KR101519448B1 - 비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 조성물의 스크리닝 방법 - Google Patents

비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 조성물의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만 및 당뇨 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 고지방식이를 섭취한 마우스의 내장지방, 피하지방 및 갈색지방의 모든 조직에서 Htr2a 및 Htr2b의 발현이 일반식이를 섭취한 대조군에 비해 높게 나타나는 것을 확인하였고, Tph1의 발현도 지방세포 조직에서 발현하는 것을 확인하였으며, aP2-Tph1 녹아웃마우스의 지방조직에서 지방세포의 크기가 감소되는 것을 확인하고, 고지방식이 섭취로 인한 비만 유도 마우스에 P-클로로페닐알라닌(p-chlorophenylalanine,PCPA)을 투여하였을 때, 상기 마우스의 체중감소, 지질축적감소, 내당능장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가를 확인함으로써, 비만 및 당뇨 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 조성물의 스크리닝 방법{A method for screening composition for prevention and treatment of obesity or diabetes}
본 발명은 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지방세포 또는 지방 조직에서 세로토닌 수용체 또는 합성효소 관련 바이오마커의 발현 수준을 이용하여 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
현대사회의 급속한 발전과 영양 섭취상태가 풍요로워 짐에 따라 원시시대와 차이가 없는 인체의 대사기관에 막대한 환경 변화가 발생하였다. 이에, 성인병 또는 현대병이라 불리는 비만, 제 2형 당뇨병, 고혈압, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 동맥경화 등의 질환이 2 개 이상 복합적으로 나타나는 대사성 질환의 유병률이 2005년 국민건강 영양조사 자료에 의하면 전체적으로 32.3%(남자 32.9%, 여자 31.8%)로, 이로부터 발병되는 심장질환과 뇌졸중이 한국인 사망원인 2, 3위를 차지할 만큼 증가하고 있는 실정이다.
이는 균형있는 신진대사가 잘 이루어지지 않아 발생하는 대사성 노폐물과 독소를 방출시키지 못함으로 인해 인체 내에 쌓인 노폐물들이 각 인체의 기능을 상실시킴으로 발생하는 증상으로 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)으로도 알려져 있는 대사증후군(Metabolic Syndrome)으로 발전하고, 대사증후군은 곧 관상동맥 내 손상을 줘 심장질환 또는 중풍의 원인을 제공하거나, 신장에서 소금을 제거하는 능력이 떨어져서 고혈압을 일으키고, 심혈관 질환의 원인을 제공하는 중성지방 비율을 증가시키고, 혈액 응고의 위험을 가중시키며 또한, 2형 당뇨로 인슐린 생산이 적어져 눈, 신장, 신경에 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다.
당뇨병은 혈당 농도가 정상인에 비하여 높아 소변으로 포도당이 배출되는 질환으로, 췌장 내의 랑게르한스섬의 β-세포에서 인슐린(insulin)의 비정상적 대사과정 또는 이상 생리활성에 의하여 발병된다. 또한 당뇨병은 만성 대사성 질환으로 오랜 시간이 경과함에 따라 혈관장애와 신경, 신장 및 망막 등의 기능이상을 초래하고 이로 인해 생명까지 잃게 하는 질환이다. 당뇨병은 인슐린의 분비와 작용 여부에 따라 인슐린 의존성 당뇨병 및 인슐린 비의존성 당뇨병으로 나누어진다. 인슐린 의존성 당뇨병(제 1형 당뇨병)은 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린을 분비하지 못하므로 심한 인슐린 결핍상태에 있으므로, 심한 고혈당증과 케톤산증, 다갈, 다음, 다뇨, 체중감소 및 피로감을 나타낸다. 케톤증과 사망을 예방하기 위해 정기적으로 외부에서 인슐린을 공급해야 하며, 주로 청소년기 이전에 발생하므로 소아 당뇨병으로 불린다. 반면에 전체 당뇨병 환자의 90% 이상인 인슐린 비의존성 당뇨병(제 2형 당뇨병)은 췌장의 베타세포에서 인슐린을 분비하는 능력은 있으나 인슐린의 기능 이상 상태로부터 유발되는 질환이며, 일반적으로 인슐린에 대하여 저항성을 나타낸다. 유전적인 요인과 비정상적인 식생활, 스트레스, 운동, 비만, 노화 등과 같은 환경적인 요인이 복합적으로 관련되어 유발되는 것으로 추정되고 있다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병은 일반적으로 당대사 및 지질대사 이상을 나타낸다. 즉, 상기 인슐린 비의존형 당뇨병 환자의 경우 음식 섭취 후 인슐린 분비가 늦어지거나 충분한 양이 분비되지 못하여 간에서의 당 생성이 줄어들지 못하고 근육, 간 및 지방과 같은 말초 조직에 의한 혈당의 이용률이 증가되지 못한다. 이 때문에 생긴 식후의 과혈당 증상은 인슐린 분비를 항상 촉진시켜 결과적으로 만성적인 인슐린 과다증을 유발하고 이러한 상태가 계속되면 베타세포가 더 이상 증가된 인슐린 분비율을 유지하지 못하게 되어 궁극적으로 인슐린 저항성이 나타난다. 지속적인 인슐린 저항성은 인슐린 생성에 문제를 초래하여 저인슐린혈증을 유도하게 된다. 특히 글루카곤에 대한 인슐린 비가 감소되면 간에서의 당신생이 증가된다. 또한, 인슐린 저항성의 원인으로 혈중 유리지방산의 증가가 제시되고 있다. 혈중 유리지방산의 증가는 말초조직에서 인슐린에 의한 당 이용을 억제시키고 간 조직에서 당 신생억제를 방해함으로써 혈당치를 높인다. 상기 인슐린 비의존형 당뇨병에서는 혈중 유리지방산 증가뿐만 아니라 혈중 콜레스테롤과 중성지질 증가 현상 및 HDL-콜레스테롤 감소 현상이 나타나며 이러한 지질이상혈증(dyslipidemia)의 발병은 정상인에 비해 2 내지 4배 정도 높다. 또한 이로 인해 비만이 유발되기도 한다. 한편 당뇨병과 당뇨 합병증에 관련된 연구에서 당뇨병이 산화적 스트레스와 밀접한 관련이 있음이 보고되고 있다. 당뇨병에서 나타나는 만성적인 고혈당은 포도당의 자동산화, 단백질 당화 등 다양한 경로에 의해 유리기의 생성을 증가시키고, 반응성이 높은 이들 물질에 의해 산화적 스트레스가 높아진다. 더구나 고혈당으로 유발된 산화적 스트레스를 방어하기에는 항산화 효소의 발현과 활성이 불충분하여 항산화 효소 활성이 비정상적으로 증가하게 되어 이들 효소사이에 유지되고 있던 균형상태가 무너지게 된다. 또한 당뇨병은 체내 고혈당환경으로 높은 삼투압 스트레스를 유발하여 백내장 및 신장질환과 같은 합병증을 유발한다(Campbell, R. K. and Steil, C. F. 1988. Diabetes, clinical pharmacy and therapeutics. William & Wilkins. 4, p.176). 당뇨병에는 인슐린을 비롯한 글루카콘(glucagon), 글루코콜티코이드(glucocorticoid) 등의 호르몬 불균형으로 탄수화물을 비롯한 단백질, 지질 및 전해질 대사 등 생리적 대사조절 기능이상으로 고혈당, 당뇨 등의 특징적인 증세를 나타내며, 만성으로 경과되면 당뇨병의 합병증으로 동맥경화증, 혈관장애, 신경장애, 골감소증 및 감염증 등이 주로 나타난다.
