KR101488778B1 - Xylitol producing microorganism deleted xylulose kinase gene and method of producing xylitol with high-yield using thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 기존의 변이주에서 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)를 추가적으로 제거한 생산균주 및 이를 이용하여 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산방법에 관한 것이다. 구체적으로, 자일룰로스 키나아제 유전자의 활성이 제거된 균주를 선별하였으며, 선별된 균주의 반복적인 발효실험을 통해 균주의 발효 생리학적 특성을 분석하여 공정을 최적화하고, 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 유지할 수 있는 균주 및 공정을 확립함으로써, 본 발명의 자일리톨 생산균주 및 생산방법이 고수율, 고생산성으로 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 것이다.The present invention relates to a production strain in which xylitol dehydrogenase ( XDH ) has been removed from a conventional mutant strains in which xylulose kinase ( XK ) has been additionally removed, and a method for producing xylitol which exhibits a high yield in a repeated fermentation process . Specifically, the strains in which the activity of the xylulose kinase gene was removed were selected, and the fermentation physiological characteristics of the strains were analyzed through repeated fermentation experiments of the selected strains to optimize the process, and a high yield was obtained in the repeated fermentation process The strain and the production method of the present invention are useful for producing xylitol with high yield and high productivity.

Description

자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 고수율의 자일리톨 생산방법{Xylitol producing microorganism deleted xylulose kinase gene and method of producing xylitol with high-yield using thereof}[0001] The present invention relates to a xylitol producing strain in which a xylitol kinase gene is deleted and a high yield xylitol producing method using the xylitol producing microorganism deleted xylitol gene and a method of producing xylitol with high-

본 발명은 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 기존의 변이주에서 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)를 추가적으로 제거한 자일리톨 생산균주 및 이를 이용하여 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a xylitol producing strain in which xylitol dehydrogenase ( XDH ) has been removed from an existing mutant strains in which xylulose kinase ( XK ) has been additionally removed, and xylitol producing strain having high yield in a repeated fermentation process ≪ / RTI >

자일리톨(xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하지만, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 설탕 대용 감미료로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄트(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성이 있어, 충치억제성분으로서도 산업적으로 널리 이용되고 있다.Xylitol (xylitol) is widely used as a functional sweetener replacing sugar because it has high sweetness as alcohol per pentane. Xylitol is similar in sweetness to sugar, but it is used as a substitute for sugar in diabetics because the metabolic process after ingestion is independent of insulin. In particular, it has a characteristic of inhibiting the growth of Streptococcus mutans , a cavity-inducing bacterium, and is widely used as an antifouling inhibitor in industry.

이러한 자일리톨은 현재 옥수수속대, 사탕수수대와 같이 자일로스(xylose)가 많이 함유된 반섬유소(hemicellulose) 가수분해물을 화학적으로 환원시키는 방법으로 생산되고 있다. 그러나 화학적 방법은 자일로스를 아라비노스, 포도당과 같은 다른 오탄당 및 육탄당 구성물들로부터 분리 및 정제하기가 어렵고 비용이 많이 들며, 이 과정에서 자일로스의 회수율이 50 ~ 60% 정도로 낮다. 또한, 수소가스 및 니켈촉매를 이용한 고온, 고압의 공정이므로 위험성과 환경적 문제가 존재한다는 단점이 있다.
Such xylitol is currently produced by a method of chemically reducing hydrolysates of hemicellulose containing a large amount of xylose, such as corncobs and sugarcane. However, the chemical method is difficult and costly to separate and purify xylose from other oligosaccharides such as arabinose, glucose, and hexose sugar components, and the recovery rate of xylose is as low as 50 to 60% in this process. In addition, since the process is a high-temperature and high-pressure process using hydrogen gas and a nickel catalyst, there is a disadvantage that there are risks and environmental problems.

근래에는 이러한 단점을 보완하기 위한 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법이 활발하게 연구되고 있다. 생물학적인 방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로서 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 공정 자체가 상온 및 상압에서 이루어지므로 안전하며 친환경적인 생산공정이다. 그리하여 고생산성, 고수율의 자일리톨 생산을 위해 다양한 세균(bacteria)과 효모 균주(yeast and fungi), 재조합 효모(recombinant yeast)를 통한 자일리톨 생산 연구가 진행되었다(Winkelhausen, E. et al., J. Ferment . Bioeng. 86:1-14, 1998; Granstrom, T. B. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 74:277-281, 2007). 그러나 세균과 재조합 효모 균주는 자일로스를 이용하는 대사경로가 약하거나 효율이 좋지 못해 산업적인 자일리톨의 생산에 적합하지 않았다. 하지만 효모 균주 중 캔디다 속(Candida sp.) 균주들은 다른 미생물에 비해 자일로스를 이용하는 능력이 뛰어나기 때문에, 자일리톨의 생산성과 수율이 높아 생물학적 자일리톨 생산에 적합한 균주로 알려져 있다.
In recent years, methods of producing xylitol by biological methods have been actively studied in order to overcome such drawbacks. The biological method is a safe and environmentally friendly production process because it can utilize xylose with a relatively low purity as a raw material compared to a chemical method and the process itself is performed at room temperature and normal pressure. Thus, studies on the production of xylitol through various bacteria, yeast and fungi, and recombinant yeast have been carried out for the production of xylitol with high productivity and high yield (Winkelhausen, E. et al., J. Chem . Ferment . Bioeng . 86: 1-14, 1998, Granstrom, TB et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 74: 277-281, 2007). However, bacterial and recombinant yeast strains were not suitable for the production of industrial xylitol due to weak or inefficient metabolic pathways using xylose. However, among the yeast strains, Candida sp .) strains are superior to other microorganisms in their ability to utilize xylose, and thus have high productivity and yield of xylitol, which is known as a strain suitable for the production of biological xylitol.

