KR101514422B1

KR101514422B1 - 해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101514422B1
Application number: KR1020080046434A
Authority: KR
Inventors: 강엽; 조기웅; 이관우; 최성이
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2008-05-20
Publication date: 2015-04-24
Also published as: KR20090120560A

Abstract

본 발명은 해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타세포 사멸억제에 탁월한 효과를 가지는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

베타세포, 해양 미생물, 지방산 독성, 당뇨병

Description

해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating diabetes comprising marine microorganism metabolite}

본 발명은 해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 해양미생물 대사체(이하, "CCRB608"이라 함)를 포함하는 베타세포사멸을 억제하는 등의 효과를 가진 당뇨병 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 당뇨병은 혈액 내 포도당 농도가 높아져서 발병하는 만성대사질환이다. 혈중 당농도가 높으면 췌장 베타세포는 이를 인지하여 인슐린을 분비하고 분비된 인슐린은 표적세포(근육, 간, 지방세포)에서 포도당 흡수를 촉진하여 혈당을 낮추게 한다. 그러나 식후에도 일정시간이 지나도 혈액 내 포도당 농도가 높은 수준으로 유지되거나, 공복시에도 혈액내 포도당 농도가 높은 수준으로 유지되면 당뇨병이라 일컫는다. 혈액내에 포도당이 지속적으로 증가되면 눈, 신장 및 신경 손상뿐만 아니라 뇌경색, 협심증 및 말초혈관질환 등의 심각한 합병증을 초래할 뿐만 아니라, 당뇨병으로 인한 사망률을 증가하고 삶의 질을 저하시키게 된다. 이러 한 만성질환인 제 2형 당뇨병은 세계적으로 가파르게 성장하고 있는 질병으로 25년 후에는 당뇨 질환 환자가 지금의 2배에 이를 것으로 추정되며, 현재 우리나라에서도 사망에 이르는 원인 4위를 차지하고 있다.

당뇨병은 발생기전에 따라 제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병으로 나누어진다. 제 1형 당뇨병은 췌장 베타세포 특이 자가면역반응에 의해 베타세포가 파괴되고 인슐린이 절대적으로 부족하여 발생하는 병이고, 제 2형 당뇨병은 췌장에서 인슐린의 분비는 이루어지지만 표적세포에서 그 작용이 원활히 이루어지지 못해서 유발하는 질병으로 보통 성인에게서 많이 발생된다. 따라서 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병이라고도 일컫는다. 그러나 최근 연구결과에 의하면 췌장의 베타세포에서 인슐린 저항성을 보상해 줄 수 있을 정도의 인슐린을 분비해준다면 당뇨병의 발병이 일어나지 않는 것으로 보아 베타세포의 기능이상 및 사멸이 제 2형 당뇨병에서 가장 중요한 원인으로 생각된다(Pick A et al.,. Diabetes 47(3):358-64, 1998, Nolan CJ et al.,. Diabetologia. 49(9):2120-30, 2006). 제2형 당뇨병의 원인은 과영양, 운동부족, 노화, 대사 이상등 환경적 요인과 유전적 요인으로 나누어진다.

제 2형 당뇨병 환자는 발병 초기에는 인슐린 저항성을 극복하고자 인슐린의 분비량을 증가시켜 고 인슐린혈증을 보이며, 병이 진행될수록 인슐린이 부족한 상태가 된다. 인슐린이 부족하게 된 원인은 베타세포의 기능이상과 베타세포의 양적감소가 주요 원인이다. 제 2형 당뇨병환자는 당뇨병이 진행됨에 따라 포도당 자극 1차 분비의 감소, 2차 분비의 감소, 마지막으로 기저 인슐린 분비가 감소하는 양상을 보인다. 특히 한국인의 베타세포는 서양인과는 달리 쉽게 인슐린 분비능력이 떨 어지고 빠르게 베타세포의 파괴가 일어나 당뇨병으로 진행된다고 생각한다.