종래 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료를 위한 조성물로는, 대한민국 등록특허 제0721508호에 위령선(威靈仙, Radix Clematidis) 추출물을 함유하는 당뇨병, 당뇨합병증, 인슐린저항성 및 그로 인한 인슐린저항성 증후군의 예방 및 치료용 약학조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제1269208호에서는 삼백초 추출분획물로부터 분리한 사우치논을 유효성분으로 포함하는 인슐린 저항성의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2012-0122970호에서는 여우콩(Rhynchosia volubilis Lour.) 분말 또는 이의 추출물을 포함하는 당뇨병 및 당뇨합병증 예방 및 치료를 위한 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 당뇨 또는 인슐린저항성 증후군 치료에 유용한 신규 치료제의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
세로토닌은 5-HT(5-hydroxytryptamine)이라고도 한다. 세로토닌은 신경전달물질이며, 식사, 수면, 각성, 고통 조절 및 꿈 등에 관련된 감정 조절에 관여한다. 세로토닌은 아미노산인 트립토판(tryptophan)에서 합성이 되며, 효소인 트립토판 하이드록실라제(tryptophan hydroxylase)가 -OH를 트립토판에 붙여서 중간물질인 5-HTP(5-hydroxytryptophan)가 생성된다. 그 후 또 다른 효소 5-HTP 디카르복실라제(decarboxylase)가 5-HTP에서 -COOH를 제거함으로써, 5-HT,즉 세로토닌을 완성한다. P-클로로페닐알라닌(p-chlorophenylalanine, PCPA)은 합성 아미노산으로 세로토닌 합성의 속도제한효소인 트립토판 하이드록실라제의 비가역적 억제제로 전신적인 세로토닌 합성 억제를 유도한다.
이에, 본 발명자들은 마우스의 내장지방, 피하지방 및 갈색지방의 모든 조직에서 Htr2a의 발현이 나타나는 것을 확인하였고, Tph1의 발현도 지방세포 조직에서 발현하는 것을 확인하였으며, aP2-Tph1 녹아웃마우스의 지방조직에서 지방세포의 크기가 감소되는 것을 확인하고, 고지방식이를 섭취한 Htr3a 녹아웃 마우스에서 체중감소, 지질축적 감소, 내당능장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가를 확인함으로써, Tph1, Htr2a 및 Htr3a를 마커로 이용하여 비만 또는 당뇨 예방 및 치료의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은
ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은
ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은
ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서는 고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스의 내장지방, 피하지방 및 갈색지방의 모든 조직에서 일반식이를 섭취한 대조군에 비해 Htr2a의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였고, Tph1의 발현도 지방세포 조직에서 발현하는 것을 확인하였으며, aP2-Tph1 녹아웃마우스의 지방조직에서 지방세포의 크기가 감소되는 것을 확인하고, 고지방식이를 섭취한 Htr3a 녹아웃 마우스에서 체중감소, 지질축적 감소, 내당능장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가를 확인함으로써, Htr2a, Tph1 및 Htr3a 단백질의 발현 또는 활성 수준이 비만 또는 당뇨에 밀접한 관련성을 확인하여, 이들을 비만 또는 당뇨 치료제 후보물질 스크리닝을 위한 바이오마커로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 내장지방, 피하지방 및 갈색지방에서 Htr2a, Htr2b 및 Tph1의 발현을 나타낸 도이다.
도 2는 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a의 발현이 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 3은 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a의 발현이 증가할 때, Htr2a 길항제를 투여하여 지방생성이 감소하는 것을 나타낸 도이다.
도 4는 siRNA를 이용하여 Htr2a의 발현을 억제함으로써 지방생성이 감소하는 것을 나타낸 도이다.
도 5는 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 작용제 처리에 의해 지방생성 관련 유전자 발현 증가를 나타낸 도이다.
도 6은 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도된 마우스군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 일반식이를 섭취한 군의 체중으로 유지되는 것을 확인한 도이다.
도 7은 일반식이를 섭취한 ob/ob 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 체중감소 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 내당능 장애 및 인슐린 저항성 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 내장지방이 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 10은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 간, 복부내장지방, 피하지방 및 갈색지방에서 세포크기 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 11은 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 피하지방에서 Ucp 1의 발현이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 12는 고지방식이를 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여하였을 때, 갈색지방 조직에서 활성화된 미토콘드리아를 확인한 도이다.
도 13 및 14는 고지방식이 섭취한 마우스 군에 P-클로로페닐알라닌을 투여 한 후, 갈색지방 조직에서 에너지 소비량(energy expenditure) 및 에너지 소비관련유전자 발현을 확인한 도이다.
도 15는 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 억제 돌연변이 마우스에서 지방세포의 크기가 감소되는 것을 확인한 도이다.
도 16 A는 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스 및 야생형 마우스의 체중 비교를 나타낸 도이다.
도 16 B는 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스에서 내당능 장애 감소효과를 나타낸 도이다.
도 16 C는 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스에서 인슐린 저항성 감소효과를 나타낸 도이다.
도 17은 Htr3a -/- 마우스에서 지질 축적감소 효과를 나타낸 도이다.
도 18은 Htr3a -/- 마우스 및 야생형 마우스의 갈색지방 조직에서 체온 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 Htr3a -/- 마우스의 갈색지방 조직에서 면역염색을 통해 세로토닌 합성효소 Tph1을 확인한 도이다.
도 20은 Htr3a -/- 마우스의 갈색지방 조직에서 열발생 유전자의 발현이 증가되는 것을 확인한 도이다.
도 21 A는 갈색지방 세포주인 HIB 1B에 길항제인 온단세트론(ondansetron)을 처리하였을 때, 갈색지방 열발생에 관여하는 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인한 도이다.
도 21 B는 갈색지방 세포주인 HIB 1B에 작용제인 m-CPBG를 처리하였을 때, 갈색지방 열발생에 관여하는 유전자들의 발현이 감소되는 것을 확인한 도이다.
도 22는 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스군의 무작위 인슐린 수치(random insulin level) 및 당으로 자극시킨 인슐린 수치(glucose stimulated insulin level)를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 비만 또는 당뇨를 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 비만 또는 당뇨의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 비만 또는 당뇨의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직은 내장지방, 피하지방 또는 갈색지방의 세포 또는 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 피검물질을 추출물, 화합물, 단백질 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현은 면역조직화학염색, RT-PCR, 웨스턴 블랏, ELISA 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 Tph1 단백질은 서열번호 1(MIEDNKENKDHSLERGRASLIFSLKNEVGGLIKALKIFQEKHVNLLHIESRKSKRRNSEFEIFVDCDINREQLNDIFHLLKSHTNVLSVNLPDNFTLNEDGMETVPWFPKKISDLDHCANRVLMYGSELDADHPGFKDNVYRKRRKYFADLAMNYKQAYRFFHPSCGWLLITKRFLIRFSLSSFSLHSICETQFRSLLYPRARYLP)의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나, 상기 아미노산 서열에서 아미노산 한 개 또는 몇 개가 치환, 첨가 또는 결실된 변이일 수 있다.