지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포 외부에서 흡수된 자일로스를 자일로스 환원효소(xylose reductase)에 의해 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)에 의해 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulokinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산화 과정(pentose phosphate pathway)을 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(Laplace, J. M. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb . Technol ., 16:933-943, 1994).
According to the study thus far, the Candida genus such as C. guillermondi , C. parapsilosis , and C. tropicalis has been found to be able to transform xylose absorbed from the outside of the cell into xylose The enzyme is converted to xylitol by xylose reductase and converted to xylulose by xylitol dehydrogenase. The xylulose is again converted to xylulose by xylulokinase. Is converted to xylulose-5-phosphate, which is known to be used for cell growth and maintenance through the pentose phosphate pathway (Laplace, JM et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 36: 158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb . Technol . , 16: 933-943,1994).

이에, 본 연구팀은 캔디다 속 균주에서 생성된 자일리톨이 자일리톨 탈수소효소에 의해서 다시 자일룰로스로 전환되어 감소된다는 점에 착안하여, 자일리톨 탈수소효소의 활성을 완전히 불활성화시킨 캔디다 트로피칼리스 변이주를 개발하였다(대한민국특허 제 10-0730315호). 이전까지는 자일리톨을 자일룰로스로 전환시키는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)의 작용억제를 위해, 세포 내의 산화환원력 불균형을 유발시키기 위한 배지 내의 산소공급제한이 필요했지만, 자일리톨 탈수소효소의 활성이 완전히 불활화된 변이주는 자일로스로부터 생산된 자일리톨이 더 이상 세포성장에 이용되지 못하게 하여, 산화환원력 불균형 유발의 필요성이 없다. 이런 방법으로 97% 내지 98%의 수율로 자일로스를 자일리톨로 생물전환할 수 있다.Therefore, the present inventors developed a Candida tropicallis mutant that completely inactivated the activity of xylitol dehydrogenase in view of the fact that the xylitol produced in the Candida genus was transformed into xylulose by the xylitol dehydrogenase to reduce it Korean Patent No. 10-0730315). Previously, in order to inhibit the action of xylitol dehydrogenase, which converts xylitol to xylulose, it was necessary to limit the oxygen supply in the medium to induce the redox potential in cells, but the activity of xylitol dehydrogenase was completely inactivated The mutant does not require xylitol produced from xylose to be used for cell growth anymore, and thus does not need to induce redox potential imbalance. In this way, xylose can be biotransformed to xylitol in a yield of 97% to 98%.

그러나 상기 변이주는 여러 세대(cycle) 배양을 할 경우, 자일리톨 탈수소효소 유전자의 재발현 혹은 비슷한 기능 효소 활성의 강화로 인해 끊어진 자일로스 대사회로가 복구되어 자일리톨의 수율, 생산성 등이 감소하는 문제점을 보였다. 이는 기업에서 산업적으로 자일리톨을 생산하는데 있어서 경제성을 떨어뜨리는 중요한 문제이며, 따라서 기존의 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스 돌연변이체에 추가적인 유전자 조작을 통하여 유전적인 안정성을 달성하고 유전체 안정성이 확보된 자일리톨 생산 미생물 균주를 개발하여 반복적인 발효공정에서도 높은 수율을 계속 유지할 수 있는 고생산성 고수율의 자일리톨 생산공정을 구축할 필요가 있다.
However, when the mutant strain is cultured for several generations, the xylitol dehydrogenase gene is reprogrammed or the function of the enzyme is restored, resulting in the recovery of the xylose metabolism cycle, thereby decreasing the yield and productivity of xylitol . This is an important issue that reduces the economical efficiency in producing industrial xylitol in industry. Therefore, it is possible to achieve genetic stability through additional genetic manipulation of the Candida tropicallis mutant in which the existing xylitol dehydrogenase has been eliminated, It is necessary to develop a high productivity and high yield xylitol production process capable of continuously maintaining a high yield in a repeated fermentation process by developing a production microorganism strain.

