KR101509651B1 - Primer set for detecting wheat streak mosaic virus and the use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 밀줄무늬모자이크 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있고, 지금까지 알려진 모든 계통의 밀줄무늬모자이크 바이러스들과 반응할 수 있으며 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하기 때문에, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 밀줄무늬모자이크 바이러스의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.The present invention relates to a primer set for RT-PCR and nested PCR for specifically detecting wheat stripe mosaic virus, a composition comprising the same, a kit and a specific detection method of wheat stripe mosaic virus using the same. The detection method according to the present invention can be diagnosed with a detection limit of 1,000 times or more as compared with a conventional method using antiserum against seeds and tissues and can be reacted with wheat stripe mosaic viruses of all known strains, Since the negative reaction can be verified, it can be efficiently used for the industrialization of the plant virus RT-PCR diagnostic kit and the inspection of the wheat stripe mosaic virus at the quarantine site of imported plants.

Description

밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도{PRIMER SET FOR DETECTING WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS AND THE USE THEREOF}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a primer set for wheat stripe mosaic virus-specific detection,

본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 PCR용 프라이머 세트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 밀줄무늬모자이크 바이러스의 특이적 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a PCR primer set for specifically detecting wheat stripe mosaic virus. More specifically, the present invention relates to a primer set for RT-PCR and nested PCR for specifically detecting wheat stripe mosaic virus, a composition comprising the same, a kit and a specific detection method of wheat stripe mosaic virus using the same .

밀줄무늬모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV)는 분류학적으로 바이러스 Group IV (+) sense ssRNA viruses, Potyviridae과 Tritimovirus속으로 분류된다. WSMV는 식물병원성 바이러스로 진드기 (Aceria tulipae)를 벡터로 전염이 된다. 주요 기주로는 밀과 옥수수이며, 귀리, 돌피, 보리, 푸새, 강아지풀 및 수수에도 감염될 수 있다(도 1 참조). Wheat streak mosaic virus (wheat streak mosaic virus ; WSMV) are classified into the taxonomic virus Group IV (+) sense ssRNA viruses , Potyviridae and Tritimovirus. WSMV is a phytopathogenic virus that causes ticks ( Aceria tulipae ) as a vector. The main groups are wheat and corn, and can also be infected with oats, molasses, barley, pheasants, marsupials and sorghum (see Figure 1).

한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만, 형태적 특징으로 종을 진단하기는 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다.On the other hand, an electron microscope or a serological method was mainly used as a conventional virus diagnosis method. Although electron microscopy can confirm the presence of virus, it is almost impossible to diagnose a species as a morphological feature. Among the serological methods, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) is the most commonly used diagnostic method, but its detection sensitivity is about 1,000 times lower than that of Polymerase Chain Reaction (PCR) Of the patients with the untreated nonspecific response.

종래, 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출하기 위하여 ELISA를 주로 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있으며, 검사시료에서 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 감염율이 낮을 경우 진단에 실패할 가능성이 높은 문제점이 있다. 또한, 검역현장에서는 하나의 검사시료에 대하여 다양한 병원체의 진단을 수행하여야 되므로 여러 가지 진단법을 사용할 경우 많은 노동력과 검사비용이 소요되는 문제점도 있다. 따라서, 각각의 병원체에 대하여 동일한 검사법의 개발이 필요하다. Conventionally, ELISA is mainly used to detect wheat stripe mosaic virus (WSMV), but it is often misdiagnosed as nonspecific reaction between plant extract and antiserum. In the test sample, infection rate of wheat stripe mosaic virus (WSMV) is low There is a problem that diagnosis is likely to fail. In addition, since the diagnosis of various pathogens must be performed on a single test sample at the quarantine site, there is a problem that a lot of labor and inspection costs are required when various diagnostic methods are used. Therefore, it is necessary to develop the same test method for each pathogen.

또한, PCR 검사법으로 진단할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비한 검사시스템이 필요한 실정이다. 더욱이, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구된다.Further, in the case of diagnosing by the PCR method, a test system is needed in case of difficulty in discrimination due to low specific strength of the reaction or in case of causing nonspecific reaction with other nucleic acid. Furthermore, the use of isolate-specific primers can lead to failure of diagnosis, and development of species-specific primers capable of detecting all isolates present in the viral species is desired.

