KR101489916B1 - A method for extracting high purity collagen from animal byproducts - Google Patents
A method for extracting high purity collagen from animal byproducts Download PDFInfo
- Publication number
- KR101489916B1 KR101489916B1 KR20130039326A KR20130039326A KR101489916B1 KR 101489916 B1 KR101489916 B1 KR 101489916B1 KR 20130039326 A KR20130039326 A KR 20130039326A KR 20130039326 A KR20130039326 A KR 20130039326A KR 101489916 B1 KR101489916 B1 KR 101489916B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- collagen
- solution
- acid
- high purity
- tissue
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/20—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof from offal, e.g. rinds, skins, marrow, tripes, feet, ears or snouts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/275—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of animal origin, e.g. chitin
- A23L29/281—Proteins, e.g. gelatin or collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/65—Collagen; Gelatin; Keratin; Derivatives or degradation products thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
본 발명은 축산 부산물로부터 고순도 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질병 등으로부터 오염되지 않은 축산 부산물로부터 비 콜라겐 물질을 제거하여 고순도의 콜라겐을 추출 정제함으로써 식용, 화장품용 또는 의료용 원료로 사용할 수 있는 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for extracting high purity collagen from livestock by-products, and more particularly, to a method for extracting high-purity collagen from an uncontaminated livestock by- And a method for extracting high purity collagen which can be used.
Description
본 발명은 축산 부산물로부터 고순도 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질병 등으로부터 오염되지 않은 축산 부산물로부터 비 콜라겐 물질을 제거하여 고순도의 콜라겐을 추출 정제함으로써 식용, 화장품용 또는 의료용 원료로 사용할 수 있는 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for extracting high purity collagen from livestock by-products, and more particularly, to a method for extracting high-purity collagen from an uncontaminated livestock by- And a method for extracting high purity collagen which can be used.
콜라겐(collagen)은 몸속에서 결합조직을 이루는 주요한 단백질로, 신체구성 단백질 중 25 ~ 35 %의 매우 많은 부분을 차지한다. 인체 부분별 콜라겐 구성비를 보면, 이의 상아질 18%, 피부표피 아래 진피의 70%, 관절 연골의 50%, 뼈의 유기물 중 80%, 뼈와 근육을 이어주는 힘줄의 80% 그리고, 눈의 각막과 결막에서 주성분을 이루고 있다. Collagen is a major protein that binds to the body and occupies a very large portion of 25-35% of body composition proteins. The collagen composition ratio of the human body is 18% of the dentin, 70% of the dermis below the skin, 50% of the articular cartilage, 80% of the organic matter of the bone, 80% of the tendons connecting the bones and muscles, .
동물에서 발견되는 콜라겐은 대부분 제 1형 콜라겐으로, 300kDa의 단량체로 이루어져 있으며, 특정부위에 공유결합을 가지고 있다. 그렇기 때문에 성숙한 조직에서 발견되는 콜라겐은 낮은 용해성을 가진다. 또한 콜라겐을 구성하는 아미노산은 글루탐산, 하이드록시프롤린, 글리신, 프롤린 및 알라닌 등이며, 그 중 콜라겐에만 특이적으로 존재하는 하이드록시프롤린의 함량이 높은 것이 특징이다. The collagen found in animals is mostly Type I collagen, which is composed of a monomer of 300 kDa and has a covalent bond at a specific site. Therefore, collagen found in mature tissues has low solubility. The amino acids constituting the collagen are glutamic acid, hydroxyproline, glycine, proline and alanine, and the content of hydroxyproline, which is specifically present only in collagen, is high.
콜라겐은 나이가 들수록 체내에서 합성하는 능력을 잃게 되는데, 18세 정도가 되면 콜라겐 생성 속도는 급속히 떨어지기 시작하여 40세에는 18세에 비해 절반 이하가 되는 것으로 알려져 있다. 또한 나이가 들게 되면 신진대사가 둔해져, 오래된 콜라겐이 분해되지 않고 계속 축적되면 콜라겐을 합성하는 재료도 부족해짐으로써 노화가 촉진된다.As collagen becomes older, it loses its ability to synthesize in the body. At about age 18, the rate of collagen production starts to drop rapidly and is known to be less than half of that at
이러한 이유로 인해, 식품이나 화장품, 의약 관련 분야 등에서는 콜라겐 개발과 이를 이용한 화장품, 식용 및 생체 소재 개발 등에 대해 지속적으로 연구되고 있다. 지금까지는 소나 돼지에서 얻어진 콜라겐이 주로 이용되어 왔지만, 소에서 발생되는 광우병의 발병 이후로 소나 돼지 이외의 어류나 기타 축산물에서 유래하는 콜라겐이 주목을 받아 화장품이나 건강식품, 의약품 등의 원료로서 이용이 검토되고 있다. 이는 사람으로부터 진화적으로 멀리 떨어져 있는 하등척추동물인 어류나 기타 축산물에서 사람과 공통되는 감염증이 비교적 발견되어 있지 않고, 소나 돼지의 콜라겐에 비하여 안전성이 높기 때문이다. For this reason, in the field of food, cosmetics, and medicine, collagen development and cosmetics using it, and development of edible materials and biological materials are continuously studied. Collagen obtained from cattle and pigs has been mainly used until now, but after the outbreak of mad cow disease in cattle, collagen derived from fish and other livestock products other than cattle and pigs attracted attention and was used as a raw material for cosmetics, health foods and medicines Is under review. This is because infectious diseases common to humans in fish and other livestock products, which are evolutionarily far away from humans, are relatively uncommon, and they are more safe than cattle or pig collagen.
종래에 일반적인 콜라겐 소 돼지와 같은 축산물 외에 오징어 등의 어류나, 녹용, 닭발 등과 같은 동물의 특수 부위에서 콜라겐을 추출하는 방법이 알려지고 있다.Conventionally, there have been known methods for extracting collagen from special animal parts such as fish such as squid, antler, chicken leg, etc. in addition to livestock such as common collagen pork.
한국특허등록 제10-892605호에서는 닭발을 이용한 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물 제조방법과 이를 조미료에 활용하는 기술이 제안되어 있다. 여기서는 닭발을 염소계 소독제로 표백 및 살균하고, 열수 또는 단백질 분해효소로 콜라겐을 포함하는 단백질을 추출한 다음, 여과, 분리 및 농축하여 콜라겐 함유량이 높은 조미료용 추출물을 제조하는 기술이 제안되어 있다.Korean Patent Registration No. 10-892605 proposes a method for producing an extract for seasoning having high collagen content using chicken legs and a technique for utilizing the extract for seasoning. Here, techniques for bleaching and sterilizing chicken feet with a chlorine-based disinfectant, extracting proteins containing collagen by hydrothermal or proteolytic enzymes, and then filtering, separating, and concentrating them to prepare an extract for seasoning having a high collagen content is proposed.
한국특허공개 제2012-120571호에서는 오징어 내피 부분을 분리 선별 취합하고 알칼리 전해수에 세척하고 산성 전해수에 살균 소독하는 전처리 공정을 거친 오징어 내피를 10-20%의 수분율로 건조하고 분쇄한 다음 효소를 이용하여 가수분해하여 콜라겐 펩타이드를 추출하고 농축하여 스프레이 건조하는 콜라겐 펩타이드 제조에 관해 기술하고 있으며, 또 한국특허공개 제2012-134935호에서는 오징어 껍질을 건조 및 분쇄한 오징어 껍질분말에 수산화나트륨 수용액을 가하여 비콜라겐 단백질을 제거하고, 중화 및 수세한 다음 물과 뉴트라제 효소를 첨가하여 가수분해하고, 다시 플라보자임 효소로 2차 가수분해하여 여과, 건조하는 콜라겐 조성물의 추출방법이 제안되어 있다.Korean Patent Laid-Open Publication No. 2012-120571 discloses a method in which squid endothelial parts are separated and collected, washed with alkaline electrolytic water, sterilized and disinfected with acidic electrolytic water, and then squid endothelium is dried and pulverized at a moisture content of 10-20% In the Korean Patent Laid-Open Publication No. 2012-134935, squid skin powder dried and ground with squid bark is added with an aqueous solution of sodium hydroxide to prepare a collagen peptide. There has been proposed a method of extracting a collagen composition by removing collagen protein, neutralizing and rinsing, adding water and a Nutraceutical enzyme to hydrolyze the extract, secondarily hydrolyzing the extract with a flavonoid enzyme, and then filtering and drying.
