KR101496790B1 - 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리를 옥신을 함유한 MS 배지에 접종하여 부정근을 유도한 후 유도된 부정근을 배양하는 단계를 포함하는 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성 물질 함량이 증대된 유리코마 속 식물 부정근에 관한 것으로, 본 발명의 부정근 배양 방법을 이용하면 생장이 증진되고 생리활성 물질의 함량이 높은 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근을 효과적으로 대량생산할 수 있고, 본 발명의 배양 방법으로 얻어진 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근의 바이오매스 및 생리활성 물질은 화장품, 식품, 향신료, 음료 및 자양 강장제 등의 제조에 이용할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용할 것으로 판단된다.
Description
본 발명은 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리를 옥신을 함유한 MS 배지에 접종하여 부정근을 유도한 후 유도된 부정근을 배양하는 단계를 포함하는 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성 물질 함량이 증대된 유리코마 속 식물 부정근에 관한 것이다.
유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia)는 소태나무과(Simaroubaceae)의 꽃을 피우는 식물(flowering plant)로 통갓 알리(Tongkat Ali)라고도 불리며 인도네시아, 말레이시아 및 베트남이 주요 산지이다. 말레이시아 등 동남아시아의 경사지고 깊은 정글에서 주로 발견되고, 키가 크고 호리호리한 관목의 일종으로 줄기가 가냘프게 생겼고, 백만년 역사의 열대 우림에서 나는 야생식물이다. 유리코마 론지폴리아의 뿌리는 열병이나 말라리아에 대한 전통적인 치료제로 사용되고 있으며, 유리코마 론지폴리아에서 추출한 여러 가지 내용물을 약학적으로 검사한 결과, 말라리아 예방 및 치료, 생장호르몬 형성 및 항궤양에 유익한 성분이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 또한, 당뇨 치료제, 결핵 치료제, 저·고혈압 치료제로 이용되고 있으며, 테스토스테론 수치 증진, 피로회복, 근육량 증가 및 근육 강화에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다(Rajeev et al., 2010, Fitoterapia 81, 669-679).
식물 조직배양 기술은 식물의 세포 및 기관을 연중 균일하게 대량생산하는 가장 보편적인 방법이다(Lee et al., 2008, Kor J Hort Sci Technol 26, 306-312). 그러므로 균일한 품질관리가 필요한 산업시장의 원료로 유리코마를 공급하기 위해서는 식물 조직배양 기술을 이용하여 대량생산하는 것이 수요자의 욕구를 만족시킬 수 있는 효과적인 생산방법이라고 할 수 있다. 최근 약용식물의 세포(Lee et al, 2006, J Plant Biol 49, 427-431), 체세포배(Shohael et al., 2008, Biochem Eng J 38, 270-273) 및 부정근(Jeong et al, 2009, Acta Physiol Plant 31, 219-222) 등의 식물조직에서 조직배양기술을 이용하여 생리활성 물질을 생산하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이 중 부정근을 이용한 배양은 배양체의 생장이 빠르고, 연속적인 증식과 안정적인 공급이 가능하며, 상업적 대량화가 용이하다(Kim et al, 2004, J Plant Biol 47, 336-56). 또한 조직배양기술을 이용하여 생리활성 물질을 생산하는 기내배양의 경우 환경조절이 용이하기 때문에 연중 균일한 품질의 생리활성 물질을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 인위적으로 함량을 증가시킬 수 있는 장점도 있다(Zhao et al., Biotechnol Adv 23, 283-333). 이를 이용한 방법을 엘리시테이션(elicitation)이라 하며, 생물적 엘리시터(elicitor) 또는 비생물적 엘리시터를 이용하여 미치광이풀(Scopolia parviflora) (Kang et al., 2004, Plant Sci 166, 745-751), 인삼(Panax ginseng) (Ali et al., 2005, Plant Sci 169, 83-92) 및 에키네시아(Echinacea purpurea ) (Wu et al., 2007, J Plant Biol 50, 636-643) 등 다양한 약용식물 부정근의 생리활성 물질 함량을 증가시키려는 실험들이 활발히 진행되었다.
본 발명에서는 식물 조직배양 기술을 이용하여 생장 및 생리활성 물질 함량이 증가된 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근을 유도하고자 하였다.
