(도 10C 참조). 한편, 검사 시행(probe trial) 동안 대상 사분면에서 보내는 시간의 퍼센트 또는 30s probe 동안 플랫폼을 가로지르는 수에 의해 평가된 수행 능력의 차이를 평가해 본 결과, 2차 검사 시행(probe trial)에서 각 그룹간의 능력의 차이는 현저한 것으로 나타났다(F(3,20)=5.998, F(3,26)=6.743). 사후 검증 분석(post-hoc analysis)에서는 2 VO 수술한 랫트 그룹에 Nox1 shRNA/AAV를 주입한 경우가 scb shRNA/AAV를 주입한 경우에 비해 대상 사분면에서 보내는 시간 및 플랫폼을 가로지르는 수가 현저히 개선되는 것으로 나타났다(도 10D 및 10E 참조).
Spatial memory capacity was performed in 10 rats per each group of the above Example <6-1>. First, the Morris water maze (MWM) test was performed by the experimental method described in the Example <5-2>. In a rat group in which a false operation and scb shRNA / AAV were injected, And the location of the platform. However, in the group of rats injected with 2 VO surgery and scb shRNA / AAV, it was not possible to locate the submerged platform in a short time. On the other hand, the spatial memory ability of the rat group injected with Nox1 shRNA / AAV2 was significantly restored (2 (F) (3, 36) = 18.9) (see FIG. However, there was no significant difference (F (3,36) = 2.645) in the results of the analysis of the swimming speed of these rat experimental groups in the training execution and in the test for searching the visible platform (see FIG. 10B). Also, the time spent searching for visible platforms was not significantly different in all experimental groups (F (3,24) = 2.473) (see FIG. 10C). On the other hand, as a result of evaluating the percentage of time spent in the target quadrant during the probe trial or the performance difference evaluated by the number of traverses across the platform during the 30s probe, (F (3,20) = 5.998, F (3,26) = 6.743). In post-hoc analysis, Nox1 shRNA / AAV injected into a 2 VO group of rats significantly improved the number of crossing times and platforms across the target quadrant compared to injecting scb shRNA / AAV (See Figures 10D and 10E).

<6-4> 새로운 물체 인식 검사<6-4> New object recognition test

상기 실시예 <6-1>의 각 그룹당 8마리의 랫트에서 허위 수술 또는 2 혈관 폐색 수술 후 13 주에 새로운 물체 인식(NOR) 및 새로운 물체 위치(NOL) 검사를 시행하였다(n=8/그룹). 이를 위하여 랫트를 40cm×40cm×40cm 크기의 상자에 넣고 하루에 10분간 3일 동안 검사 공간에 익숙해지도록 하였다. 이후 24시간이 경과하고, 새로운 물체 2개를 검사 공간에 넣고 랫트가 상자에서 5 분간 검사 공간의 새로운 물체 2개를 탐색하도록 하였다. 3시간 후 물체 중 하나의 위치를 변경하거나 새로운 물체로 대체하였고, 랫트가 검사 공간을 다시 2분간 탐색하도록 하였다. 이 두 시행(trial) 사이의 간격은 24시간이었다. 새로운 물체를 탐색하였다는 것은 랫트의 머리가 물체의 45° 범위 내에 있거나 그로부터 4cm 이내에 있는 경우로 정의하였고, 물체 위에 올라가거나 물체 위에 앉는 경우는 이에 포함시키지 않았다. 비디오 카메라를 검사 공간에 배치하고 탐색 행동은 추후 분석을 위해 녹화하였다. 새로운 물체를 탐색하는데 소요된 시간을 기록하였고, 판별비(discrimination ratio)는 블라인드 방식으로 [(새로운 물체 또는 위치를 탐색하는데 걸린 시간) - (친숙한 물체 또는 위치를 탐색하는데 걸린 시간)/물체를 탐색하는데 걸린 시간]으로 계산하였다. 8 rats per group of the above Example <6-1> performed a new object recognition (NOR) and a new object position (NOL) test at 13 weeks after the false operation or 2 vascular occlusion surgery (n = 8 / group ). For this purpose, the rats were placed in a box of 40 cm × 40 cm × 40 cm and allowed to acclimate to the examination space for 3 days for 10 minutes per day. Over the next 24 hours, two new objects were placed in the examination space and the rats were allowed to explore two new objects in the examination space for 5 minutes in the box. After three hours, one of the objects was repositioned or replaced with a new object, and the rats were again allowed to search the inspection space for 2 minutes. The interval between these two trials was 24 hours. The search for a new object was defined as the case where the head of the rat was within 45 degrees of the object or within 4 cm of it and did not include it when climbing on or sitting on the object. A video camera was placed in the test space and the navigation behavior was recorded for further analysis. The time spent searching for a new object was recorded, and the discrimination ratio was calculated by blind method (time spent searching for a new object or location) - (time spent searching for a familiar object or location) Time taken to take the test.