상기 Tph1 단백질은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지며, 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것을 모두 사용할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단백질 활성은 면역조직화학염색, 웨스턴 블랏, ELISA 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
음식섭취를 억제하는 대표적인 신경전달 물질 중의 하나인 세로토닌(serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT)은 필수 아미노산인 트립토판으로부터 생합성되며, 속도제한 효소인 트립토판 히드록실라제(tryptophan hydroxylase 1,Tph1)에 의해서 조절을 받는다(Kuhn D.M., et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 73, 78-84, 1999). 봉선핵(raphe nucleus)에서 방출되는 세로토닌 신경섬유는 시상하부와 해마 및 대뇌피질에까지 연결이 되어 있다. 시상하부의 뇌실주위 핵과 배내측핵에는 많은 세로토닌 수용체가 있기 때문에 시상하부는 세로토닌계의 중요한 작용 부위이고, 소위 포만중추라고 알려진 시상하부의 배내측핵은 세로토닌에 의해 조절이 되며 이 부위의 세로토닌 증가는 음식섭취와 식욕 조절에 관여된다고 보고되어 있다(Jacobs B.L., et al., Physiol. Rev., 72, 165-229, 1992). 중추신경계에서 증가된 세로토닌은 음식섭취와 식사행동에 많은 영향을 미치며, 세로토닌의 파괴가 저지되거나 과다 생성되거나 또는 직접적으로 세로토닌 수용체를 자극하면, 식욕부진 반응이 일어난다고 알려져 있다(Pinder BM, et al., Drug, 10, 241-323, 1975). 따라서, 세로토닌 합성효소인 Tph1 발현을 억제함으로써 비만 또는 당뇨를 예방 및 치료할 수 있는 이론이 확실한 것으로 나타났다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 Tph1 마커는 고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스의 내장지방, 피하지방 및 갈색지방 모든 조직에서 Tph1 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 1 참조), 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 합성 효소인 Tph1을 억제 시킨 돌연변이(aP2-Tph1 K/O) 마우스를 제작하여 상기 마우스의 지방세포 크기를 확인한 결과, 상기 마우스의 지방세포 크기가 감소되는 것을 확인하였다(도 15 참조). 이에, 본 발명의 Tph1 마커를 시료 또는 단백질 수준에서 비만 또는 당뇨 치료제 스크리닝의 바이오마커로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직은 내장지방, 피하지방 또는 갈색지방의 세포 또는 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 피검물질을 추출물, 화합물, 단백질 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현은 면역조직화학염색, RT-PCR, 웨스턴 블랏, ELISA 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 Htr2a 단백질은 서열번호 2(MDILCEENTSLSSTTNSLMQLNDDTRLYSNDFNSGEANTSDAFNWTVDSENRTNLSCEGCLSPSCLSLLHLQEKNWSALLTAVVIILTIAGNILVIMAVSLEKKLQNATNYFLMSLAIADMLLGFLVMPVSMLTILYGYRWPLPSKLCAVWIYLDVLFSTASIMHLCAISLDRYVAIQNPIHHSRFNSRTKAFLKIIAVWTISVGISMPIPVFGLQDDSKVFKEGSCLLADDNFVLIGSFVSFFIPLTIMVITYFLTIKSLQKEATLCVSDLGTRAKLASFSFLPQSSLSSEKLFQRSIHREPGSYTGRRTMQSISNEQKACKVLGIVFFLFVVMWCPFFITNIMAVICKESCNEDVIGALLNVFVWIGYLSSAVNPLVYTLFNKTYRSAFSRYIQCQYKENKKPLQLILVNTIPALAYKSSQLQMGQKKNSKQDAKTTDNDCSMVALGKQHSEEASKDNSDGVNEKVSCV) 또는 서열번호 3(MQFLKSAKQKPNYYHIMLVEDQEEGTLHQFNYCERCSESQNNKCISCVDPEDKWYRWPLPSKLCAVWIYLDVLFSTASIMHLCAISLDRYVAIQNPIHHSRFNSRTKAFLKIIAVWTISVGISMPIPVFGLQDDSKVFKEGSCLLADDNFVLIGSFVSFFIPLTIMVITYFLTIKSLQKEATLCVSDLGTRAKLASFSFLPQSSLSSEKLFQRSIHREPGSYTGRRTMQSISNEQKACKVLGIVFFLFVVMWCPFFITNIMAVICKESCNEDVIGALLNVFVWIGYLSSAVNPLVYTLFNKTYRSAFSRYIQCQYKENKKPLQLILVNTIPALAYKSSQLQMGQKKNSKQDAKTTDNDCSMVALGKQHSEEASKDNSDGVNEKVSCV)의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나, 상기 아미노산 서열에서 아미노산 한 개 또는 몇 개가 치환, 첨가 또는 결실된 변이일 수 있다.
상기 Htr2a 단백질은 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지며, 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것을 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 당뇨는 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
세로토닌 수용체(serotonin receptor)는 세로토닌(5HT)과 결합하여 세포 내에 생리활성을 일으키는 수용체이다. 중추 신경계 세로토닌 신경 전달을 증가시키면서 음식 섭취가 감소되는 것이 동물 및 인간에서 증명되었다(Hong Y et al., 1995). 세로토닌 수용체가 차단되면 지방보다는 탄수화물의 산화를 증가시켜서 식욕을 자극하고 지방축적이 유도된다(김용식, 2006). 따라서, 세로토닌 수용체인 Htr2a 및 Htr2b 발현을 억제함으로써 비만 또는 당뇨를 예방 및 치료할 수 있는 이론이 확실한 것으로 나타났다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 Htr2a 및 Htr2b 마커는 고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스의 내장지방, 피하지방 및 갈색지방의 모든 조직에서 Htr2a 및 Htr2b의 발현을 확인하였으며(도 1 참조), 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a의 발현이 증가하는 것을 확인하였고(도 2 참조), Htr2a의 발현이 증가할 때, Htr2a 길항제를 투여하여 지방생성이 감소하는 것을 확인하였으며(도 3 참조), siRNA를 이용하여 Htr2a 발현을 억제함으로써 지방 생성이 감소하는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 작용제를 처리하였을 때, 지방생성 관련 유전자인 Acaca, Acly, Fasn, Dgat, Me 및 PPARg의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5 참조). 이에, 본 발명의 Htr2a는 시료 또는 단백질 수준에서 비만 또는 당뇨 치료제 스크리닝의 바이오마커로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직은 내장지방, 피하지방 또는 갈색지방의 세포 또는 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ｉ)의 피검물질을 추출물, 화합물, 단백질 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 단계 ⅱ)의 발현은 면역조직화학염색, RT-PCR, 웨스턴 블랏, ELISA 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 Htr3a 단백질은 서열번호 4(MLLWVQQALLALLLPTLLAQGEARRSRNTTRPALLRLSDYLLTNYRKGVRPVRDWRKPTTVSIDVIVYAILNVDEKNQVLTTYIWYRQYWTDEFLQWNPEDFDNITKLSIPTDSIWVPDILINEFVDVGKSPNIPYVYIRHQGEVQNYKPLQVVTACSLDIYNFPFDVQNCSLTFTSWLHTIQDINISLWRLPEKVKSDRSVFMNQGEWELLGVLPYFREFSMESSNYYAEMKFYVVIRRRPLFYVVSLLLPSIFLMVMDIVGFYLPPNSGERVSFKITLLLGYSVFLIIVSDTLPATAIGTPLIGVYFVVCMALLVISLAETIFIVRLVHKQDLQQPVPAWLRHLVLERIAWLLCLREQSTSQRPPATSQATKTDDCSAMGNHCSHMGGPQDFEKSPRDRCSPPPPPREASLAVCGLLQELSSIRQFLEKRDEIREVARDWLRVGSVLDKLLFHIYLLAVLAYSITLVMLWSIWQYA)의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나, 상기 아미노산 서열에서 아미노산 한 개 또는 몇 개가 치환, 첨가 또는 결실된 변이일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 Htr3a 단백질은 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 가지며, 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것을 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은
ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 당뇨는 제 1형 당뇨병, 제 2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은
ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A) 단백질에 피검물질 처리;
ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 체중 감소, 지질축적 감소, 내당능 장애 억제, 인슐린 저항성 감소, 갈색지방 활성, 미토콘드리아 활성 및 대사율 증가로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 작용제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 인슐린 저항성은 인슐린이 체내에서 정상적으로 분비됨에도 불구하고, 그들이 수행하는 "포도당을 세포 내로 공급하는 작용"이 제대로 일어나지 못하는 현상을 의미하는바, 혈액 중의 포도당은 세포 내로 들어가지 못해 고혈당 증세를 보이게 되고, 세포는 세포대로 포도당이 부족해 정상 기능을 수행하지 못하므로, 결국 대사증후군 증상이 나타나게 되는 것이다.
미토콘드리아 기능이상으로 인한 질병은 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능이상, 유전적 요인으로 인한 기능이상, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함으로 인한 질환 등이 포함될 수 있는데, 상기 원인으로 인한 질병은 비만, 당뇨, 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 프리드리히 보행실조, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육병증, 근육위축, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등이 발생할 수 있다(미국 특허등록 제6,183,948호, 한국 특허출원공개 제2004-7005109호, Journal of clinical investigation 111, 303-312, 2003, Mitochondria 74, 1188-1199, 2003, Biochimica et Biophysica acta 1658(2004) 80-88 참조).