한편, 한국등록특허 제0842420호에는 '생물반응기를 이용한 에키네시아 속 식물의 부정근 대량생산 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1018843호에는 '펠라고니움 속 식물 부정근의 증식방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법에 대해서는 기재된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 또는 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid, NAA)의 옥신 처리 농도를 결정하여 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근 배양 배지 조건을 최적화하였고, 상기 배지를 이용하여 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 식물을 배양한 결과, 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량이 증가한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리를 옥신을 함유한 MS 배지에 접종하여 부정근을 유도한 후 유도된 부정근을 배양하는 단계를 포함하는 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성 물질 함량이 증대된 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물 부정근을 제공한다.
본 발명의 부정근 배양 방법을 이용하면 생장이 증진되고 생리활성 물질의 함량이 높은 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근을 효과적으로 대량 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 배양 방법으로 얻어진 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근의 바이오매스 및 생리활성 물질은 화장품, 식품, 향신료, 음료 및 자양 강장제 등의 제조에 이용할 수 있으므로, 산업적으로 매우 유용할 것으로 판단된다.
도 1은 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근의 유도 및 증식 과정을 나타낸다. 기내 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리에서 유도한 부정근을 페트리디쉬, 플라스크 및 생물 반응기를 이용하여 순차적으로 증식하였다.
도 2는 플라스크를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 초기 배지 내 옥신의 종류 및 농도가 유리코마 부정근의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (A) 생체중, (B) 부정근 형상을 나타낸다. IBA; 인돌부티르산(indole butyric acid), NAA; 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid).
도 3은 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 유리코마 부정근의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (A) 생물반응기 배양 모습, (B) 생체중을 나타낸다.
도 4는 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 pH에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 5는 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 전기 전도도(Electrical Conductivity, EC)에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 6은 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 수분 포텐셜에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 7은 유리코마 부정근 생산 과정을 나타낸다. 20ℓ 생물반응기에서 부정근을 증식하여 공장형 생물반응기를 이용하여 대량 생산 후, 건조 과정을 거쳐 최종 판매단계의 상품 생산 과정으로 이루어진다.
도 2는 플라스크를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 초기 배지 내 옥신의 종류 및 농도가 유리코마 부정근의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (A) 생체중, (B) 부정근 형상을 나타낸다. IBA; 인돌부티르산(indole butyric acid), NAA; 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid).
도 3은 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 유리코마 부정근의 생장에 미치는 영향을 측정한 결과이다. (A) 생물반응기 배양 모습, (B) 생체중을 나타낸다.
도 4는 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 pH에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 5는 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 전기 전도도(Electrical Conductivity, EC)에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 6은 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양 7주 후, 부정근 배양시 배지 종류가 배지 수분 포텐셜에 미치는 영향을 나타낸다. bz는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
도 7은 유리코마 부정근 생산 과정을 나타낸다. 20ℓ 생물반응기에서 부정근을 증식하여 공장형 생물반응기를 이용하여 대량 생산 후, 건조 과정을 거쳐 최종 판매단계의 상품 생산 과정으로 이루어진다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리를 옥신을 함유한 MS 배지에 접종하여 부정근을 유도한 후 유도된 부정근을 배양하는 단계를 포함하는 유리코마 속 식물 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 증대시키는 방법을 제공한다.