베타세포의 파괴는 제 1형과 2형 당뇨병에서 모두 중요한 병인으로 알려져 있다(Lee SC et al.,, Int J Biochem Cell Biol, 39(3):497-504, 2007, Nagata M et al.,. Diabetes 41(8):998-1008, 1992).특히 제 2형 당뇨병에서 인슐린 저항성을 지닌 비만 환자 중 당뇨병으로 진행되는 비율은 30%라는 사실은 인슐린 저항성만으로는 당뇨병의 원인을 설명하기 불충분하다는 것을 말해준다. 베타세포의 양은 외부 환경에 따라서 조절되는데 특히 체질량이 증가한 상태, 임신 중인 상태, 인슐린 저항성이 동반되어 혈당이 증가한 상태가 되면 인슐린을 만들어내는 베타세포는 증가하고 필요한 양의 인슐린을 분비하여 혈당을 조절한다. Butlet 등은 당뇨를 동반하지 않은 비만환자에서 베타세포의 양이 뚜렷이 증가되어있으며, 당뇨가 동반된 환자의 베타세포는 베타세포의 양이 의미 있게 감소되어 있음을 보고하였다(Butlet AE et al., Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes Jan;52(1)102. 2003). Rhodes 역시 췌장 소도 베타세포의 양적 조절은 베타세포의 복제, 신생, 세포사, 균형에 의해 조절되는데 당뇨병환자의 베타세포는 베타세포의 복제 및 신생이 불충분하고 세포사멸이 상대적으로 많아 베타세포의 양적 감소가 일어난다고 보고하였다 (Rhodes CJ et al., Type 2 diabetes-a matter of beta-cell life and death, Science. 307(5708):380. 2005). 베타세포의 양적 감소의 이유는 유전적 변이와 같은 내재적 요인과 환경적 요인으로 나눌 수 있다. 특히 베타세포의 양적 감소를 유발할 수 있는 환경적 요인은 지방산의 세포 독성, 특히 당농도가 높은 상황에서 포도당/지방 산 독성은 베타세포의 양적 감소에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다. 지방산은 그 자체로 베타세포에 독성을 보이는데 지방산에 노출되면 세포내 대사과정이 지방산화에서 지방합성으로 대사의 변화가 일어나고 이때 형성되는 중간산물들이 세포신호들을 활성화하여 세포사멸을 유도한다고 추측된다 (Prentki M et al., Diabetes. 51 Suppl 3:S405-13. 2002, Choe SS et al., Diabetes. 56(6):1534-43. 2007). 지방산에 의한 베타세포 사멸 기작들은 활성산소, 염증반응, 소포체의 스트레스, JNK 같은 스트레스 신호, 지방대사 변화로 인한 중간대사산물 증가, 파이르베이트와 malate 왕복의 손상과 AKT의 감소 등으로 보고 되어졌다.

종래의 당뇨병 치료제에 사용되는 물질은 당뇨병 환자에서 혈당을 조절하기 위해 인슐린 분비를 증가시키거나 인슐린에 대한 감수성을 높이는 약제들이다. 따이아졸리딘다이온 계열 (Thiazolidinedions)의 약제 중 피오글리타존 (pioglitazone)과 로지글리타존 (rosiglitazone)은 인슐린의 반응을 증강시키는 효과가 있고 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약제인 메트포민(metformin)은 인슐린 저항성과 간에서 포도당 생합성을 줄여준다. 또한 인슐린분비촉진제는 췌장의 베타세포에서 인슐린분비를 자극하여 강력한 혈당감소 효과를 나타내는 약물로 썰폰요소제 (sulfonylurea)와 메글리티나이드 (meglitinide)계열이 있다 (Chapentier, 2002). 그러나 현재 이 약물들에 대한 베타세포사멸 효과는 연구가 미진한 상태이며 또한 베타세포의 사멸을 조절하는 약물은 개발되지 않은 상태이다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 당뇨병 발병의 원인이 되는 베타세포 사멸을 저해하는 물질을 개발하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은

해양미생물 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 해양 미생물은 Halomonas 속인 것이 바람직하며, Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 해양 미생물 대사체는 메탄올과 헥산 용매로부터 추출되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명의 상기 조성물은 베타세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 a) 해양 미생물 균주를 배양하는 단계;b) 상기 배양된 균주를 용매를 이용하여 추출하는 단계;c) 상기 추출된 해양 미생물 대사체를 농축하는 단계; 및 d) 상기 농축된 대사체를 분리하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 해양 미생물은 Halomonas 속인 것이 바 람직하고, Halomonas CCRB608(KCTC 11313BP)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 상기 해양 미생물 대사체는 메탄올과 헥산 용매로부터 추출되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명은 설명한다.