현재, RNA 바이러스의 진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 병원체의 PCR 진단을 위해서는 종 특이적 프라이머의 개발이 가장 중요함에도 불구하고, 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출하기 위한 특이적 프라이머는 아직 개발된 바 없다.Currently, the RT-PCR method, which has high detection sensitivity and convenience, is most commonly used for diagnosis of RNA viruses. However, although the development of species specific primers is most important for PCR diagnosis of pathogens, specific primers for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV) have not yet been developed.

이에, 본 발명자들은 농가에서 크게 문제가 되고 있는 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 용이하게 검출하기 위해 연구한 결과, 현장에서 전문장비 없이 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 다양한 strain들을 고감도로 신속하게 모두 검출할 수 있는 RT-PCR용 프라이머 세트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have conducted extensive studies to easily detect wheat stripe mosaic virus (WSMV), which is a major problem in a farm, and as a result, various strains of wheat stripe mosaic virus (WSMV) The inventors have developed a primer set for RT-PCR that can detect the present invention, thereby completing the present invention.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 밀줄무늬모자이크 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 RT-PCR 및 네스티드 PCR용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.Disclosure of the Invention The present invention has been conceived to solve the above problems of the prior art, and it is an object of the present invention to provide a primer set for RT-PCR and nested PCR for specifically detecting wheat stripe mosaic virus, a composition comprising the same, And to provide a striped mosaic virus-specific detection method.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되, 상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 3 또는 서열번호 5이고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 10, 서열번호 14 또는 서열번호 16인, 프라이머 세트를 제공한다.The present invention relates to a primer set for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection, wherein the primer set comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 Wherein the forward primer is SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 and the reverse primer is SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, A primer set is provided.

본 발명의 일 구현예로, 서열번호 3 및 서열번호 16로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, a primer set comprising a pair of primers consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 16 is characterized in that it is for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

본 발명의 다른 구현예로, 서열번호 5 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the set of primers comprising a pair of primers consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 14 is characterized in that it is for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).

본 발명의 또 다른 구현예로, 서열번호 5 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 한다.In another embodiment of the present invention, the primer set comprising the primer pair consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 16 is characterized in that it is for nested PCR.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection comprising the primer set.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 진단을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다.The present invention provides a kit for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific diagnosis comprising the primer set.

본 발명의 일 구현예로, 양성대조군으로 서열번호 17 및 돌연변이 양성대조군으로 서열번호 18로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the present invention, a plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 as a positive control and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 as a mutation positive control is further characterized.

본 발명은,According to the present invention,

(a) 밀줄무늬모자이크 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;(a) performing reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using RNA extracted from a sample to detect wheat stripe mosaic virus as a template using the primer set;

(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및(b) performing a nested PCR using the RT-PCR product obtained from the step (a) as a template using the primer set; And

(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 밀줄무늬모자이크 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 밀줄무늬모자이크 바이러스 검출방법을 제공한다.(c) determining the size of the nested PCR product obtained from the step (b) to determine whether the wheat stripe mosaic virus is infected.

본 발명에 따른 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 고정밀도로 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출할 수 있다. 따라서 식물 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 WSMV 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.By using the primer set, the composition including the primer set, the kit and the detection method using the primer set according to the present invention, it is possible to detect wheat stripe mosaic virus (WSMV) with high precision in a short time without professional equipments. Therefore, it is expected that viruses that can cause huge damage to plant growers can be detected early, so that a faster and more efficient WSMV diagnosis system can be constructed and economic loss due to virus infection can be prevented.

또한, 본 발명에 따른 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 검출용 프라이머 세트는, 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있다. In addition, the primer set for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV) according to the present invention can be diagnosed at a detection limit of 1,000 times or more as compared with a conventional method using antisera for plant seeds and tissues.

또한, 본 발명에 따른 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 검출용 프라이머 세트는, 지금까지 알려진 모든 계통의 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)들과 반응할 수 있고, 양성 및 음성 반응의 검증도 가능하다.In addition, the primer set for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV) according to the present invention can react with wheat stripe mosaic viruses (WSMV) of all known strains, and also can verify positive and negative reactions.

또한, 본 발명에 따른 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 검출용 프라이머 세트는, 식물바이러스 RT-PCR 진단키트의 산업화와 수입 식물체의 검역현장에서 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 검사에 효율적으로 이용할 수 있다.In addition, the primer set for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV) according to the present invention can be efficiently used for the industrialization of the plant virus RT-PCR diagnostic kit and the inspection of the wheat stripe mosaic virus (WSMV) at the quarantine site of imported plants .