상기 부정근의 유도는 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 부정근 유도 배지에는 식물 생장조절제로서 IBA(indole butyric acid), IAA(indole acetic acid), NAA(naphthalene acetic acid), Kin(kinetin) 또는 BAP(benzyl amino purine) 등이 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 IBA 1~5mg/ℓ 및 설탕 10~50g/ℓ가 첨가된 3/4 MS 배지에서 식물체로부터 부정근을 유도할 수 있고, 더욱 바람직하게는 IBA 2~4mg/ℓ 및 설탕 20~40g/ℓ가 첨가된 3/4 MS 배지에서 식물체로부터 부정근을 유도할 수 있고, 가장 바람직하게는 IBA 3mg/ℓ 및 설탕 30g/ℓ가 첨가된 3/4 MS 배지에서 식물체로부터 부정근을 유도할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 부정근의 배양은 바람직하게는 40~60일 동안 수행될 수 있고, 가장 바람직하게는 49일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 옥신은 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 또는 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid, NAA)일 수 있고, IBA 처리 농도는 바람직하게는 1~5mg/ℓ, 더욱 바람직하게는 2~4mg/ℓ, 가장 바람직하게는 3mg/ℓ일 수 있으며, NAA 처리 농도는 바람직하게는 3~9mg/ℓ, 더욱 바람직하게는 4~6mg/ℓ, 가장 바람직하게는 5mg/ℓ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물은 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia), 유리코마 아피쿨라타(Eurycoma apiculata), 유리코마 하르만디아나(Eurycoma harmandiana) 또는 유리코마 라티폴리아(Eurycoma latifolia)일 수 있고, 가장 바람직하게는 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 생리활성 물질은 생체의 기능을 증진시키거나 또는 억제시키는 물질을 말하며, 페놀 화합물(phenolic), 플라보노이드(flavonoid), 안쓰라퀴논(anthraquinone), 이소플라본(isoflavone), 베타글루칸, 루틴(rutin), 제니스테인(genistein), 글리시테인(glycitein), 제아잔틴(zeaxanthin), 폴리페놀(polyphenol), 시린진(syringin), 프로폴리스(propolis), 레스베라트롤(resveratrol), 트리터펜(triterpen), 라이코펜(lycopene), 퀘르세틴(quercetin), 사포닌(saponin), 옥타코사놀(octacosanol), 피토스테롤(phytosterol), 진세노이드(ginsenoid), 안토시아닌(anthocyanin), 카테킨(catechin) 또는 감마리놀렌산(gamma linolenic acid) 등일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 생리활성 물질은 페놀 화합물(phenolic) 또는 플라보노이드(flavonoid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 생장 및 생리활성 물질 함량이 증대된 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물 부정근을 제공한다. 상기 유리코마 속(Eurycoma sp.) 식물 부정근은 상기한 유리코마 속 식물들의 부정근을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 식물의 부정근일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1)
부정근
유도 및 증식
유리코마 부정근을 유도하기 위하여 기내 배양 식물체의 잎, 줄기 또는 뿌리를 절단하여 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 1.0~5.0mg/ℓ, 설탕 10~50g/ℓ가 첨가된 1/4―1MS 배지(Murashige and Skoog, 1962, Physiol Plant 15, 473-497)에 치상하여 부정근을 유도하였다.
유도된 부정근을 0.5~1.5cm 간격으로 절단하여 동일 배지가 포함된 페트리디쉬, 플라스크 또는 생물반응기를 이용하여 유지, 증식시키며 실험 재료로 사용하였다. 배지는 1N NaOH 또는 1N HCl을 이용하여 pH 5.8로 조정 후, 121℃, 1.2 기압 조건에서 멸균하여 사용하였다. 모든 부정근은 22±1℃가 유지되는 암조건에서 6~8주 간격으로 연속 배양하였다(도 1).
2)
옥신(식물 생장조절 물질)의
종류 및 농도가 유리코마
부정근의
생장 및 생리활성 물질 생산에 미치는 영향
유리코마 부정근의 생장 및 생리활성 물질 축적에 적합한 옥신의 종류와 농도를 조사하기 위하여 설탕 30g/ℓ가 첨가된 MS 배지에 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid, NAA)을 각각 1, 3, 5, 7 및 9mg/ℓ로 처리하여 7주간 배양하였다.
배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후, 공기 용적이 250㎖인 삼각플라스크에 100㎖씩 분주하여 121℃, 1.2 기압에서 멸균하여 사용하였다. 배양은 생체중을 기준으로 5.0g/ℓ 접종 밀도로 부정근을 접종한 후, 22±1℃가 유지되는 암조건에서 100rpm 속도로 진탕 배양하였고, 각 처리군 당 5회 반복하였다. 배양 7주 후, 생장량 측정을 위해 생체중, 건물중 및 생체중에 대한 건물중 비율을 측정하였으며, 생리활성 물질로는 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다.
3)
배지 종류가 유리코마
부정근의
생장 및 생리활성 물질 생산에 미치는 영향
유리코마 부정근의 생장 및 생리활성 물질 축적에 적합한 옥신의 종류 및 농도를 조사하기 위하여, 선행 실험에서 부정근의 생장과 생리활성 물질 축적에 가장 효과적인 결과를 나타낸 IBA 3mg/ℓ 및 설탕 30g/ℓ를 첨가한 MS, 3/4MS, B5, DKW(Driver-Kuniyuk-Walnut) 및 WPM(Woody plant medium) 배지를 이용하였다. 상기 배지에 무기물 농도를 달리 처리하여 유리코마 부정근을 7주간 배양하였다.