상기 세로토닌 수용체가 차단되면 지방보다는 탄수화물의 산화를 증가시켜서 식욕을 자극하고 지방축적이 유도됨으로써, 세로토닌 수용체 종류에 포함되는 Htr3a 발현을 억제함으로써 비만 또는 당뇨를 예방 및 치료할 수 있는 이론이 확실한 것으로 나타났다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 Htr3a 마커가 비만 또는 당뇨에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Htr3a 녹아웃 마우스+정상 식이(NCD), 야생형 마우스+ 정상 식이(NCD), Htr3a 녹아웃 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스(Wilde type)+고지방식이(HFD)를 섭취한 군의 체중을 측정하였을 때, Htr3a 녹아웃 마우스+정상식이(NCD) 및 야생형 마우스+ 정상식이(NCD)를 섭취한 마우스 군의 체중은 비슷한 것을 확인하였고, Htr3a 녹아웃 마우스+고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스 군의 체중이 야생형 마우스(Wilde type)+고지방식이(HFD)를 섭취한 군의 마우스보다 체중이 증가하지 않는 것을 확인하였으며(도 16 A 참조), 고지방식이를 섭취한 Htr3a 녹아웃 마우스(Htr3a-/-)의 인슐린 저항성이 고지방 식이를 섭취한 야생형 마우스의 인슐린 저항성보다 낮은 것을 확인하였다(도 16 B 참조). Htr3a -/- 마우스에서 지질 축적 감소를 확인한 결과, Htr3a -/- 마우스의 지방, 간, 뼈 근육에서 지질 축적이 감소되는 것을 확인하였다(도 17 참조). Htr3a -/- 마우스에서 대사율을 확인한 결과, 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 갈색 지방 조직에서 지방세포의 크기가 작고 지방세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다(도 18 A 참조). 또한, 야생형 마우스와 Htr3a -/- 마우스의 갈색 지방 조직에서 체온을 측정한 결과, Htr3a -/- 마우스에서 체온이 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 18 B 참조). 야생형 마우스 및 Htr3a 녹아웃 마우스(Htr3a-/-)의 갈색 지방 조직에서 Htr3 발현 여부를 확인한 결과, 갈색 지방 조직에서 Htr3a의 발현을 확인하였으며(도 19 A 참조), 면역염색을 통해서 세로토닌 합성효소인 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)을 확인하였다(도 19 B 참조). 따라서, 갈색 지방 조직에서 세로토닌의 발현을 확인함으로써, 세로토닌-Htr3-갈색지방 축(serotonin-Htr3-brown fat axis)이 혈류를 통한 전신 작용과 함께 갈색 지방 조직내의 자가분비(autocrine)/측분비(paracrine) 효과를 통해서도 동시에 작용할 수 있음을 확인하였다. 야생형 마우스 및 Htr3a 녹아웃 마우스(Htr3a -/-)의 갈색 지방 조직에서 열 발생 및 미토콘드리아 생합성에 관여하는 유전자 발현을 확인한 결과, Htr3a -/- 마우스의 갈색 지방 조직에서 열 발생 유전자인 Ucp1 및 Dio2의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 20 참조). 또한, 갈색 지방에 대한 Htr3 발현의 직접적인 연관성을 확인한 결과, 갈색 지방 세포주인 HIB 1B에 길항제(antagonist)인 온단세트론(ondansetron)을 처리하였을 때, 갈색 지방 열발생에 관여하는 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 21 A 참조), HIB 1B에 작용제(agonist)인 m-CPBG를 처리하였을 때, 갈색 지방 열발생에 관여하는 유전자인 Ucp 1 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 21 B 참조). 또한, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스에서 인슐린 수치를 확인한 결과, Htr3a -/- 마우스에 고지방식이를 섭취시킨 후, 무작위 인슐린 수치(random insulin level) 및 당으로 자극시킨 인슐린 수치(glucose stimulated insulin level)에서 더 낮은 인슐린 수치가 나타나는 것을 확인하였다(도 22 참조). 따라서, 베타 세포(beta cell)에서 Htr3이 인슐린 분비액(insulin secreation)에 관여하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 Htr3a 마커를 시료 또는 단백질 수준에서 비만 또는 당뇨 치료제 스크리닝의 바이오마커로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 실험동물의 준비 및 사육
7주령 수컷 흰쥐(C57BL/6)를 (주)중앙실험동물에서 구입하고 1주일 동안 일반사료를 급여 하에 적응시간을 가진 후, 5마리씩 두 개의 각기 다른 식이 군으로 나누어 실험을 수행하였다. NCD(Normal Chow Diet)군은 일반식이를 섭취하였고, HFD(High-Fat Diet)군은 60% 고지방식이를 8주 동안 섭취하였다. 12 시간 밝은 조명, 12 시간 어두운 조명 일주기하에서 물과 사료가 자유롭게 주어지며 23±1℃와 56% 상대습도가 유지되는 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육되었다. 실험에 사용된 마우스 관련 진행 과정은 한국과학기술원 동물시험 관련 위원회로부터 검토되고 승인받았다.
< 실시예 2> 실험동물로부터 조직 적출
상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 사육한 NCD군 및 HFD군으로부터 각각 졸레틸(Zoletil, Virbac)로 근육주사하여 마취시킨 후, 상기 마우스의 피부를 절개하여 피하지방 및 갈색지방을 적출한 후, 복강을 절개하여 내장지방, 간 및 근육을 적출하였다.
< 실시예 3> 지방세포의 분화 유도
마우스(mouse) 배아 줄기세포에서 유래한 지방전구세포(preadipocyte) 세포주인 3T3-L1은 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였다. 상기 세포는 10% 우아혈청(bovine calf serum)(Invitrogen, Carlsbad, CA), 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(methylxanthine)(500 uM), 덱사메타손(dexamethasone)(1 uM) 및 인슐린(insulin)(167 nM)이 함유된 DMEM에서 48시간 동안 배양을 하였다. 상기 배양된 세포를 10% FBS 및 인슐린이 포함된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 10% FBS만 포함된 DMEM에서 4일 동안 배양하여 분화된 지방세포를 획득하였다.
< 실험예 1> 지방세포 분화 동안 세로토닌( serotonin ) 수용체 및 합성효소 변화 분석 확인
<1-1> 세로토닌 수용체 Htr 및 세로토닌 합성효소 Tph1( Tryptophan hydroxylase 1) 발현 확인
내장지방, 피하지방 및 갈색지방에서 세로토닌 수용체인 Htr 및 합성효소 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)의 발현 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 적출된 지방을 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction)을 사용하여 세로토닌 수용체인 Htr 및 합성효소 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)의 발현을 측정하였다. 실험동물에서 분리한 내장지방, 피하지방 및 갈색지방 조직으로부터 트리졸 시약(trizol reagent, Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하고 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였다. 분리된 총 RNA로부터의 cDNA 합성을 위하여 2 ug의 RNA를 65℃에서 5분간 열처리한 후 4℃에서 5분 동안 방치하고 여기에 Superscript III reverse transcriptase 200U, dNTP 10 mM 1 ul, oligo(dT) 프라이머 1ul을 혼합한 후, DEPC-water로 20 ul를 맞추어 50℃에서 1시간, 75℃에서 15분 조건으로 cDNA를 합성하였다. RT-PCR 조건은 95℃에서 10분, 뒤이어 95℃에서 30초, 60℃에서 1분으로 40 사이클을 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분 동안 수행하였다. 모든 유전자의 mRNA 양은 Actb(Actin, beta)를 내부 대조군으로 이용하여 표준화하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머는 Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/)를 이용하여 제작하였으며 하기 [표 1]에 기재된 서열을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 내장지방, 피하지방 및 갈색지방의 모든 조직에서 Htr2a 및 Htr2b의 발현이 높게 나 타는 것을 확인하였으며, 세로토닌 합성 효소인 Tph1도 지방세포 조직에서도 발현하는 것을 확인하였다(도 1).
유전자 정방향 프라이머(Forward primer) 역방향 프라이머(Reverse primer)
Htr2a AGCTGCAGAATGCCACCAACTAT
(서열번호 5)		 GGGATTGGCATGGATATACCTAC
(서열번호 6)
Htr2b AAATAAGCCACCTCAACGCCT
(서열번호 7)		 TCCCGAAATGTCTTATTGAAGAG
(서열번호 8)
Tph1 ACCATGATTGAAGACAACAAGGAG
(서열번호 9)		 TCAACTGTTCTCGGCTGATG
(서열번호 10)
<1-2> 지방세포 분화 동안 Htr2a 및 Htr2b 의 발현 여부 확인
지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 및 Htr2b의 발현 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 지방전구세포를 분화시킨 후, 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14일째 세포들을 상기 실험예 <1-1>에 기재된 방법으로 cDNA를 합성하여 Htr2a 및 Htr2b 에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하여 정량적으로 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 동안 Htr2a의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 2).
