KR101508733B1 - Biodegradable polymeric matrialsfor for tissue regeneration and process for producing thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조직 재생용 생분해성 고분자 제제는 생체재료인 실크단백질과 분해제인 4-헥실레조르시놀을 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 실크단백질을 비로한 생체재료의 생체 적합성을 높이고, 우수한 생분해성을 나타내는 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법이 제공된다.The present invention relates to a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration and a method for producing the same.
The biodegradable polymer preparation for tissue regeneration of the present invention is characterized by containing a silk protein as a biomaterial and 4-hexyl resorcinol as a decomposing agent.
According to the present invention, there is provided a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration, which exhibits biocompatibility of a biomaterial based on a silk protein ratio and exhibits excellent biodegradability, and a method for producing the same.

Description

조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법{BIODEGRADABLE POLYMERIC MATRIALSFOR FOR TISSUE REGENERATION AND PROCESS FOR PRODUCING THEREOF}TECHNICAL FIELD [0001] The present invention relates to a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration,

본 발명은 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 특히 생체재료의 생체적합성을 높여줌과 동시에 생분해성을 나타내는 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration and a production method thereof, and more particularly to a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration, which exhibits biodegradability while enhancing biocompatibility of biomaterials and a method for producing the same.

최근 생명공학 분약 중에서도 조직의 치료 및 재생을 위한 조직공학 분야가 발달하고 있다. 여기서 조직공학이란 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하고, 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포의 배양을 통하여 필요한 양만큼 증식시키는 생분해성 고분자 지지체에 심어 일정기간 체외 배양한 뒤 이 하이브리드형 세포/고분자 구조물을 다시 인체 내에 이식하는 것이다.Recently, tissue engineering fields for the treatment and regeneration of tissues have been developed among biotechnological agents. Here, tissue engineering refers to a method of collecting the necessary tissues from the body of a patient, separating the cells from the tissue, culturing the cells in a biodegradable polymer scaffold for growing the separated cells, / Implant the polymeric structure back into the human body.

이식 후 세포들은 대부분의 조직이나 장기의 경우 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체 내의 혈관이 자라 들어와 혈액이 공급이 이루어지면 세포들이 증식 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 지지체는 그동안 분해되어 없어지게 되는 기법을 응용하는 것이다.After transplantation, most tissues or organs are fed with oxygen and nutrients by diffusion of body fluids until new blood vessels are formed. When blood vessels in the body grow and blood is supplied, cells multiply and differentiate into new tissues and organs And the polymer scaffold is disintegrated.

이러한 조직공학용 지지체의 재료의 주된 요건은 생분해성과 생체적합성의 조건을 만족하여야 하며 면역거부 반응이 없어야 한다. The main requirement for the materials of such tissue scaffolds should be biodegradability and biocompatibility and should be free of immune rejection.

폴리(α-히드록시에스테르), 즉 폴리락트산(Poly lactic acid), 폴리글리콜산(Polyglycolic acid) 및 폴리락트산-글리콜산(Poly lactic acid-Glycollic acid) 공중합체는 생체재료 및 조직공학 기법을 이용한 조직 재생용 담체로 흔히 사용되고 있는 제제이다. 그러나 이들은 가수분해시 생성되는 락트산(Lactic acid) 및 글리콜산(Glycollic acid)으로 인해 고분자 제제 주위의 pH가 감소하여 염증반응 및 조직독성을 유발할 가능성이 있다.Poly (lactic acid), poly (lactic acid) and poly (lactic acid) -glycollic acid copolymers have been used in biomaterials and tissue engineering techniques It is a formulation commonly used as a tissue regeneration carrier. However, they are likely to cause inflammation and tissue toxicity due to the decrease in the pH around the polymer preparation due to lactic acid and glycolic acid produced during hydrolysis.

뿐만 아니라 혈관조직의 부실 또는 대사능력이 낮아 산분해산물을 제거할 능력이 떨어지게된다면, 국소적으로 독성을 일으킬 가능성이 더 커지게 된다. In addition, if the vascular tissue is poorly or poorly metabolized, and the ability to remove acid seafood is reduced, the potential for local toxicity is greater.

이러한 부작용을 줄이기 위하여 현재 하이드록시에퍼타이트(Hydroxyapatite,HA) 및 염기성 염을 고분자 매트릭스에 도입하려는 시도가 시행되고 있다.Currently, attempts have been made to introduce hydroxyapatite (HA) and basic salts into polymer matrices to reduce these side effects.

다시말해 상기 하이드록시에퍼타이트(Hydroxyapatite,HA) 및 염기성 염의 염기성 분해산물은 고분자의 산분해산물을 중화시켜 pH 감소로 인한 조직의 독성을 감쇠켜 생체적합성을 증진할 수 있다. 그러나 이들 염기성 염은 고분자 매트릭스로부터 용출되어 나와 장기간 도안 산주와효과를 유지할 수가 없으며 또한 이들은 조직재생에 유리한 작용을 하지 못하는 문제점이 있다. In other words, the basic decomposition products of hydroxyapatite (HA) and basic salts can neutralize the acidic decomposition products of the polymer, thereby attenuating the toxicity of the tissue due to the decrease in pH and improving the biocompatibility. However, these basic salts are eluted from the polymer matrix and can not maintain long-term patterning and effects, and they have a problem in that they do not have a favorable effect on tissue regeneration.

이에, 산의 의한 조직독성을 감소시켜 생체적합성을 높여줌과 동시에 생분해성이 높은 고분자 제제에 대한 연구가 시급한 실정이다.Therefore, it is urgently required to study a biodegradable polymer preparation that increases biocompatibility and reduces tissue toxicity caused by acid.

관련 선행기술로는 일본공개특허 특개2004-18757호(공개일: 2003년 12월 31일, 명칭: 생분해성 생체고분자재료, 그 제조방법 및 이 고분자재료로 이루어지는 기능성 소재)가 있다.
Related Prior Art Japanese Patent Laid-Open No. 2004-18757 (published on Dec. 31, 2003, entitled: Biodegradable Biopolymer Material, Manufacturing Method Thereof and Functional Material Made of Polymer Material) is available.

본 발명의 목적은 생체 적합성이 높으면서 생분해성이 우수한 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is to provide a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration having high biocompatibility and excellent biodegradability and a method for producing the same.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not intended to limit the invention to the particular embodiments that are described. It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory and are not restrictive of the invention, There will be.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 조직 재생용 생분해성 고분자 제제는 생체재료인 누에 유래 실크 단백질과 분해제인 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)를 포함하는 것이 특징이다.To achieve the above object, the biodegradable polymer preparation for tissue regeneration of the present invention comprises silk protein derived from silkworm, which is a biomaterial, and 4-hexylresorcinol, which is a decomposing agent.

상기 실크단백질은 실크 피브로인인 것이 특징이다.The silk protein is silk fibroin.

상기 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)은 상기 실크단백질 중량을 기준으로 0.001~10 중량%를 포함하는 것이 특징이다.The 4-hexylresorcinol is characterized by containing 0.001 to 10% by weight based on the weight of the silk protein.

상기 조직 재생용 생분해성 고분자 제제에는 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)가 더 포함되는 것이 특징이며, 상기 실크단백질 중량을 기준으로 1~5중량%를 포함되는 것이 특징이다.The biodegradable polymer preparation for tissue regeneration further comprises Tricalcium phosphate (TCP), which is contained in an amount of 1 to 5% by weight based on the weight of the silk protein.

본 발명의 본 발명의 조직 재생용 생분해성 고분자 제제의 제조방법은 누에고치를 정선한 후 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는 제1단계 및, 상기 실크 피브로인을 용해한 후 투석하여 염이 제거된 실크 피브로인 용액을 제조하는 제2단계 및, 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)을 에탄올로 용해하여 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol) 용액을 제조하는 제3단계 및, 상기 제2단계에서 제조된 염이 제거된 실크 피브로인 용액에 상기 제3단계에서 제조한 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol) 용액을 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 이를 성형하여 조직 재생용 생분해성 고분자 제제를 제조하는 제4단계를 포함하는 것이 특징이다.
The method for producing a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration according to the present invention comprises a first step of selecting a silkworm cocoon and then removing sericin to obtain silk fibroin and a step of dissolving the silk fibroin and then dialyzing to obtain a silk fibroin (4-hexylresorcinol) is dissolved in ethanol to prepare a solution of 4-hexylresorcinol, and a third step of preparing a solution of 4-hexylresorcinol The 4-hexylresorcinol solution prepared in the third step is mixed with the silk fibroin solution from which the salt has been removed to prepare a mixed solution, which is then molded to form a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration And a fourth step of manufacturing the semiconductor device.

본 발명에 의해, 실크단백질을 비로한 생체재료의 생체 적합성을 높이고, 우수한 생분해성을 나타내는 조직 재생용 생분해성 고분자 제제 및 그 제조방법이 제공된다.
According to the present invention, there is provided a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration, which exhibits biocompatibility of a biomaterial based on a silk protein ratio and exhibits excellent biodegradability, and a method for producing the same.