그 결과, scb shRNA를 주입한 허위 수술군과 scb shRNA를 주입한 2 VO 수술군 간에 판별비는 현저한 차이를 나타내었으며(NOR, F(3,36) = 5.728, P < 0.05; NOL, F(3,36) = 2.517, P < 0.05; 도 10F 참조), scbRNA shRNA를 주입한 2 VO 수술군과 Nox1 shRNA를 주입한 2 VO 수술군간의 새로운 물체 인식의 판별비도 현저한 차이를 나타내었다(F(3, 28)=5.728, P<0/05; 도 10F 참조).
As a result, the discrimination ratio between the scar shRNA injected group and the scar shRNA injected group was significantly different (NOR, F (3,36) = 5.728, P <0.05; NOL, F 3, 36) = 2.517, P <0.05; see FIG. 10F), the discrimination ratio of the new object recognition between the 2 VO surgery group injected with scbRNA shRNA and the 2 VO surgery group injected with Nox1 shRNA showed a significant difference (F 3, 28) = 5.728, P <0/05; see FIG. 10F).

<6-5> 후각 식별기능 검사<6-5> Olfactory identification test

후각 식별기능 검사를 위해 32마리의 랫트(260-350g)을 단독으로 표준 플라스틱 랫트 케이지에 사육하면서 12h 명암주기를 유지하였다. 모든 검사는 명/암 주기 중 명주기에서 시행하였다. 검사 기간 동안 각 랫트는 자유로이 먹이에 접근할 때의 몸무게의 85-90%가 되도록 초기 식이를 조절하였으나, 식수에는 자유로운 접근이 가능하도록 하였다. 검사 장치는 48cm 너비, 25.5cm 폭, 30.0cm 높이의 투명 아크릴 벽을 갖는 상자로 구성되어 있으며, 불투명한 검정색 아크릴판으로 구성된 이동식 슬라이드 도어를 상자의 일면으로부터 24cm 되는 지점에 배치하였다. 이동식 슬라이드 도어는 박스를 24×25.5cm의 시작 챔버(start chamber)와 24×25.5cm의 선택 챔버(choice chamber)로 구획하였다. 미로의 바닥은 희색으로 칠해진 아크릴판으로 구성되었다. 선택 챔버의 종단벽에서는 직경 8cm, 깊이 4.5cm로 된 2개의 세라믹 용기를 배치하였다. Thirty-two rats (260-350 g) were kept alone in a standard plastic rat cage for the olfactory identification function test and maintained a 12 h light cycle. All tests were performed in the light cycle during the light / dark cycle. During the test period, each rat adjusted its initial diet to 85-90% of its body weight when freely accessible, but allowed free access to drinking water. The inspection apparatus consisted of a box having 48 cm wide, 25.5 cm wide and 30.0 cm high transparent acrylic walls, and a removable slide door composed of an opaque black acrylic plate was placed at a point 24 cm from one side of the box. The movable slide door partitioned the box into a 24 × 25.5 cm start chamber and a 24 × 25.5 cm choice chamber. The bottom of the labyrinth consisted of an acrylic plate painted in white. Two ceramic containers having a diameter of 8 cm and a depth of 4.5 cm were arranged at the end walls of the selection chamber.