<1-3> 지방세포 분화 동안 Htr2a 길항제 처리에 의한 지방생성 감소 확인
지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 길항제(antagonist, sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA)처리에 의한 지방생성감소를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 지방전구세포를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 길항제(antagonist)를 2일 간격으로 처리하였다. siRNA의 경우는 분화 24시간 전에 siRNA를 리포펙타민(lipofectamine) 2000을 이용하여 형질전환(transfection) 시킨 후 분화유도를 하였다. 분화가 유도된 상기 세포들의 분화 정도를 측정하기 위하여, 오일 레드 오(Oil Red O) 염색법을 수행하였다. 8일 동안 분화 유도된 지방세포를 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 15분간 고정 시킨후, PBS로 3회 세척한 후, 오일 레드 오(Oil Red O)를 60% 이소프로판올에 0.5% 농도로 녹인 염색액을 이용하여 상온에서 10분 동안 방치하여 지방세포 안의 지질을 염색하였다. 염색된 오일 레드 오를 정량하기 위해 이소프로판올로 용출시킨 후 500 나노미터(nm) 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화 중 Htr2a의 발현이 증가할때, Htr2a 길항제를 투여하여 지방생성이 감소하는 것을 확인하였으며(도 3), siRNA를 이용하여 Htr2a 발현을 억제함으로써 지방 생성이 감소하는 것을 확인하였다(도 4).
<1-4> 지방세포 분화 동안 Htr2a 작용제 처리에 의한 지방생성 관련 유전자 확인
지방전구세포(preadipocyte)를 지방세포로 분화시키는 동안 Htr2a 작용제(sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA))처리에 의한 지방생성 관련 유전자 발현을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 지방전구세포를 지방세포로 분화하였다. 상기 분화된 지방세포에 DMSO(대조군) 및 100 nM의 Htr2a 작용제(실험군)를 처리한 후 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 RNA를 추출하여, 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 지방전구세포를 지방세포로 분화하는 동안 Htr2a 작용제 처리에 의해 지방생성 관련 유전자인 Acaca, Acly, Fasn, Dgat, Me 및 PPARg의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5).
< 실시예 2> 고지방식이 섭취로 인한 비만 유도 마우스에 PCPA(p-chlorophenylalanine)를 투여하여 지방감소 확인
<2-1> PCPA (p- chlorophenylalanine )를 투여에 의한 비만 유도 마우스 체중 변화 측정
PCPA(p-chlorophenylalanine)를 투여에 의한 비만 유도 마우스 체중 변화를 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 사육한 마우스(C57BL/6)를 1주일 동안 일반사료를 급여 하에 적응시간을 가진 후, 5마리씩 네 개의 각기 다른 식이 군으로 나누어 실험을 수행하였다. NCD(Normal Chow Diet)군은 일반식이를 섭취하였고, HFD(High-Fat Diet)군은 60% 고지방식이를 섭취하였으며, NCD+PCPA군은 일반식이에 마우스 체중 1kg당 300mg의 PCPA를, HFD(High-Fat Diet)+PCPA 군은 60% 고지방식이+ 마우스 체중 1 kg 당 300mg 용량의 PCPA를 복강주사 하여 8주 동안 매일 투여하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 고지방식이(High fat diet)만 섭취한 마우스는 비만이 유도되는 것을 확인하였고, 비만이 유도된 마우스군에 PCPA(p-chlorophenylalanine)를 투여하였을 때, 체중이 감소하는 것을 확인하였으며, 일반식이(Normal diet)를 섭취한 마우스군의 체중과 비슷하게 유지되는 것을 확인하였다. 또한, ob/ob 마우스와 같은 비만 모델에서도 PCPA를 투여하였을 때 체중이 저하되는 것을 확인하였다(도 7).
<2-2> 고지방식이 섭취로 비만을 유도한 마우스에 PCPA 를 처리하여 내당능 장애 및 인슐린 저항성 확인
고지방식이를 섭취한 마우스에 PCPA를 투여하여 내당능 장애 및 인슐린 저항성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 각기 다른 식이를 섭취하는 마우스를 사육하는 동안 1주일에 한 번씩 체중과 꼬리 끝으로부터 혈액을 채취하여 혈당을 측정하였다. 내당능은 절식 후 포도당 용액을 체중 kg 당 2 g씩 복강내로 투여하고 0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다. 인슐린 저항성은 절식 후 인슐린 용액을 체중 kg 당 0.75 U 씩 복강내로 투여하고 0, 15, 30, 45, 60, 90 및 120분 경과 후에 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취하여 비만이 유도된 마우스 군에서는 내당능 장애와 인슐린 저항성이 증가하는 것을 확인하였고, 비만이 유도된 마우스에 PCPA를 투여하였을 때 내당능 장애 및 인슐린 저항성이 유의적으로 감소 되는 것을 확인하였다(도 8).
<2-3> 고지방식이 섭취로 비만을 유도한 마우스에 PCPA 를 처리하여 내장지방, 지방간 및 지방조직에 미치는 영향 확인
고지방식이를 섭취한 마우스에 PCPA를 투여하여 내장지방, 지방간 및 지방조직에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>에 기재된 방법으로 사육한 마우스(C57BL/6)를 각각 3마리씩 대조군 및 실험 군으로 나누었다. 대조군은 PBS를 투여시켰고, 실험군에는 상기 마우스 체중 1 kg 당 300 mg의 PCPA를 PBS에 혼합하여 매일 1회 8주 동안 복강투여 한 후, 간, 복부내장지방, 피하지방 및 갈색지방 조직을 적출하여 크기를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취한 마우스군에 PCPA를 투여하였을 때, 내장지방이 감소하는 것을 확인하였으며, 지방간에서는 변화가 일어나지 않는 것을 확인하였다(도 9).
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 간, 복부내장지방, 피하지방 및 갈색지방에서 세포크기가 감소하는 것을 확인하였다(도 10).
<2-4> 고지방식이 섭취로 비만을 유도한 마우스에 PCPA 를 처리하여 Ucp 1 발현 여부 확인
고지방식이를 섭취한 마우스에 PCPA를 투여한 후 Ucp 1 발현 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>에 기재된 방법으로 사육한 마우스(C57BL/6)에 일반식이(NCD), 일반식이(NCD)+PCPA, 고지방식이(HFD) 및 고지방식이(HFD)+PCPA를 4주 동안 투여한 마우스의 피하지방을 외과적 방법으로 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후, 파라핀으로 포매 후, 5 um 두께로 절단하여 슬라이드에 접착시킨 후 탈파라핀 및 함수과정을 거쳐 얻은 조직절편을 이용하여 Ucp1에 대한 면역조직화학 염색을 시행하였다. 그런 다음, 조직 내의 내인성 과산화효소(peroxidase)를 제거하기 위해서 0.5% 과산화수소가 함유된 PBS 용액에서 20분간 반응시킨 후 10분씩 2회 PBS로 세척한 조직절편을 5% 염소 혈청에 30분간 반응시켜 비특이적인 결합을 억제시킨후 Ucp1에 대한 항체(Abcam)를 1:1,000의 비율로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBS로 10분간 3회 세척하였다. 이후 과정은 통상적인 호스래디쉬 퍼록시다제(Horseradish peroxidase) 법을 이용한 면역조직화학반응을 실시하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 피하지방(subcutaneous fat)에서 Ucp 1 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 11).