도 1은 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol) 처리후 시간별 DAGK의 단백질 발현을 나타낸 도면이다.
도 2는 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol) 처리후 시간별 DAGK 유전자 발현을 나타낸 도면이다.
도 3A는 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)의 농도별 처리 후 포스파티딘산(Phosphatidic acid) 억제정도를 나타낸 도면이다.
도 3B는 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)의 농도별 처리 후 디아실글리세롤(Diacyllglcerol) 증가정도를 나타낸 도면이다.
도 4A는 조직학적 관점에서 대식세포에서 다핵거대세포로의 형성 억제능을 나타낸 도면이다.
도 4B는 대식세포에서 다핵거대세포로 형성이 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)에 의한 억제능을 농도별로 나타낸 그래프이다.
도 5는 이식재에 대한 FT-IR 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 각 이식 재료에 따른 주사전자현미경 이미지 사진을 나타낸 도면이다.
도 7A는 동물실험한 시편을 미세전산화 단층 촬영한 도면이다.
도 7B는 동물실험한 시편에서 각 이식 재료 당 골 형성 정도를 나타낸 도면이다.
도 8은 동물실험에서 이식편을 넣고 4주째 대식세포의 형성정도와 잔존 이식재의 양을 조직학적으로 관찰한 도면이다.
도 9는 동물실험에서 이식편을 넣고 8주째 대식세포의 형성정도와 잔존 이식재의 양을 조직학적으로 관찰한 도면이다.
도 10은 동물실험에서 이식재의 잔존량을 평가한 도면이다.
도 11은 대식세포에서 4-헥실레조르시놀(4-Hexylresorcinol)의 작용 기전을 설명한 도면이다.FIG. 1 is a graph showing protein expression of DAGK over time after treatment with 4-hexylresorcinol. FIG.
FIG. 2 is a graph showing DAGK gene expression after treatment with 4-Hexylresorcinol. FIG.
FIG. 3A shows the degree of inhibition of phosphatidic acid after treatment with 4-hexylresorcinol. FIG.
FIG. 3B is a graph showing the degree of increase in diacylglycerol after treatment with 4-hexylresorcinol. FIG.
FIG. 4A is a diagram showing the ability of macrophages to inhibit the formation of polynuclear giant cells from a histological point of view.
FIG. 4B is a graph showing concentration-dependent inhibition by 4-hexylresorcinol of macrophages to polynuclear giant cells. FIG.
Fig. 5 is a view showing FT-IR results for a graft material. Fig.
Fig. 6 is a scanning electron microscope image photograph according to each graft material. Fig.
FIG. 7A is a micro CT sectional view of an animal test piece. FIG.
FIG. 7B is a diagram showing the degree of bone formation per each graft material in an animal test specimen.
FIG. 8 is a histological view of the degree of formation of macrophages and the amount of residual graft material at 4 weeks after implantation in an animal experiment.
FIG. 9 is a histological view of the degree of formation of macrophages and the amount of residual graft material at 8 weeks after implantation in an animal experiment.
Fig. 10 is an evaluation of the remaining amount of the implant in an animal experiment. Fig.
11 is a diagram illustrating the mechanism of action of 4-Hexylresorcinol in macrophages.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.The terms, techniques, and the like described in this specification are used in the meaning commonly used in the technical field to which the present invention belongs, unless otherwise specified.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 생체재료로써 누에 유래 실크 단백질을 사용하며 이의 생분해성을 높여주고 이종 단백질에 대한 이물 반응을 줄이기 위해 소독약과 식품첨가제로만 쓰이던 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)을 포함하여 조직 재생용 생분해성 고분자 제제를 제조하게 되었다.The present inventors used 4-hexylresorcinol (4-HR), a silk protein derived from silkworm as a biomaterial, which was used as a disinfectant and a food additive to increase the biodegradability of the silkworm silk protein and to reduce the foreign body reaction to heterologous proteins To prepare a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration.

생체재료란 조직의 기능을 대체하기 위하여 체내에서 간헐적 또는 지속적으로 주위 조직과 직접 접촉하며 체액에 노출되는 인공적인 물질로서 생체의 기능을 치환, 대체하기 위하여 사용되는 물질 또는 골격계 손상을 회복시키기 위하여 사용되는 물질을 의미한다. Biomaterial is an artificial substance that is exposed to body fluids in direct contact with surrounding tissues intermittently or continuously in the body to replace the function of tissue and is used to replace materials used for replacing or replacing the functions of living bodies or to repair skeletal system damage Of the substance.

이에 생체재료는 어떤 형태이던지 인체와 접촉하므로 반드시 생물학적으로 적합해야만 한다. 일반적으로 의료용으로 사용되는 재료는 주변 조직과의 생물학적 반응 형태에 따라 이식 후 면역반응을 일으키지 않으면서 형태와 구조를 유지하는 생체불활성, 주위 조직과 직접 결합하여 생물학적 기능을 제공하는 생체활성 및 이식 후 서서히 체내에서 분해되어 재생하는 자가 조직으로 치환되는 생분해성 재료로 나누어 볼 수 있다.Biomaterials must be biologically compatible because they come into contact with the body in whatever form. In general, materials used for medical use are inactive in vivo which maintains shape and structure without causing post-transplantation immune reaction depending on the type of biological reaction with surrounding tissues, bioactivity that provides biological functions by direct binding with surrounding tissues, Biodegradable materials that are slowly degraded and replaced by self-renewing tissues in the body.

이와 같이 생체재료와 인체조직과의 반응은 숙주의 면역 반응에 관련된 생체안정성과 재료의 성질에 관련된 생체적합성을 고려해야 한다. Thus, the reaction between the biomaterial and the human tissue must take into account the biostability associated with the host immune response and the biocompatibility associated with the nature of the material.

이에, 생체재료로는 생체 재료의 이식 후 발열, 염증, 항원성, 발암성 반응이 일어나지 않으며 체내에 이식될 경우 해부학적 크기와 형태가 수복되어야 할 부위와 정확하게 일치하여야 하며, 재료의 탄성계수(Young's modulus)와 같은 기계적 성질도 본래 조직과 가능한 같아야 지속적인 인체 운동에 의해 유발되는 물리적 부하에 이해 유발되는 기계적 열화와 피로를 피하여 유지할 수 있으며, 이식 후 생체재료와 조직의 접촉경게부위는 생물기능 부전을 발생을 일으키지 않는 소재를 사용한다. Therefore, when biomaterials are transplanted into the body, there is no fever, inflammation, antigenicity, or carcinogenic reaction after transplantation of the biomaterial. The anatomical size and shape should be exactly the same as the site to be restored. Young's modulus) should be as close as possible to the original tissue to maintain mechanical fatigue and avoiding the mechanical load induced by sustained human motion, and the contact area of biomaterials and tissues after implantation may be biodegradable The material which does not cause the generation of the foreign matter is used.

이에 본 발명은 생체재료로 성숙된 누에의 유충이 토사하여 만든 섬유 형상 시료로서, 화학시약이나 효소의 작용을 받아도 강한 약품 저항성을 나타내며 생체내에서의 비흡수성 재료로 분류되는 물질인 누에 유래 실크단백질을 사용한다.Therefore, the present invention relates to a silk protein-derived silk protein, which is a fibrous sample produced by soil larvae of a silkworm matured as a biomaterial, which exhibits strong resistance to chemicals even under the action of a chemical reagent or an enzyme and is classified as a non- Lt; / RTI >

다시 말해 상기 실크 단백질은 생체내에서 생분해성을 제어할 수 있고, 생체안전상의 문제도 없고, 제조가격이 저렴한 생분해성 재료임과 동시에 분해생산물에 세포독성이 없으며 또한 부산물로서 포름알데히드 등과 같은 유해물질을 발생시키지 않는 장점을 갖고 있다. 그러나, 단기간에 분해되지 않고 봉합 후에도 체내에 남아 생체재료로써의 이용에 다소 문제점이 있다. 또한 다른 고분자 소재와 유사하게 생체 내 이식 시에 이물 반응을 유도하고 그 증거로 다른 고분자에서 관찰되는 것과 마찬가지로 이물 반응(Foreign body reaction)에 의한 다핵거대세포 (Multinucleated giant cell)가 다수 출현하게 된다. 체내에 이식되는 재료에 대한 이물 반응은 생체 재료가 체내에서 목적한 바의 기능을 수행하는데 중요한 방해 요인이며 최근 조직공학에서는 다핵거대세포의 출현을 억제할 수 있는 기술 개발에 많은 노력을 기울이고 있다. In other words, the silk protein is a biodegradable material which can control biodegradability in vivo, has no biosafety problem, and is low in production cost, and at the same time, has no cytotoxicity to decomposition products and also has harmful substances such as formaldehyde It is advantageous in that it does not generate the light. However, it is not decomposed in a short period of time, and remains in the body even after suturing, which causes some problems in utilization as biomaterial. In addition, similar to other polymer materials, multinucleated giant cells due to foreign body reaction appear in the same way as those observed in other polymers. The foreign body reaction to the material to be implanted in the body is an important obstacle to the function of the biomaterial in the body. Recently, in the tissue engineering, much efforts are being made to develop a technique that can inhibit the appearance of polynucleic giant cells.

이에, 다핵거대세포의 출현을 억제하고 동시에 우수한 생분해성을 겸비한 제제를 제조하기 위해 분해제로 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorinol)을 포함하여 구성된다.Therefore, it is composed of 4-hexylresorinol as a decomposing agent in order to inhibit the appearance of polynuclear giant cells and to produce a preparation having excellent biodegradability.

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorinol)은 이소프레노이드 리피드(isoprenoid lipid)의 일종으로서, 종래 장염의 치료 목적으로 올리브유에 타서 복용하거나 최근에는 바다새우의 탈색을 막을 목적으로 첨가하거나 식품과 방부제의 소재로 흔히 사용되어왔다. 또한, 상기 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorinol)은 항원-항체 상호작용을 억제할 수 있으며, 미생물의 막 투과성도 변경시킬 수 있다.4-hexylresorinol is a type of isoprenoid lipid, which is conventionally used for the treatment of enteritis, in olive oil or in recent years for the purpose of preventing discoloration of sea shrimp, Has been commonly used as a material. In addition, the 4-hexylresorinol can inhibit antigen-antibody interactions and change the membrane permeability of microorganisms.