배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후, 공기 용적이 3ℓ인 생물반응기에 2ℓ씩 분주하여 121℃, 1.2 기압에서 멸균하여 사용하였다. 배양은 생체중을 기준으로 5.0g/ℓ 접종 밀도로 부정근을 접종한 후, 22±1℃가 유지되는 암조건에서 0.05vvm(Air volume culture volume-1 min-1)으로 공기를 공급하며 배양하였고, 각 처리군 당 3회 반복하였다. 배양 7주 후, 생장량 측정을 위해 생체중, 건물중 및 생체중에 대한 건물중 비율을 측정하였으며, 생리활성 물질로는 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다. 기타 부정근의 생리특성을 파악하고자 배지의 pH, 전기 전도도(Electrical Conductivity, EC) 및 수분 포텐셜을 측정하였다.
4)
생장량 측정
배양 7주 후, 배지를 제거한 부정근을 흡습지를 이용하여 충분히 수분을 제거한 다음 생체중을 측정하였다. 생체중을 측정한 부정근을 60℃로 고정시킨 건조기에서 48시간 동안 건조시킨 후에 건물중을 측정하였으며, 생체중에 대한 건물중 비율은 Shohael 등(Shohael et al., 2006 Process Biochem 41, 1179-1185)의 방법에 따라 하기의 식을 이용하여 계산하였다.
생체중에 대한 건물중 비율 = (최종 수확한 건물중) / (최종 수확한 생체중)×100
5)
생리활성 물질 함량 측정
건조된 부정근 0.1g을 60~80%(w/v) 메탄올에 침지하여 냉각관이 부착된 환류 냉각 추출장치(LS-2050-S10, LS-TECH, 한국)를 이용하여 80℃에서 2시간 동안 추출하였다. 추출액은 여과지(Advantec 110mm, Toyo Rosihi Kaisha Ltd., 일본)를 이용하여 여과한 다음 50㎖로 정용하여 최종 추출물을 조제하였다.
Foline-Ciocalteu 시약이 추출물의 총 페놀 화합물에 의해 환원되면서 몰리브덴 청색으로 발색하는 Foline-Ciocalteu 방법(Foline and Ciocalteu, 1927 J Biol Chem 27, 627-650)에 기초한 Ali 등(Ali et al., 2006, Enz Microbial Technol 39, 982-990)의 방법을 이용하여 부정근의 총 페놀 화합물 함량을 측정하였다. 추출액 및 표준물질 용액 0.05㎖에 증류수 2.55㎖을 첨가한 뒤, 2N Foline-Ciocalteu 시약 용액(10배 희석; Sigma chemical Co., St. Louis, MO, 미국) 0.1㎖을 첨가하였다. 6분 뒤 혼합액에 20%(w/v) Na2CO3 용액 0.5㎖을 첨가하고, 30분간 암상태로 방치한 후에 분광광도계를 이용하여 760nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 물질로는 갈릭산(garlic acid, Sigma chemical Co., St. Louis, MO, 미국)을 사용하였으며, 부정근의 총 페놀 화합물 함량을 mg/g·DW로 나타내었다.
부정근의 총 플라보노이드 함량은 비색법(Colorimetric method)에 기초한 Sakanaka 등(Sakanaka et al., 2005 Food Chem 89, 569-575)의 방법에 따라 측정하였다. 추출액 및 표준물질용액 0.25㎖에 증류수 1.25㎖을 첨가한 뒤, 5%(w/v) NaNO2 용액 0.075㎖을 첨가하였다. 6분 뒤 혼합액에 10%(w/v) AlCl3 용액 0.15㎖을 첨가한 후, 5분간 방치한 다음 1N NaOH 용액 0.5㎖을 첨가하였다. 혼합액의 최종 부피가 2.5㎖이 되도록 증류수를 첨가한 뒤 분광광도계를 이용하여 510nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 (+/-) 카테킨(catechin) 표준용액(Sigma chemical Co., St. Louis, MO, 미국)을 사용하였으며, 부정근의 총 플라보노이드 함량을 mg/g·DW로 나타내었다.
6)
pH
와
EC
측정
부정근을 제거한 배지를 여과지(Advantec 110mm, Toyo Rosihi Kaisha Ltd., 일본)를 이용하여 여과하였다. 그 후 부정근 배양 배지의 pH 및 전기 전도도(Electrical Conductivity, EC)를 pH 미터(pH-Electrode SenTix 41, WTW GmbH, Weilhein, 독일) 및 EC 미터(TetraCon 325, WTW GmbH, Weilhein, 독일)를 이용하여 측정하였다.