한국특허등록 제10-1105603호에서는 동물 조직에서 산 용해, 펩신처리, 염 침전, 여과, 2차 산 용해, 2차 염 침전, 상 분리 및 농축, 산 용해 등을 거쳐서 콜라겐을 고순도로 처리하는 방법이 제안되어 있다. 여기서는 동물의 조직을 염산용액으로 연화시킨 후 펩신효소를 이용하고 인산용액에 넣어 콜라겐을 조직으로부터 분리해내고 염화나트륨으로 침전시킴으로써 효소분리된 콜라겐을 회수하는 방법과, 이를 다시 인산용액에 용해하고 희석한 후 제균 여과한 다음 염 침전시켜서 콜라겐을 분리하고 수분을 제거한 뒤 콜라겐 침전물을 가압, 농축하고 인산용액에 재용해하고 수산화나트륨용액으로 중화하여 콜라겐 용액을 제조방법을 제안하고 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출방법은 산과 염기 처리 및 효소처리 등을 이용하는 전형적인 추출방법으로서 공정이 복잡하고 순도가 좋지 못하여 상업화가 어려운 문제가 있다.Korean Patent Registration No. 10-1105603 discloses a method of treating collagen with high purity through acid dissolution, pepsin treatment, salt precipitation, filtration, secondary acid dissolution, secondary salt precipitation, phase separation and concentration, and acid dissolution in animal tissues Has been proposed. Here, the animal tissue is softened with a hydrochloric acid solution, and the collagen is separated from the tissue by using a pepsin enzyme, and the precipitated collagen is precipitated with sodium chloride to recover the enzyme-separated collagen, which is then dissolved in a phosphoric acid solution and diluted After removing the collagen by filtration and salt precipitation, the collagen precipitate is pressurized, concentrated, redissolved in the phosphoric acid solution and neutralized with the sodium hydroxide solution to propose a method of producing the collagen solution. However, such a collagen extraction method is a typical extraction method using an acid, a base treatment and an enzyme treatment, and has a problem in that it is difficult to commercialize it because the process is complicated and the purity is poor.
또한, 한국특허공개 제2012-76901호에서는 오리 날개와 오리발로부터 화장용 원료 및 식품 원료로 사용할 수 있는 콜라겐 함유량이 높은 콜라겐 추출물을 조제하기 위한 오리 콜라겐 제조방법을 개시하면서, 상기 날개 및 발의 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 후 -20℃이하에 급냉시키는 원료 전처리 단계와, 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하는 단계와, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하는 단계와, 추출에 사용한 염을 제거하는 탈염단계와, 이를 농축 건조하여 콜라겐 함유 건조물을 얻는 건조공정으로 구성되는 것을 특징으로 하는 오리의 콜라겐의 제조방법이 제안되어 있다. 그러나 이러한 콜라겐 추출 제조방법은 오리의 조직부위에서 산과 염기를 이용한 콜라겐을 추출방법으로서 지방제거와 건조 농축 등을 통해 콜라겐의 추출효율 개선에 주안점을 두고 있지만 기존의 전통적 방법을 벗어나지 못하고 있으며 콜라겐 함량이 비교적 낮고 그 순도 면에서도 고순도를 기대하기 어려워서 개선의 필요성이 있었다.
Korean Patent Laid-Open Publication No. 2012-76901 discloses a method for preparing duck collagen for preparing a collagen extract having high collagen content which can be used as cosmetic raw materials and food raw materials from duck wings and flippers, A raw material pre-treatment step of quenching each of the small pieces together with the husks at a temperature of less than -20 ° C, a step of removing bleached and excessive fats by using sodium hydroxide, and a step of removing soluble collagen extract , A desalting step of removing the salt used for extraction, and a drying step of obtaining a dried collagen-containing dried product by concentrating and drying it. However, this method of extracting collagen is a method of extracting collagen using an acid and a base at the tissue part of a duck, and it focuses on improvement of extraction efficiency of collagen through removal of fat and drying concentration. However, it does not escape from the conventional methods and collagen content It is difficult to expect a high purity from the viewpoint of its purity and there is a need for improvement.
위와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고 보다 고순도의 콜라겐을 효과적으로 추출하기 위한 방법을 연구한 결과, 질병 등으로 오염되지 않은 축산 부산물을 탈회 처리하고 지방을 제거한 다음, 콜라겐을 추출하고, 챠콜을 이용한 불순물 제거 및 투석, 농축 후, 정제 공정에서 알코올로 침전시키는 일련의 과정을 거치게 되면 식품, 화장품 또는 의약 등의 용도로 활용 가능한 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있다는 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.As a result of studying a method for efficiently extracting collagen with higher purity by resolving the problems of the prior art as described above, it has been found that the collagen is extracted by deliming livestock by-products which are not contaminated with diseases and the like, It is possible to obtain high-purity collagen which can be used for foods, cosmetics, medicines, or the like if a series of processes such as filtration, removal, dialysis, concentration, and precipitation with alcohol in the purification process are carried out.
따라서 본 발명은 축산 부산물로부터 고순도의 콜라겐을 추출하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for extracting high purity collagen from livestock by-products.
또한 본 발명은 식용, 화장품용 및 의료용 원료로 적용 가능한 고순도의 콜라겐을 포함하는 조직공학용 생체재료를 제공하는데 있다.
The present invention also provides a biomaterial for tissue engineering comprising high-purity collagen applicable to edible, cosmetic and medical raw materials.
위와 같은 과제 해결을 위해, 본 발명은 In order to solve the above problems,
질병으로 오염되지 않은 축산 부산물의 조직부위를 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비하는 단계;Preparing a cut tissue by cutting and washing the tissue part of the animal by-product uncontaminated with the disease;
절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액인 탈회용액 내에서 교반 및 초음파(Sonication) 처리하여 탈회시키고 세척하는 탈회단계;A demineralizing step of demineralizing and washing the cut tissue by agitation and sonication treatment in a demineralized solution having an acidic solution of pH 4.5 to 6.5;
탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거하는 지방제거 단계;Removing fat from the demineralized cleavage tissue in a base solution or an organic solvent;
지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계;A collagen extraction step of adding an organic acid solution to the cut tissue from which fat has been removed and extracting collagen by stirring;
콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 단계;Adding an activated charcoal having fine pores to the collagen solution obtained in the collagen extraction step to remove impurities by centrifugation;
불순물이 제거된 콜라겐 용액을 투석막에서 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 단계;Dialyzing the collagen solution from which the impurities have been removed by dialysis to remove salts, neutralizing and concentrating the collagen solution;
농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계; 및Washing the concentrated collagen solution and lyophilization to obtain a collagen powder; And
상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 60~100% 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 정제단계;A step of dissolving the collagen powder in an acid solution, centrifuging the mixture using an ultrafilter to collect the collagen, precipitating the precipitate in a 60 to 100% alcohol solution to collect precipitates to obtain high purity collagen;
을 포함하는 축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법을 제공한다.And a method for extracting high-purity collagen from an animal by-product containing lysine.
또한, 본 발명은 상기 얻어진 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 캐스팅하여 조직공학적 생체재료 용으로 제조된 콜라겐-PLGA 필름 또는 콜라겐-PLGA 지지체를 포함한다.