<2-5> 고지방식이 섭취로 비만을 유도한 마우스에 PCPA 를 투여한 후 지방조직에서 활성화된 미토콘드리아( Mitochondria ) 관찰
고지방식이를 섭취한 마우스에 PCPA를 투여한 후, 지방 조직에서 활성화된 미토콘드리아(Mitochondria)를 관찰하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 5마리씩 세 개의 각기 다른 식이 군으로 마우스를 나누어 실험을 수행하였다. NCD(Normal Chow Diet)군은 일반식이를 섭취하였고, HFD(High-Fat Diet)군은 60% 고지방식이를 섭취하였으며, HFD(High-Fat Diet)+PCPA 군은 60% 고지방식이+PCPA를 8주 동안 섭취하였다. 그런 다음, 상기 마우스 조직을 적출하였다. 적출된 상기 마우스의 조직을 3 % 글루트알데히드에 2시간동안 상온에서 고정시킨 후, 0.1 몰농도의 카코딜레이트 버퍼로 4℃로 세척한 후 물을 이용하여 다시 한번 세척하였다. 상기 세척된 조직에 에탄올을 이용하여 탈수 시킨 후, Embed-812(EMS사)로 포매 후, 레진을 통해 폴리머를 형성한 후, 전자현미경(Tecnai G2 spirit Twin transmission electron microscope, FEI company)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취한 마우스에 PCPA를 투여한 후, 갈색지방 조직에서 활성화된 미토콘드리아(mitochondria)를 확인하였다(도 12).
<2-6> 고지방식이 섭취로 비만을 유도한 마우스에 PCPA 를 투여한 후 갈색지 방 조직에서 에너지 소비량( energy expenditure ) 및 에너지 소비 관련 유전자 발현 확인
갈색지방에서 활성화된 미토콘드리아를 관찰한 후, 에너지 소비량 유전자 발현을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-1>과 동일한 방법으로 사육한 마우스(C57BL/6)에 일반식이(NCD), 일반식이(NCD)+PCPA, 고지방식이(HFD) 및 고지방식이(HFD)+PCPA를 투여한 마우스의 갈색지방을 적출하여 RNA를 추출한 후, 상기 실험예 <1-1>과 동일한 방법으로 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머는 하기 [표 2]에 기재된 서열을 사용하였다. 에너지 소비량은 Phenomaster system(TSE systems)를 이용하여 측정하였다. 상기 마우스를 간접적 열량측정(indirect calorimetry) 챔버에서 48시간 동안 유지시키면서, 섭취량, 산소 소비량, 이산화탄소 배출량을 측정하여 에너지 소비를 측정하였다. 대조군으로는 고지방식이+PBS를 섭취한 마우스 군의 결과를 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 일반식이+PCPA 및 고지방식이+PCPA를 투여한 마우스의 갈색지방 조직에서 PCPA에 의하여 Ucp 1, Pgc1a 및 Dio 2 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 13).
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 고지방식이+PCPA를 섭취한 마우스 군과 고지방식이+PBS를 섭취한 군의 갈색지방 조직에서 에너지 소비량을 측정하여 비교하였을 때, 고지방식이+PCPA를 섭취한 마우스 군의 섭취량, 산소 소비량, 이산화탄소 배출량, 열 배출량이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다(도 14). 따라서, PCPA 에 의한 갈색지방 조직(brown adipose tissue)에서 에너지 소비량(energy expenditure) 및 에너지 소비관련 유전자 발현의 증가하는 것을 확인하였다.
서열번호 서열
Ucp1(서열번호 11)_F CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Ucp1(서열번호 12)_R ACTGCCACACCTCCAGTCATT
Dio2(서열번호 13)_R ttggggtagggaatgttggc
Dio2(서열번호 14)_F tccgtttcctctttccggtg
Ppargc1a(서열번호 15)_R GCCCAGGTACGACAGCTATG
Ppargc1a(서열번호 16)_F ACGGCGCTCTTCAATTGCTT
< 실험예 3> 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 합성 억제 돌연변이 마우스에서 지방감소에 대한 영향 확인
<3-1> 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 억제 돌연변이 마우스 제작
세로토닌 수용체인 Htr 및 합성효소 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)의 floxed 마우스와 aP2 프로모터에 의한 Cre 마우스를 교배하여 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌이 억제된 마우스를 제조하였다.
구체적으로, aP2 프로모터에 의한 Cre 마우스(Jackson laboratory)와 Tph1의 floxed 마우스(Jackson laboratory)를 교배하여 더블-헤테로(double-hetero) 마우스를 획득한 후, 상기 마우스를 Tph1의 floxed 마우스와 다시 교배하여, aP2 프로모터에 의한 Tph1 녹아웃 마우스를 제조하였다.
<3-2> 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 억제 돌연변이 마우스에서 지방조직 감소 확인
지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌이 억제된 마우스에서 지방 조직 감소를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <3-1>과 동일한 방법으로 제조한 aP2-Tph1 녹아웃 마우스(aP2-Tph1 K/0)의 지방조직을 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후, 파라핀으로 포매 후, 5 um 두께로 절단하여 슬라이드에 접착시켰다. 이후 탈파라핀 및 함수과정을 거쳐 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, aP2-Tph1 K/0 마우스에서 지방세포의 크기가 감소되는 것을 확인하였다(도 15).
< 실험예 4> 지방 조직에서 특이적으로 발현하는 세로토닌 수용체 Htr3 억제 돌연변이 마우스에서 지방감소에 대한 영향 확인
<4-1> Htr3a 녹아웃 마우스( Htr3a -/- )의 체중 변화, 인슐린 저항성 및 내당능 측정
Htr3a 녹아웃 마우스의 체중 변화, 인슐린 저항성 및 내당능을 측정하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, Jackson Laboratory(USA)에서 구입한 세로토닌 수용체 Htr3의 서브유닛(sbuunit)인 Htr3a 녹아웃 마우스(Jackson laboratory) 및 야생형(Jackson laboratory) 마우스를 Htr3a 녹아웃 마우스+정상 식이(NCD), 야생형 마우스+ 정상 식이(NCD), Htr3a 녹아웃 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스(Wilde type)+고지방식이(HFD)를 섭취하는 군으로 나누었다. 그런 다음, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 사육하는 동안 1주일에 한번 씩 체중과 꼬리 끝으로부터 혈액을 채취하여 혈당, 내당능 및 인슐린 저항성을 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, Htr3a 녹아웃 마우스+정상 식이(NCD) 및 야생형 마우스+ 정상 식이(NCD)를 섭취한 마우스의 체중은 비슷한 것을 확인하였고, 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 체중과 고지방 식이를 섭취한 야생형(wild type) 마우스의 체중을 비교하였을 때, 고지방식이를 섭취한 Htr3a-/- 마우스의 체중이 고지방 식이를 섭취한 야생형(wild type) 마우스의 체중에 비해 증가하지 않는 것을 확인하였으며(도 16 A), 고지방 식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 인슐린 저항성이 고지방 식이를 섭취한 야생형(wild type) 마우스의 인슐린 저항성보다 낮은 것을 확인하였다(16 B).
<4-2> Htr3a 녹아웃 마우스( Htr3a -/- )에서 지질 축적 감소 확인
Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스에서 지질 축적이 감소되는 것을 확인하기 위하여, H&E 염색방법을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스 및 야생형 마우스를 Htr3a 녹아웃 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스+고지방식이(HFD)를 섭취하는 군으로 나누었다. 그런 다음, 상기 마우스의 지방, 간, 근육을 적출하여 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색하여 지질축적을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이를 섭취한 야생형 마우스와 고지방식이(HFD)를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 지방, 간, 근육에서 지질 축적을 비교하였을 때, 고지방식이(HFD)를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 지방, 간 및 근육에서 지질 축적이 감소되는 것을 확인하였다(도 17).
<4-3> Htr3a 녹아웃 마우스( Htr3a -/- )에서 대사율( metabolic rate) 확인
Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스에서 대사율(metabolic rate)을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스 및 야생형(Jackson laboratory) 마우스를 Htr3a 녹아웃 마우스+정상 식이(NCD), 야생형 마우스+ 정상 식이(NCD), Htr3a 녹아웃 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스(Wilde type)+고지방식이(HFD)를 섭취하는 군으로 나누었다. 그런 다음, 상기 마우스의 지방세포 수 및 갈색지방을 적출한 후, 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색하여 체온을 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스(Wilde type)+고지방식이(HFD)를 섭취한 마우스 군의 갈색지방 조직에서 체온을 측정한 결과, 고지방식이를 섭취한 야생형 마우스 및 Htr3a -/- 마우스의 갈색지방 조직에서 체온이 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 18).