도 1은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)에 감염된 증상을 나타낸 것이다.
도 2는 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 검출을 위해 설계한 프라이머 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머의 1차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머의 3차 및 4차 선발 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선발된 프라이머 조합들의 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 선발된 프라이머 조합들의 nested PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머 세트 1 (N20/C80, 833bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 8은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머 세트 2 (N30/C70, 671bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 9는 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조구의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 양성대조구(N20/C50, 2,013 bp)의 결합부위를 나타낸 것이다.
도 11은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV) 돌연변이-양성대조구(N20/C80, 840bp)의 결합부위, nested PCR 프라이머 결합부위, 염기서열 삽입부위를 나타낸 것이다.Figure 1 shows symptoms infected with wheat stripe mosaic virus (WSMV).
Figure 2 shows a primer map designed for detection of wheat stripe mosaic virus (WSMV).
Fig. 3 shows the results of the first selection of primers for detection of wheat stripe mosaic virus (WSMV).
Fig. 4 shows the results of third and fourth selection of wheat stripe mosaic virus (WSMV) diagnostic primers.
Figure 5 shows end-point PCR results of selected primer combinations.
Figure 6 shows nested PCR results of selected primer combinations.
Figure 7 shows the binding sites of the wheat stripe mosaic virus (WSMV) diagnostic primer set 1 (N20 / C80, 833bp).
Fig. 8 shows the binding sites of the wheat stripe mosaic virus (WSMV) diagnostic primer set 2 (N30 / C70, 671 bp).
Figure 9 shows the PCR result of the positive control product containing the primer interval for wheat stripe mosaic virus (WSMV) and the final selected primer combinations.
Fig. 10 shows binding sites of positive control (N20 / C50, 2,013 bp) of wheat stripe mosaic virus (WSMV).
Figure 11 shows the binding sites of the wheat stripe mosaic virus (WSMV) mutation-positive control (N20 / C80, 840 bp), the nested PCR primer binding site, and the base sequence insertion site.

본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출하기 위한 최적의 RT-PCR용 프라이머 세트 및 이에 부합하는 검정용 네스티드 프라이머 세트(nested primer ser)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이적 프라이머 은행 및 양성대조구를 포함하고 있다.
The present invention relates to a primer set and a use thereof for specifically detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV), which comprises a primer set for optimal RT-PCR for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV) A nested primer set, a species-specific primer bank that can support it, and a positive control.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.The term "primer " in the present invention is a nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template and serving as a starting point for template strand copying ≪ / RTI > The primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization and a different four nucleoside triphosphate at a suitable buffer solution and temperature.

본 발명에서 용어 "중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)"은, DNA 또는 RNA의 특정영역을 튜브 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술을 의미하며, PCR 증폭효율에 영향을 미치는 요인으로는 각 단계의 반응온도와 시간, cycle수, 반응액 조성(주형 DNA, dNTP농도, Mg2+ 농도 등) 등이 있지만, 프라이머 설계가 가장 중요하다.The term "Polymerase Chain Reaction (PCR) " in the present invention means an epoch-making technique for amplifying a specific region of DNA or RNA in a large amount in a tube. Factors affecting PCR amplification efficiency include, The reaction temperature and time, the number of cycles, the reaction solution composition (template DNA, dNTP concentration, Mg2 + concentration, etc.), but primer design is most important.

본 발명에서 용어 "역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reactionpolymerase chain reaction; RT-PCR)"은 RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 시행하여 complementary DNA를 합성하여 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 기술을 의미한다. 본 발명을 위해 RT-PCR은 42℃, 60분의 역전사반응과 95℃, 10분의 denaturation 후 95℃에서 45초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분 과정을 35회 반복 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다.In the present invention, the term " Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) "is a method for synthesizing complementary DNA by reverse transcription using RNA as a template, Means an enzyme-chain reaction technique. For the present invention, RT-PCR was performed by repeating 35 cycles of reverse transcription at 42 DEG C for 60 minutes and denaturation at 95 DEG C for 45 seconds at 95 DEG C, 1 minute at 55 DEG C, and 1 minute at 72 DEG C, At 72 ° C for 5 minutes.