In addition, the present invention includes a collagen-PLGA film or a collagen-PLGA support prepared for tissue engineering biomaterial by casting the obtained high-purity collagen lyophilized collagen powder with PLGA.
본 발명은 기존에 버려지거나 미미하게 이용되어왔던 축산 부산물의 조직부위를 효과적으로 활용하여 고부가가치 재료로 활용하도록 할 수 있는 산업적 효과를 얻을 수 있으며, 특히 비 콜라겐성 물질을 제거하는 탈회 과정 중에 칼슘, 납 등의 금속이 제거되고 챠콜 등을 이용하여 불순물과 악취 등을 제거하는 등의 공정을 거쳐 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있는 효과가 있다.The present invention can provide an industrial effect that can effectively utilize tissue portions of livestock by-products which have been abandoned or minimally used, and can be utilized as high value-added materials. In particular, during the demineralization process for removing non-collagenous materials, Lead and the like are removed and the impurities and the odor are removed by using charcoal or the like, whereby high purity collagen can be obtained.
또한 본 발명에 따라 추출된 고순도 콜라겐은 순도가 매우 우수하여 동결건조하여 분말 상으로 이용하거나 이를 겔, 용액, 필름 또는 지지체로 제작하여 사용하는 경우 식용, 화장품용 및 조직공학용 재료나 다양한 의료용 원료로 매우 유용하게 활용할 수 있는 효과가 있는 것이다.
Also, the high purity collagen extracted according to the present invention has a very high purity and can be used as a powdery phase by freeze-drying, or in the form of a gel, a solution, a film or a support, and used as food, cosmetics and tissue engineering materials or various medical raw materials This is a very useful effect.
도 1 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 조성을 확인한 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 분석결과이다.
도 2 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 하이드록시프롤린 함량을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 3 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 단백질 함량을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 4 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 점성을 측정한 그래프로서, A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 본 발명의 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.
도 5 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐에 대한 동결건조한 뒤의 결과물 사진이다.
도 6 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐 겔을 조직공학적 재료의 제작에 사용하기 위해 준비한 겔 상태의 사진이다.
도 7 는 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐 용액을 조직공학적 재료의 제작에 사용하기 위해 준비한 용액 상태의 사진이다.
도 8 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 제작한 콜라겐 지지체의 일 구현예를 보여주는 사진이다.
도 9 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 일 구현예로 제작한 콜라겐-PLGA 하이브리드 필름 사진이다.
도 10 은 본 발명의 실시예에 따라 추출하여 얻어진 고순도 콜라겐을 이용하여 일 구현예로 제작한 콜라겐-PLGA 하이브리드 지지체 사진이다.FIG. 1 is a result of SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) analysis showing the composition for high purity collagen extracted and obtained according to the embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the content of hydroxyproline in high-purity collagen obtained by extraction according to an embodiment of the present invention. In FIG. 2, A is a collagen extracted as a comparative example and B is a high purity collagen extracted by the method of the present invention .
FIG. 3 is a graph showing protein content of high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention, wherein A is a collagen extracted as a comparative example, which is a conventional method, and B is a high purity collagen extracted in an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a graph showing the viscosity of high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention. In FIG. 4, A is a collagen extracted by a conventional method, and B is a high purity collagen extracted by an embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a photograph of the result after lyophilization of high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention.
FIG. 6 is a gel-like photograph prepared for use in the production of a tissue engineering material by high purity collagen gel extracted and obtained according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a photograph of a solution state prepared for use in the production of a tissue engineering material, a high purity collagen solution obtained by extracting according to an embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a photograph showing an embodiment of a collagen support prepared using high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 is a photograph of a collagen-PLGA hybrid film produced in an embodiment using high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a photograph of a collagen-PLGA hybrid support prepared in one embodiment using high purity collagen extracted and obtained according to an embodiment of the present invention.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail as an embodiment.
본 발명은 축산 부산물의 절단 조직 준비단계, 탈회단계, 지방제거 단계, 콜라겐 추출단계, 불순물 제거 단계, 농축 단계, 콜라겐 분말을 얻는 단계, 정제단계 등을 포함하여 고순도 콜라겐을 추출하는 것을 특징으로 한다.The present invention is characterized by extracting high purity collagen including a step of preparing a cleavage structure of animal by-products, a demineralization step, a fat removal step, a collagen extraction step, an impurity removal step, a concentration step, a step of obtaining collagen powder, .
이러한 본 발명의 추출방법은 종래에 비하여 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있으므로 식품, 화장품, 의료용 재료 등에 널리 활용할 수 있는 것이다.The extraction method of the present invention can obtain collagen of high purity as compared with the conventional method, and thus it can be widely used for foods, cosmetics, medical materials and the like.
본 발명은 축산 부산물의 절단 조직 준비단계에서 질병으로 오염되지 않은 축산 부산물의 조직부위를 선별 세척하여 절단하여 절단 조직을 준비한다. 이때 축산 부산물로서는 조류 또는 포유류의 조직부위가 사용될 수 있고, 바람직하게는 오리 또는 닭의 발, 머리, 날개의 조직부위가 사용될 수 있다. 세척은 증류수 등으로 세척하고 절단은 1~10mm 정도로 세절하는 것이 좋다.In the present invention, at the preparation stage of the cutting tissue of the livestock by-product, the tissue part of the livestock by-product not contaminated with the disease is selectively washed and cut to prepare a cut tissue. At this time, as a livestock by-product, algae or a mammalian tissue site may be used, preferably a tissue region of a duck or chicken's foot, head, and wing. Washing should be done with distilled water. Cutting should be done in 1 ~ 10mm.
탈회단계에서는 상기 절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액 내에서 교반 및 초음파 처리하여 조직을 연화시킨 다음 탈회시키고 세척하는 과정을 거친다. 이때 사용되는 산 용액으로서는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), HCl, 트리클로로아세트산(TCA) 및 포름산 중에서 선택된 산의 수용액이 사용될 수 있으며 그 중에서 에틸렌디아민테트라아세트산이 바람직하게 사용될 수 있다. 산 용액은 pH 4.5~6.5인 용액이 바람직한 바, pH가 4.5 보다 낮은 경우, 탈회단계에서 산 가용성으로 추출되어지는 콜라겐이 함께 추출되며, 조직이 산팽창되어 조직내의 섬유단백질 속으로 탈회용액의 침투가 어려워 추출 수율이 좋지 않게 되는 단점이 있다. 따라서, 상기와 같은 pH 4.5이상인 산 용액을 탈회과정에 사용함으로써 콜라겐의 수득율을 높일 수 있다. 그러나 위와 같은 pH가 높은 산성 탈회용액 사용 시 탈회시간이 3일~14일 정도로 길어지고 균일한 탈회가 이뤄지지 않는다는 단점이 있다. 그러므로 탈회과정 중에 4℃에서 초음파 처리를 하여 균일한 탈회가 이뤄지게 함과 동시에 탈회시간을 4~8시간으로 줄이고 조직의 연화 또한 돕게 된다. 산성의 탈회 용액은 일반적으로는 5~15% 농도의 산 수용액이 적당하고, 절단 조직의 5~10배의 부피비로 첨가하여 저온에서 탈회를 진행한다. 용액의 양이 조직 부피의 5배 미만일 경우에는 탈회의 완료에 어려움이 있고, 15배를 초과하는 경우에는 용액의 낭비가 크다는 문제점이 있다. 일반적으로 탈회의 완료점은 5% 암모늄술포네이트(Ammonium sulfate), 리튬카보네이트(Lithium carbonate) 등으로 확인할 수 있다.In the demineralization step, the cut tissues are agitated and sonicated in an acid solution of pH 4.5 to 6.5 to soften the tissue, followed by demineralization and washing. As the acid solution used herein, an aqueous solution of an acid selected from ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), HCl, trichloroacetic acid (TCA) and formic acid may be used, of which ethylenediaminetetraacetic acid is preferably used. The acid solution is preferably a solution having a pH of 4.5 to 6.5. When the pH is lower than 4.5, the collagen extracted with acid-soluble in the demineralization step is extracted together with the acid, and the acid is swollen to penetrate into the fibrous protein And the extraction yield is poor. Therefore, by using an acid solution having a pH of 4.5 or more as described above in the demineralization process, the yield of collagen can be increased. However, when the acidic demineralized solution having a high pH as described above is used, the demineralization time is prolonged to about 3 days to 14 days and a uniform demineralization is not performed. Therefore, during the demineralization process, ultrasonic treatment is performed at 4 ° C to achieve uniform demineralization, and the demineralization time is reduced to 4 to 8 hours, thereby softening the texture. An acidic solution is usually prepared in an aqueous acid solution at a concentration of 5 to 15%, and the solution is added at a volume ratio of 5 to 10 times the volume of the cut tissue. When the amount of the solution is less than 5 times the volume of the tissue, it is difficult to complete the demineralization. When the amount of the solution is more than 15 times, the solution is wasted. In general, the completion point of the demineralization can be confirmed by using 5% ammonium sulfate, lithium carbonate or the like.