본 발명은 베타세포사멸을 저해함으로 당뇨병의 발병을 예방하기 위해 안출된 것으로써, 갯벌 시료로부터 확보한 해양 미생물을 배양시켜 메탄올과 헥산을 첨가하여 진탕혼합 시킨 뒤 배양액에서 유기용매 층을 분리 농축하여 지방산에 의한 베타세포사멸을 억제하는 물질을 분리하고자 하였다. 본 발명자들은 종래의 당뇨병치료제와는 다른 측면인, 대사적측면에서 지방독성에 의해서 베타세포사멸을 억제 할 수 있는 치료제를 개발하려는 시도를 하였으며, 그 결과 지방독성에 대해서 베타세포사멸을 억제하는 CCRB608을 개발하였다. 본 발명은 종래의 몇몇 당뇨병 치료제에 비해 탁월한 베타세포사멸 억제 효과를 보였으며, 이 물질은 해양 미생물로부터 무제한으로 생산해 낼 수 있는 것이 그 특징이다.

본 발명은 1).해양 미생물로부터 대사체를 분리하였고, 2).분리한 해양미생물 대사체의 효능을 검사하기 위해서 베타세포에 불포화지방산인 palmitate를 첨가하여 베타세포 세포사멸을 유도하는 시스템을 구축하였고, 3).CCRB608은 베타포주인 INS-1와 MIN6N81에서 세포사멸억제 효과를 보였고 췌장 소도 베타세포 사멸억제 효과를 나타냈다.

본 발명에 있어서, "해양 미생물"이란 강화도 주변 갯벌시료를 채취하여 갯 벌 시료로부터 Zobell 배지를 이용하여 균주를 분리한 후, 새로운 배지에서 집락의 형태등에 따라 각각의 균주를 순수 분리하여 배양했다.

본 발명에 있어서, "해양 미생물 대사체"란 해양 미생물이 Zobell 배지에 존재하는 영양성분을 이용하여 성장하면서 생산해내는 모든 대사산물을 의미하며, 대사산물은 세포내에 존재 하거나, 미생물이 분비하는 경우에는 배지에 존재한다.

본 발명에 있어서, 상기에 기재된 용매 외에도 물 또는 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등과 같은 C1-4의 알콜, 또는 이들의 혼합용매를 용매로 사용하여 추출하여 열탕추출, 소니케이션 등 통상의 방법으로 추출물을 형성하거나, 이 추출물의 동결건조물을 형성하여 본 발명의 조성물에 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 하기 실시예와 같이 당뇨 또는 혈당조절이상을 현저하게 개선하여, 당뇨 및 혈당조절이상에 관련된 질환, 및 이들의 합병증의 예방제 또는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법의 의해 제제화할 수 있고, 추출물 자체 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 드링크제와 같은 액제, 시럽제, 캡슐제 등으로 제제화될 수 있으며, 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 빠른 효과를 위해서 드링크제로써 식전 및/또는 후에 경구 투여하는 것이 바람직하다.

상기 본 발명의 조성물을 포함하는 액제, 캡슐제 등은 의약품 또는 건강기능식품으로 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명에서 사용된, 용어 "건강기능식품"이 라 함은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립,액상, 환, 젤리등의 형태로 제조 가공한 식품을 말한다.

본 발명의 조성물은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 성인에게 1일 0.01∼600 mg/kg, 바람직하게는 1∼200 mg/kg으로 1일 1 내지

3회 투여하는 것이 바람직하다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여, 상세하게 살펴보기로 한다.

1. 해양미생물 배양, 추출 및 균주 동정

도 1a는 해양미생물에서 베타세포 사멸 억제하는 물질의 추출방법을 나타내는 흐름도이며,

도 1b와 c는 CCRB608을 생산해내는 균주를 Easy24plusE kit를 이용하여 생리학적 검사를 한 결과이며, 도 1d는 CCRB608 생산 균주의 16s rDNA를 분리하여 sequencing한 균주 동정 결과이다.