이에, 본 발명자들은 기존의 자일리톨 탈수소효소가 제거된 변이주의 자일로스 대사회로를 분석하여, 자일룰로스 이후의 대사경로 상에 존재하는 자일룰로스 키나아제(Xylulose kinase, XK)의 유전자 서열을 확보하여, 이를 선택적으로 제거하였고, 상기 자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 균주들의 자일룰로스 키나아제 활성 분석 실험과 대사 산물 생성 실험을 통해 자일룰로스 키나아제 유전자의 활성이 제거되었는지 확인하고 최적의 균주를 선별하였으며, 선별된 균주의 반복적인 발효실험을 통해 균주의 발효 생리학적 특성을 분석하여 공정을 최적화하고, 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 유지할 수 있는 균주 및 공정을 확립하여 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors analyzed the xylose metabolism circuit of the mutant strains in which the existing xylitol dehydrogenase has been removed, and obtained a gene sequence of Xylulose kinase ( XK ) present on the metabolic pathway after xylulose, , And it was confirmed that the activity of the xylulose kinase gene was eliminated through the assay of the xylulose kinase activity assay and the metabolite production experiment of the strains in which the xylulose kinase gene was removed and the optimal strain was selected , The present inventors have completed the present invention by optimizing the process by analyzing the fermentation physiological characteristics of the strains through repeated fermentation experiments of the selected strains and establishing strains and processes capable of maintaining a high yield in repeated fermentation processes.

본 발명의 목적은 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XHD)가 제거된 균주에 추가적으로 자일룰로오스 키나아제(xylulose kinase, XK) 유전자를 제거하여 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a xylitol producing strain which shows a high yield in a repeated fermentation process by removing xylulose kinase ( XK ) gene in addition to a strain from which xylitol dehydrogenase ( XHD ) has been removed will be.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주의 제조방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for producing xylitol producing strains which exhibits a high yield even in the repeated fermentation process.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주를 이용하여 자일리톨을 고생산성으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing xylitol with high productivity using the xylitol producing strain which exhibits a high yield even in the repeated fermentation process.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK) 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a recombinant vector comprising a xylulose kinase ( XK ) gene fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, a URA3 gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, A gene construct comprising the XK gene fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO.

또한, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트를 제공한다.The present invention also relates to a gene fragment comprising an XK gene fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, a URA3 gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and an XK gene fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: Provide trucks.

또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 자일리톨 탈수소효소가 녹아웃 된 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된, 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주를 제공한다.The present invention also provides a xylitol producing strain, which is produced by introducing the gene construct into a xylitol producing strain knocked out by a xylitol dehydrogenase, and exhibiting a high yield even in a repeated fermentation process.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 자일리톨 생산균주 제조방법을 제공한다:The present invention also provides a method for producing a xylitol producing strain comprising the steps of:

1) 자일룰로스 키나아제 유전자 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;1) preparing a xylulose kinase gene knockout cassette;

2) 상기 단계 1)의 녹아웃 카세트를 캔디다 속 균주에 형질전환하는 단계: 및2) transforming the knock-out cassette of step 1) into a Candida genus; and

3) 상기 단계 2)의 형질전환된 균주에서 자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 균주를 선별하는 단계.3) selecting strains from which the xylulose kinase gene has been deleted in the transformed strain of step 2).

아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 자일리톨 대량 생산방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method for mass production of xylitol comprising the steps of:

1) 상기 자일리톨 생산균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;1) culturing the xylitol producing strain in a medium containing a biomass hydrolyzate and a carbon source;

2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및2) producing xylitol from the cultured strain; And

3) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계.
3) separating xylitol from the culture.

본 발명의 자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 자일리톨 생산균주, 이의 제조방법 및 이를 이용한 자일리톨 대량 생산방법은, 기존의 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 자일리톨 생산균주가 반복적인 생산공정에서 자일로스(xylose) 대사회로의 복구로 자일리톨의 생산성이 감소하는 문제점을 해결하여, 반복적인 발효공정에서도 높은 수율을 계속 유지할 수 있는 고생산성 고수율의 자일리톨 생산공정을 구축하여 자일리톨을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
The xylitol producing strain of the present invention wherein the xylitol dehydrogenase ( XDH ) -removed xylitol dehydrogenase ( XDH ) -solubilized xylitol dehydrogenase gene of the present invention has been removed, The present invention solves the problem that the productivity of xylitol decreases due to the recovery of the xylose metabolism circuit and is useful for producing xylitol by constructing a high productivity high yield xylitol production process capable of maintaining a high yield even in a repeated fermentation process Can be used.