본 발명에서 용어 "네스티드 중합효소 연쇄반응(Nested Polymerase Chain Reactionpolymerase chain reaction; nested PCR)"은, 목적하는 영역의 처음의 PCR산물을 주형으로 처음에 사용한 프라이머의 위치보다 양쪽 모두 안쪽으로 프라이머의 위치를 설정하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 기술을 의미하며, 이를 통해 목적 이외의 영역으로부터 유래하는 산물을 제거할 수 있다. 본 발명을 위해 PCR은 RT-PCR의 역전사반응을 제외한 나머지와 동일하게 반응시켰다.The term "nested polymerase chain reaction polymerase chain reaction (nested PCR)" in the present invention means that the position of the primer in both the inside and the outside of the primer using the first PCR product of the target region as a template , Which is a technique for performing a polymerase chain reaction. Thus, products derived from regions other than the target region can be removed. For the present invention, PCR was carried out in the same manner as the rest except for the reverse transcription of RT-PCR.

본 발명은 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 10, 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 군에서 선택되는 염기서열의 조합을 포함하되, 상기 조합은 정방향 프라이머(forward primer)가 서열번호 3 또는 서열번호 5이고, 역방향 프라이머(reverse primer)가 서열번호 10, 서열번호 14 또는 서열번호 16인 프라이머 세트를 제공한다.The present invention relates to a primer set for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection, wherein the primer set comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16 Wherein the forward primer is SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 and the reverse primer is reverse primer SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 16, Lt; / RTI >

본 발명에 따른 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트에서, 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머의 조합은 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 또는 서열번호 5 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.In the primer set for polymerase chain reaction (PCR) for wheat-stripe mosaic virus-specific detection according to the present invention, the combination of primers for RT-PCR is preferably SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: A pair of primers; Or a pair of primers consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 14.

또한, 본 발명에 따른 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트에서, 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용 프라이머의 조합은 바람직하게는 서열번호 5 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.In addition, in the primer set for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection according to the present invention, the combination of the primers for nested PCR is preferably SEQ ID NO: 5 and the sequence Lt; RTI ID = 0.0 > 16 < / RTI >

본 발명의 일 실시예에서는 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 다양하게 조합(27가지)하여(실시예 1 참조), 조합된 프라이머 세트 중 조합 4(서열번호 3 및 서열번호 16) 및 조합 7(서열번호 5 및 서열번호 14)이 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출하는데 최적의 프라이머 세트임을 확인하였고, 검정 시스템인 네스티드 프라이머 세트를 설계한 결과, 조합 4 및 조합 7에 대하여 각각 서열번호 5 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 세트가 최적의 네스티드 PCR용 프라이머 세트임을 확인하였다(실시예 2 참조).(SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 16) and combination 7 (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) of the combined primer sets by combining 27 kinds of forward primers and reverse primers 5 and SEQ ID NO: 14) were found to be optimal primer sets for detecting wheat stripe mosaic virus (WSMV). As a result of designing a nested primer set as a screening system, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: It was confirmed that the primer set consisting of No. 16 was the optimal set of primers for nested PCR (see Example 2).

이에, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a composition for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection comprising the primer set.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 키트는 양성대조구로 서열번호 17 및 돌연변이 양성대조구로 서열번호 18로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함할 수 있다.The present invention also provides a kit for polymerase chain reaction (PCR) for wheat stripe mosaic virus-specific detection comprising the primer set. Preferably, the kit according to the present invention may further comprise a plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 as a positive control and SEQ ID NO: 18 as a mutant positive control.

본 발명에 따른 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 고정밀도로 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)를 검출할 수 있고, 식물체 종자와 조직 등을 대상으로 기존 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계로 진단할 수 있다. By using the primer set, the composition including the primer set, and the kit according to the present invention, it is possible to detect wheat stripe mosaic virus (WSMV) with high precision from a plant sample in a short time without professional equipments, , It can be diagnosed with a detection limit of 1,000 times or more than the conventional method using antiserum.

이에, 본 발명은Therefore,

(a) 밀줄무늬모자이크 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;(a) performing reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) using RNA extracted from a sample to detect wheat stripe mosaic virus as a template using the primer set;

(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 상기 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및(b) performing a nested PCR using the RT-PCR product obtained from the step (a) as a template using the primer set; And

(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 밀줄무늬모자이크 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 밀줄무늬모자이크 바이러스 검출방법을 제공한다.
(c) determining the size of the nested PCR product obtained from the step (b) to determine whether the wheat stripe mosaic virus is infected.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the following examples.