지방 제거단계에서는 탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거한다. 염기 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘, 차아염소산나트륨 중에서 선택된 염기의 수용액, 또는 클로로포름과 에탄올의 혼합용액, n-헥산 중에서 선택된 유기용매 등을 사용할 수 있다. 그 중에서 클로로포름과 에탄올의 혼합용액이 바람직하게 사용될 수 있다. 염기 용액으로서는 0.5~2M의 염기 수용액을 사용할 수 있으며 pH 9 이하, 좋기로는 pH7.5~9가 바람직하다. pH가 9를 초과할 경우 지방뿐만 아니라 조직의 모든 단백질이 녹게 되어 수율이 낮아진다. 이러한 염기성 용액은 탈회가 완료된 절단 조직에 대해 1~10배의 량으로 첨가하여 바람직하게는 24~36시간 저온, 좋기로는 4℃에서 교반함으로서 지방의 제거가 이루어질 수 있다. 이렇게 지방을 제거하면 콜라겐을 제외한 칼슘, 납 등의 금속성분과 지방 등의 비 콜라겐 물질들이 제거될 수 있고 이런 과정을 거침으로서 추출되는 콜라겐의 순도가 더욱 좋아지게 된다.In the fat removal step, the demineralized tissue is removed from the base solution or the organic solvent. The base solution may be an aqueous solution of a base selected from sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide and sodium hypochlorite, or a mixed solution of chloroform and ethanol, or an organic solvent selected from n-hexane. Among them, a mixed solution of chloroform and ethanol can be preferably used. As the base solution, an aqueous base solution of 0.5 to 2 M can be used and a pH of 9 or less, preferably pH 7.5 to 9, is preferable. When the pH exceeds 9, not only the fat but also all of the proteins in the tissue are dissolved and the yield is lowered. The basic solution is added in an amount of 1 to 10 times to the cleavage tissue which has undergone demineralization, and the fat can be removed by stirring at a low temperature, preferably at 4 to 24 hours, for 24 to 36 hours. When the fat is removed, the non-collagen materials such as calcium and lead and metal components other than collagen can be removed, and the purity of extracted collagen is further improved through such a process.
콜라겐 추출단계에서는, 상기와 같이 지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 과정을 거친다. 여기서 사용되는 유기산 용액은 콜라겐을 용해할 수 있는 유기산이면 사용 가능하며, 바람직하게는 시트르산, 구연산, 초산 및 포름산 중에서 선택된 것이 사용될 수 있고, 이 중에서 시트르산이 더욱 바람직하게 사용될 수 있다. 지방이 제거된 절단 조직에 대해 3~8% 농도의 유기산 용액을 사용할 수 있고 1~20배의 부피비로 사용하여 24~48시간 저온 교반하면 조직에서 콜라겐이 추출된다. 이러한 유기산 용액으로의 추출은 수회 반복할 수 있다.In the collagen extraction step, an organic acid solution is added to the cut tissue from which fat has been removed as described above, and the collagen is extracted by stirring. The organic acid solution used herein may be an organic acid capable of dissolving collagen, and may be selected from among citric acid, citric acid, acetic acid and formic acid, among which citric acid may be more preferably used. Organic acid solution at a concentration of 3 ~ 8% can be used for the cut tissue from which the fat is removed. When the fat is mixed at 1 to 20 times volume ratio and stirred at low temperature for 24 ~ 48 hours, collagen is extracted from the tissue. Extraction with this organic acid solution can be repeated several times.
상기 추출된 콜라겐 추출 용액에 함유된 불순물 제거 단계에서는 콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 과정이다. 여기서 사용되는 챠콜은 과염소산칼슘(KClO4), 과염소산나트륨(NaClO4) 또는 이들의 혼합물을 사용하여 탄화물을 산화시켜 표면에 미세 다공구조를 형성시키는 방법으로 활성화된 챠콜을 콜라겐 추출 용액 에 대해 8~12g/L로 사용하는 것이 좋은데, 챠콜을 가하여 저온 교반한 다음 원심분리하여 불순물과 챠콜을 침전시켜 제거한다. 본 발명에 따르면 이러한 불순물의 제거로 제품의 순도가 증가할 뿐만 아니라, 부패나 악취의 원인을 제거하여 더욱 안정성이 보장된 제품을 만들 수 있다.In the step of removing impurities contained in the extracted collagen extraction solution, an activated charcoal formed by oxidizing the collagen solution obtained in the collagen extraction step is added to the activated charcoal and centrifuged to remove impurities. The charcoal used herein is a method of oxidizing carbide by using calcium perchlorate (KClO 4 ), sodium perchlorate (NaClO 4 ) or a mixture thereof to form a microporous structure on the surface, It is preferable to use 12 g / L. Charcoal is added, stirred at low temperature, and centrifuged to precipitate impurities and charcoal. According to the present invention, removal of such impurities not only increases the purity of the product, but also eliminates the cause of corruption and odor, thereby making the product more stable.
농축 단계에서는 상기와 같이 불순물이 제거된 콜라겐 용액에 염을 가하여 침전시키고 이를 투석막을 이용하여 증류수와 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 투석 외액으로 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 과정을 거친다. 이때 불순물이 제거된 콜라겐 용액에 염을 첨가하여 투석막으로는 예컨대 셀룰로오스 한외여과막에 충전하고 증류수를 이용하여 투석을 실시한다. 투석하는 과정에서 염이 제거되고 산성을 가지는 콜라겐 용액이 중성화되고 농축이 이루어진다. 이렇게 투석을 통해 농축된 콜라겐은 원심분리하고 세척하면 농축이 완료되는데, 이 경우 이를 동결건조하여 분말화하는 것이 다음 단계 진행을 위해서 바람직하다.In the concentration step, a salt is added to the collagen solution from which the impurities have been removed as described above, and the mixture is precipitated, dialyzed with distilled water and polyethylene glycol (PEG) using a dialysis membrane to remove salts, neutralized and concentrated. At this time, a salt is added to the collagen solution from which impurities have been removed, and the dialysis membrane is filled in, for example, a cellulose ultrafiltration membrane and dialyzed with distilled water. During dialysis, the salt is removed and the acidic collagen solution is neutralized and concentrated. The concentrated collagen through the dialysis is centrifuged and washed to complete the concentration. In this case, it is preferable to lyophilize and pulverize the collagen in order to proceed to the next step.
이를 위해, 분말화 단계로서 농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계를 거친다. 이때 세척은 일반적으로는 알코올 등으로 수회 세척하고 증류수에 재현탁하여 동결건조하는 과정을 거치게 된다.To this end, the powdered collagen solution is washed and lyophilized to obtain a collagen powder. In this case, washing is generally carried out by washing several times with alcohol or the like, resuspending in distilled water, and freeze-drying.