CCRB608 생산 균주는 대한민국 서해안 갯벌에서 채취한 균주로 고체 배지인 Seawater Complete Medium (SWC)에서 대량 배양하였다. 다음, SWC 배지에 키운 균주를 건조시킨 후, 잘게 잘라 5 L들이 유리병에 넣고 메탄올을 첨가하여 교반 후 배지덩어리는 제거하였다. 동량의 핵산을 첨가하고 교반을 반복하고 총 추출액을 Saperatory Funnel에 넣어 상층액을 분리하고 Rotary Evaporator (감압 농충기)로 농축시킨다. 다음 단계는 Flash Chromatography로 농축시킨 시료를 분리하는 과정 으로, 농축시킨 시료를 핵산으로 녹인 후, Silica gel과 함께 완전히 건조시키고 column에 패킹한다. Hexane, Hexane: Diethly ether (4:1), Hexane: Diethly ether (3:2), Hexane: Diethly ether (2:3), Hexane: Diethly ether (1:4), Diethly ether, Acetone, 등 7개의 용매를 만들어 nonpolar한 순서로 vacumm을 걸어 뽑아낸다. 시료를 농축시킨 후 무게의 차를 이용하여 시료의 무게를 구한다. 7개 시료를 Centra-Vac으로 용매를 날려 농축시킨다. 생리학적 검사는 Easy24plusE kit를 사용하여 해양미생물의 활성을 조사하였다. 그 결과를 도 1B에 도시하였고, 추출물은 Halomonas sp균에 속하는 것임을 확인하였다. 다음으로 CCRB608 생산균주의 16s rDNA를 분리하였고 sequencing을 수행하여 동정 작업을 진행하였다. 해양미생물의 phenol extraction을 이용하여 chromosomal DNA를 분리하고 16s rDNA 에 상보적인 primer를 이용해 sequencing을 의뢰한 결과 CCRB608 생산균주가 Halomonas sp균에 속하는 것임을 재확인하였으며, 상기 균주를 Halomonas sp CCRB608로 명명하였다.

상기 균주는 대한민국 대전시 유성구 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 4월 15일 KCTC 11313BP로 기탁하였다.

2. 지방산독성을 이용한 베타세포사멸 모델 구축

본 실험은 상기 분리한 CCRB608의 효능을 검증하기 위하여 구축한 실험이다. 지방 독성을 이용한 베타세포의 사멸모델을 구축하기 위하여, 불포화 지방산인 palmitate를 베타세포에 첨가하여 베타세포 독성을 유발시키고 일정시간이 지난 후 MTT 분석을 통해 세포 생존력을 측정하였다.

2.1 Palmitate 준비

Palmitate/BSA (bovineserum albumin)의 결합은 Listenberger의 방법에 따라 준비하였다. 20 mM의 palmitate 용액과 0.01 M NaOH를 70℃에서 30분 동안 교반기에서 배양 후 fatty acid soaps를 PBS에 녹여져있는 5% BSA와 3:1의 비율로 섞어준다. 만들어진 Palmitate/BSA 결합체를 농도에 맞추어 세포에 넣어 배양하였다.

2.2 생존력 확인 실험

베타세포의 생존 확인을 위해서 MTT 실험을 수행하였다. 베타세포에 0.5 mg/ ml 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoiliumbromide (MTT)를 첨가하고 37℃, CO₂ 배양기에서 2시간 배양하였다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 상온에서 30분 동안 추가 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 확인하였다.

3. CCRB608 의 효능 확인

CCRB608의 효능을 확인하기 위하여 INS-1 세포는 고농도의 포도당과 palmitate를 처리하였고 (Karaskov E et al., Endocrinology. 147(7):3398-407. 2006), MIN6N8a 세포는 Bay K8644와 palmitate를 처리하여 (Sung-E Choi et al., Endocrinology. 272:50-62. 2007) 베타세포 사멸 모델을 구축하였다. 도 2, 3은 백서, 마우스의 베타세포주와 SD 백서의 췌장에서 분리한 소도 베타세포에서 CCRB608의 세포사멸억제 효능을 확인한 실험이다. INS-1 베타세포, MIN6N8a, 백서췌장 소도 베타세포에서 CCRB608를 전 처리하고 불포화지방산인 palmitate를 첨가 하여 일정시간 배양 후 광학현미경과 MTT 분석을 통해 베타세포의 생존력을 측정하였다. 그 결과 CCRB608은 지방독성에 의한 INS-1, MIN6N8a, rat islet 베타세포 사멸을 통계적으로 의미있게 세포사멸을 억제시키는 효과를 나타냈다.

본 발명에서 본 발명의 조성물은 기존의 당뇨 치료제에 비하여 탁월한 베타세포사멸 억제 효과를 보였으며, 이 물질은 해양 미생물로부터 무제한으로 생산해 낼 수 있으므로 더욱 바람직하다.

이하에서는 본 발명을 좀더 자세히 실시예를 들어 설명하고자한다. 본 발명 하기부분은 발명을 이해를 돕고자 예시를 들어 부연 설명하였다.