<4-4> 야생형 마우스 및 Htr3a 녹아웃 마우스( Htr3a -/- )의 갈색지방 조직에서 Htr3 발현 여부 확인
Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스와 야생형 마우스의 갈색지방 조직에서 Htr3 발현 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스 및 야생형 마우스의 등쪽 피하에서 갈색지방조직을 적출하고, 트리졸 용액을 사용하여 총 RNA를 추출을 한 후, cDNA를 합성하였고, 유전자의 발현은 PCR을 사용하였으며, 이때 하기 [표 3]에 기재된 서열을 사용하였다. 또한, 상기 마우스의 등쪽 피하에서 갈색지방 조직을 적출한 후, 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 갈색지방 조직에서 면역염색을 통해서 세로토닌 합성효소인 Tph1(Tryptophan hydroxylase 1)을 확인하였다(도 19).
따라서, 세로토닌-Htr3-갈색지방 축(serotonin-Htr3-brown fat axis)이 혈류를 통한 전신 작용과 함께 갈색지방 조직내의 자가분비(autocrine)/측분비(paracrine) 효과를 통해서도 동시에 작용할 수 있음을 확인하였다.
서열 번호 서열
Htr3a_F(서열번호 17) AAATCAGGGCGAGTGGGAGCTG
Htr3a_R(서열번호 18) GACACGATGATGAGGAAGACTG
<4-5> 야생형 마우스 및 Htr3a 녹아웃 마우스( Htr3a -/- )의 갈색지방 조직에서 열발생 및 미토콘드리아 생합성에 관여하는 유전자 발현 확인
Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스 및 야생형 마우스에 고지방식이를 섭취시킨 후, 갈색지방 조직에서 열 발생 및 미트콘드리아 생합성에 관여하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스 및 야생형 마우스에 고지방식이를 투여한 마우스의 갈색지방을 적출하여 RNA를 추출한 후, 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때 PCR에 사용된 프라이머는 상기 [표 2] 및 하기 [표 3]에 기재된 서열을 사용하였다. 에너지 소비량은 Phenomaster system(TSE systems)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취한 야생형 마우스 및 Htr3a-/- 마우스의 갈색지방 조직에서 열발생 유전자인 Ucp1 및 Dio2의 발현을 비교하였을 때, 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스의 갈색지방 조직에서 Ucp1 및 Dio2의 발현이 증가하는 것을 확인하였고, 고지방식이를 섭취한 Htr3a -/- 마우스에서 미토콘드리아 생체 내 합성에 관여하는 cytc, Cox8b, mtTFA 및 Nrfl 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 20).
<4-6> 갈색지방에 대한 Htr3 의 직접적인 연관성 확인
갈색지방에 대한 Htr3의 직접적인 연관성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 Kajimura 교수(캘리포니아 대학교, 미국)로부터 제공받은 갈색지방 세포주 HIB 1B를 사용하였다. 상기 세포는 10% FBS, 100 units/ml 페니실린(penicillin), 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin), 0.5 ug/mL 인슐린 및 1 nM T3가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 분화시키기 위하여 세포가 플레이트에 가득 채워졌을 때, 상기 배양 배지 DMEM에 125 nM 인도메타신(indomethacin), 2 ug/mL 덱사메타손(dexamethasone) 및 500 uM IBMX를 첨가하여 2일 동안 배양한 후 다시 상기 배양 배지를 이용하여 4일동안 배양시키고 온단세트론을 처리하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 갈색지방 세포주인 HIB 1B에 길항제(antagonist)인 온단세트론(ondansetron)을 처리하였을 때, 갈색지방 열발생에 관여하는 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며(도 21 A), HIB 1B에 효능제(agonist)인 m-CPBG를 처리하였을 때, 갈색지방 열발생에 관여하는 유전자들의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 21 B).
<4-7> Htr3a 녹아웃( Htr3a -/- ) 마우스에서 인슐린 수치 확인
Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스에 고지방식이를 섭취시킨 후, 상기 마우스의 인슐린 수치를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 야생형 마우스+ 일반식이(NCD), Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-)마우스+일반식이(NCD), Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스+고지방식이(HFD)를 투여한 마우스의 혈액을 채취하여, mouse ultrasensitive insulin ELISA(ALPCO)를 이용하여 인슐린 수치를 측정하였다.
그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, Htr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스+고지방식이(HFD) 및 야생형 마우스+고지방식이(HFD)를 투여한 마우스의 혈액에서 인슐린 수치를 측정하여 비교하였을 때, tr3a 녹아웃(Htr3a -/-) 마우스+고지방식이(HFD)를 섭취한 군에서 무작위 인슐린 수치(random insulin level) 및 당으로 자극시킨 인슐린 수치(glucose stimulated insulin level)에서 더 낮은 인슐린 수치가 나타나는 것을 확인하였다(도 22).
따라서, 베타 세포(beta cell)에서 Htr3이 인슐린 분비액(insulin secreation)에 관여하는 것을 확인하였다.
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Phe Phe His Pro Ser Cys Gly Trp Leu Leu Ile Thr Lys Arg Phe Leu 165 170 175 Ile Arg Phe Ser Leu Ser Ser Phe Ser Leu His Ser Ile Cys Glu Thr 180 185 190 Gln Phe Arg Ser Leu Leu Tyr Pro Arg Ala Arg Tyr Leu Pro 195 200 205 <210> 2 <211> 471 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Ile Leu Cys Glu Glu Asn Thr Ser Leu Ser Ser Thr Thr Asn 1 5 10 15 Ser Leu Met Gln Leu Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe 20 25 30 Asn Ser Gly Glu Ala Asn Thr Ser Asp Ala Phe Asn Trp Thr Val Asp 35 40 45 Ser Glu Asn Arg Thr Asn Leu Ser Cys Glu Gly Cys Leu Ser Pro Ser 50 55 60 Cys Leu Ser Leu Leu His Leu Gln Glu Lys Asn Trp Ser Ala Leu Leu 65 70 75 80 Thr Ala Val Val Ile Ile Leu Thr Ile Ala Gly Asn Ile Leu Val Ile 85 90 95 Met Ala Val Ser Leu Glu Lys Lys Leu Gln Asn Ala Thr Asn Tyr Phe 100 105 110 Leu Met Ser Leu Ala Ile Ala Asp Met Leu Leu Gly Phe Leu Val Met 115 120 125 Pro Val Ser Met Leu Thr Ile Leu Tyr Gly Tyr Arg Trp Pro Leu Pro 130 135 140 Ser Lys Leu Cys Ala Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr 145 150 155 160 Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala 165 170 175 Ile Gln Asn Pro Ile His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala 180 185 190 Phe Leu Lys Ile Ile Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met 195 200 205 Pro Ile Pro Val Phe Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu 210 215 220 Gly Ser Cys Leu Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe 225 230 235 240 Val Ser Phe Phe Ile Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu 245 250 255 Thr Ile Lys Ser Leu Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu 260 265 270 Gly Thr Arg Ala Lys Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser 275 280 285 Leu Ser Ser Glu Lys Leu Phe Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly 290 295 300 Ser Tyr Thr Gly Arg Arg Thr Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys 305 310 315 320 Ala Cys Lys Val Leu Gly Ile Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp 325 330 335 Cys Pro Phe Phe Ile Thr Asn Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser 340 345 350 Cys Asn Glu Asp Val Ile Gly Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile 355 360 365 Gly Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn 370 375 380 Lys Thr Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys 385 390 395 400 Glu Asn Lys Lys Pro Leu Gln Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala 405 410 415 Leu Ala Tyr Lys Ser Ser Gln Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser 420 425 430 Lys Gln Asp Ala Lys Thr Thr Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu 435 440 445 Gly Lys Gln His Ser Glu Glu Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val 450 455 460 Asn Glu Lys Val Ser Cys Val 465 470 <210> 3 <211> 387 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gln Phe Leu Lys Ser Ala Lys Gln Lys Pro Asn Tyr Tyr His Ile 1 5 10 15 Met Leu Val Glu Asp Gln Glu Glu Gly Thr Leu His Gln Phe Asn Tyr 20 25 30 Cys Glu Arg Cys Ser Glu Ser Gln Asn Asn Lys Cys Ile Ser Cys Val 35 40 45 Asp Pro Glu Asp Lys Trp Tyr Arg Trp Pro Leu