본 발명에 따르면 고순도 콜라겐을 얻기 위해, 정제단계로서 상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 과정을 거칠 수 있다. 이때 사용되는 산 용액은 탈회과정에서 사용된 것을 사용할 수 있는 데, 여기에 추가로 HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술포닉산)을 첨가하여 혼합용액으로 사용하는 것이 바람직하다. 가장 좋기로는 탈회용액으로 사용된 것 중에서 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)를 사용하고 여기에 HEPES를 첨가한 EDTA-HEPES 혼합용액을 사용하는 것이 좋다, 이렇게 산 용액에 녹인 콜라겐 용액 원심분리하여 일정 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거하는데, 울트라필터, 3,000~30,000 NMWL의 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거한다. 그 다음으로는, 이를 알코올 용액, 바람직하게는 60~100% 알코올 용액 중에서 12-36시간, 좋기로는 하루 침전시켜서 다시 저속 원심분리(1200~3000rpm, 3분, 20℃)로 좋기로는 10,000 NMWL이하, 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐만을 수거하면 정제된 고순도의 콜라겐을 얻을 수 있게 된다. 여기서 수거된 좋기로는 10,000 NMWL이하, 적어도 30,000 NMWL 이하의 콜라겐은 조직공학적으로 적용시 분해 및 흡수가 좋고, 염증반응 또한 줄여준다. 이렇게 수거된 고순도의 콜라겐은 활용성을 좋게 하기 위해 동결건조시키는 것이 바람직하다.According to the present invention, in order to obtain high-purity collagen, the collagen powder is dissolved in an acid solution as a purification step, centrifuged to collect collagen, and precipitated in an alcohol solution to collect precipitates to obtain high purity collagen. The acid solution used can be the one used in the demineralization process, which is further mixed with HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid) desirable. It is best to use EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) as the decalcifying solution and EDTA-HEPES mixed solution to which HEPES is added. The collagen solution dissolved in the acid solution is centrifuged to obtain a constant NMWL Only collagen is collected, and only collagen of at least 30,000 NMWL or less is collected by centrifugation using an ultrafilter, an ultrafilter of 3,000 to 30,000 NMWL. Next, it is precipitated in an alcohol solution, preferably a 60-100% alcohol solution for 12-36 hours, preferably a day, followed by slow centrifugation (1200-3000 rpm, 3 minutes, 20 ° C) NMWL or less, collagen of at least 30,000 NMWL or less is collected, and purified high purity collagen can be obtained. Collected here, preferably less than 10,000 NMWL, and at least 30,000 NMWL collagen, when applied in tissue engineering, is good for degradation and absorption, and also reduces inflammation. The high-purity collagen thus collected is preferably lyophilized to improve usability.
본 발명에 따라 이런 과정으로 추출한 고순도 콜라겐은 기존의 콜라겐보다 단백질 함량이 30% 이상 낮으며, 하이드록시프롤린 함량이 2배 가까이 높아서 기존에 비해 매우 우수한 순도를 가지는 것으로 얻어질 수 있다. 또한, type I 콜라겐이 대부분 차지하고 그 점도 또한 우수하므로 화장품, 식용, 의료생체 재료 등으로 매우 적합하다.According to the present invention, the high purity collagen extracted by such a process has a protein content of 30% or more lower than that of the existing collagen, and the hydroxyproline content is about twice as high as that of the conventional collagen. In addition, most of type I collagen is occupied and its viscosity is also excellent, so it is very suitable for cosmetics, food, medical biomaterial.
본 발명에 따라 추출한 고순도 콜라겐은 겔이나 용액 상태로 이용할 수 있고, 조작공학적 재료로 제작된 필름형이나 지지체로 만들어 사용될 수 있다.The high purity collagen extracted according to the present invention can be used in a gel or solution state, and can be used as a film type or a support made of an operation engineering material.
필름형은 예컨대 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA로 용매 캐스팅하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 필름으로 제조된 것을 포함한다. 이때 용매캐스팅은 분말 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하는 방법으로 하여 필름형으로 제작할 수 있다.Film types include those made from collagen-PLGA films made of tissue engineering biomaterial by solvent casting, for example, lyophilized collagen powder with PLGA. At this time, solvent casting can be made into a film type by adding PLGA and methylene chloride to the collagen obtained in powder form.
또한, 지지체는 역시 유사하게 분말 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 염 캐스팅 방법으로 하여 지지체로 제작할 수 있다.The support may also be made into a support by a salt casting method in which PLGA and methylene chloride are added to the collagen obtained similarly in powder form.
따라서 본 발명은 상기 얻어진 고순도 콜라겐을 동결건조한 콜라겐 분말을 PLGA를 이용하여 조직공학적 생체재료로 제조된 콜라겐-PLGA 필름 또는 콜라겐-PLGA 지지체를 포함한다.
Therefore, the present invention includes a collagen-PLGA film or a collagen-PLGA support made of a tissue engineering biomaterial using PLGA, the collagen powder obtained by freeze-drying the obtained high purity collagen.
상기와 같은 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
The present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited to the examples.
실시예Example
[절단 조직 준비단계][Cutting tissue preparing step]
오리발을 증류수에 하루 동안 담가 핏물을 제거하고 증류수로 여러 번 세척하였다. 오리발을 1mm ~ 10mm 크기로 잘게 절단하여, 이 절단 조직을 원료로 사용하였다. 절단한 원료를 -20℃ 이하의 냉장고에서 급속 동결시켜 보관하였다.The flippers were soaked in distilled water for one day to remove the blood and washed several times with distilled water. The flippers were finely cut into a size of 1 mm to 10 mm, and the cut tissue was used as a raw material. The cut material was stored in a refrigerator of -20 ° C or less and rapidly frozen.
[탈회단계][Termination phase]
상기 절단 조직의 10배(w/v)의 10% EDTA 용액을 첨가하여 4℃에서 1시간 교반 및 4시간 초음파 처리하여 탈회하였다. 탈회의 완료점은 5% 암모늄술포네이트 등으로 확인하였다. 탈회가 완료되면 조직을 증류수에 여러 번 세척하였다. 10% (w / v) 10% EDTA solution of the above cut tissues was added, and the mixture was demineralized by stirring at 4 ° C for 1 hour and sonication for 4 hours. The completion point of the demineralization was confirmed with 5% ammonium sulfonate or the like. After the demineralization was complete, the tissue was washed several times in distilled water.
[지방 제거단계][Fat Removal Step]
탈회를 마친 절단 조직을 지방제거를 위하여 클로로포름과 메탄올을 3 : 1로 섞은 용액을 사용하였다. 24시간 동안 4℃에서 250rpm으로 교반하여 지방제거 후 조직을 수거하여 증류수로 여러 번 세척한다.The cleaved tissue was used to remove fat by 3: 1 mixture of chloroform and methanol. After 24 hours of stirring at 250 rpm at 4 ° C, tissues are removed after fat removal and washed several times with distilled water.
[콜라겐 추출 단계][Collagen extraction step]
상기 지방이 제거된 절단 조직을 알코올과 아세톤을 이용하여 추가적으로 세척한 뒤, 5%의 시트르산을 8배수(w/v) 첨가하여 48시간 저온(4℃)에서 250rpm으로 교반하여 조직에서 콜라겐이 산성용액으로 녹아나오게 하였다. 이 콜라겐이 추출된 용액을 180~250㎛ 체에 걸러 녹지않은 조직은 수거하여 다시 산성 용액을 가하여 교반하였고, 추출된 용액은 냉장보관하였다.The cut tissue from which the fat was removed was further washed with alcohol and acetone, and then 8% (w / v) 5% citric acid was added and stirred at 250 rpm at low temperature (4 캜) for 48 hours. Solution. The solution from which the collagen was extracted was filtered through a 180-250 mu m sieve, and the unmelted tissue was collected, the acid solution was added again, and the extracted solution was refrigerated.