도 1은 기존의 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 균주의 문제점을 나타내는 도이다.
도 2는 자일로스 대사회로에서 자일리톨 탈수소효소 및 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)의 녹아웃(knock-out)을 나타내는 도이다.
도 3은 자일룰로스 키나아제 유전자를 녹아웃시키기 위한 녹아웃 카세트를 나타내는 도이다.
도 4는 녹아웃 카세트의 설계, 표적 유전자의 제거 및 이의 확인을 나타내는 도이다.
도 5는 blank - URA3 - blank 형태의 URA3 팝아웃 모듈을 나타내는 도이다.
도 6은 URA3 팝아웃 모듈의 제작 과정을 나타내는 도이다:
A: URA3 유전자가 있는 플라스미드 벡터에 순차적으로 상기 URA3 유전자의
왼쪽 및 오른쪽에 1.5 kb 서열의 삽입; 및
B: 제한효소에 의해 절단된, URA3 유전자가 포함된 단편.
도 7은 배양액 내의 모든 자일로스가 자일리톨로 전환되는 것을 확인한 도이다.
도 8은 50번의 반복적인 발효공정에 있어서 수율 및 생산성 유지를 확인한 도이다.FIG. 1 is a diagram showing a problem of a strain in which xylitol dehydrogenase ( XDH ) has been removed.
2 is a diagram showing knock-out of xylitol dehydrogenase and xylulose kinase ( XK ) in a xylose metabolism circuit.
3 is a diagram showing a knockout cassette for knocking out a xylulose kinase gene.
4 is a diagram showing the design of the knockout cassette, the removal of the target gene, and confirmation thereof.
5 shows a URA3 popout module of the blank- URA3 -blank type.
6 is a diagram showing a process of manufacturing the URA3 pop-out module;
A: Sequencing the plasmid vector carrying the URA3 gene with the URA3 gene
Insertion of a 1.5 kb sequence on the left and right; And
B: A fragment containing the URA3 gene, which was digested with restriction enzymes.
FIG. 7 is a view showing that all the xyloses in the culture liquid are converted into xylitol.
FIG. 8 is a graph showing the yield and productivity maintained in 50 repeated fermentation processes. FIG.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK)유전자 단편, 및 마커로서 사용되는 URA3 유전자를 포함하는, 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)에서 상기 유전자를 녹아웃 할 수 있는 녹아웃카세트(유전자 컨스트럭트)를 제공한다.The present invention relates to a knockout cassette capable of knocking out the gene in Candida tropicalis , which comprises a xylulose kinase ( XK ) gene fragment and a URA3 gene used as a marker, ).

XK의 첫 번째 일배체를 녹아웃 하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The gene to knock out the first haplotype of XK construct teuneun base to be written in XK gene fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, URA3 gene having a base sequence described in SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4 preferably it consists of XK gene fragment having the sequence, but not always limited thereto.

XK의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자, 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편으로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
The gene construct for knocking out the second day embryo of XK comprises an XK gene fragment having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5, a URA3 gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, and a nucleotide sequence having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 preferably it consists of XK gene fragment having the sequence, but not always limited thereto.

본 발명의 한 실시예에서, 자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주에 추가적으로 자일룰로스 키나아제를 제거하여 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주를 제조하였다. 구체적으로, 상기 자일룰로스 키나아제가 자일룰로스를 오인산 자일룰로스로 변환한다는 것에 기초하여, 자일리톨 탈수소효소 유전자의 재발현 혹은 비슷한 기능 효소 활성의 강화로 인해 끊어진 자일로스 대사회로가 복구되더라도 자일리톨이 대사되지 않도록 하기 위해, 자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주의 자일로스 대사회로에 관여하는 유전자(XK)를 녹아웃하였다(도 2 참조). 이때, 상기 유전자를 녹아웃하기 위한 녹아웃카세트를 구축하여, 이를 세포 내로 도입함으로써 각 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주를 제조하였다(도 4 참조).In one embodiment of the present invention, a xylitol producing strain producing a xylitol producing strain which is knocked out by a xylitol dehydrogenase additionally removes xylulose kinase to produce a high yield in a repeated fermentation process. Specifically, even when the xylitol dehydrogenase gene is repaired or the xylitol metabolic circuit that has been broken due to the enhancement of the similar functional enzyme activity is restored based on the fact that the xylulose kinase converts the xylulose to the xylulose orthophosphate, In order to prevent metabolism, a gene ( XK ) involved in the xylose metabolism circuit of the xylitol producing strain knocked out by xylitol dehydrogenase was knocked out (see Fig. 2). At this time, a knockout cassette for knocking out the gene was constructed and introduced into cells to produce a xylitol producing strain in which each gene was knocked out (see FIG. 4).

본 발명자들은 상기와 같이 제조한 자일로스 대사회로에 관여하는 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산속도의 변화와 반복된 발효공정에서의 수율을 확인하기 위하여, XK의 이배체가 모두 녹아웃된 균주(XK12K)를 자일로스 및 글루코스가 함유된 배지에서 탄소원으로서 포도당을 첨가하여 유가식 배양을 통해 생산되는 자일리톨의 양을 측정하였다. 그 결과, XK 유전자를 녹아웃 한 균주는 배지 내의 자일로스를 자일리톨로 효율적으로 전환하는 것을 확인하였고(도 7 참조), 50회의 반복된 발효공정에서도 자일리톨의 수율이 일정한 것을 확인하였다(도 8 참조).The present inventors have been to confirm that the yield in the change in the gene involved in the production xylose metabolism circuit knockout xylitol of the xylitol-producing strain production rate and repeating the fermentation process, all of the diploid a XK knockout strain as described above ( XK12K) was added to glucose as a carbon source in a medium containing xylose and glucose to measure the amount of xylitol produced through fed-batch culture. As a result, it was confirmed that the strain knocking out the XK gene effectively converted xylose in the medium to xylitol (see Fig. 7), and that the yield of xylitol was constant even in 50 repeated fermentations (see Fig. 8) .