디아실글리세롤이산화효소(Diacylglycerol kinase,DAGK)은 대장균 및 진핵세포에서 신호전달에 관여하는 효소의 일종으로써 대식세포의 거대 세포 형성을 촉진하는 것으로 알려져있다. 디아실글리세롤이산화효소(Diacylglycerol kinase,DAGK)는 대식세포 내에서 디아실글리세롤 (Diacylglycerol,DAG)을 인산화시켜서 포스파티딕산 (Phosphatidic acid,PA)를 생성하는 효소이다. 포스파티딕산(Phosphatidic acid,PA)는 염증성사이토카인(proinflammatory cytokines)의 분비를 촉진하는 데, 포스파티딕산(Phosphatidic acid,PA)가 대식세포에서 분비를 촉진시키는 염증성 사이토카인(Proinflammatory cytokines)은 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha), 인터루킨-1β(Interleukin-1beta), 인터루킨-6(Interleukin-6), 일산화질소(Nitric oxide), 프로스타글란딘E2(prostaglandin E2)가 있다. 포스파티딕산(Phosphatidic acid,PA)는 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha)의 분비 촉진을 통하여 대식세포에서 MMP-9의 발현을 증가시키기도 한다. 따라서 포스파티딕산(Phosphatidic acid,PA)의 형성 촉진은 주변 조직의 염증 반응을 심화시키고 동시에 거대세포의 형성을 촉진하게 한다. 따라서 디아실글리세롤이산화효소(Diacylglycerol kinase,DAGK) 억제제는 염증 반응을 줄이고 동시에 거대세포 형성 억제를 위한 것이다. 또한 디아실글리세롤이산화효소(Diacylglycerol kinase,DAGK) 억제제는 디아실글리세롤 (Diacylglycerol,DAG)의 세포 내 축적을 상대적으로 돕게 되는 데, IgG-매개성 식세포작용(IgG-mediated phagocytosis는 칼슘(calcium)에 비의존적이고 디아실글리세롤(Diacylglycerol,DAG)에 의하여 촉진된다. 따라서 대식세포 내에서 디아실글리세롤(Diacylglycerol,DAG)의 증가는 대식세포의 식작용(phagocytosis)를 촉진하여 생체 재료의 분해를 촉진하게 된다 (도 11). Diacylglycerol kinase (DAGK) is an enzyme involved in signal transduction in E. coli and eukaryotic cells, and is known to promote macrophage formation of macrophages. Diacylglycerol kinase (DAGK) is an enzyme that phosphorylates diacylglycerol (DAG) in macrophages to produce phosphatidic acid (PA). Phosphatidic acid (PA) promotes the secretion of proinflammatory cytokines. Proinflammatory cytokines, which promote the secretion of phosphatidic acid (PA) from macrophages, Interleukin-1beta, Interleukin-6, Nitric oxide, and prostaglandin E2 are known to be involved in the pathogenesis of this disease. Phosphatidic acid (PA) also increases the expression of MMP-9 in macrophages by promoting the secretion of tumor necrosis factor-alpha (α). Thus, the promotion of the formation of phosphatidic acid (PA) deepens the inflammatory reaction of surrounding tissues and simultaneously promotes the formation of giant cells. Therefore, inhibitors of diacylglycerol kinase (DAGK) are intended to reduce the inflammatory response and simultaneously inhibit the formation of giant cells. In addition, inhibitors of diacylglycerol kinase (DAGK) are relatively assisted in the accumulation of diacylglycerol (DAG) in the cells, and IgG-mediated phagocytosis And is promoted by diacylglycerol (DAG). Therefore, the increase of diacylglycerol (DAG) in macrophages promotes phagocytosis of macrophages, thereby promoting decomposition of biomaterials 11).

본 발명에서 사용된 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)은 RAW264.7 세포(대식세포)에 포함된 디아실글리세롤이산화효소(Diacylglycerol kinase,DAGK) 유전자 발현의 억제능을 나타낸다. 이에 따라 디아실글리세롤 (Diacylglycerol,DAG)의 세포 내 농도는 증가하였고 포스파티딕산(Phosphatidic acid,PA)의 세포 내 농도는 감소하였다. 또한 세포 실험에서 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)의 투여는 대식세포의 거대세포 형성을 억제하였다. 이어지는 동물 실험에서 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)을 함유한 실크 소재의 경우 생체 내 분해 속도가 증가하였고 이에 따른 신생골의 형성도 증가하였다. The 4-hexylresorcinol (4-HR) used in the present invention shows the inhibitory effect of the expression of diacylglycerol kinase (DAGK) gene contained in RAW264.7 cells (macrophages). Thus, the intracellular concentration of diacylglycerol (DAG) was increased and the intracellular concentration of phosphatidic acid (PA) was decreased. In addition, administration of 4-hexylresorcinol (4-HR) inhibited the macrophage formation of macrophages in cell experiments. In subsequent animal experiments, the rate of degradation in silk containing 4-hexylresorcinol (4-HR) increased in vivo and the formation of new bone was increased.

이에, 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)은 실크 소재에 의한 생체 내 거대세포 출현을 억제하고 대식세포의 활성화를 통한 실크 소재의 생분해성을 촉진하였으며 결과적으로 실크 이식재에 대한 신생골 형성을 촉진하였음을 알 수 있다.Therefore, 4-hexylresorcinol (4-HR) inhibited the appearance of giant cells in vivo by silk material and promoted the biodegradability of silk material through activation of macrophages. As a result, It is evident that the new bone formation was promoted.

이에, 상기 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)은 상기 실크 단백질 중량을 기준으로 0.1~10 중량% 함유하는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)의 함량이 0.5중량%인 것이 좋다. Thus, the 4-hexylresorcinol (4-HR) is preferably contained in an amount of 0.1 to 10% by weight based on the weight of the silk protein, more preferably 4-hexylresorcinol , 4-HR) is 0.5% by weight.

상기 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)의 함량이 0.1 중량% 미만으로 함유될 경우 목적하는 상기 실크단백질의 생분해성을 높여주는 역할과 생체 재료에 대한 이물 반응 억제 능력이 미흡하여 생체내 생분해성이 더디고 염증 반응을 억제할 수 없어서 조직재생능이 떨어지게 되며, 10 중량%를 초과하여 함유될 경우에는 오히려 세포독성을 일으킬 우려가 있다.If the content of 4-hexylresorcinol (4-HR) is less than 0.1% by weight, the silk protein of the present invention may have insufficient ability to increase the biodegradability of the silk protein and inhibit the foreign matter reaction against the biomaterial The biodegradability in vivo is slow and the inflammatory reaction can not be inhibited and the tissue regeneration ability is deteriorated. If it is contained in an amount exceeding 10% by weight, it may cause cytotoxicity.

또한, 본 발명은 뼈 형성을 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있는 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)를 추가로 더 포함하기도 한다. 이때, 상기 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)는 염산 용액에 녹여 사용하며, 그 함량은 상기 실크 단백질 중량을 기준으로 1~5 중량% 함유하는 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 2중량%인 것이 좋다. In addition, the present invention may further include a calcium phosphate (TCP) which is known to have an effect of promoting bone formation. At this time, the calcium phosphate (TCP) is dissolved in a hydrochloric acid solution. The content of the calcium phosphate is preferably 1 to 5 wt%, more preferably 2 wt%, based on the weight of the silk protein.

상기 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)의 함량이 1 중량% 미만으로 함유될 경우 목적하는 실크 단백질만을 함유할 경우와 대비하여 더 상승된 뼈 형성 촉진 효과를 기대하기 어려우며, 5 중량%를 초과하여 함유될 경우에는 오히려 세포독성을 일으킬 우려가 있다.
If the content of the calcium phosphate (TCP) is less than 1% by weight, it is difficult to expect a promoting effect of bone formation, which is higher than that of the desired silk protein alone, and more than 5% There is a risk of causing cytotoxicity.

이와 같이 상기 생체 적합한 생체재료인 실크단백질을 사용함으로써 인체에 무해함과 동시에 우수한 생분해성을 갖도록 하는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)을 포함함으로 상기 생체재료의 생분해성은 높아지고 이로 인해 조직 재생능을 높여주는 조직 재생용 생분해성 고분자 제제가 제공되게 된다.By using 4-hexylresorcinol (4-HR) which is harmless to the human body and has good biodegradability by using the silk protein, which is a biocompatible biomaterial, the biodegradability of the biomaterial is increased As a result, a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration that enhances tissue regeneration capability is provided.

이러한 생분해성 고분자 제제는 성형과정에 따라 다공성을 갖거나, 필름상으로 제조하거나, 분말형태로 제조하는 등 용도에 맞게 성형하여 용도별 제형을 갖추게 된다.
Such a biodegradable polymer preparation may be formulated according to the intended use, such as having porosity according to the molding process, producing it in the form of a film, or producing it in a powder form.

하기 실시예 및 실험예에 의해서 보다 구체적으로 설명하지만 보호범위가 하기 실시예 및 실험예에 국한되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples and experimental examples, but the scope of protection is not limited to the following examples and experimental examples.

<실시예 1> 본 발명의 조직 재생용 생분해성 고분자 제제의 제조방법<Example 1> Manufacturing method of biodegradable polymer preparation for tissue regeneration of the present invention

농가에서 수집한 누에고치를 정선하여 내부오염견, 외부외염견, 그밖 등 오염된 견을 제거하여 재료로 사용하였다. The cocoon collected from the farmhouse was selected and used as a material by removing the contaminated dogs, the external environmental dogs and other contaminated dogs.