7)
수분
포텐셜
측정
배양용기에서 채취한 배지를 여과지(Advantec 110mm, Toyo Rosihi Kaisha Ltd., 일본)를 이용하여 불순물을 제거한 다음 분석시료로 사용하였다. 분석시료는 5㎖씩 정용하여 샘플 챔버(sample chamber)에 넣고 밀봉하여 수분 포텐셜 측정기(WP4 Potentia Meter, Decagon, Washington, 미국)를 이용하여 측정하였다. 수분 포텐셜 측정기는 25℃ 실온에서 30분간 보정한 후 사용하였으며, 각 처리구 당 5회씩 반복하여 측정하였다.
실시예
1.
옥신의
종류 및 농도가 유리코마 론지폴리아(
Eurycoma
longifolia
)
부정근의
생장 및 생리활성 물질 생산에 미치는 영향
유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 부정근의 생장량 및 생리활성 물질 함량을 증가시키기 위하여 식물 생장조절 물질인 옥신을 처리한 후 부정근의 생장 및 생리활성 물질 함량을 측정하였다. 대표적인 옥신의 종류인 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 나프탈렌아세트산(α-Naphtalene acetic acid, NAA)을 각각 1, 3, 5, 7 및 9mg/ℓ로 농도를 달리 처리하여 7주간 배양하였다. 옥신을 처리하지 않은 배지를 대조구로 사용하였다. 배양 7주 후, 생장량 측정을 위해 생체중, 건물중 및 생체중에 대한 건물중 비율을 측정하였으며, 생리활성 물질로는 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다.
IBA 및 NAA의 농도를 달리 처리하여 배양한 부정근의 생리활성 물질 함량을 측정한 결과, IBA 및 NAA가 첨가된 배지에서 각각 7주간 배양한 부정근이 대조구에 비해 건물 1g 당 함유하고 있는 생리활성 물질 함량이 증가한 것을 확인하였다(표 1). 특히 IBA 3mg/ℓ 처리구에서 총 페놀 화합물 및 총 플라보노이드 함량이 대조구에 비해 각각 26% 및 34% 증가하여 건물 1g 내에 함유된 총 생리활성 물질 함량이 대조구에 비해 현저히 증가하였다. NAA를 5mg/ℓ 처리한 처리구에서도 총 페놀 화합물 및 총 플라보노이드 함량이 대조구에 비해 각각 24% 및 41% 증가하여 건물 1g 내에 함유된 총 생리활성 물질 함량이 대조구에 비해 현저히 증가하였다. IBA 및 NAA의 처리 농도가 증가할수록 부정근의 페놀 화합물 및 플라보노이드 함량이 대조군에 비하여 뚜렷이 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, IBA 및 NAA의 농도를 달리 처리하여 부정근을 배양한 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조구에 비해 IBA 및 NAA가 첨가된 배지에서 각각 7주간 배양한 부정근의 생체중 및 건물중이 모두 증가한 것을 확인하였다. 전체적으로 NAA를 5mg/ℓ 이상 처리한 조건에서 배양된 부정근의 생체중 및 건물중이 가장 많이 증가하였으나, 배양 8주 후 부정근이 짧고 비대된 형태를 나타내어 IBA를 최적 옥신으로 선택하고, IBA의 농도 3~7mg/ℓ를 적정 농도로 결정하였다.
상기 결과로서 IBA 및 NAA의 처리에 의해 유리코마 부정근의 생장량 및 생리활성 물질 함량이 증가되는 것을 확인하였고, 유리코마 부정근의 연속 배양에 적합한 최적 옥신의 종류 및 농도를 IBA 3mg/ℓ로 결정하였다.
z는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
NS; 유의하지 않음(no significant).
* 유의성; P ≤ 0.1
** 유의성; P ≤ 0.01
*** 유의성; P ≤ 0.001
실시예
2.
배지 종류가 유리코마
론지폴리아
(
Eurycoma
longifolia
)
부정근의
생장 및 생리활성 물질 생산에 미치는 영향
유리코마 부정근의 기내 대량생산에 적합한 배지 종류 및 농도를 결정하기 위하여 MS, 3/4 MS, B5, DKW(Driver-Kuniyuk-Walnut) 및 WPM(Woody plant medium) 배지를 이용하였다. 상기 배지에 선행 실험에서 최적 옥신으로 선별된 IBA를 3mg/ℓ 처리하고, 설탕을 3% 처리한 후, pH를 5.7로 조정한 후 생물반응기에서 7주간 배양하며 부정근의 생장량 및 생리활성 물질 함량을 측정하였다. 배양 7주 후, 생장량 측정을 위해 생체중, 건물중 및 생체중에 대한 건물중 비율을 측정하였으며, 생리활성 물질로는 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하였다.