따라서, XK 유전자의 녹아웃카세트는, 반복적인 발효공정에서도 자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 균주의 자일리톨 생산 수율이 고수율을 유지하기 위한 유전자 컨스트럭트로서 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the knockout cassette of the XK gene can be usefully used as a genetic construct for maintaining the yield of xylitol production of a strain in which xylitol dehydrogenase is knocked out even in a repeated fermentation process.

또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된, 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주를 제공한다.The present invention also provides a xylitol producing strain, which is produced by introducing the gene construct into a xylitol producing strain knocked out by a xylitol dehydrogenase, and exhibiting a high yield even in a repeated fermentation process.

상기 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주는 상기 XK의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 XK의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트를 도입하여 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.That the iterative xylitol production strain showing a high yield in the fermentation process are prepared by introducing a gene construct to knock out the second haplotype of a gene construct, and XK to knockout the first haplotype of the XK But is not limited thereto.

상기 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주는 상기 XK의 첫 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트 및 XK의 두 번째 일배체를 녹아웃하기 위한 유전자 컨스트럭트가 도입되어, 서열번호 1로 기재되는 XK 유전자의 이배체가 녹아웃된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Xylitol production strain showing a high yield, even the repetitive fermentation process a gene construct to knock out the gene construct, and the second haplotype of XK to knockout the first haplotype of the XK is introduced, SEQ ID NO: one preferred that the diploid the XK gene is described in the first knock-out is not limited to this.

상기 자일룰로스 키나아제가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주는 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)인 것이 바람직하고, 본 발명자들의 선행문헌(대한민국특허 출원번호 10-2009-0135380호)에 기재된, 자일리톨 탈수소효소가 불활화된 캔디다 트로피칼리스 균주(기탁번호: KCTC 11137BP)를 이용하여 제조한, 자일리톨 생산 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 자일리톨을 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이든지 사용가능하다.It is preferable that the xylitol producing strain in which the xylulose kinase is knocked out is Candida tropicalis , and the xylitol dehydrogenase described in the prior art (Korean Patent Application No. 10-2009-0135380) of the present inventors is inactivated (Accession number: KCTC 11137BP) produced by the cultured Candida tropicris strain. However, the present invention is not limited thereto, and any strains capable of producing xylitol can be used.

자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주에 XK 녹아웃카세트를 도입하여 제조한, 상기 유전자가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주는 배지 내의 자일로스를 자일리톨로 효율적으로 전환하는 것을 확인하였고, 50회의 반복된 발효공정에서도 자일리톨의 수율이 일정한 것을 확인함으로써, 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산균주로서 유용하게 사용될 수 있다.
It was confirmed that the gene producing xylitol producing strain prepared by introducing the XK knockout cassette into the xylitol producing strain knocking out the xylitol dehydrogenase effectively converted the xylose in the medium into xylitol, By confirming that the yield of xylitol is constant, it can be usefully used as a xylitol producing strain which shows a high yield even in a repeated fermentation process.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 유전자 컨스트럭트를 이용하여, 자일룰로스 키나아제가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주의 자일리톨 생산수율 유지 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for maintaining xylitol production yield of a xylitol producing strain in which xylulose kinase is knocked out using the gene construct according to the present invention.

자일리톨 탈수소효소가 녹아웃된 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 자일로스 대사회로에 존재하는 XK 유전자의 녹아웃카세트를 제조하여, 이를 이용하여 상기 유전자의 이배체가 모두 녹아웃된 균주를 제조하였고, 이와 같이 제조한 균주는 자일리톨 생산속도는 유지한 채, 반복적인 발효공정에서도 자일리톨 생산 수율을 고수율로 유지함을 확인함으로써, 상기 유전자를 제거하여 자일로스 대사회로를 차단하는 것은 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산 방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
A knockout cassette of the XK gene in the Xylose metabolism circuit was prepared from Candida tropicalis , a xylitol producing strain in which the xylitol dehydrogenase was knocked out, and a knockout cassette of all the diploids of the gene was knocked out using the cassette. The thus-produced strains were confirmed to maintain the yield of xylitol production at a high yield in a repeated fermentation process while maintaining the production rate of xylitol. Thus, blocking the xylitol metabolic pathway by removing the gene was effective in repeated fermentation processes Can be usefully used as a method for producing xylitol showing yield.