정선한 누에고치에서 세리신을 제거하기 위하여 마리세유 비누(marseilles soap)와 탄산나트륨 용액(sodium carbonate solution)으로 100℃에서 1시간동안 정련하여 실크 피브로인을 얻었다. In order to remove sericin from selected silkworm cocoons, silk fibroin was obtained by refining with marseilles soap and sodium carbonate solution at 100 ° C for 1 hour.

얻어진 실크 피브로인 35g을 염화칼슘, 에탄올, 물 혼합용액을 사용하여 95℃에서 5시간 동안 용해한 후 셀룰로오스 투석막을 사용하여 3일간 투석함으로써 용해할 때 사용한 염을 제거하여 실크 피브로인 용액을 얻었다.35 g of the obtained silk fibroin was dissolved in a mixed solution of calcium chloride, ethanol and water at 95 ° C for 5 hours, and then dialyzed for 3 days using a cellulose dialysis membrane to remove salts used to dissolve the silk fibroin to obtain a silk fibroin solution.

상기 조직 재생용 생분해성 고분자 제제를 제조하기 위하여 먼저, 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR) 용액과 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP) 용액을 하기와 같이 제조하였다. First, a 4-hexylresorcinol (4-HR) solution and a calcium phosphate (TCP) solution were prepared as follows to prepare the biodegradable polymer preparation for tissue regeneration.

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR) 용액은 에탄올 100 mL에 3g의 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)을 녹여 3% 용액을 제조하였다. 또한 뼈 형성을 촉진하는 효과가 있는 것으로 알려져 있는 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)는 0.05M 염산 용액에 녹여 실험재료로 사용하였다.A 3% solution of 4-hexylresorcinol (4-HR) was prepared by dissolving 3 g of 4-hexylresorcinol (4-HR) in 100 mL of ethanol. Tricalcium phosphate (TCP), which is known to promote bone formation, was dissolved in 0.05 M hydrochloric acid solution and used as an experimental material.

상기 실크피브로인용액에 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR) 용액과 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP) 용액을 첨가하여 20분간 잘 혼합하였다. 실크 중량대비 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)의 함량은 0.001~10중량% 로 조절하였고, 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)의 함량은 1~5중량%로 조절하였다. 바람직하게는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR)의 함량이 0.5%, 인산칼슘제(Tricalcium phosphate, TCP)의 함량이 2중량%로 조절하였다. 4-Hexylresorcinol (4-HR) solution and Tricalcium phosphate (TCP) solution were added to the silk fibroin solution and mixed well for 20 minutes. The content of 4-hexylresorcinol (4-HR) was adjusted to 0.001 to 10% by weight and the content of calcium phosphate (TCP) was adjusted to 1 to 5% by weight based on the weight of silk. Preferably, the content of 4-hexylresorcinol (4-HR) is 0.5%, and the content of calcium phosphate (TCP) is adjusted to 2% by weight.

상기 실크단백질 혼합 용액은 -20℃에서 동결한 후 동결건조기를 이용하여 건조하여 본 발명의 조직 재생용 생분해성 고분자 제제를 제조하였다.
The silk protein mixed solution was frozen at -20 ° C and then dried using a freeze dryer to prepare a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration of the present invention.

<실험예 1> 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol,4-HR놀 처리후 DAGK의 발현 확인EXPERIMENTAL EXAMPLE 1 Expression of DAGK after Treatment of 4-hexylresorcinol and 4-HRNOL

1. 실험방법1. Experimental Method

대식 세포는 한국세포주은행 (RAW264.7; KCLB No. 40071)으로부터 분주를 받았다. 분주 받은 세포를 20% 자가혈청(Autologous serum,AS)과 항생제/항진균제(antibiotics/antimycotic,(PenStrepFungizone, Invitrogen))이 포함된 무혈청배지(serum free medium (SFM, Invitrogen, Grand Island, NY))에 풀어주었다.Macrophages were distributed from the Korean Cell Line Bank (RAW 264.7; KCLB No. 40071). Dissociated cells were suspended in serum free medium (SFM, Invitrogen, Grand Island, NY) containing 20% autologous serum (AS) and antibiotics / antimycotic (PenStrep Fungizone, Invitrogen) To release.

아르기닌글리신아스파테이트(RGD,(arginineglycineaspartate)) 고분자시약( polymer reagent,(bronectin-like protein polymer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 25㎍/㎖를 이용하여 모든 표면을 30분 동안 미리 코팅한 후, 칼슘(calcium)과 마그네슘(magnesium)이 포함된 인산완충식염수(phosphate-buffered saline, (PBS++, Invitrogen))로 2회 수세를 시행한 배양접시를 사용하였다.All surfaces were pre-coated for 30 min using 25 μg / ml of arginine glycine aspartate (RGD) polymer reagent (Becton-like protein polymer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (PBS ++, Invitrogen) containing calcium and magnesium was used as the culture dish. The culture plate was washed twice with water and then washed twice with phosphate-buffered saline (PBS ++, Invitrogen) containing calcium and magnesium.

웨스턴블럿팅(Western blotting)을 위한 시편을 만들기 위해서, 대식세포를 well 당 3x10⁶개의 양으로 6-well culture plate에 풀어준 후, 37℃ 습윤화 된 5% CO₂ 와 95% 공기 상태에서 1.5 시간을 배양하였다. To prepare the specimens for Western blotting, macrophages were dissociated into 6-well culture plates at 3 × 10 ⁶ cells / well and incubated at 37 ° C in humidified 5% CO ₂ and 95% Time was cultured.

배양 후 부착하지 못한 세포는 37℃로 미리 맞춘 PBS++를 이용하여 씻어내었다. 이 단계를 웨스턴블럿팅(western blotting) 과정에서 0인 시점으로 디자인하였다. Cells that did not attach after incubation were washed with PBS ++ pre-adjusted to 37 ° C. This step was designed as a zero point in the western blotting process.

웨스턴블럿팅(Western blotting)을 위한 샘플을 환원된 소디움도데실설페이트버퍼(Sodium dodecyl sulfate buffer)에 섞은 다음 가열하였고, 10% 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide gel)에서 전기영동을 시행하였다.Samples for Western blotting were mixed with reduced sodium dodecyl sulfate buffer, heated and electrophoresed on 10% polyacrylamide gel.

면역블럿(Immunoblot) 분석을 위하여, 겔(gel)을 폴리비닐리덴플루오라이드 막(polyvinylidenedifluoride membrane)으로 전달(transfer)하였다. For immunoblot analysis, the gel was transferred to a polyvinylidene fluoride membrane.

5% 탈지분유(non fat dry milk) 를 0.1% 트윈20(Tween20)이 포함된 인산완충식염수(phosphate buffered saline,(PBST; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, U.S.A.)에 섞은 후 1시간 정도 블러킹(blocking) 과정을 시행하였다. 5% non fat dry milk was mixed with 0.1% Tween 20 in phosphate buffered saline (PBST; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) blocking process.

0.5 % milk가 포함된 인산완충식염수(PBST)에 일차 항체를 희석하여 프로브(probe)로 사용을 하였다 (25℃, 1.5hr).The primary antibody was diluted in phosphate-buffered saline (PBST) containing 0.5% milk and used as a probe (25 ° C., 1.5 hr).

일차항체는 디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ)(ab64976, Abcam, Cambridge, U.K.)와 베타-액틴(β-actin, (Sigma-Aldrich)을 1:500으로 희석하여 사용하였다. Primary antibodies were diluted 1: 500 with diacylglycerol dioxide-DAGKδ (ab64976, Abcam, Cambridge, U.K.) and beta-actin (Sigma-Aldrich)

이차 항제로는 겨자무과산화효소-복합 염소 항생쥐 또는 항토끼 면역글로불린G(Ighorseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG)를 1:50,000으로 희석하여 사용하였다. As a secondary antibody, a mustard radish peroxidase-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit immunoglobulin G (1: 50,000) was diluted to 1: 50,000.

발광(chemiluminescence)되는 신호는 이씨엘키트(ECL kit, (RTN2106, GE health care, Buckinghamshire, U.K.)를 이용하여 측정하였다.The chemiluminescence signal was measured using an ECL kit (RTN 2106, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

실험군으로는 5㎍/㎖의 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 각각 2, 8, 24 시간 동안 적용한 세 그룹을 만들어 대식세포를 배양하였고, 대조군에는 4-헥실레조르시놀(4-HR_을 적용하지 않았다. As experimental groups, macrophages were cultured in three groups of 5 μg / ml of 4-Hexyl resorcinol (4-HR) applied for 2, 8, and 24 hours, respectively. In the control group, 4-hexyl resorcinol (4- HR_ was not applied.

실험군과 대조군은 동일한 기간을 배양을 하였으며, 배양액을 제거한 후에 매뉴얼을 따라 트리시약(Tri-Reagent)(Molecular Research Center, Inc. Cincinnati, OH)를 사용하여 각 군당 종합RNA(total RNA)를 추출하였다. After the culture medium was removed, the total RNA (total RNA) was extracted from each group using Tri-Reagent (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, Ohio) according to the manual .

RNA의 농도는 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 평가를 하였다.The concentration of RNA was assessed using a spectrophotometer.

PCR은 다음의 프로토콜을 따라 시행을 하였다. PCR was performed according to the following protocol.