[실시예][Example]

실시예 1. 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)에 특이적으로 결합하는 프라이머 설계 및 조합Example 1. Primer design and combination specifically binding to wheat stripe mosaic virus (WSMV)

1-1. 프라이머 설계1-1. Primer design

밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 진단용 프라이머 설계를 위하여 미국 국립생물정보센터로부터 WSMV의 11가지 strain과 분류학적으로 유사한 포티비리데 (Potyviridae) 4종의 염기서열을 다운로드 하였고, 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.Wheat stripe was downloaded similar Fourteen cheated to (Potyviridae) nucleotide sequence of the four kinds of the 11 kinds of strain and taxonomic of WSMV for diagnostic primer design mosaic virus (WSMV) from the National Biotechnology Information Center, specific information, the following Table 1 Respectively.

Figure 112013076557367-pat00001
Figure 112013076557367-pat00001

다운로드한 15종의 염기서열은 'fasta' format으로 정렬 한 뒤, sequence alignment program인 DNAMAN package를 사용하여 multiple alignment 하였다. 그 후 WSMV의 종 특이적인 서열을 탐색하였고, 약 9.4 Kb 중 '4,502-8,754' 부분을 대상으로 진단용 primer를 설계하였으며, 이에 대한 구체적인 프라이머 지도는 도 2에 나타내었다.
The 15 sequences were sorted in 'fasta' format and multiple alignment was performed using the sequence alignment program DNAMAN package. Then, a species-specific sequence of WSMV was searched and a diagnostic primer was designed for the portion of 4,502-8,754 of about 9.4 Kb, and a specific primer map for this was shown in FIG.

1-2. 프라이머 조합1-2. Primer combination

실시예 1-1에 의해 설계한 프라이머는 정방향 9가지와 역방향 8가지의 총 17가지로, 각각의 프라이머들의 구체적인 염기서열은 하기의 표 2에 나타내었고, 이들을 조합하여 PCR 증폭이 가능한 27가지 조합을 선발하였으며, 각각의 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR) 산물(product)의 예상 크기(length, bp)는 표 3에 나타내었다.The primers designed in Example 1-1 are nine kinds in forward direction and eight kinds in total in reverse direction. The specific nucleotide sequences of the respective primers are shown in Table 2 below, and 27 kinds of combinations And the expected size (length, bp) of the product of each RT-PCR (RTPCR) product is shown in Table 3.

Figure 112013076557367-pat00002
Figure 112013076557367-pat00002

*GenBank accession number AF057533을 기준으로 작성 * Based on GenBank accession number AF057533

Figure 112013076557367-pat00003
Figure 112013076557367-pat00003

실시예 2. 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 최적 프라이머 세트 선발 및 진단용 프라이머 은행 구축Example 2. Construction of a primer bank for screening and diagnosis of an optimum primer set of wheat stripe mosaic virus (WSMV)

2-1. 최적 프라이머 세트 선발2-1. Selection of optimal primer set

WSMV의 최적 진단용 프라이머 세트 선발을 위해 상기 실시예 1-2에서 설계한 27가지 primer 조합으로 1-4차까지의 선발 과정을 진행하였다.For the selection of the optimal diagnosis primer set for WSMV, the selection process of the 1st through the 4th primers was carried out using the 27 primer combinations designed in Example 1-2.

우선, 1차 선발에서 27가지 조합 중 5가지 조합을 선발하였다(도 3 참조). 2차 선발 대상인 유연관계 바이러스는 확보하지 못하였으며, 3차 선발 대상인 기주관련 바이러스인 Cereal chlorotic mottle virus (CCMV)와 Cucumber mosaic virus (CMV)와의 결과와 4차 선발인 옥수수 기주의 genomic DNA와의 반응에서 5가지 조합 중 2가지 조합을 선발하였다(도 4 참조). First, five combinations of 27 combinations were selected in the first selection (see FIG. 3). The results of the third selection, Cereal chlorotic mottle virus (CCMV) and Cucumber mosaic virus (CMV), and genomic DNA of the fourth selection, maize host, were not obtained. Two combinations of five combinations were selected (see FIG. 4).