구체적으로, 상기 반복적인 발효공정에도 높은 수율을 나타내는 자일리톨 생산 방법은 하기의 단계를 포함하는 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:Specifically, the method for producing xylitol, which exhibits a high yield even in the repeated fermentation process, is preferably, but not limited to, a preparation method comprising the following steps:

1) 자일룰로스 키나아제 유전자 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;1) preparing a xylulose kinase gene knockout cassette;

2) 상기 단계 1)의 녹아웃 카세트를 캔디다 속 균주에 형질전환하는 단계: 및2) transforming the knock-out cassette of step 1) into a Candida genus; and

3) 상기 단계 2)의 형질전환된 균주에서 자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 균주를 선별하는 단계.3) selecting strains from which the xylulose kinase gene has been deleted in the transformed strain of step 2).

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 캔디다 속 균주에 추가적으로 자일룰로스 키나아제를 제거한 자일리톨 생산균주인 것이 바람직하며, 기탁번호: KCTC 11137BP로 기재되는 균주에 추가적으로 자일룰로스 키나아제를 제거한 자일리톨 생산균주인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the Candida genus of step 1) is any one selected from the group consisting of Candida albicans ( C. guillermondi ), Candida parapsilosis , and Candida tropicalis But it is not limited to this. It is preferable that xylitol-producing strain obtained by removing xylitol dehydrogenase ( XDH ) in addition to Candida genus strain further comprises xylitol producing strain, and in addition to the strain described in Accession No. KCTC 11137BP It is more preferable that xylitol-producing strains are obtained by removing xylulose kinase, but the present invention is not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 1)에서 자일룰로스 키나아제 유전자를 제거하기 위해서 본 발명의 바람직한 실시예에서는 녹아웃 카세트(knock-out cassette)를 이용하였으나, 당업계에 잘 알려진 유전자 제거 방법이라면 모두 사용가능하다. 또한, 상기 녹아웃 카세트는 자일룰로스 키나아제 1개 카피(copy)를 적중시킬 수 있는 것이 바람직하고, 4개 카피의 유전자까지 적중시킬 수 있는 것이 더욱 바람직하며, 8개 카피의 유전자까지 적중시킬 수 있는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
In the above method, a knock-out cassette is used in the preferred embodiment of the present invention in order to remove the xylulose kinase gene in step 1), but any method of gene removal well known in the art can be used . It is preferable that the knockout cassette is able to hit a copy of xylulose kinase, and it is more preferable to be able to hit up to four copies of the gene, and it is possible to hit up to eight copies of the gene Most preferably, but not limited thereto.

또한 본 발명의 자일리톨 생산균주를 이용한 자일리톨 대량생산 방법은 하기의 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:The method for mass production of xylitol using the xylitol producing strain of the present invention is preferably, but not limited to, the following steps:

1) 상기 자일리톨 생산균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;1) culturing the xylitol producing strain in a medium containing a biomass hydrolyzate and a carbon source;

2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및2) producing xylitol from the cultured strain; And

3) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계.3) separating xylitol from the culture.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 자일로스를 포함하는 모든 바이오매스가 사용가능하다.In this method, the biomass hydrolyzate of step 1) is preferably any one selected from the group consisting of corn steep hydrolyzate, hydrolyzate versus sugar cane hydrolyzate, coconut by-product, and hydrolyzate of birch, but is not limited thereto All biomass, including xylose, is available.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 균주 배양에 사용되는 모든 탄소원이 사용가능하다.In the above method, the carbon source of step 1) is preferably glucose, but not limited thereto, and all the carbon sources used for culturing the strain may be used.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 배양방법은 특별히 제한되지 않으며, 자일리톨 생산이 세포배양 배지를 포함하는 바이오리액터(bioreactor)와 같은 장치에서 1회 이상 배지가 보충되는 방식으로 이루어지는 유가 배양(fed batch culture), 추가 배지 보충 없이 처음 제공된 세포 배양 배지에서 단백질을 생산하는 회분 배양(batch culture), 또는 세포배양 배지가 주기적으로 또는 연속적으로 첨가되고 수확되는 방식의 관류 배양(perfusion culture) 등 당업계에 알려진 모든 세포 배양 방식을 사용할 수 있다.In the above method, the culturing method of step 1) is not particularly limited, and the production of xylitol may be carried out in a manner such that the medium is supplemented at least once in a device such as a bioreactor including a cell culture medium, culture, a batch culture that produces proteins in the cell culture medium initially provided without supplementing the medium, or a perfusion culture in which the cell culture medium is periodically or continuously added and harvested Any known cell culture method can be used.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 생산된 자일리톨의 생산성은 반복적인 발효공정에서도 3 g/L 이상인 것이 바람직하고, 3 내지 5 g/L인 것이 더욱 바람직하며, 4 내지 5 g/L인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In this method, the productivity of the produced xylitol in step 2) is preferably 3 g / L or more, more preferably 3 to 5 g / L, more preferably 4 to 5 g / L in the repeated fermentation process But is not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 배양은 25시간 이상 배양하는 것이 바람직하며, 40 ~ 60시간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the culture of step 3) is preferably performed for 25 hours or more, more preferably 40 to 60 hours, but is not limited thereto.