행동조형을 위하여, 각 실험동물은 강제택일 판별 과정으로 훈련되었는데, 시행(trial) 초기에는 랫트를 시작 챔버에 위치시키고, 양 챔버 사이의 도어를 닫아두었다. 두 개의 세라믹 용기는 테스트 챔버에 위치시켰으며, 냄새 물질을 도포하고 보상 물질(초콜릿 쌀 시리얼, post, 한국)을 은폐하는데 사용하였다. 각 용기에는 균등하게 50cm³의 깔집으로 채우고, 50㎕의 희석된 냄새 물질을 용기 중앙부의 깔집 윗부분에 묻힌 후, 다시 50cm³의 깔집으로 그 위를 덮어 주었다. 행동조형 과정에서 부틸아세테인트(butylacetate)를 보상을 받는 냄새 물질로 사용하였다. 하나의 용기에는 보상을 받는 냄새 물질과 보상 물질을 함께 넣고, 다른 용기에는 냄새 물질만 넣고 보상 물질을 넣지 않았다. 슬라이딩 도어를 제거하면 랫트가 검사 챔버로 들어가고, 보상 물질을 찾을 때까지 양 용기를 파낼 수 있도록 하였다. 초기 행동 조형은 보상 물질을 깔집 위에 놓고 실험 동물이 보상 물질을 찾을 수 있도록 하여 훈련하였다. 이후 행동 조형 훈련은 보상 물질을 점차 깊이 묻으면서 실시하여, 보상 물질이 보이지 않아도 깔집을 파헤칠 때까지 실시하였다. 일단 랫트가 깔집을 지속적으로 파헤치는 경우, 랫트는 검사 장치의 선택 챔버에서 용기를 파헤치도록 조형 훈련하였다. 훈련 기간 동안 랫트는 하루에 15번의 5분 시행(trial)을 받았고, 각 시행(trial) 사이안격은 5분이었다. 만약 랫트가 조형 훈령 과정에서 15번의 5분 시험을 성공하지 못하는 경우, 랫트는 후각 식별기능 검사에서 배제하였다. 다음날, scb shRNA/AAV를 주입한 허위 수술 랫트(n=10)과 Nox1 shRNA/AAV를 주입한 2 혈관 폐색 수술 랫트(n=10)를 대상으로 동시에 제시된 2가지 냄새를 구별하는지 후각 식별기능 검사를 실시하였다. 각 랫트는 하루에 15번의 시험을 실시하였다. 선호도 검사에서 두 가지 냄새 물질(L-limonene and R-limonene)이 선정되었고, 이 중 하나는 보상을 받는 냄새 물질로 다른 하나는 보상을 받지 않는 냄새 물질로 지정하였다. 각 시험에서 두 개의 채굴용 용기를 동시에 랫트에 제시하였다. 보상을 받는 냄새 물질을 포함하는 깔집에는 보상 물질을 함께 묻어두었고, 보상을 받지 않는 냄새 물질을 포함하는 깔집에는 보상 물질을 묻지 않았다. 슬라이딩 도어를 제거하였을 때, 랫트는 검사용 챔버로 들어가 양 용기를 2분간 파낼 수 있도록 허용하였고, 랫트가 보상 물질을 찾는데 실패하면 냄비 위에 보상 물질을 넣어 주었다. 각 랫트 당 총 15번의 시험을 실시하였고, 각 시행(trial) 사이의 간격은 5분이었다. 매 5번째 시험에서 시험은 검사 시행(probe trial)으로 실시하여, 보상을 받는 냄새 물질을 보상 물질 없이 제시하고, 랫트가 보상을 받는 냄새 물질을 찾는데 성공하면 보상 물질을 용기 위로 놓아 주었다. 보상 물질을 찾는데 걸리는 반응시간을 측정하였고, 데이터는 이를 파내는데 걸리는 총 시간으로 나타내었다. For behavioral modeling, each experimental animal was trained by a forced selection procedure. At the beginning of the trial, the rats were placed in the starting chamber and the door between the chambers was closed. Two ceramic containers were placed in the test chamber, applied with odorous substance and used to cover the compensating material (chocolate rice cereal, post, Korea). Each container was evenly filled with a 50 cm ³ ridge, and 50 쨉 l of diluted odor material was placed on the top of the ridge at the center of the container, and then covered with a 50 cm ³ ridge. Butylacetate was used as a deodorant material to compensate in the behavior shaping process. In one container, the odorous substance and the compensating substance to be compensated are put together, and the other container is filled with odorous substance and no compensating substance. Removal of the sliding door allowed the rats to enter the test chamber and be able to dig both containers until they found the compensating material. Early behavioral formulations were trained by placing the compensating material on the bedside and allowing the animal to find the compensating material. Behavioral modeling exercises were then carried out with increasingly deep burial of compensating substances until the rubble was excavated even if no compensation material was visible. Once the rats constantly digested the rug, the rats were trained to dig the containers in the selection chambers of the test device. During the training period, the rats received 15 5-minute trials per day and 5-minute intervals between each trial. Rats were excluded from the olfactory identification test if the rat failed the 15-minute 5-minute test in the formalization procedure. On the following day, two scintigraphic smells were discriminated between the scar shRNA / AAV injected rats (n = 10) injected with scx shRNA / AAV and the 2-vessel occlusion rats (n = 10) injected with Nox1 shRNA / AAV Respectively. Each rat was tested 15 times a day. In the preference test, two odor substances (L-limonene and R-limonene) were selected, one of which was a rewarding odor substance and the other was an uncompensated odor substance. In each test, two mining containers were simultaneously presented to the rats. Ridges that contain rewarded odorous materials are buried with compensating materials, and ridges containing odorous materials that are not redeemed do not contain compensating materials. When the sliding door was removed, the rats were allowed to enter the test chamber and allowed to digest both containers for 2 minutes, and when the rats failed to find the compensating material, they put the compensation material on top of the pot. A total of 15 trials were performed per each rat, with a 5 minute interval between each trial. In every fifth test, the test was carried out in a probe trial, presenting the rewarded odorant without compensation, and placing the compensator on the container if the rat succeeded in finding the rewarded odorant. The response time for finding the compensating material was measured and the data was expressed as the total time taken to break it.