실시예 1: 해양미생물 배양 및 추출

서해안 갯벌에서 채취한 CCRB608 균주를 Sea water Complete Medium (SWC) 배지 50장에 smearing 한 후, 28°C에서 24시간 배양하여 균주를 대량 생산하였다. 다음 2단계는 추출단계로 적당히 자란 균주를 건조 시킨후 배지를 잘게 잘라 5L들이 유리병에 넣어 잠길 정도로 메탄올을 넣고 Stirrer (Labortechnik Co., Germany)로 24시간 교반하여 추출하였다. 24시간 후 배지 덩어리들은 체에 걸러내고 추출액에 동량의 핵산을 첨가하여 다시 잘 섞어준다. 6시간 정도 교반한 후 총 추출액을 Saperatory Funnel에 넣어 24시간 동안 분리시킨다. 그 결과 상층에는 Hexane과 sample, 중층에는 Methanol, 하층에는 배지 찌꺼기 순서로 sample이 정렬 하게 된다. 본 발명자들은 상층액을 모아서 감압 농축기로 농축시켰다. 다음 4 단계는 Flash Chromatography로 농축시킨 시료를 분리하는 과정이다. 농축시킨 시료에 핵산 10 ml을 첨가하고, Silica gel 10g을 섞은 후 Rotary Evaporator로 완전 건조시킨다. Silica에 시료가 부착하였는지 확인하고 완전 건조된 Silica를 column에 충전한다. 하기의 7개의 용매 (20 ml)를 만들어 무극성 용매 순서로 진공을 걸어 뽑아낸다.

① Hexane:20 ml

② Hexane: Diethly ether = 4:1: 20 ml

③ Hexane: Diethly ether = 3:2: 20 ml

④ Hexane: Diethly ether = 2:3: 20 ml

⑤ Hexane: Diethly ether = 1:4: 20 ml

⑥ Diethly ether: 20 ml

⑦ Acetone: 20 ml

빈 병의 무게를 재고, 시료를 농축시킨 후 무게의 차를 구해 농축된 시료의 무게를 구한다. 7개 시료를 Centra-Vac으로 용매를 날려 농축시킨다. 그 결과 하기의 시료를 얻었으며, 시료는 DMSO에 100 mg/ml의 농도로 만들어서 베타세포 사멸억제에 효과가 있는지 확인하였다.

No.	1	2	3	4	5	6	7
	Hexane 20ml	Hexane: Diethly ether = 4:1	Hexane: Diethly ether = 3:2	Hexane: Diethly ether = 2:3	Hexane: Diethly ether = 1:4	Diethly ether 20ml	Acetone 20ml
Sample Weight (mg)	0.1	5.3	6.4	8.0	0.6	0.9	1.7

실시예 2: 생리학적 검사 및 16s rDNA sequencing 에 의한 균주 동정

상기 2에 기재된 방법에 따라서 생리학적 검사 및 16s rDNA sequencing으로 균주 동정을 수행하였다. 자세한 결과는 도 1 b, c 및 d에 도시하였다.

균주의 형태는 1000 X 광학 현미경 하에서 수행하였다. 생리학적 검사는 장내 세균 동정 키트인 Easy24plusE kit (Komed 사, 한국)를 사용하였고, 활성이 확인된균주는 16s rDNA sequencing를 통해 동정 작업을 수행하였다. 해양 미생물에서 chromosomal DNA를 분리한 후 16s rDNA에 특이한 primer를 이용하여 sequencing하였다. 그 결과 상기 출물은 Halomonas 균에 속하는 것임을 확인하였다. 16s rDNA sequencing 결과는 도1 d에 그 결과를 기록하였다.

실시예 3: 분리한 해양 미생물대사체의 효능 확인

INS-1 베타세포, MIN6N8a, rat islet에 해양 미생물대사체를 전 처리하고 불포화지방산인 palmitate를 사용하여 베타세포 세포사멸을 억제하는 CCRB608의 효능 확인하였다.

3-1. INS -1 세포의 확보

INS-1 세포주는 백서의 베타 세포주 (insulinoma cell line: INS-1)로써, 인슐린이 분비되는 세포이다. 이 세포주는 미국 시카고 의과대학교 윤지원 박사님 실험실에서 분양받았다. INS-1 세포주는 NEDH 백서에서 분리한 radiation-induced insulinoma (M. Asfari, et.al., Endocrinology 130 167-178, 1992) 세포주이다. 분양 후 5-10 passage 배양 후 질소 탱크에 저장하였고 필요시마다 꺼내 다시 5-20 passage 내에서 배양한 세포를 사용하였다. 포도당 반응 인슐린분비 능력이 항상 유지되는지 검토 한 후 사용하였다. INS-1 세포를 배양하기 위한 배지로 RPMI 1640 (Cellgro Cat. No. 50-020-PB, mediatech, VA, USA)에 10% Fetal bovine serum (Cellgro Cat. No. 35-010-CV, mediatech, VA, USA), 100 ㎍/ml streptomycin (Cas. NO. 3810-74-0, Duchefa biochemie, Haarlem, Netherland)로 첨가하여 사용하였다. INS-1 세포주는 5% CO₂와 37℃의 온도를 유지하면서 배양하였다.