역전사효소키트(Reverse transcriptase kit, (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 얻어진 RNA 로부터 cDNA를 합성하였다. 반응 시 프라이머(primer)로는 올리고(oligo) (dT) 3μl와 10mM dNTP 1μl mixture를 사용하였다. 디에틸피로카르본산(DEPC) 처리한 3차 증류수(tertiary distilled water)를 추가하여 총 부피를 40 μl으로 만들었다. 65℃에서 5분간 반응을 시킨 후, 실온에서 천천히 냉각시켰다. 10x first-strand buffer 2 μl, 25mM 염화마그네슘(MgCl2) 4μl, 0.1M 디티오트레이톨(DTT) 2μl, 리보핵산분해효소 블럭 리보뉴클레오타이드 저해제(RNased block Ribonucleotide inhibitor) (40 u/μl) 1μl, 알테이즈(RTase) 1μl를 다시 추가한 후 총 부피를 50 μl로 만든 다음 42℃에서 1시간 동안 반응을 시행하였다. 1μl의 cDNA를 이용하여 PCR을 시행하였다. 디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ)의 프라이머(primer)로는 "forward: AAG GTG TCC ACG TCG GGT CAGA", "reverse: CTC GCG TGG GAA CAG GCG TA"를 사용하였다. 갭디에이치(GAPDH)의 ㅍ프프라이머(primer)로는 "forward: AGG ACT CAT GAC CAC AGT CCA", "reverse: TGT TGC TGT AGC CAA ATT CGTT"를 사용하였다. 예상되는 PCR 생성물 크기는 갭디에이치(GAPDH) 의 경우 452 염기 쌍, DAGKδ의 경우 395 염기 쌍이었다. 프라이머(Primer)와 cDNA의 혼합물을 로드스위치티엠피씨알 프리믹스(AccuPowerTMPCR PreMix) (Bioneer, Daejeon, Korea)에 첨가하여 총부피를 20μl으로 만들었다. ㄱ갭디에이치(GAPDH)를 위한 PCR 조건은 다음과 같다. 95℃에서 10 분간 변성(denaturing) 후 PCR cycle을 다음의 순서로 설정하였다. 95℃에서 30초, 58℃에서 30초, 60℃에서 30초로 각 샘플마다 총 33 cycle을 시행하였다. 디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ)를 위한 PCR 조건은 갭디에이치(GAPDH)의 조건과 비교할 때 어닐링(annealing) 온도가 60.4℃로 달랐다. PCR 생성물을 1.5% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동하였고, 에티디움브로마이드용액(ethidium bromide solution)을 이용하여 염색을 하였다.CDNA was synthesized from RNA obtained using reverse transcriptase kit (Invitrogen, Inc., Carlsbad, Calif.). As a primer, 3 μl of oligo (dT) and 1 μl of 10 mM dNTP (DEPC) -treated distilled water was added to make a total volume of 40 μl The reaction was allowed to proceed at 65 ° C. for 5 minutes and then slowly cooled at room temperature 10 × first -strand buffer, 2 μl of 25 mM magnesium chloride (MgCl 2), 2 μl of 0.1 M dithiothreitol (DTT), 1 μl of RNased block ribonucleotide inhibitor (40 μl / μl) RTase) was added again, and the total volume was adjusted to 50 μl, followed by reaction at 42 ° C. for 1 hour. PCR was carried out using 1 μl of cDNA. Primer of diacylglycerol dioxidease-delta (DAGKδ) (primer) "forward: AAG GTG TCC ACG TCG GGT CAGA "and" reverse: CTC GCG TGG GAA CAG GCG TA "were used as the primers of GAPDH. The primers of GAPDH were" forward: AGG ACT CAT GAC CAC AGT CCA " (TGT TGC TGT AGC CAA ATT CGTT) was used. The expected PCR product size was 452 base pairs in the case of GaddiH (GAPDH) and 395 base pairs in the case of DAGKδ. The PCR conditions for GAPDH were as follows: denaturation at 95 ° C for 10 min, and then PCR (pH 7.0) cycle in the following order. A total of 33 cycles were performed for 30 seconds at 95 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 30 seconds at 60 ° C. The PCR conditions for diacylglycerol dioxygenase-delta (DAGKδ) were 60.4 ° C for the annealing temperature when compared to the conditions of GapDH. The PCR product was electrophoresed on 1.5% agarose gel and stained with ethidium bromide solution.

정량적인 PCR 분석은 Ebiogen Co. (Seoul, Korea)에 의뢰하였다. 상대적인 유전자의 mRNA levels의 양적인 분석을 수행하기 위해서 CYBR green PCR master mix (ABI, Foster city, CA, USA)를 사용하였다.Quantitative PCR analysis was performed by Ebiogen Co. (Seoul, Korea). CYBR green PCR master mix (ABI, Foster City, CA, USA) was used to quantitatively analyze relative gene mRNA levels.

디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ)의 프라이머(Primer) 순서는 "forward: ACTCCGATGGGTTCTGGAAG" and "reverse: GGAATAACCGTAAGCCGAGG"이고, 예상되는 생성물의 크기는 186 염기쌍이었다.The order of the primers of diacylglycerol dioxidease-delta (DAGKδ) was "forward: ACTCCGATGGGTTCTGGAAG" and "reverse: GGAATAACCGTAAGCCGAGG", and the expected product size was 186 base pairs.

template 가 없는 음성 대조군으로는 각 분석 (assay)마다 포함이 되었다.A negative control with no template was included for each assay.

PCR 95℃ 에서 10 분간 변성(denaturation) 다음 95℃ for 30 s, 60℃ for 30 s, and 72℃ for 30 s 총 40 사이클(cycles)을 시행을 하였다. PCR denaturation at 95 ° C for 10 min followed by a total of 40 cycles of 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s, and 72 ° C for 30 s.

PCR cycle number 에 대응하는 더사이클스레시홀드(The cycle threshold,Ct) 값은 형광 발광이 기준치를 넘어 실시간으로 역치에 도달하는 값으로 정하였다 상대적인 발현 정도는 갭디에이치(GAPDH)의 발현값과 비교하여 비율 값으로 계산을 하였다.The cycle threshold (Ct) value corresponding to the PCR cycle number was set to a value at which the fluorescence emission reached the threshold value in real time beyond the reference value. The relative expression level was compared with the expression value of GAPDH And the ratio was calculated.

측정은 총 3번을 시행하였다 평균값을 가지고 비교를 시행하였다.
A total of 3 measurements were made.

2. 실험결과2. Experimental results

상기 배양한 대식세포주에 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 후 2, 8, 24시간에 관찰한 결과, 도 1에 나타나 있듯이 디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ) 단백질의 발현은 전체적으로 감소되었다. As shown in FIG. 1, the expression of diacylglycerol dioxygenase-delta (DAGKδ) protein in the cultured macrophage cell line was observed at 2, 8, and 24 hours after 4-hexyl resorcinol (4-HR) Overall reduction.

단백질 발현의 감소 정도는 4-헥실레조르시놀(4-HR) 투여 후 8시간 경과된 시점에서 가장 크게 나타났다.The decrease in protein expression was greatest at 8 hours after 4-Hexyl resorcinol (4-HR) administration.

또한, 도 2에 나타나 있듯이, 디아실글리세롤이산화효소-델타(DAGKδ) 유전자의 발현도 마찬가지로 조사하여 보았는데, 동일한 실험 조건에서 단백질의 발현과 마찬가지로 2, 8, 24시간에 억제되는 것으로 관찰되었다.
As shown in FIG. 2, the expression of diacylglycerol dioxide-DAGKδ gene was similarly examined, and it was observed that it was suppressed at 2, 8, and 24 hours as in protein expression under the same experimental conditions.

<실험예 2> 4-헥실레조르시놀의 처리 후 포스파티딘산(phosphatidic acid)와 억제정도 및 디아실글리세롤(diacyllglcerol) 증가정도 확인EXPERIMENTAL EXAMPLE 2 Confirmation of the degree of inhibition and diacylglycerol increase with phosphatidic acid after 4-hexylresorcinol treatment

1. 실험방법1. Experimental Method

포스파티딘산(phosphatidic acid, PA)와 억제정도 및 디아실글리세롤(diacyllglcerol, DAG) 의 양적인 평가를 위해서, 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용하거나 적용하지 않은 뒤 8시간 후의 세포를 모았다. For quantitative evaluation of phosphatidic acid (PA) and inhibition level and diacylglycerol (DAG), cells after 8 hours without or with 4-hexyl resorcinol (4-HR) Gathered.

디아실글리세롤(DAG)의 양적인 분석을 위하여, 세포의 세포막 부분을 모았다. 세포들을 모은 후, 메탄올(methanol) 1.5ml 초음파 처리한 펠렛(pellet)에 추가를 하였다. For quantitative analysis of diacylglycerol (DAG), cell membrane portions of the cells were collected. After collecting the cells, they were added to a 1.5 ml sonicated pellet of methanol.

1M NaCl 2.25 ml와 클로로폼(chloroform) 2.25 ml을 샘플에 추가한 후에 vortex에서 골고루 섞어주었다. 2.25 ml of 1 M NaCl and 2.25 ml of chloroform were added to the sample and mixed well in vortex.

4℃에서 10분간 1,500g 의 속도로 원심분리 하였다. 상층액을 버린 후, 아래층에 클로로폼(chloroform) 층을 2ml 프리-이퀼리브래티드(pre-equilibrated) 상층액을 이용하여 2번 씻어냈다. 두 번째 PEU 세척 후, 상층액은 제거하고 아래의 클로로폼(chloroform)층을 유리튜브에 이동시켰다.Followed by centrifugation at 4 ° C for 10 minutes at a rate of 1,500 g. The supernatant was discarded and the chloroform layer was washed twice with 2 ml of pre-equilibrated supernatant in the lower layer. After the second PEU wash, the supernatant was removed and the following chloroform layer was transferred to the glass tube.