[불순물 및 악취 제거 단계][Steps for removing impurities and odors]
추출된 용액에 L당 10g의 활성화된 챠콜을 가하여 4시간 동안 저온에서 교반하였다. 이때 사용된 챠콜은 탄화물에 NaClO4를 첨가한 뒤 24시간 교반 후 세척하여 37℃ 인큐베이터에서 건조시켜 미세 다공질의 활성화된 챠콜을 사용하였다. 가해 준 챠콜을 제거하기 위해 원심분리(12000rpm, 20분, 4℃)하여 불순물과 챠콜을 침전시켰다. 상등액을 수거하여 2.0㎛ 필터페이터, 0.22㎛ 멤브레인에 차례로 통과시켜 남아있는 챠콜과 불순물을 제거하였다.10 g of activated charcoal per L was added to the extracted solution and stirred at low temperature for 4 hours. The charcoal used was prepared by adding NaClO 4 to the carbide, stirring it for 24 hours, washing it, and drying it in an incubator at 37 ° C to use microporous activated charcoal. To remove the charcoal, the impurities and charcoal were precipitated by centrifugation (12,000 rpm, 20 minutes, 4 ° C). The supernatant was collected and passed through a 2.0 탆 filter paper and a 0.22 탆 membrane in order to remove residual charcoal and impurities.
[투석 및 농축 단계][Dialysis and concentration step]
상기에서 얻은 용액에 1M의 염을 첨가하여 12~24hr 침전시킨 뒤, 셀룰로오스 한외여과막(3500Mw)에 충전시켜 24시간 이상 증류수를 투석외액으로 투석하여 염을 제거함과 동시에 산성 콜라겐 용액을 중성이 되게 하였다. 증류수는 1일 5회 이상 교환해주었다. 여기서는 48시간 투석한 뒤, 투석 외액을 폴리에틸렌글리콜로 바꿔주어 콜라겐 용액을 24시간 동안 농축시켰다. 농축이 완료된 콜라겐 용액은 수거하여 원심분리(12000rpm, 20분, 4℃) 한 뒤, 70% 알코올로 2회 세척하고 증류수에 재현탁시켜 동결건조하여 콜라겐을 파우더의 형태로 얻었다.A 1 M salt was added to the solution, and the solution was precipitated for 12 to 24 hours. Then, the solution was charged into a cellulose ultrafiltration membrane (3500 Mw), and distilled water was dialyzed for 24 hours or more with dialysis external solution to neutralize the acid collagen solution . Distilled water was exchanged more than 5 times a day. Here, after dialysis for 48 hours, the dialysis external solution was changed to polyethylene glycol, and the collagen solution was concentrated for 24 hours. The concentrated collagen solution was collected, centrifuged (12,000 rpm, 20 minutes, 4 ° C), washed twice with 70% alcohol, resuspended in distilled water and lyophilized to obtain collagen in the form of powder.
[정제단계][Purification step]
상기에서 얻은 콜라겐 파우더를 다시 산 용액에 녹인 뒤, 10mM 에틸렌디아민테트라아세트산-(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술포닉산(EDTA-HEPES) 용액과 1M의 NaCl을 가하여 30분 정도 교반하였다. 이 용액을 울트라필터(10,000 NMWL)를 사용하여 원심분리(8,000xg, 30분, 10℃)하고 필터에 걸러지는 콜라겐만 수거하였다. 수거된 콜라겐은 0.45㎛, 0.22㎛ 주사기 필터로 차례로 거른 뒤 60% 알코올을 3배수(w/v)로 넣어준 뒤, 냉장고에서 24시간 보관하여 침전시켰다. 이 침전물을 저속 원심분리(1200~3000rpm, 3분, 20℃)하여 수거한 뒤, 70, 80, 90, 95 및 100% 알코올에 차례로 탈수시켰다. 탈수가 완료 된 뒤 얻어진 콜라겐을 다시 증류수에 재 분산시켜 동결건조하였다.
The collagen powder obtained above was dissolved again in an acid solution, and 10 mM ethylenediaminetetraacetic acid- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (EDTA-HEPES) solution and 1M NaCl (8,000 × g, 30 minutes, 10 ° C.) using an ultrafilter (10,000 NMWL), and only the collagen filtered by the filter was collected. The collected collagen was collected through a 0.45 μm, 0.22 μm syringe filter (W / v) of 60% alcohol, and then stored in a refrigerator for 24 hours. The precipitate was collected by low-speed centrifugation (1200 to 3000 rpm, 3 minutes, 20 ° C) , 70, 80, 90, 95 and 100% alcohol. After completion of dehydration, the obtained collagen was redispersed in distilled water and lyophilized.
비교예Comparative Example
동일 시료에 대해 기존의 콜라겐 추출방법으로 오리발에서 뼈를 제거한 후, 껍질과 함께 각각 작은 크기로 세절한 뒤, 급냉시켜 이를 수산화나트륨을 이용하여 표백 및 과도한 지방을 제거하고, 산 및 염화나트륨을 이용하여 가용성 콜라겐 추출물을 제조하여, 염을 제거하고 이를 농축 건조하는 방법으로, 한국특허공개 제10-2012-0076901호에 명시된 실시예 1~5에서 제시하고 있는 전처리 단계, 지방제거단계, 콜라겐 추출단계, 탈염 및 농축단계 등을 거쳐 콜라겐 추출물을 얻었다.
For the same samples, the bone was removed from the flippers by the existing collagen extraction method, and the flour was cut into small pieces each with a small size, followed by quenching, followed by removal of the bleached and excessive fats by using sodium hydroxide, Soluble collagen extract is prepared, and the salt is removed and concentrated and dried. As a pretreatment step, a fat removing step, a collagen extraction step, and a collagen extraction step, which are shown in Examples 1 to 5 described in Korean Patent Publication No. 10-2012-0076901, Desalting and concentration steps, etc., to obtain a collagen extract.
실험예 1Experimental Example 1
[콜라겐 조성 분석][Analysis of collagen composition]
상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 조성을 알아보기 위하여 5% 겔을 사용하여 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 그 결과 도 1 에 도시한 바와 같이 분자량 200, 140, 120 kDa의 type I 콜라겐이 대부분임을 확인하였으며, type III 콜라겐도 다량 포함되어 있음을 확인하였다. 도 1의 S는 표준물질이고 A는 기존의 방법으로 추출한 콜라겐이며 B는 본 발명의 방법으로 추출한 콜라겐이다.
SDS-PAGE analysis was performed using 5% gel to examine the composition of collagen extracted from the above examples. As a result, as shown in FIG. 1, it was confirmed that type I collagen having molecular weights of 200, 140, and 120 kDa was mostly present, and that it contained a large amount of type III collagen. S in Fig. 1 is a standard substance, A is collagen extracted by the conventional method, and B is collagen extracted by the method of the present invention.
실험예 2Experimental Example 2
[콜라겐 및 단백질 함량 분석][Analysis of collagen and protein content]
상기 실시예에서 추출한 콜라겐의 콜라겐 함량을 측정하고자, 콜라겐이 분해될 때 특이적으로 분해되는 하이드록시프롤린 함량을 측정하여 콜라겐의 함량을 분석하였다. 하이드록시프롤린 함량 측정 결과 기존 방법의 추출법 보다는 본 발명의 추출법으로 추출한 콜라겐에서 하이드록시프롤린 함량이 2배 가까이 높음을 알 수 있었다. 그 측정 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.In order to measure the collagen content of the collagen extracted in the above examples, the content of hydroxyproline specifically decomposed when the collagen was decomposed was measured to analyze the content of collagen. As a result of the measurement of the hydroxyproline content, it was found that the content of hydroxyproline in the collagen extracted by the extraction method of the present invention was twice that of the conventional method. The measurement results are shown in Fig. In Fig. 2, A is collagen extracted as a comparative example, and B is high purity collagen extracted by the method of Example.