상기 방법에 있어서, 단계 3)에서 최종 분리된 자일리톨의 수율은 반복적인 발효공정에서도 80% 이상인 것이 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하며, 98% 이상인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
In the above method, the yield of xylitol finally separated in step 3) is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 98% or more in a repeated fermentation process, but is not limited thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

<< 실시예Example 1>  1> 자일룰로스Xylulose 키나아제Kinase (( xylulosexylulose kinasekinase ) 유전자의 녹아웃(Gene knockout knockknock -- outout ) 카세트() Cassette ( cassettecassette )의 제작) Production

<1-1> <1-1> 자일룰로스Xylulose 키나아제Kinase 유전자의 서열 결정 방법 Methods for sequencing genes

자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)가 불활화된 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 변이주 BSXDH3(I1)은 서열 전체가 밝혀져 있지 않아서 표적이 되는 유전자 서열을 밝히는 일을 우선 수행하였다. 원하는 유전자 서열을 얻기 위해 유연종의 해당 유전자 서열을 바탕으로 프라이머를 제작하여 PCR을 통해 서열을 증폭한 후, 서열분석을 통해 서열을 확인하였다. 캔디다 트로피칼리스의 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase) 유전자의 서열을 캔디다 알비칸스(C. albican), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis ), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 등 유연종의 유전자 데이터베이스를 바탕으로 프라이머 제작 및 PCR, 서열분석으로 확보하였다. The xylitol dehydrogenase inactivated Candida tropicallis ( Candida tropicalis ) mutant BSXDH3 (I1) was not identified in the entire sequence, so that the target gene sequence was first identified. In order to obtain the desired gene sequence, a primer was prepared based on the corresponding gene sequence of the flexible species, and the sequence was amplified by PCR and sequenced by sequence analysis. The sequence of the xylulose kinase gene of Candida tropicallis is referred to as Candida albicans, Pichia stipitis), a Saccharomyces Celebi Asia (Saccharomyces Based on the genomic database of lichen species such as S. cerevisiae, we obtained primer, PCR and sequence analysis.

구체적으로, 하기 표 1의 각각의 프라이머를 상기 유연종 간에 유전자 상동성이 높은 부위를 선택하여 제작하였으며, 상기 PCR은 캔디다 트로피칼리스의 게놈 DNA를 주형으로 하여 10×완충용액(MgCl2), 2.5 mM dNTPs, Taq DNA 중합효소(Takara, 일본) 및 각각의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃에서 5분, 97℃에서 1분간 변성, 57℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 3분간 신장의 조건으로 30회 반복하여 수행하였다. 상기 PCR 산물 및 pGEM-T Easy vector(Promega, 미국)를 약 100 ng씩 사용하여, 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 DH5α(RBCBioscience, 대만)에 형질 전환하여 앰피실린(ampicillin)이 함유된 플레이트에서 선별하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 서열분석(sequencing)을 통해 최종적으로 상기 유전자의 부분적인 서열을 확인하였다. 상기 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase, XK) 유전자의 부분적인 서열은 서열번호 1로 기재하였다.Specifically, each primer shown in Table 1 was prepared by selecting a region having high homology between the above-mentioned flexible species. The PCR was carried out using 10 × buffer solution (MgCl 2 ), 2.5 mM dNTPs, Taq DNA polymerase (Takara, Japan) and each pair of primers were subjected to denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 97 ° C for 1 minute, annealing at 57 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 3 minutes . The PCR product and pGEM-T Easy vector (Promega, USA) were reacted at 16 ° C for 16 hours by adding 1 unit of ligase using about 100 ng each. After the ligation reaction, the plasmid was transformed into DH5α (RBCBioscience, Taiwan) and selected on a plate containing ampicillin to obtain a plasmid containing the desired DNA fragment. DNA sequencing was performed to finally obtain the gene Were identified. The partial sequence of the xylulose kinase ( XK ) gene is shown in SEQ ID NO: 1.

프라이머 이름Name of the primer 정방향/역방향Forward / Reverse 서열order 서열번호SEQ ID NO: XKXK 정방향Forward ggagaagatggtgaagttataagtccggagaagatggtgaagttataagtcc 77 역방향Reverse gtctcttccatcttagctaacataccgtctcttccatcttagctaacatacc 88

<1-2> 녹아웃 카세트(<1-2> The knock-out cassette KnockKnock -- outout cassettecassette )의 제작 방법How to make

이배체의 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)를 녹아웃하기 위하여 URA3를 마커로 하는 카세트를 도 4에 나타낸 바와 같이 제조하였다(도 4). A cassette using URA3 as a marker was prepared as shown in Fig. 4 in order to knock out diploid xylulose kinase (Fig. 4).