배지 종류에 따른 부정근의 생장량을 측정한 결과 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 3/4 MS 배지 및 B5 배지 조건에서 7주간 생물 반응기를 이용하여 배양된 유리코마 부정근의 생체중 및 건물중이 가장 높았다. 3/4 MS 배지에 배양한 부정근의 생체중 및 건물중이 각각 31.07g/ℓ 및 3.22g/ℓ로 가장 높았으며, MS 배지에 비해 증가한 것을 확인하였다.
또한, 배양 7주 후 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양시 배지 종류에 따른 부정근의 생리활성 물질 함량을 측정한 결과, 3/4 MS 배지 조건에서 배양된 유리코마 부정근의 총 페놀 화합물(phenolic) 및 총 플라보노이드(flavonoid) 함량이 각각 7.04mg/g·DW 및 1.95mg/g·DW로 MS 배지에서 배양한 부정근에 비해 생리활성 물질 함량이 증가된 것을 확인하였다(표 3). 특히 3/4 MS 배지에서 배양된 유리코마 부정근 내의 생리활성 물질 함량이 B5 배지에서 배양된 부정근 내 생리활성 물질 함량보다 높아 최적 배지 조성으로 결정하였다.
z는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
z는 Duncan's multiple range 시험에 의한 5% 수준 이내의 평균치 검정을 나타낸다.
실시예
3. 배지 종류에 따른
부정근의
생리특성 측정
생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양시 배지 종류에 따른 부정근의 생리특성을 파악하고자 배지의 pH, 전기 전도도(Electrical Conductivity, EC) 및 수분 포텐셜을 측정하였다. 부정근을 제거한 배지를 여과지를 이용하여 불순물을 제거한 후, 분석 시료로 사용하였다.
배양 7주 후, 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양시 배지 종류가 pH에 미치는 영향을 측정한 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 배지 종류에 따른 pH는 약 5~6 정도로 큰 차이는 없는 것으로 나타났다.
배양 7주 후, 생물반응기를 이용한 유리코마 부정근 배양시 배지 종류가 전기 전도도 및 수분 포텐셜에 미치는 영향을 측정한 결과, 3/4 MS 배지의 전기 전도도는 약 4.0mS/cm인 것으로 나타났으며(도 5), 수분 포텐셜은 약 -0.3MPa인 것으로 나타났다(도 6).
뿌리를 일반적으로 이용하는 유리코마의 경우, 한국에서는 온도조건 때문에 자연 상태로는 대량 생산이 어렵다. 따라서 본 발명에서는 부정근 형태로 기내에서 공장형으로 대량 생산하여 생리활성 물질을 생산하는 방법으로 유리코마의 이용성을 높이고자 하였다(도 7). 본 발명의 기내 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리에서 유도한 부정근을 페트리디쉬, 플라스크 및 생물반응기를 이용하여 순차적으로 증식시키고, 유리코마 부정근의 기내 대량 생산에 적합한 옥신의 종류 및 농도, 배지 종류를 결정하였다. 본 발명의 유리코마 부정근 배양 방법을 이용하면 생장 및 생리활성 물질이 증진된 유리코마 부정근을 효과적으로 대량 생산할 수 있을 것으로 판단된다.
Claims (8)
- 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리를 2~4mg/ℓ 인돌부티르산(indole butyric acid, IBA) 및 20~40g/ℓ 설탕이 첨가된 3/4 MS 배지에 접종하여 부정근을 유도한 후 유도된 부정근을 40~60일 동안 배양하는 단계를 포함하는 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 식물 부정근의 생장 및 페놀 화합물(phenolic) 또는 플라보노이드(flavonoid) 함량을 증대시키는 방법.
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- 제1항의 방법에 의해 제조된 생장 및 페놀 화합물(phenolic) 또는 플라보노이드(flavonoid) 함량이 증대된 유리코마 론지폴리아(Eurycoma longifolia) 식물 부정근.
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SOBRI HUSSEIN외, ‘Adventitious roots induction of recalcitrant tropical woody plant, Eurycoma longifolia’ Romanian Biotechnological Letters Vol. 17, No. 1, 2012 (p7026~7035)* |
SOBRI HUSSEIN외, 'Adventitious roots induction of recalcitrant tropical woody plant, Eurycoma longifolia' Romanian Biotechnological Letters Vol. 17, No. 1, 2012 (p7026~7035) * |
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