그 결과, 사후 검증 분석(post-hoc analysis)에서 scb shRNA/AAV를 주입한 2 VO 수술한 그룹에 비해 Nox1 shRNA/AAV를 주입한 2 VO 수술한 그룹에서 후각 식별 기능이 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
As a result, in the post-hoc analysis, the olfactory discrimination function was significantly increased in the group treated with 2 VOs injected with Nox1 shRNA / AAV compared to the group treated with 2 VOs injected with scb shRNA / AAV.

<< 실시예Example 7> 7>

운동기능 검사Exercise function test

모든 시험에 선행하여 앞다리 구부르기와 일방으로의 회전과 같이 육체적으로 수영 능력을 제한할 수 있는 주요 신경학적 결손을 측정하였다. 또한, 모든 시행(trial) 과정에서 수영 속도를 모니터링하였다.
Prior to all trials, major neurological deficits were measured that could physically limit swimming ability, such as forearm swaying and one-sided rotation. Also, swimming speed was monitored during all trial.

<< 실시예Example 8> 8>

정량 분석Quantitative analysis

조직학적 검사는 각 그룹 당 4마리의 랫트로부터 해마 조직을 추출하여 실험하였다. 해마(bregma -3.0 to -4.20 mm; 각 랫트 당 6 절편, 모든 다섯 번째 절편)의 CA1에서 하나의 절편 당 0.1mm²의 5 개의 관심 부위(ROIs)를 선정하였다. 전체 세포 중 DHE-, MDA-, c-fos, nitrotyrosine-, 8-oxo-dG-, NeuN- or nissl-양성 신경세포의 수를 각 ROI에서 측정한 후 평균하였다. 데이터는 총 세포 중 신호 양성 세포의 퍼센트로 나타내었고, 모든 정량 분석은 블라인드 방식으로 평가하였다.
Histological examination was performed by extracting hippocampal tissue from 4 rats per group. Five ROIs of 0.1 mm ² per segment were selected for CA1 from hippocampus (bregma -3.0 to -4.20 mm; 6 fragments per rat, all fifth fragments). The number of DHE-, MDA-, c-fos, nitrotyrosine-, 8-oxo-dG-, and NeuN- or nissl-positive neurons in all cells was measured and then averaged in each ROI. Data were expressed as percentage of signal positive cells in total cells, and all quantitative analysis was assessed by blind method.