3-2. MIN6N8a 세포의 확보

MIN6N8a 세포주는 생쥐의 베타 세포주로써, 인슐린이 분비되는 세포이다. 이 세포주는 일본 Tokyo Miyazaki 박사님 실험실에서 분양받았다. MIN6N8a 세포주는 NOD background 생쥐에서 분리한 insulinoma (Miyazaki J, et.al.,Endocrinology 127 :126 132,1990) 세포주이다. 분양 후 5-10 passage 배양 후 질소 탱크에 저장하였고 필요시마다 꺼내 다시 5-20 passage 내에서 배양한 세포를 사용하였다. 포도당 반응 인슐린분비 능력이 항상 유지되는지 검토 한 후 사용하였다. MIN6N8a 세포를 배양하기 위한 배지로 DMEM (Cellgro Cat. No. 50-014-PB, mediatech, VA, USA)에 10% Fetal bovine serum (Cellgro Cat. No. 35-010-CV, mediatech, VA, USA), 100 ㎍/ml streptomycin (Cas. NO. 3810-74-0, Duchefa biochemie, Haarlem, Netherland)로 첨가하여 사용하였다. MIN6N8a 세포주는 5% CO₂와 37℃의 온도를 유지하면서 배양하였다.

3.3 췌장 소도 세포 ( Pancreas islet ) 분리

췌장 소도 세포는 collagenage digestion 방법으로 분리하였다. 8-10주된 웅성 Sprague-Dawley 쥐 (300g)의 common bile duct에 0.75 mg/ml의 collagenase를 10 ml 주사하고 췌장을 분리하였다. 37℃ water bath에서 약 10분 정도 배양하여 digestion 시킨 후, 차가운 HBSS를 20 ml 넣어 효소의 작용을 중지 시키고 pipeting을 20회 반복하고, 600 ㎛ mesh에 걸러서 digestion되지않은 exocrine 세포들은 제거하였다. 걸러진 용액은 50 g 로 원심분리하여 상등액은 버리고 침전물을 HBSS를 넣고 섞어 50 g로 원심분리하여 씻어내는 과정을 3회 반복하였다. 남은 침전물은 25% ficol 용액에 섞은 후, 그 위로 23%, 21.5%, 20%, 11%의 ficol 층을 만들고 3500 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 11%와 20.5% 사이 층에 걸린 췌장의 소도 세포를 분리하여 RPMI 1640로 세척한 후, RPMI1640 (10% fetal bovine serum과 1% 항생제 포함) 배지로 배양하였다.

3.4 CCRB608 실험군 및 대조군

본 발명에 따른 베타세포 사멸억제 물질인 CCRB608은 DMSO에 녹여서 주사기 여과기 (0.2 uM)를 이용하여 멸균상태를 유지하여 사용하였다. 또한 CCRB608의 세포사멸억제 활성 측정 테스트를 위한 양성 대조군 시료로는 PPAR-α를 자극하는 물질인 0.5 mM bezafibrate, 음성 대조군 시료로는 BSA와 PBS를 3:1로 혼합하여 실험군과 동량 세포에 첨가하였다.

3.5 베타세포에서 CCRB 의 효능 확인 실험

본 발명에 따른 추출물인 CCRB608가 Palmitate에 의한 베타세포사멸에 효능이 있는지 확인한 실험으로 베타세포 INS-1 세포들, MIN6N8a 세포들과 백서의 췌장 소도 베타세포를 사용하였으며, MTT assay와 광학 현미경을 통해서 세포의 생존력 및 사멸을 확인하였다.

3.5.1 INS -1 세포에서 CCRB608 효능 확인

본 발명의 추출물인 CCRB608를 INS-1 세포에 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml의 농도로 전 처리하고, 30분 후 25 mM 포도당과 400 μM palmitate을 처리하고 24시간 37℃, CO₂ 배양기에서 배양한다. 광학 현미경과 MTT 분석을 통해 세포의 생존력을 측정하였다. 도 2a, 3a는 INS-1 베타세포에서 CCRB608의 세포사멸억제 실험을 한 결과 그래프이다.