1-4차 선발 결과, 밴드의 끌림이 없으며 가장 깔끔한 결과를 보인 2가지 조합 (조합 4 및 7)을 선발하였다. 선발된 조합들로 end-point PCR (희석한계 실험)을 실시한 결과, 각각 10-7 및 10-4의 민감도를 보임을 확인하였다 (도 5 참조). As a result of selecting 1-4, we selected 2 combinations (Combinations 4 and 7) that showed no banding and the most neat results. End-point PCR (dilution limit experiment) was performed with selected combinations, confirming sensitivity of 10 -7 and 10 -4 , respectively (see FIG. 5).

한편, 각 lane 별 희석 배수는 다음과 같다. Lane 1~8: WSMV 원액~10-7 희석; lane 9: negative control; lane 10~17: WSMV 원액~10-7 희석; lane 18: negative control
The dilution factor for each lane is as follows. Lane 1 ~ 8: WSMV stock solution ~ 10 -7 dilution; lane 9: negative control; lane 10 ~ 17: WSMV undiluted solution ~ 10 -7 dilution; lane 18: negative control

2-2. 2-2. 네스티드Nested 중합효소 연쇄반응( Polymerase chain reaction nestednested PCRPCR )용 )for 프라이머primer 세트 설계 Set design

상기 실시예 2-1에 의해 선발된 조합들에 대하여 검정 시스템인 nested 프라이머 조합을 설계하였으며, 상기 프라이머에 대한 구체적인 정보는 하기의 표 4에 나타내었다. 이때 주형으로 사용되는 RT-PCR의 산물은 각각 1/100 희석하여 사용하였다.The combination of nested primers, which is a verification system, was designed for the combinations selected by Example 2-1, and specific information on the primers is shown in Table 4 below. RT-PCR products used as templates were diluted 1/100 each.

Figure 112013076557367-pat00004
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Nested PCR 결과, 모든 조합에서 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다(도 6 참조). Nested PCR 프라이머는 밴드의 밝기와 두께, 비특이적인 밴드의 유무, 크기 (length) 및 선발된 조합과 산물과의 크기가 어느 정도 차이 나는 것을 고려하여 최종 선발하였다.
As a result of nested PCR, it was confirmed that bands appeared in all combinations (see FIG. 6). Nested PCR primers were finally selected considering the difference in the brightness and thickness of the bands, the presence or absence of nonspecific bands, the length, and the size of the selected combination.

2-3. 2-3. 프라이머primer 은행 구축 Bank construction

상기 실시예 2-1 및 2-2 실험 결과, 조합 4와 7을 WSMV 최종 진단용 프라이머 조합으로 선발하였고, 검정 시스템인 nested primer 역시 각각 한 세트씩 선발하였다. WSMV를 검사하기 위한 최종 진단용 primer 조합, nested primer 및 양성대조구의 크기를 하기 표 5에 나타내었고, 각 프라이머의 정보를 하기 표 6에 나타내었다.As a result of Examples 2-1 and 2-2, Combinations 4 and 7 were selected by a combination of primers for the final diagnosis of WSMV, and nested primers as a screening system were also selected one by one. The final diagnostic primer combinations, nested primers, and positive control sizes for testing WSMV are shown in Table 5, and the information of each primer is shown in Table 6 below.

Figure 112013076557367-pat00005
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Figure 112013076557367-pat00006
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실시예 3. 밀줄무늬모자이크 바이러스(WSMV)의 검출 및 양성대조구 제작Example 3. Detection of wheat stripe mosaic virus (WSMV) and production of positive control

3-1. 3-1. WSMVWSMV 의 검출Detection

실시예 2에 의해 얻어진 최종 WSMV 검출용 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 one-step 또는 two-step RT-PCR로 검사를 수행한 결과, 프라이머들이 각각의 상보적 위치에 결합(binding)하여 밴드를 형성함을 확인할 수 있었고, 이때 각각의 서열위치는 도 7 및 도 8에 나타내었다. 보다 구체적으로 즉, 도 7은 WSMV진단용 프라이머 세트 1 (N20/C80, 833 bp)의 결합부위([ ]부분)를 나타낸 것이고, 도 8은 WSMV 진단용 primer set 2 (N30/C70, 671 bp)의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
As a result of performing one-step or two-step RT-PCR using primer set 1 and set 2 for final WSMV detection obtained in Example 2, primers were bound to respective complementary positions, And the positions of the respective sequences are shown in FIGS. 7 and 8. FIG. More specifically, Fig. 7 shows the binding sites ([(N20 / C80, 833 bp)] of the WSMV diagnostic primer set 1 FIG. 8 shows the binding site of the WSMV diagnostic primer set 2 (N30 / C70, 671 bp) ([ ] Section).