하층액은 질소 증기를 이용하여 조심스럽게 건조시킨다. 샘플은 500㎕의 1% 트리톤 엑스-100(Triton X-100)에 다시 부유시킨 후, 샘플은 검정(assay)를 시행하기 전에 버퍼를 이용하여 희석시킨다. 다음의 과정들은 키트(kit)를 이용하여 시행을 하였다. The bottom layer is carefully dried with nitrogen vapor. Samples are resuspended in 500 μl of 1% Triton X-100 and the samples are diluted with buffer before assay. The following procedures were performed using a kit.

포스파티딘산(PA)의 양적인 평가를 위해서 분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor cocktail, (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.) 를 포함한 프로테오젯 포유류세포 용해 시약(ProteoJET^TM Mammalian Cell Lysis Reagent) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.A.) 를 사용하였다. (ProteoJET ^™ Mammalian Cell Lysis Reagent) containing a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA) was used for the quantitative evaluation of phosphatidic acid (PA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass., USA).

배양액을 제거한 후, 피비에스(PBS)로 수세한 후, 모아진 세포 펠렛(pellet)에 1000 μl 의 준비된 혼합물(mixture) 를 적용한다. After removing the culture medium, the plate is washed with PBS, and 1000 μl of the prepared mixture is applied to the collected cell pellet.

샘플은 쉐이커(shaker)에서 실온상태로 10분간 배양(incubation) 한 후 plate로부터 용해물(lysate) 를 모은 후 micro-centrifuge tube로 옮겼다. Samples were incubated in a shaker at room temperature for 10 minutes, lysates were collected from the plate and transferred to a micro-centrifuge tube.

20,000g의 속도로 15분간 원심분리를 시행한 후 상층액을 새로운 튜브로 옮긴다. Centrifuge at 20,000 g for 15 minutes and transfer the supernatant to a new tube.

그 다음의 과정은 디아실글리세롤(DAG)의 정량적인 분석에 사용하였던 과정과 동일하게 적용되었다.
The next step was the same as the procedure used for the quantitative analysis of diacylglycerol (DAG).

2. 실험결과2. Experimental results

상기 대식세포주에 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 PA의 세포 내 농도 변화를 관찰한 경우 도 3A에 나타나 있듯이 1 μM에서 25 μM까지의 농도 범위에서 PA의 검출 농도가 감소되는 것으로 관찰되었다.When 4-Hexyl resorcinol (4-HR) was applied to the macrophage cell, the detection concentration of PA was decreased in the concentration range of 1 μM to 25 μM as shown in FIG. 3A when the intracellular concentration of PA was observed Respectively.

4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용하지 않은 대조군과 1 μM, 5 μM, 25μM의 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 포스파티딘산(PA)의 검출 농도는 각각 90.18 ± 1.57 μM,78.67 ± 1.57μM, 68.34 ± 8.07μM, 72.10 ± 4.22μM이었다. 각각의 차이는 통계적으로 유의하였고 (p=0.002), 사후검증에서 대조군과 비교 시에 1 μM, 5 μM, 25μM의 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 모두 통계적으로 유의한 차이를 보여주었다 (각각 p=0.016, p<0.001, p=0.001).The concentrations of phosphatidic acid (PA) in the control group without 4-Hexyl resorcinol (4-HR) and with 1 μM, 5 μM and 25 μM 4-Hexyl resorcinol (4-HR) 90.18 ± 1.57 μM, 78.67 ± 1.57 μM, 68.34 ± 8.07 μM, and 72.10 ± 4.22 μM. (P = 0.002). In the post-hoc test, 4-Hexyl resorcinol (4-HR) of 1 μM, 5 μM and 25 μM was applied in comparison with the control group, all of which were statistically significant (P = 0.016, p < 0.001, p = 0.001, respectively).

또한, 도 3B에 나타나 있듯이, 대식세포주에 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 DAG의 세포 내 농도 변화를 관찰한 경우 1 μM에서 25 μM까지의 농도 범위에서 디아실글리세롤(DAG)의 검출 농도가 증가되는 것으로 관찰되었다. As shown in FIG. 3B, when 4-Hexyl resorcinol (4-HR) was applied to the macrophage cell line, changes in the intracellular concentration of DAG were observed. In the concentration range from 1 μM to 25 μM, diacylglycerol ) Was observed to be increased.

4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용하지 않은 대조군과 1 μM, 5 μM, 25μM의 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 디아실글리세롤(DAG(의 검출 농도는 각각 6.98 ± 0.22 μM, 25.13 ± 2.38μM, 81.93 ± 16.30μM, 105.62 ± 9.50μM이었다. 각각의 차이는 통계적으로 유의하였고 (p<0.001), 사후검증에서 대조군과 비교 시에 1 μM, 5 μM, 25μM의 4-HR을 적용한 경우 모두 통계적으로 유의한 차이를 보여주었다 (각각 p=0.048, p<0.001, p<0.001).
When the control group to which 4-Hexyl resorcinol (4-HR) was not applied and 1 μM, 5 μM, 25 μM 4-Hexyl resorcinol (4-HR) were applied, the detection concentrations of diacylglycerol (P <0.001). In the post-test, the differences were statistically significant at 1 μM, 5 μM, and 25 μM (P = 0.048, p <0.001, p <0.001, respectively) in the 4-HR group.

<실험예 3> 다핵거대세포로의 형성 억제능 확인<Experimental Example 3> Confirmation of inhibition of formation of polynucleic giant cells

1. 실험방법1. Experimental Method

대식세포의 초기 배양 3일이 되는 시점에서 계대 배양을 시행하면서 세포 배양 배지를 56℃에서 45분간 열처리한 5% AS를 포함한 SFM으로 바꾸어 주었다. After 3 days of initial culture of macrophages, subculture was performed and the cell culture medium was changed to SFM containing 5% AS heat-treated at 56 ° C for 45 minutes.

이 때 대식 세포 융합 (fusion)을 위하여 15 ng/ml의 재조합인간인터류킨-4(recombinant human IL-4) (R& D Systems, Minneapolis, MN)를 실험군에는 적용하고 대조군에는 적용하지 않았다. At this time, 15 ng / ml recombinant human IL-4 (R & D Systems, Minneapolis, Minn.) Was applied to the experimental group and not to the control group for macrophage fusion.

배양은 5일 째에 종료가 되었으며, 배양한 세포를 메이어스 헤마톡실린(Mayer's hematoxyline)을 이용하여 염색을 시행한 후, 바닥에 부착되어 있는 세포 수를 세었다. The culture was terminated on the fifth day, and the cultured cells were stained with Meyer's hematoxylin, and the number of cells adhering to the bottom was counted.

융합이 일어난 비율을 분석하는 방법으로는 하기 방법을 적용하였다. As a method for analyzing the rate at which fusion occurred, the following method was applied.

다시 말해, 융합된 대식 세포 비율을 평가하기 위해서 각 샘플당 저배율로 (20x) 대표적인 2개의 마이크로스코픽 필즈(microscopic fields) (250 cells)를 정한 후 평균적으로 부착된 전체 세포 수에 대한 다핵세포의 수의 비율을 기록을 하였다. In other words, in order to evaluate the ratio of fused macrophages, two representative microscopic fields (250 cells) at low magnification (20x) per sample were set, and the number of polynuclear cells Were recorded.

통계학적인 유의성은 95% 신뢰도(confidence level)에서 언페어 스튜던트 T 테스트(unpaired student’s t test)를 사용하여 평가하였다. 현미경 이미지는 Olympus DC-73 digital camera (Tokyo, Japan)와 CS-ST-MPC software를 이용하여 단일이미지포착모드(single image acquisition mode)로 촬영을 하였다.
Statistical significance was assessed using the unpaired student's t test at a 95% confidence level. Microscopic images were taken in a single image acquisition mode using an Olympus DC-73 digital camera (Tokyo, Japan) and CS-ST-MPC software.

2. 실험결과 2. Experimental results

상기 실험결과 도 4A에 나타나 있듯이, 배양된 대식세포주에서 거대세포의 형성은 4-헥실레조르시놀(4-HR)의 투여에 의하여 억제되었다. 관측된 전체 세포에서 거대세포의 비율은 대조군에서는 21.2 ± 2.5%였다. As shown in FIG. 4A, the formation of giant cells in the cultured macrophage line was inhibited by 4-Hexyl resorcinol (4-HR) administration. The proportion of giant cells in the observed whole cells was 21.2 ± 2.5% in the control group.

또한, 도 4B에 나타나 있듯이 5 μM, 25μM의 4-헥실레조르시놀(4-HR)을 적용한 경우 각각 16.6 ± 4.1% 및 9.2 ± 4.3%였다. 세 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하였고 (p=0.001), 사후검증에서 25μM의 4-HR을 적용한 경우가 약물 처리하지 않은 대조군에 비하여 통계적으로 유의할 정도로 낮은 값을 보여주었다 (p<0.001).
In addition, as shown in FIG. 4B, when 4-Hexyl resorcinol (4-HR) was applied at 5 μM and 25 μM, it was 16.6 ± 4.1% and 9.2 ± 4.3%, respectively. The difference between the three groups was statistically significant (p = 0.001). In the post-test, 25 μM of 4-HR was statistically significantly lower than the control group (p <0.001).

<실험예 4> 이식재료에 따른 결과 확인&Lt; Experimental Example 4 >

1. 실험방법1. Experimental Method

동물 실험에 사용될 샘플은 농촌진흥청 (Suwon, Korea)으로부터 제공을 받았다. Samples for animal testing were provided by the Rural Development Administration (Suwon, Korea).

피티-아이알 스펙트라(FT-IR spectra) 결과는 베르텍스 80 스펙트로미터(Vertex 80 spectrometer) (Bruker Optics, Germany)에 부착된 하이퍼리온3000현미경(Hyperion 3000 microscope) (Bruker Optics, Germany)를 사용하여 얻었다.FT-IR spectra results were obtained using a Hyperion 3000 microscope (Bruker Optics, Germany) attached to a Vertex 80 spectrometer (Bruker Optics, Germany) .