즉, INS-1 세포를 5X10⁴의 농도로 96 well에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 RPMI 1640 배지에 최종농도가 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml 준비하였고, 음성 대조군은 RPMI1640 배지에 CCRB608과 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였고, 양성대조군은 0.5 mM bezafibrate를 배지에 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 96 well의 INS-1 세포에서 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 30분 후 palmitate와 glucose를 각각 400 μM, 25 mM이 되도록 첨가하여 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 24시간 후 광학현미경으로 세포의 모양을 관찰하고 사진을 찍은 결과를 도 2 a에 나타내었다. 또한 세포의 생존력 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다. 96 well plate에서 배양이 끝난 INS-1 세포의 배지를 제거하고 0.5 mg/ml MTT를 100 ㎕씩 첨가하여 2-3 시간 CO₂ 배양기에서 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 RT에서 30분 동안 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 정량하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

결과를 정리하면, 도 3a에 도시한 바와 같다. 각 실험은 3회 반복한 것으로 평균값으로 나타냈고 평균값 ± SD로 표시하였다. *는 통계 처리에 의한 유의성이 있음을 의미한다. 음성 대조군은 모두 베타세포사멸을 억제하지 못하였으며 양성 대조군인 bezafibrate는 약 65% 세포사멸억제 효과를 보였다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 양성 대조군의 실험이 정확하게 되었음을 의미한다. 실험군인 CCRB608는 72%의 세포사멸억제 효과를 나타냈으며, 음성대조군 또는 양성 대조군인 bezafibrate에 비교하여 의미있게 사멸억제효과가 증가되었으며, CCRB608의 농도 의존적으로 베타세포사멸을 억제하는 현상을 나타냈다.

3.5.2 MIN6N8a 세포에서 CCRB 효능

본 발명의 추출물인 CCRB608를 MIN6N8a 세포에 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml 농도로 전처리하고, 30분 후 10 mM Bay K8644와 500 μM palmitate을 처리하고 24시간 37℃, CO₂ 배양기에서 배양한다. 광학 현미경과 MTT 분석을 통해 세포의 생존력을 측정하였다. 도 2b, 도 3b는 MIN6N8a 베타세포에서 CCRB608의 세포사멸억제 실험을 한 결과 그래프와 사진이다.

즉, MIN6N8a 세포를 5X10⁴의 농도로 96 well plate에 분주하고 배양기에서 24시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 DMEM 완전배지에 최종농도가 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml 되도록 준비하였고, 음성 대조군은 DMEM 완전배지에 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였다. 양성대조군은 0.5 mM bezafibrate를 배지에 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 96 well plate의 MIN6N8a 세포에서 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 palmitate와 Bay K8644를 각각 400 μM, 10 mM이 되도록 첨가하여 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 24시간 후 광학현미경으로 세포의 모양을 관찰하고 사진을 찍은 결과를 도 2 b에 나타내었다. 또한 세포의 생존력 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다. 96 well plate에서 배양을 끝낸 MIN6N8a 세포에 배지를 제거하고 0.5 mg/ml MTT를 100 ㎕씩 첨가하여 2-3 시간 CO₂ 배양기에서 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 상온에서 30분 동안 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 정량하였다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

결과를 정리하면, 도 3a에 도시한 바와 같다. 각 실험은 3회 반복한 것으로 평균값으로 나타냈고 평균값 ± SD로 표시하였다. *는 통계 처리에 의한 유의성이 있음을 의미한다. 음성 대조군은 모두 베타세포사멸을 억제하지 못하였으며 양성 대조군인 bezafibrate는 약 60% 세포사멸억제 효과를 보였다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 양성 대조군의 실험이 정확하게 되었음을 의미한다. 실험군인 CCRB608는 약 68% 세포사멸을 억제하였고 음성대조군에 비교하여 통계적으로 의미있는 사멸억제 효과를 보였으며 이는 양성 대조군인 bezafibrate 보다 우수하였다.

3.5.3 췌장 소도 베타세포에서 CCRB 효능

본 발명의 추출물인 CCRB608을 췌도 베타세포에 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml 농도로 전 처리하고, 30분 후 500 μM palmitate를 처리하고 36시간 37℃, CO₂배양기에서 배양한다. 광학 현미경과 MTT 분석을 통해 췌장 소도 베타세포의 생존력을 측정하였다. 도 2c, 도 3c는 MIN6N8a 베타세포에서 CCRB608의 세포사멸억제 실험을 한 결과 사진과 그래프이다.