3-2. 양성대조구 제작3-2. Production of positive control

양성대조구(positive control)로 사용할 수 있도록 진단용 프라이머가 설계된 전체 영역을 포함하는 플라스미드(plasmid)를 제조하였다. 도 9는 WSMV 진단용 프라이머 구간을 포함하는 양성대조구의 산물과 최종 선발된 프라이머 조합들의 PCR 결과를 나타낸 것이고, 도 10은 WSMV 양성대조구 (N20/C50, 2,013 bp; 서열번호 18)에서의 결합부위([ ] 부분)를 나타낸 것이다.
A plasmid containing the whole region in which a diagnostic primer was designed to be used as a positive control was prepared. Figure 9 shows the PCR result of the positive control product containing the WSMV diagnostic primer section and the final selected primer combinations, Figure 10 shows the PCR result of the binding site in the WSMV positive control (N20 / C50, 2,013 bp; SEQ ID NO: 18) [ ] Section).

3-3. 돌연변이-양성대조구 제작3-3. Mutation - positive control production

WSMV 검출 시 양성대조구의 오염으로 인한 거짓양성이 나타날 경우를 대비하여 plasmid 서열의 일부를 변형한 돌연변이-양성대조구 (mutation positive control)(서열번호 19)를 제작하였다. 도 11은 WSMV 돌연변이-양성대조구 (N20/C80, 840 bp)에서의 결합부위([ ] 부분)과, Nested 프라이머 결합부위(< > 부분)와, 염기서열 삽입에 의한 돌연변이부위(

Figure 112013076557367-pat00007
부분)를 나타낸 것이다.A mutation positive control (SEQ. ID. NO. 19) was prepared by modifying a part of the plasmid sequence in case of false positives due to contamination of the positive control during WSMV detection. FIG. 11 shows the binding sites ([SEQ ID NO: 1]) in the WSMV mutation-positive control (N20 / C80, 840 bp) ] Portion) and a nested primer binding site (< &Lt; / RTI &gt; part), and a mutation site
Figure 112013076557367-pat00007
Section).

돌연변이-양성대조구를 사용할 때에는 WSMV 최종 진단용 프라이머 세트 1(조합 4)을 사용하여야 하며, nested 검정 역시 set 1의 nested 프라이머를 사용해야 한다(표 6 참조). 제작한 돌연변이-양성대조구를 positive control로 사용한다면, 검사 후에 양성반응이 나타난 시료의 염기서열 분석 할 때, 그것이 진짜 바이러스에 감염되어 있는 시료인지 우리의 양성대조구로부터 오염이 된 것인지를 판단 할 수 있을 것이다. 종 내에는 다양한 주(strain)가 있으며, 일부가 치환(substitution)되어 염기서열 확인 시 산물의 크기가 조금 차이가 있을 수 있다.
When using a mutation-positive control, the WSMV final diagnostic primer set 1 (combination 4) should be used, and the nested test should also use set 1 nested primers (see Table 6). If the mutant-positive control is used as a positive control, it is possible to determine whether it is a sample that has been infected with the real virus or contaminated from our positive control when the sample is subjected to a positive reaction after the test will be. There are various strains in the species, some of which are substituted, and the size of the products may be slightly different when the sequence is checked.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> Animal and Plant Quarantine Agency <120> PRIMER SET FOR DETECTING WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS AND THE USE THEREOF <130> PB13-11401 <160> 19 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N10 <400> 1 ttgttggcat ttggactc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C10 <400> 2 acccatcctg gaagtaagg 19 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N20 <400> 3 tggcgatgaa gatgtcag 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C20 <400> 4 ggtgctggaa acactaaac 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N30 <400> 5 gcgtggtaac gaatacacat acta 24 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C30 <400> 6 tcctttgtgt cggcatta 18 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N40 <400> 7 ggctaatagt tgggaacata ctct 24 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C40 <400> 8 gaagtggagt gattgaactg tc 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N50 <400> 9 catagtagca gtagcagacc taa 23 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C50 <400> 10 aacacacttc atcagtccc 19 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N60 <400> 11 gaacttcaag gctatcgc 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C60 <400> 12 tgccaactaa ccaagtcg 18 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N70 <400> 13 tcaataagtt caacggagg 19 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C70 <400> 14 ttctcctctc tgttcctcat a 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N80 <400> 15 ttgacgaggc ttaccgta 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-C80 <400> 16 ccatttctgt gaaggcttt 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSMV-N90 <400> 17 acccgaacgg atttagga 18 <210> 18 <211> 2013 <212> DNA <213> Wheat streak mosaic virus <400> 18 tggcgatgaa gatgtcagca aatcctgaag atgtgggaac catattgtat atggttgagc 60 aagcgctaat aagtgaaaag acgaaactgg agaatttaac ccaggcattc cagcagcaac 120 aatcaacata ttgcagcgtg ctcatcccta attttaatgt tgctggtcgg ctaacacagg 180 caatggatcg cataagaaag aatgtttctg tgctgcaaca ccagaaaaca gctctcgaaa 240 aggcggcagt gacttacgac tacacgaagt tagttgagct ccttgatgaa aatccaagca 300 tagcttccca tgtgtcatac caggctgggc cagcaaaatt cattgatgaa ttcatattgg 360 agaagcgcga ttatgggtgg ctaccatatc ttgcagtagg aactgcgtgt gcaattgctg 420 gcacaacact tgtaatgatg tactaccgtc gcatgaagcg tagtgtcaag ttcgagggca 480 aagcagcacg caacaggagt gcaaaacgac aatcagcaag agaccaaaag atggagcgtg 540 gtaacgaata cacatactac gatgctggtg acaccttgta taatggagtt caagagaata 600 tgaatcatgc accagactgg accgatcgga ttaagaagaa gactcatgca tacgctatgc 660 aatttggtag ggaagtacca aagactgaaa cacagcgatc ctcacaatac tggcacttct 720 acggttttga tccaaagatg tatgactcag tcgaattcaa ggacatagca gcaaacttct 780 cagtgcacca 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acagaaatgg 840                                                                          840