이 현미경은 게르마늄 감쇠전반사 대물렌즈(germanium (Ge) attenuated total reflectance objective lens) (ATR 20×) 와 액화 질소에 의하여 냉각되는 텔루르화수은카드뮴디텍터(mercury cadmium telluride (MCT) detector)가 장착이 되어 있다. 모든 스펙트라(spectra)는 600 to 4,000 cm^-1의 측정범위와, 4 cm^{- 1}해상도에서, 그리고 128회의 반복된 스캔을 통해서 이루어졌다. This microscope is equipped with a germanium (Ge) attenuated total reflectance objective lens (ATR 20 ×) and a mercury cadmium telluride (MCT) detector cooled by liquefied nitrogen. All spectra were obtained at a measurement range of 600 to 4,000 cm ^-1 , at 4 cm ^{- 1} resolution, and through 128 repeated scans.

실크(Silk), 실크+제3인산칼슘(silk +TCP), 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4-HR) 시편의 주사전자현미경 촬영은 SU-70 주사전자현미경 (Hitachi, Japan)을 이용하여 5 keV 하에 시행되었다.
Scanning electron microscopy (SEM) of the silk, silk + tribasic calcium silk + TCP, silk + tribasic calcium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + (5 keV) using an electron microscope (Hitachi, Japan).

2. 실험결과2. Experimental results

상기 실험결과, 도 5에 나타나 있듯이 동물 실험에 사용될 실크 소재 이식재에 대한 FT-IR 결과로 사용된 세 가지 재료 모두에서 첨부된 실크에 대한 전형적인 밴드가 600에서 1700 cm^-1 범위에서 관찰되었다.As shown in FIG. 5, typical bands for attached silks were observed in the range of 600 to 1700 cm ^-1 in all three materials used as FT-IR results for silk material implants to be used in animal experiments.

특히 1235 cm^-1 범위에서 관찰되는 흡수 밴드는 실크 소재의 임의 코일 구조와 연관이 있다. 10% 제3인산칼슘(TCP)나 10% 제3인산칼슘(TCP)와 3% 4-헥실레조르시놀(4-HR)이 첨부된 소재도 실크 단독 소재와 유사한 소견을 보인다. 그러나 실크 아미드밴드(amide band)에 대한 신호 강도는 세 가지 재료 사이에 다소 차이가 관찰되었다. 세 가지 재료에 대한 주사 전자현미경 소견은 도 6에 나타나 있다.
In particular, the absorption band observed in the 1235 cm ^-1 range is related to the arbitrary coil structure of the silk material. Materials with 10% trisodium phosphate (TCP) or 10% trisodium phosphate (TCP) and 3% 4-hexyl resorcinol (4-HR) are also similar to silk sole material. However, the signal intensity for the silicate amide band was somewhat different between the three materials. Scanning electron microscopic findings for the three materials are shown in FIG.

<실험예 5> 골형성 정도 확인&Lt; Experimental Example 5 >

1. 실험방법1. Experimental Method

동물 실험은 크게 세 개의 서로 다른 군으로 나누어 시행되었다. Animal experiments were divided into three different groups.

골 결손부에 실크 소재만 이식한 군 (silk군)과 골 결손부에 실크 소재에 10% 제3인산칼슘(tricalcium phosphate,TCP)이 첨부된 소재를 이식한 군 (silk+TCP군), 그리고 실크 소재에 10% 제3인산칼슘(TCP)와 3% 4-헥실레조르시놀(4-HR)이 첨부된 소재를 이식한 군 (silk+TCP+4HR군)으로 나뉘어진다. (Silk group) implanted with only silk material in the bone defect, and a group (silk + TCP group) implanted with 10% tricalcium phosphate (TCP) attached to the silk material in the bone defect (Silk + TCP + 4HR group) with 10% trisodium phosphate (TCP) and 3% 4-hexyl resorcinol (4-HR) attached to the silk material.

실험에 사용된 골 결손부의 크기는 직경이 8mm인 골편채취기(trephine bur)를 사용하여 얻어졌으며 이는 기존에 출간된 논문을 참고하여 설정 되었다.The size of the bone defect used in the experiment was obtained by using a trephine bur with a diameter of 8 mm, which was set with reference to the previously published paper.

간략하게 실험 방법을 설명하면 가토를 약물을 이용하여 전신 마취한 다음에 두피에 리도카인을 이용하여 국소마취를 시행하였다.  A brief description of the experimental procedure is given. The anesthetics of the rabbits were made by general anesthesia using the drug, followed by local anesthesia using lidocaine.

두개골 정중부에 시상면에 평행하게 절개한 다음에 직경 8mm의 골편채취기(trephine bur)를 이용하여 골 결손부를 형성하였다. 골 결손부의 형성 시에 골막을 제거되는 골에 붙여서 같이 제거하여 자가 치유가 지나치게 빨리 일어나는 것을 억제하였다.After the incision was made parallel to the sagittal plane in the median part of the skull, a bone defect was formed using a 8 mm diameter trephine bur. At the time of formation of the bone defect, the periosteum was attached to the removed bone, and the self-healing was prevented from occurring too early.

이후 앞에서 설명한 것과 같이 사전에 준비된 이식재를 각각의 결손부에 이식한 다음에 3-0 블랙실크(black silk)를 이용하여 전층을 한번에 봉합하였다. 이후 수술후 1주일까지 창상 부분을 아이오딘(iodine) 제재로 소독하였고 수술후 3일까지는 소염진통제와 항생제를 근육주사하였다. Then, as described above, the grafts prepared in advance were transplanted into each defect, and then all the layers were sutured at once using a 3-0 black silk. The wound was then disinfected with iodine until 1 week postoperatively, and intramuscular injection of anti-inflammatory analgesic and antibiotics was administered until 3 days postoperatively.

술후 3일 이후에 실험동물에서 사료 섭취 저하나 이상 행동과 같은 통증 등과 같은 술후 합병증에서 기인한 것으로 해석될 수 있는 증상이 관찰되는 경우에는 추가적인 진통제를 투여를 고려하였다. Additional analgesics were considered when symptoms that could be interpreted as resulting from postoperative complications such as lower feed intake or abnormal behavior in experimental animals 3 days after surgery.

하지만 본 실험에서는 이와 같은 현상은 관찰되지 않았다. However, this phenomenon was not observed in this experiment.

실험 동물은 각각 4주 및 8주에 희생되었고 희생 방법은 진정제의 과다 투여법을 이용하여 고통을 최소화하는 방법으로 시행되었다. 각각의 실험 동물에서 얻어진 시편은 포르말린에 고정한 채로 추후 분석을 위하여 보내어졌다. Experimental animals were sacrificed at 4 and 8 weeks, respectively, and sacrifice was performed by using overdose method to minimize pain. The specimens obtained from each experimental animal were sent for further analysis while fixed in formalin.

미세 전산화 단층 촬영은 기초과학 지원센터 (청원, 대한민국)에 의뢰되어 시행되었다. 각 조직은 Explored Locus SP μ-CT scanner (GE Medical systems, Ontario, Canada)를 이용하여 촬영되었다. Micro CT scans were performed by the Basic Science Support Center (Cheongwon, Korea). Each tissue was photographed using an Explored Locus SP μ-CT scanner (GE Medical systems, Ontario, Canada).

전산화 단층 촬영 장치 내부에 있는 판에 조직을 움직이지 않게 고정한 후에 수평과 수직으로 움직여서 위치를 조정하였다. 이후 표본은 0.05mm의 두께로 촬영되었다. After fixation of the tissue to the plate inside the computerized tomography apparatus, the tissue was moved horizontally and vertically to adjust its position. The specimen was then taken at a thickness of 0.05 mm.

촬영된 이미지는 Microview software (GE Medical systems)를 이용하여 삼차원으로 재구성되었다. 수술 시 형성한 결손부가 지름 8.0mm의 원형이므로 관심영역(ROI, region of interest)은 초기 결손부 크기와 형태에 맞게 고려되었다. The images were reconstructed three-dimensionally using Microview software (GE Medical systems). The ROI (region of interest) was considered to fit the size and shape of the initial defect, since the defect formed during surgery was a circular shape with a diameter of 8.0 mm.

각각 시편에서 관심영역의 신생골 형성 정도 (BV, bone volume)를 소프트웨어를 통하여 분석되었다.
The bone mineral density (BV, bone volume) of each region of interest was analyzed by software.

2. 실험결과2. Experimental results

상기 실험결과 도 7A에 나타나 있듯이, 미세전산화 단층촬영 결과 silk+TCP+4HR군에서 다른 그룹에 비하여 많은 양의 석회화된 영역을 보여 주었다. As shown in FIG. 7A, fine CT scans showed a larger amount of calcified regions in the silk + TCP + 4HR group than in the other groups.

도 7B에 나타나 있듯이, 수술후 4주의 신생골 형성정도(BV)는 실크(silk)군에서는 5.79± 0.60 mm³이었고, 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군에서는 6.26± 5.29 mm³이었고, 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 10.05± 2.46 mm³이었다. 비록 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서 가장 높은 평균값을 보였지만 그 차이는 유의하지는 않았다 (p>0.05). As shown in FIG. 7B, the degree of new bone formation (BV) at 4 weeks postoperatively was 5.79 ± 0.60 mm ³ in the silk group, 6.26 ± 5.29 mm ³ in the silk + tribasic calcium phosphate group (silk + TCP) + Trisodium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) group was 10.05 ± 2.46 mm ³ . The highest value was found in silk + triccium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) group, but the difference was not significant (p> 0.05).