<< 실시예Example 9> 9>

데이터 분석 및 통계Data Analysis and Statistics

수영 속도, 탐색 오류, 반응시간을 포함하는 공간 기억 검사는 two-way repeated measure ANOVA와 post hoc LSD's multiple Comparison Test로 분석하였다. 검사시행(probe trial), 신호행동(cued behavior), 탐색 선호도(percent exploratory preference), 후각 식별기능의 소요시간, 웨스턴 블라팅과 면역조직화학법의 정량 데이터는 One-way ANOVA로 분석하였다. 통계 분석은 one-way ANOVA와 Newman-Keuls Multiple Comparison Test로 수행하였다. p<0.05는 유의적 차이가 없는 것으로 간주하였으며, 데이터 분석은 SPSS software version 12.0로 수행하였다. Spatial memory tests including swimming speed, search error, and reaction time were analyzed by two-way repeated measure ANOVA and post hoc LSD's multiple comparison test. One-way ANOVA was used to analyze the probe trial, cued behavior, percent exploratory preference, time required for olfactory identification, Western blotting and immunohistochemistry. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA and Newman-Keuls Multiple Comparison Test. p <0.05 was considered as not significant difference, and data analysis was performed with SPSS software version 12.0.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

2 VO : 2 혈관 폐색2 VO: 2 vessel occlusion

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Composition for treatment or prevention of Vascular Dementia comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active ingredient <130> PN1308-288 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Rattus norvegicusalbinus <400> 1 agcttccttt gcttccttct tgaaatctat ttcaagagaa tagatttcaa gaaggaagca 60 aaggtttttt g 71 <110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Composition for treatment or prevention of Vascular Dementia          comprising an inhibitor of NADPH oxidase 1 as an active          ingredient <130> PN1308-288 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 71 <212> DNA <213> Rattus norvegicusalbinus <400> 1 agcttccttt gcttccttct tgaaatctat ttcaagagaa tagatttcaa gaaggaagca 60 aaggtttttt g 71

Claims (10)

서열번호 1로 표시되는 DNA에 상보적인 염기서열을 포함하는 shRNA를 유효성분으로 포함하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.1. A pharmaceutical composition for treating or preventing vascular dementia comprising, as an active ingredient, an shRNA comprising a nucleotide sequence complementary to the DNA represented by SEQ ID NO: 1. 제1항에 있어서,
상기 혈관성 치매는 만성 대뇌 저관류에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein said vascular dementia is induced by chronic cerebral hypoperfusion. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 조성물은 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 초과산화물(superoxide) 생성 또는 DNA 산화를 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the composition exhibits a therapeutic effect by inhibiting or reducing superoxide production or DNA oxidation in the CA1 region of the hippocampus of a patient suffering from vascular dementia. 제1항에 있어서,
상기 조성물은 혈관성 치매 환자의 해마(hippocampus)의 CA1 부위에서의 신경세포 사멸을 억제 또는 감소시킴으로써 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.The method according to claim 1,
Wherein the composition exhibits a therapeutic effect by inhibiting or reducing neuronal apoptosis in the CA1 region of the hippocampus of a patient suffering from vascular dementia. 제1항 있어서,
상기 조성물은 NADPH 산화효소1(NADPH oxidase 1, Nox1)의 Rac1 활성을 저해하여 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 혈관성 치매의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.The method of claim 1,
Wherein said composition exhibits a therapeutic effect by inhibiting Rac1 activity of NADPH oxidase 1 (Nox1 oxidase 1, Nox1). 삭제delete

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