또한 이렇게 추출한 콜라겐이 기존의 방법과 비교하여 고순도의 콜라겐임을 추출했음을 확인하기 위하여 단백질 함량 분석을 실시하였다. 단백질 함량 분석은 Coomassie Plus Reagent (Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, USA) 을 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 3에서와 같이 기존의 방법보다 30% 정도 낮은 단백질을 함유하고 있음을 확인하였다. 도 3에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예로 추출한 고순도 콜라겐이다.
In order to confirm that the extracted collagen was extracted with high purity collagen as compared with the conventional method, the protein content was analyzed. Protein content was analyzed using Coomassie Plus Reagent (Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit, USA). As a result, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the protein contained about 30% lower than the conventional method. In FIG. 3, A is collagen extracted as a comparative example which is a conventional method, and B is high purity collagen extracted as an example.
실험예 3Experimental Example 3
[콜라겐 점도 분석][Analysis of collagen viscosity]
콜라겐의 점도는 점도계(Rheometer)를 이용하여 측정하였다. 동결건조 된 콜라겐을 0.5% 산용액에 50mg/mL의 농도가 되도록 첨가한 뒤, 2시간 동안 4에서 교반하여 0~ 50의 온도범위에서 절대 점도를 측정하였다. 점도 측정 결과 기존 방법의 추출법 보다는 본 발명의 추출법으로 추출한 콜라겐에서 점성이 3배 가까이 높음을 알 수 있었다. 그 측정 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 A는 기존의 방법인 비교예로 추출한 콜라겐이고 B는 실시예의 방법으로 추출한 고순도 콜라겐이다.
The viscosity of the collagen was measured using a rheometer. The lyophilized collagen was added to a 0.5% acid solution to a concentration of 50 mg / mL, and the mixture was stirred at 4 for 2 hours to measure the absolute viscosity in the temperature range of 0 to 50. As a result of the viscosity measurement, it was found that the viscosity of the collagen extracted by the extraction method of the present invention was three times higher than that of the conventional method. The measurement results are shown in Fig. In FIG. 4, A is collagen extracted by the conventional method, and B is high purity collagen extracted by the method of the embodiment.
이러한 실험예 1-3의 결과, 실시예에 따른 콜라겐 추출방법으로 얻어진 콜라겐은 비교예의 방법에서 얻어진 콜라겐에 비해 단백질 함량이 훨씬 적고 하이드록시플롤린 함량은 월등하게 높아서 비교예의 추출방법에 비해 고순도의 콜라겐을 추출할 수 있음이 확인되었고, 실시예에서 얻어진 콜라겐의 경우 비교에에 비해 점성도 훨씬 큰 것으로 확인되었다.
As a result of Experimental Example 1-3, the collagen obtained by the collagen extraction method according to the Example had much lower protein content and higher hydroxyproproline content than the collagen obtained by the method of Comparative Example, It was confirmed that collagen could be extracted, and it was confirmed that the collagen obtained in the examples was much higher in viscosity than the comparative example.
제조실시예Manufacturing Example
[콜라겐 겔, 용액, 필름 및 지지체 제작][Production of collagen gel, solution, film and support]
상기 실시예에 의해 추출하여 얻은 고순도 콜라겐 용액을 이용하여 겔, 용액, 필름 및 지지체를 각각 제작하였다. 그 제작에 사용된 실시예에서 얻어진 콜라겐을 동결건조한 형태는 도 5에 도시한 바와 같았다.A gel, a solution, a film, and a support were prepared using the high-purity collagen solution extracted and obtained in the above Example. The lyophilized form of the collagen obtained in the examples used for the production was as shown in Fig.
동결 건조된 콜라겐을 0.03%의 농도로 펩신이 첨가된 0.5% 산성용액에 50mg/mL로 첨가하여 2시간 동안 4에서 교반하여 고순도 콜라겐 겔을 얻었으며, 이 겔은 도 6에 도시한 바와 같다. 조직공학적 사용을 위해 사용 전 0.45, 0.22 um 실린지 필터에 차례로 통과시켜 멸균하였다. The lyophilized collagen was added to the 0.5% acidic solution to which pepsin had been added at a concentration of 0.03% at 50 mg / mL, and the mixture was stirred at 4 for 2 hours to obtain a high purity collagen gel. The gel was as shown in FIG. For tissue engineering use, sterilized by passing through a 0.45, 0.22 um syringe filter before use.
동결건조된 콜라겐을 0.3% 산성용액에 10mg/mL의 농도로 분산시켰으며, 이렇게 얻어진 콜라겐 용액은 도 7에 도시한 바와 같다. 조직공학적인 사용을 위해 0.45, 0.22 um 실린지 필터에 차례로 통과시켜 멸균하였다. The lyophilized collagen was dispersed in a 0.3% acidic solution at a concentration of 10 mg / mL, and the collagen solution thus obtained is as shown in FIG. Sterilized by passing through a 0.45, 0.22 um syringe filter in turn for tissue engineering use.
이 용액을 몰드에 넣고 냉동한 다음, 동결건조시키고, EDC[1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide ; 1-에틸-3-(3-ㄷ디디메틸아미노프로필)카보디이미드]로 가교하여 도 8과 같은 통상의 지지체를 완성하였다.This solution was frozen in a mold, lyophilized, and dissolved in EDC [1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; Ethyl-3- (3-dimethyldimethylaminopropyl) carbodiimide] to complete a conventional support as shown in Fig.
한편, 상기 실시예에서 정제 뒤 파우더 형태로 얻은 콜라겐에 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 용매 캐스팅 방법으로 도 9와 같은 콜라겐/PLGA 필름을 제작하였다. Meanwhile, PLGA and methylene chloride were added to collagen obtained in the form of powder after tablet purification in the above example, and a collagen / PLGA film as shown in FIG. 9 was prepared by a solvent casting method.
또한 PLGA와 메틸렌클로라이드를 첨가하여 염 캐스팅 방법으로 도 10과 같은 콜라겐/PLGA 지지체를 제작하였다. 그 다음, 이러한 조직공학용 지지체들은 70% 알코올, 감마선, 에틸렌옥사이드(EO) 가스를 이용하여 멸균하였다.In addition, PLGA and methylene chloride were added, and a collagen / PLGA support as shown in FIG. 10 was prepared by a salt casting method. These tissue engineering supports were then sterilized using 70% alcohol, gamma, or ethylene oxide (EO) gas.
도 9는 고순도 콜라겐을 용매 캐스팅 방법으로 제작한 콜라겐/PLGA 하이브리드 필름 사진이고, 도 10은 콜라겐/PLGA 하이브리드 지지체 사진을 보여주는 것이다.FIG. 9 is a photograph of collagen / PLGA hybrid film prepared by solvent casting of high purity collagen, and FIG. 10 is a photograph of collagen / PLGA hybrid support.