즉, 분리한 SD 백서의 췌장 소도를 trypsin을 처리하여 단일세포로 만든 후 1X 10⁵의 농도로 96 well plate에 분주하고 배양기에서 48시간 배양한다. 본 발명의 추출물은 RPMI1640 완전배지에 최종농도가 400 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml 되도록 준비하였다. 음성 대조군은 DMEM 완전배지에 동량의 DMSO를 첨가하여 준비하였고, 양성대조군은 0.5 mM bezafibrate를 배지에 첨가하여 준비하였다. 충분히 자란 96 well plate에 소도 베타세포의 배지를 제거한 후 준비된 시료를 첨가하고 500 μM palmitate 을 첨가하여 36시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양한다. 36시간 후 광학현미경으로 세포의 모양을 관찰하고 사진을 찍은 결과를 도 2c에 나타내었다. 또한 세포의 생존력 실험은 다음과 같은 과정으로 진행되었다. 배양이 끝난 췌장 소도 베타세포에 배지를 제거하고 0.5 mg/ml MTT를 100 ㎕씩 첨가하여 2-3 시간 CO₂ 배양기에서 배양한다. 상등액을 제거한 후 acidic isopropanol (0.04 N HCl)을 첨가하여 RT에서 30분 동안 추가 배양한 후 microplate reader (BIO-RAD, Hercules, CA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 정량하였다. 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

결과를 정리하면, 도 3c에 도시한 바와 같다. 각 실험은 3회 반복한 것으로 평균값으로 나타냈고 평균값 ± SD로 표시하였다. *는 통계 처리에 의한 유의성이 있음을 의미한다. 음성 대조군은 모두 베타세포사멸을 억제하지 못하였으며 양성 대조군인 bezafibrate는 약 65% 세포사멸억제 효과를 보였다. 이는 문헌에서 제공되는 정보와 일치하는 것으로 양성 대조군의 실험이 정확하게 되었음을 의미한다. 실험군인 CCRB608 군은 상기에서 같이 음성대조군에 비교하여 통계적으로 의미있는 베타세포 사멸억제 효과를 보였으며 이는 양성 대조군인 bezafibrate와 비슷한 수준이었다.

이상의 결과를 종합하여 보면, 본 발명의 추출물인 CCRB608은 마우스의 베타세포주인 MIN6N8세포, 췌도 베타세포주인 INS-1세포, 정상의 백서 췌장에서 분리한 소도의 베타세포에서 모두 지방산에 대한 독성을 현저히 억제하는 특징을 나타냈다.

도 1은 CCRB608을 생산하는 해양미생물 균주동정 결과를 나타낸 것으로, a)는 해양미생물 배양 및 대사물질 추출법을, b)와 c)는 CCRB608을 생산하는 해양미생물의 생리학적 검사 (Easy24plusE kit)를, d)는 CCRB608을 생산하는 해양미생물의 균주 동정을 위한 16s rDNA sequencing 분석을 나타낸다.

도 2는 CCRB608의 지방독성에 의한 베타세포 사멸억제 효과 (광학현미경 분석)를 나타낸 것으로 a)는 INS-1 베타세포 사멸억제 효과를 나타낸 사진, b)는 MIN6N8a 베타세포 사멸억제 효과를 나타낸 사진, c)는 쥐의 췌장 소도 베타세포 사멸억제 효과를 나타낸 사진이다.

도 3은 CCRB608의 지방독성에 의한 베타세포 사멸억제 효과 (MTT 분석을 통한 생존력 실험 결과)를 나타낸 것으로서, a)는 INS-1 베타세포 사멸억제 효과 (생존력)를, b)는 MIN6N8a 베타세포 사멸억제 효과 (생존력)를, c)는 쥐의 췌장 소도 베타세포 사멸억제 효과 (생존력)를 나타낸다.

Claims

할로모나스(Halomonas) CCRB608(KCTC 11313BP) 대사체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 할로모나스(Halomonas) CCRB608(KCTC 11313BP) 대사체는 메탄올과 헥산 용매로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 베타세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
a) 할로모나스(Halomonas) CCRB608(KCTC 11313BP) 균주를 배양하는 단계;

b) 상기 배양된 균주를 메탄올과 헥산 용매를 이용하여 추출하는 단계;

c) 상기 추출된 균주 대사체를 농축하는 단계; 및

d) 상기 농축된 대사체를 분리하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조방법.
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