Pro Ser Lys Leu Cys 50 55 60 Ala Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr Ala Ser Ile Met 65 70 75 80 His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala Ile Gln Asn Pro 85 90 95 Ile His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala Phe Leu Lys Ile 100 105 110 Ile Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met Pro Ile Pro Val 115 120 125 Phe Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu Gly Ser Cys Leu 130 135 140 Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe Val Ser Phe Phe 145 150 155 160 Ile Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu Thr Ile Lys Ser 165 170 175 Leu Gln Lys Glu Ala Thr Leu Cys Val Ser Asp Leu Gly Thr Arg Ala 180 185 190 Lys Leu Ala Ser Phe Ser Phe Leu Pro Gln Ser Ser Leu Ser Ser Glu 195 200 205 Lys Leu Phe Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly Ser Tyr Thr Gly 210 215 220 Arg Arg Thr Met Gln Ser Ile Ser Asn Glu Gln Lys Ala Cys Lys Val 225 230 235 240 Leu Gly Ile Val Phe Phe Leu Phe Val Val Met Trp Cys Pro Phe Phe 245 250 255 Ile Thr Asn Ile Met Ala Val Ile Cys Lys Glu Ser Cys Asn Glu Asp 260 265 270 Val Ile Gly Ala Leu Leu Asn Val Phe Val Trp Ile Gly Tyr Leu Ser 275 280 285 Ser Ala Val Asn Pro Leu Val Tyr Thr Leu Phe Asn Lys Thr Tyr Arg 290 295 300 Ser Ala Phe Ser Arg Tyr Ile Gln Cys Gln Tyr Lys Glu Asn Lys Lys 305 310 315 320 Pro Leu Gln Leu Ile Leu Val Asn Thr Ile Pro Ala Leu Ala Tyr Lys 325 330 335 Ser Ser Gln Leu Gln Met Gly Gln Lys Lys Asn Ser Lys Gln Asp Ala 340 345 350 Lys Thr Thr Asp Asn Asp Cys Ser Met Val Ala Leu Gly Lys Gln His 355 360 365 Ser Glu Glu Ala Ser Lys Asp Asn Ser Asp Gly Val Asn Glu Lys Val 370 375 380 Ser Cys Val 385 <210> 4 <211> 478 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Leu Trp Val Gln Gln Ala Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Thr 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Asn Thr Thr Arg Pro 20 25 30 Ala Leu Leu Arg Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Thr Asn Tyr Arg Lys Gly 35 40 45 Val Arg Pro Val Arg Asp Trp Arg Lys Pro Thr Thr Val Ser Ile Asp 50 55 60 Val Ile Val Tyr Ala Ile Leu Asn Val Asp Glu Lys Asn Gln Val Leu 65 70 75 80 Thr Thr Tyr Ile Trp Tyr Arg Gln Tyr Trp Thr Asp Glu Phe Leu Gln 85 90 95 Trp Asn Pro Glu Asp Phe Asp Asn Ile Thr Lys Leu Ser Ile Pro Thr 100 105 110 Asp Ser Ile Trp Val Pro Asp Ile Leu Ile Asn Glu Phe Val Asp Val 115 120 125 Gly Lys Ser Pro Asn Ile Pro Tyr Val Tyr Ile Arg His Gln Gly Glu 130 135 140 Val Gln Asn Tyr Lys Pro Leu Gln Val Val Thr Ala Cys Ser Leu Asp 145 150 155 160 Ile Tyr Asn Phe Pro Phe Asp Val Gln Asn Cys Ser Leu Thr Phe Thr 165 170 175 Ser Trp Leu His Thr Ile Gln Asp Ile Asn Ile Ser Leu Trp Arg Leu 180 185 190 Pro Glu Lys Val Lys Ser Asp Arg Ser Val Phe Met Asn Gln Gly Glu 195 200 205 Trp Glu Leu Leu Gly Val Leu Pro Tyr Phe Arg Glu Phe Ser Met Glu 210 215 220 Ser Ser Asn Tyr Tyr Ala Glu Met Lys Phe Tyr Val Val Ile Arg Arg 225 230 235 240 Arg Pro Leu Phe Tyr Val Val Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ile Phe Leu 245 250 255 Met Val Met Asp Ile Val Gly Phe Tyr Leu Pro Pro Asn Ser Gly Glu 260 265 270 Arg Val Ser Phe Lys Ile Thr Leu Leu Leu Gly Tyr Ser Val Phe Leu 275 280 285 Ile Ile Val Ser Asp Thr Leu Pro Ala Thr Ala Ile Gly Thr Pro Leu 290 295 300 Ile Gly Val Tyr Phe Val Val Cys Met Ala Leu Leu Val Ile Ser Leu 305 310 315 320 Ala Glu Thr Ile Phe Ile Val Arg Leu Val His Lys Gln Asp Leu Gln 325 330 335 Gln Pro Val Pro Ala Trp Leu Arg His Leu Val Leu Glu Arg Ile Ala 340 345 350 Trp Leu Leu Cys Leu Arg Glu Gln Ser Thr Ser Gln Arg Pro Pro Ala 355 360 365 Thr Ser Gln Ala Thr Lys Thr Asp Asp Cys Ser Ala Met Gly Asn His 370 375 380 Cys Ser His Met Gly Gly Pro Gln Asp Phe Glu Lys Ser Pro Arg Asp 385 390 395 400 Arg Cys Ser Pro Pro Pro Pro Pro Arg Glu Ala Ser Leu Ala Val Cys 405 410 415 Gly Leu Leu Gln Glu Leu Ser Ser Ile Arg Gln Phe Leu Glu Lys Arg 420 425 430 Asp Glu Ile Arg Glu Val Ala Arg Asp Trp Leu Arg Val Gly Ser Val 435 440 445 Leu Asp Lys Leu Leu Phe His Ile Tyr Leu Leu Ala Val Leu Ala Tyr 450 455 460 Ser Ile Thr Leu Val Met Leu Trp Ser Ile Trp Gln Tyr Ala 465 470 475 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htr2a_F primer <400> 5 agctgcagaa tgccaccaac tat 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htr2a_R primer <400> 6 gggattggca tggatatacc tac 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA 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gacagctatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ppargc1a_F primer <400> 16 acggcgctct tcaattgctt 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htr3a_F primer <400> 17 aaatcagggc gagtgggagc tg 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htr3a_R primer <400> 18 gacacgatga tgaggaagac tg 22

Claims (9)

  1. ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Tph1(Trypotophan hydroxylase)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  2. 제 1항에 있어서 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직은 내장지방, 피하지방 또는 갈색지방의 세포 또는 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  3. 제 1항에 있어서 상기 단계 ｉ)의 피검물질을 추출물, 화합물, 단백질 및 조성물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  4. 제 1항에 있어서 상기 단계 ⅱ)의 발현은 면역조직화학염색, RT-PCR, 웨스턴 블랏, ELISA 및 단백질칩으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  5. ｉ) Tph1(Trypotophan hydroxylase) 단백질에 피검물질 처리;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Tph1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Tph1 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  6. ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  7. ｉ) Htr2a(5-hydroxytryptamine receptor 2A) 단백질에 피검물질 처리;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr2a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr2a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  8. ｉ) 분리된 지방세포 또는 조직에 피검물질을 처리하는 단계;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 지방세포 또는 조직으로부터 Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)의 발현 여부를 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a의 발현이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.
  9. ｉ) Htr3a(5-hydroxytryptamine receptor 3A)단백질에 피검물질 처리;
    ⅱ) 상기 단계 ｉ)의 Htr3a 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및
    ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 Htr3a 활성이 무처리 대조군에 비해 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 비만 또는 당뇨 예방 및 치료제 스크리닝 방법.





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