Claims (9)
절단 조직을 pH 4.5~6.5의 산 용액인 탈회용액 내에서 교반 및 초음파(Sonication) 처리하여 탈회시키고 세척하는 탈회단계;
탈회된 절단 조직을 염기 용액 또는 유기용매 내에서 지방을 제거하는 지방제거 단계;
지방이 제거된 절단 조직에 유기산 용액을 가하고 교반하여 콜라겐을 추출하는 콜라겐 추출단계;
콜라겐 추출단계에서 얻어진 콜라겐 용액에, 산화시켜 미세한 다공이 형성된 활성화된 챠콜을 콜라겐 용액에 대하여 8~12g/L로 첨가하고 원심분리하여 불순물을 제거하는 단계;
불순물이 제거된 콜라겐 용액을 투석막에서 투석하여 염을 제거하고 중성화한 다음 농축하는 단계;
농축된 콜라겐 용액을 세척하고 동결건조하여 콜라겐 분말을 얻는 단계; 및
상기 콜라겐 분말을 산 용액에 녹이고 3,000~30,000 NMWL의 울트라필터를 사용하여 원심분리하여 콜라겐을 수거한 다음, 60~100% 알코올 용액 중에서 침전시켜 침전물을 수거하여 고순도 콜라겐을 얻는 정제단계;
을 포함하는 축산 부산물로부터의 고순도 콜라겐의 추출방법.Preparing a cut tissue by selectively washing undiluted flies with the disease and cutting them as they are;
A demineralizing step of demineralizing and washing the cut tissue by agitation and sonication treatment in a demineralized solution having an acidic solution of pH 4.5 to 6.5;
Removing fat from the demineralized cleavage tissue in a base solution or an organic solvent;
A collagen extraction step of adding an organic acid solution to the cut tissue from which fat has been removed and extracting collagen by stirring;
Adding to the collagen solution obtained in the collagen extraction step an oxidized charcoal having fine pores formed therein is added to the collagen solution at 8 to 12 g / L and centrifuged to remove impurities;
Dialyzing the collagen solution from which the impurities have been removed by dialysis to remove salts, neutralizing and concentrating the collagen solution;
Washing the concentrated collagen solution and lyophilization to obtain a collagen powder; And
The collagen powder is dissolved in an acid solution, centrifuged using an ultrafilter of 3,000 to 30,000 NMWL to collect collagen, and precipitated in a 60 to 100% alcohol solution to collect precipitates to obtain high purity collagen;
Wherein the high-purity collagen is extracted from livestock by-products.
The method of extracting high purity collagen according to claim 1, wherein the acid solution used in the demineralizing step is an aqueous solution of an acid selected from ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), HCl, trichloroacetic acid (TCA) and formic acid.
The method of extracting high purity collagen according to claim 1, wherein the dialysis is performed using a dialysis membrane with distilled water and polyethylene glycol as an external dialysis fluid.
The method according to claim 1, wherein the acid solution used in the purification step is the same acid solution used in the demineralization step used in the demineralizing step, and is added with ethylenediaminetetraacetic acid- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethanesulfo Nitric acid) solution is added to dissolve the collagen extract, followed by centrifugation.
The method of extracting high purity collagen according to claim 1, wherein the precipitation in an alcohol solution is carried out for 12 to 36 hours in the purification step.
A collagen-PLGA film produced from a tissue engineering biomaterial by solution casting collagen powder obtained by freeze-drying high purity collagen extracted according to any one of claims 1, 3, and 7 to PLGA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130039326A KR101489916B1 (en) | 2013-04-10 | 2013-04-10 | A method for extracting high purity collagen from animal byproducts |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130039326A KR101489916B1 (en) | 2013-04-10 | 2013-04-10 | A method for extracting high purity collagen from animal byproducts |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140122532A KR20140122532A (en) | 2014-10-20 |
| KR101489916B1 true KR101489916B1 (en) | 2015-02-06 |
Family
ID=51993596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR20130039326A KR101489916B1 (en) | 2013-04-10 | 2013-04-10 | A method for extracting high purity collagen from animal byproducts |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101489916B1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180076478A (en) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 전북대학교산학협력단 | PLGA/Hydroxyapatite hybrid bone graft containing duck's feet-derived collagen and a fabrication method of it |
| KR102002275B1 (en) | 2019-03-14 | 2019-07-19 | 박호근 | Method of manufacturing fermented powder for removing odor from livestock by-products and method of using same |
| KR102281355B1 (en) * | 2020-12-02 | 2021-07-26 | 순천대학교 산학협력단 | Collagen liquid fertilizer using rendered cadaver residues and preparation method thereof |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101531479B1 (en) | 2014-11-21 | 2015-06-26 | 세원셀론텍(주) | High concentration collagen production method for use as medical materials |
| GB201708853D0 (en) | 2017-06-02 | 2017-07-19 | Jellagen Pty Ltd | Method |
| KR101969096B1 (en) * | 2019-01-29 | 2019-08-20 | 하태걸 | Composition of chicken feet mucus and producing method the same |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120076901A (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-10 | 주식회사 정다운 | Method of manufacture high concentration collagen extract using duck and extract from thereof |
-
2013
- 2013-04-10 KR KR20130039326A patent/KR101489916B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120076901A (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-10 | 주식회사 정다운 | Method of manufacture high concentration collagen extract using duck and extract from thereof |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180076478A (en) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 전북대학교산학협력단 | PLGA/Hydroxyapatite hybrid bone graft containing duck's feet-derived collagen and a fabrication method of it |
| KR101902198B1 (en) * | 2016-12-28 | 2018-09-28 | 전북대학교산학협력단 | PLGA/Hydroxyapatite hybrid bone graft containing duck's feet-derived collagen and a fabrication method of it |
| KR102002275B1 (en) | 2019-03-14 | 2019-07-19 | 박호근 | Method of manufacturing fermented powder for removing odor from livestock by-products and method of using same |
| KR102281355B1 (en) * | 2020-12-02 | 2021-07-26 | 순천대학교 산학협력단 | Collagen liquid fertilizer using rendered cadaver residues and preparation method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140122532A (en) | 2014-10-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101489916B1 (en) | A method for extracting high purity collagen from animal byproducts | |
| US7781158B2 (en) | Method of separating collagen from the various animal tissues for producing collagen solution and product using the same | |
| JP5774999B2 (en) | Collagen extract from aquatic animals | |
| US5420248A (en) | Unpigmented fish skin, particularly from flat fish, as a novel industrial source of collagen, extraction method, collagen and biomaterial thereby obtained | |
| JP4863433B2 (en) | Method for obtaining fish scale collagen | |
| KR101871395B1 (en) | Method for production collagen with high yield | |
| CN103772734A (en) | Preparation method of high-purity collagen protein sponge | |
| CN1653087A (en) | Collagen and method for producing same | |
| KR101760890B1 (en) | Preparing method of Collagen | |
| Siddiqui et al. | Isolation of pepsin-solubilized collagen (PSC) from crude collagen extracted from body wall of sea cucumber (Bohadschia spp.) | |
| JP2001211895A (en) | Method of producing physiologically active peptide | |
| KR101916759B1 (en) | The Method of High-yield and High-purity Manufacturing of Allo-collagen Composition Extracted From Human origin | |
| JP2006151847A (en) | Collagen peptide composition, method for producing the same and cosmetic composition | |
| JPH1017310A (en) | Collagen, production of hydroxyapatite and its product | |
| JP4587711B2 (en) | Soluble fish collagen, method for producing the same and collagen cosmetic | |
| CN105481978B (en) | Preparation method of high-purity collagen | |
| KR20120076901A (en) | Method of manufacture high concentration collagen extract using duck and extract from thereof | |
| JP5043215B1 (en) | Type II collagen obtained by a simple extraction method from sturgeon notochord | |
| Vázquez et al. | Tailor-made process to recover high added value compounds from fishery by-products | |
| Isnaini et al. | An update review: several extraction methods for collagen isolation in vertebrate fish | |
| KR101837118B1 (en) | A Method for Extracting Collagen using Bacterial Fermentation | |
| Jain et al. | Bioprocessing of Chicken Meat and Egg Processing Industries' Waste to Value‐Added Proteins and Peptides | |
| JP6324733B2 (en) | Collagen triple helical structure stabilizer | |
| TWI236501B (en) | Process for extracting soluble collagen from animal tissue and products containing soluble collagen prepared therefrom | |
| JP2006152108A (en) | Fish collagen composition and method for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171220 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181226 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200122 Year of fee payment: 6 |