수술후 8주의 신생골 형성정도(BV)는 실크(silk)군에서는 14.45 ± 2.77 mm³이었고, 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군에서는 19.20± 7.42 mm³이었고, 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 36.58± 11.06 mm³이었다. 세 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하였다 (p=0.001). 사후 분석법 (post hoc analysis)에서 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군이 실크(silk)군과 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군과의 비교에서 통계적으로 유의할만큼 높은 골 형성을 보여주었다 (각각 p<0.001 및 p=0.003).
Bone formation (BV) of 8 weeks postoperatively was 14.45 ± 2.77 mm ³ in the silk group, 19.20 ± 7.42 mm ³ in the silk + triccium phosphate (silk + TCP) group, and silk + tribasic calcium phosphate + And 36.58 ± 11.06 mm ^{3 in the} 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) group. The difference between the three groups was statistically significant (p = 0.001). In the post hoc analysis, the groups of silk + triccium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) and silk + triccium phosphate (silk + TCP) (P <0.001 and p = 0.003, respectively).

<실험예 6> 대식세포의 형성정도와 잔존 이식재의 양 확인<Experimental Example 6> The degree of formation of macrophages and the amount of residual implant material

1. 실험방법 및 결과1. Experimental Methods and Results

전산화 단층 촬영을 거친 조직은 다시 탈회를 거쳐서 파라핀에 포매되었다. 조직절편은 골이식부위 및 정상부위가 모두 포함되도록 제작되었고 박편의 두께는 6μm로 하였다. 신생골의 형성 정도를 분석하기 위하여 조직은 H&E 염색법(hematoxylline and eosin)으로 염색하였다. The tissue undergoing computed tomography was again demineralized and embedded in paraffin. Tissue sections were prepared to include both the bone graft site and the normal site, and the thickness of the thin section was 6 μm. Tissue was stained with H & E staining (hematoxylline and eosin) to analyze the degree of new bone formation.

그 결과 도 8에 나타나있듯이 수술 후 4주 경과된 시편에서 얻어진 조직학적 소견에서 이물 반응과 관계된 다핵거대세포는 3개의 군에서 모두 관찰되었다.As a result, as shown in FIG. 8, in the histologic findings obtained at the 4 weeks after the operation, multinucleated giant cells related to the foreign body reaction were observed in all three groups.

하지만 그 정도는 실크(silk)군에서 가장 심하게 나타났다. 흥미롭게도 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 다른 군에 비하여 다핵거대세포의 출현은 적었고 실크 이식재 상에 결합조직 매개 없이 직접적인 골 형성이 관찰되었다. However, the degree of this was highest in the silk group. Interestingly, in the silk + triccium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) group, the appearance of multinucleated giant cells was fewer than in the other groups and direct bone formation was observed on the silk graft material without connective tissue mediation.

또한 도 9에 나타나 있듯이 수술 후 8주 경과된 시편에서 얻어진 조직학적 소견에서 실크(silk)군은 4주 소견과 비교 시에 큰 차이가 없었다.Also, as shown in FIG. 9, there was no significant difference in the silk group compared with the 4th week in the histologic findings obtained at 8 weeks after surgery.

실크+제3인산칼슘(Silk+TCP)군은 4주에 비하여 8주 경과 시에 더욱 심한 이물반응이 나타났고 이에 따라 다핵거대세포의 출현도 빈번하게 관찰되었다. 하지만 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 다핵거대세포가 거의 관찰되지 않았고 신생골 형성이 더욱 빈번하게 관찰되었다. In the silk + triccium phosphate (Silk + TCP) group, the foreign body reaction was more severe at 8 weeks than at 4 weeks, and the appearance of polynuclear giant cells was frequently observed. However, in the group of silk + triccium phosphate + 4 - hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR), polynuclear giant cells were rarely observed and new bone formation was observed more frequently.

또한, 조직 시편에서 이식재의 잔존량은 최초 골결손부의 크기 대비 관측 시점에서 잔존하여 있는 이식재의 양을 퍼센트로 계산하였다. In addition, the residual amount of the graft material in the tissue specimen was calculated as the amount of the graft material remaining at the observation time with respect to the size of the initial bone defect portion as a percentage.

그 결과 도 10에 나타나 있듯이 수술후 4주의 이식재 잔존량은 실크(silk)군에서는 87.09 ± 2.69 %이었고, 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군에서는 81.63 ± 13.15 %이었고, 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 23.04 ± 15.14 %이었다. 세 군 사이에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (p<0.001). 사후 분석법 (post hoc analysis)에서 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군이 실크(silk)군과 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군과의 비교에서 통계적으로 유의할만큼 적은 잔존 실크 이식재 비율을 보여주었다 (모두 p<0.001). 수술후 8주의 잔존 이식재량은 실크(silk군에서는 52.13 ± 15.82 %이었고, 실크+제3인산칼슘(silk+TCP)군에서는 46.52 ± 15.30 %이었으며, 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군에서는 3.22 ± 3.28 %이었다. 세 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하였다 (p=0.002). 사후 분석법 (post hoc analysis)에서 실크+제3인산칼슘+4-헥실레조르시놀(silk+TCP+4HR)군이 실크(silk)군에 비하여 통계적으로 유의할만큼 적은 잔존 이식재 비율을 보여주었다 (p<0.001).
As a result, as shown in Fig. 10, the residual amount of the implant after 4 weeks of operation was 87.09 ± 2.69% in the silk group, 81.63 ± 13.15% in the silk + trisodium phosphate (silk + TCP) group, And 23.04 ± 15.14% in the calcium + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) group. There was a statistically significant difference between the three groups (p <0.001). In the post hoc analysis, the groups of silk + triccium phosphate + 4-hexyl resorcinol (silk + TCP + 4HR) and silk + triccium phosphate (silk + TCP) A statistically significant lower percentage of residual silk material was shown in the comparison (all p <0.001). The remaining grafts at 8 weeks postoperatively were 52.13 ± 15.82% in the silk group and 46.52 ± 15.30% in the silk + trisodium phosphate (silk + TCP) group, and the silk + tribasic calcium phosphate + 4-hexyl resorcinol The difference between the three groups was statistically significant (p = 0.002). Post hoc analysis showed that silk + triccium phosphate + 4-hexylzereosin + There was a statistically significant reduction in the residual graft ratio (p <0.001) in the ricinol (silk + TCP + 4HR) group compared to the silk group.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the inventions. Examples and experiments may be implemented. The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all differences within the scope of the claims are to be construed as being included in the present invention.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 실험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예 및 실험예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit or scope of the inventions. Examples and experiments may be implemented. The scope of the present invention is defined by the appended claims, and all differences within the scope of the claims are to be construed as being included in the present invention.

Claims (10)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 누에고치를 정선한 후 세리신을 제거하여 실크 피브로인을 얻는 제1단계;
상기 실크 피브로인을 용해한 후 투석하여 염이 제거된 실크 피브로인 용액을 제조하는 제2단계;
4-헥실레조르시놀을 에탄올로 용해하여 4-헥실레조르시놀 용액을 제조하는 제3단계 및,
상기 제2단계에서 제조된 염이 제거된 실크 피브로인 용액에 상기 제3단계에서 제조한 4-헥실레조르시놀 용액을 상기 실크 피브로인 용액 중량을 기준으로 0.001~10중량%로 혼합하여 혼합용액을 제조한 후, 이를 성형하여 조직 재생용 생분해성 고분자 제제를 제조하는 제4단계;를 포함하되,
상기 제4단계의 혼합용액에서 인산칼슘제 용액을 상기 실크피브로인 용액의 중량을 기준으로 1~5중량%로 더 포함하여, 다핵거대세포 (Multinucleated giant cell)의 형성 억제능 및 생체재료의 생체 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는,
조직 재생용 생분해성 고분자 제제의 제조방법.
A first step of selecting silkworm cocoon and removing sericin to obtain silk fibroin;
A second step of dissolving the silk fibroin and then dialyzing to prepare a salt-free silk fibroin solution;
A third step of dissolving 4-hexyl resorcinol with ethanol to prepare a 4-hexyl resorcinol solution,
The 4-hexyl resorcinol solution prepared in the third step is added to the salt-free silk fibroin solution prepared in the second step in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the weight of the silk fibroin solution to prepare a mixed solution And then molding the biodegradable polymer preparation to prepare a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration,
The calcium phosphate solution is further added in a concentration of 1 to 5% by weight based on the weight of the silk fibroin solution in the mixed solution of the fourth step so that the biocompatibility of the biocompatible organic material with the ability to inhibit the formation of multinucleated giant cells &Lt; / RTI &gt;
A method for producing a biodegradable polymer preparation for tissue regeneration.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제6항의 제조방법에 의해 제조되어,
실크단백질, 4-헥실레조르시놀 및 인산칼슘제를 포함하되,
상기 4-헥실레조르시놀은 상기 실크단백질 중량을 기준으로 0.001~10중량%를 포함하며, 상기 인산칼슘제는 상기 실크단백질 중량을 기준으로 1~5중량%를 포함하여, 다핵거대세포 (Multinucleated giant cell)의 형성 억제능 및 생체재료의 생체 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는,
조직 재생용 생분해성 고분자 제제.
7. A process for producing a polyurethane foam, which is produced by the production process of claim 6,
Silk protein, 4-hexyl resorcinol and calcium phosphate,
Wherein the 4-hexyl resorcinol comprises from 0.001 to 10% by weight based on the weight of the silk protein, and the calcium phosphate agent comprises from 1 to 5% by weight, based on the silk protein weight, of a Multinucleated giant cell, and biodegradability of the biomaterial.
Biodegradable polymer preparation for tissue regeneration.

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