Claims (8)

밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 세트;
서열번호 5 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트; 및
서열번호 5 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 프라이머 세트.
As a primer set for polymerase chain reaction (PCR) for wheat-stripe mosaic virus-specific detection,
Wherein the primer set comprises a primer set consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 16;
A primer set consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 14; And
A primer set selected from the group consisting of primers set forth in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 16;
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
The primer set according to claim 1, wherein the primer set is a primer set consisting of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 16, and the primer set is for reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
The primer set of claim 1, wherein the primer set is a primer set consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 14, and the primer set is for RT-PCR.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 16으로 이루어진 프라이머 세트이고, 상기 프라이머 세트는 네스티드 중합효소연쇄반응(nested PCR)용인 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
The primer set according to claim 1, wherein the primer set is a primer set consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 16, and the primer set is a nested PCR.
제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 검출을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 조성물.
A composition for polymerase chain reaction (PCR) for wheat-stripe mosaic virus-specific detection comprising a primer set according to claim 1.
제1항에 따른 프라이머 세트를 포함하는, 밀줄무늬모자이크 바이러스 특이적 진단을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
A kit for polymerase chain reaction (PCR) for wheat-stripe mosaic virus-specific diagnosis comprising a primer set according to claim 1.
제6항에 있어서, 양성대조군으로 서열번호 17 및 돌연변이 양성대조군으로 서열번호 18로 이루어진 염기서열을 포함하는 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 중합효소연쇄반응(PCR)용 키트.
7. The kit for polymerase chain reaction (PCR) according to claim 6, further comprising a plasmid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17 as a positive control and SEQ ID NO: 18 as a mutation positive control.
(a) 밀줄무늬모자이크 바이러스를 검출하고자 하는 샘플로부터 추출한 RNA를 주형으로 제2항 또는 제3항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 얻어진 RT-PCR 산물을 주형으로 제4항에 따른 프라이머 세트를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄반응(nested PCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)로부터 얻어진 nested PCR 산물의 크기를 확인하여 밀줄무늬모자이크 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는, 밀줄무늬모자이크 바이러스 검출방법.(a) performing reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) using RNA extracted from a sample to detect wheat stripe mosaic virus as a template using the primer set according to (2) or (3);
(b) performing a nested PCR using the RT-PCR product obtained from the step (a) as a template and using the primer set according to claim 4; And
(c) determining the size of the nested PCR product obtained from the step (b) to determine whether the wheat stripe mosaic virus is infected.
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