구체적으로, 부분적으로 확보한 XK의 서열에서 카세트를 만드는데 이용하기 위한 60 bp 정도의 영역 8곳을 선정하였다(도 3). 첫 번째 카세트와 두 번째 카세트를 만들기 위해 사용한 영역을 포함하도록 벡터를 제작하였다(Bioneer, 한국). 녹아웃카세트에서 URA3 유전자 영역을 팝아웃(상동성 재조합을 통한)하기 위해, 1.5 kb 정도의 의미 없는 서열(발현되지 않는 부분, 단백질을 만들지 않는 부분)을 확보하였다. 이러한 팝아웃 방법을 이용한 균주에는 유전자의 녹아웃 후 1.5 kb 정도의 의미 없는 서열이 유전자상에 남아있게 되기 때문에 후에 이 균주를 산업적으로 사용할 시 문제가 되는 것을 방지하기 위해 안전하다고 알려진 바실러스 서브틸리스(Bacillus Subtilis)[GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물]의 아미노산 생합성 오페론 서열의 일부를 PCR을 통해 제조하였다(트립토판, 트레오닌, 아르기닌, 글루타민산, 류신의 영역). 상기 제조한 1.5 kb의 서열과 URA3 유전자를 이용하여 URA3 팝아웃 모듈을 완성하였다(blank - URA3 - blank 형태)(도 5). Specifically, eight regions of about 60 bp for use in producing a cassette in a partially secured sequence of XK were selected (Fig. 3). A vector was created to include the first cassette and the area used to make the second cassette (Bioneer, Korea). In order to pop out the URA3 gene region (via homologous recombination) from the knockout cassette, a sequence of about 1.5 kb in length (a non-expressed region, a region not creating a protein) was obtained. In order to prevent this strain from becoming a problem in industrial use after the knockout of the gene by using this pop-out method, since a meaningless sequence of about 1.5 kb remains on the gene, the Bacillus subtilis Bacillus (Tryptophan, threonine, arginine, glutamic acid, and leucine) of a subtilis (Generally Recognized As Safe) microorganism. The URA3 pop-out module was completed using the 1.5 kb sequence and the URA3 gene (blank- URA3 - blank form) (FIG. 5).

또한, 상기 URA3 팝아웃 모듈은 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 3 kb의 플라스미드 벡터에 1.7 kb URA3 유전자가 존재하고, 순차적으로 URA3 유전자의 왼쪽 및 오른쪽에 1.5 kb의 서열을 삽입하였다(도 6). 그런 다음, 도 3의 1st와 도 6의 B의 두 단편을 라이게이션(ligation)하여 첫 번째 일배체의 녹아웃벡터를 제조하고, HpaⅠ 효소로 절단하여 첫 번째 일배체의 녹아웃카세트를 제조하였다(도 4). 또한, 도 3의 2nd와 도 6의 B의 두 단편을 라이게이션(ligation)하여 두 번째 일배체의 녹아웃 벡터를 제조하고, SmaⅠ 효소로 절단하여 두 번째 일배체의 녹아웃 카세트를 제조하였다(도 4).
The URA3 pop-out module was manufactured as follows. A 1.7 kb URA3 gene was present in the 3 kb plasmid vector and a 1.5 kb sequence was inserted sequentially to the left and right of the URA3 gene (Fig. 6). Then, the first and second fragments of Fig. 3 and Fig. 6B were ligated to produce a knockout vector of the first uniaxial mutant, which was then digested with Hpa I enzyme to prepare a knockout cassette of the first uniaxial mutant 4). In addition, the two fragments of Fig. 3 and Fig. 6B were ligated to produce a knockout vector of the second monoclonal antibody and digested with SmaI enzyme to prepare a knockout cassette of the second monoclonal antibody (Fig. 4 ).

<< 실시예Example 2>  2> 자일룰로스Xylulose 키나아제가Kinase 녹아웃된 균주의 구축 Construction of knockout strains

<2-1> <2-1> 자일로스Xylose 탈수소효소의 발현이 억제된 캔디다  Candida suppressed the expression of dehydrogenase 트로피칼리스Trophy 구축 build

본 발명의 균주를 구축하기 위하여, 먼저 자일로스 탈수소효소 발현이 억제된 캔디다 트로피칼리스를 구축하였다.In order to construct the strain of the present invention, firstly Candida tropicallis suppressed the expression of xylose dehydrogenase was constructed.

구체적으로, 캔디다 트로피칼리스 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 이용한 PCR[94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분]을 수행하여, 캔디다 트로피칼리스 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 캔디다 트로피칼리스 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 pGEM-T easy 벡터(BIONEX, 한국)에 클로닝한 다음, 상기 자일리톨 탈수소효소의 유전자 중간에 BamH I 좌위에 URA3 유전자를 도입하여, 4.7 kb의 형질전환 벡터 pXYL2-URA3을 수득하였다.Specifically, PCR was carried out using 94 [deg.] C for 1 minute, 25 cycles (94 [deg.] C for 30 seconds, 58 [deg.] C for 30 seconds, 72 [deg.] C for 30 seconds) and 72 [deg.] C for 3 minutes using the Candida tropicoliosis genomic DNA as a template, To amplify the gene of Candida tropicalis xylitol dehydrogenase and to clone the gene of the amplified Candida tropicalis xylitol dehydrogenase into pGEM-T easy vector (BIONEX, Korea). Then, the gene intermediate of the xylitol dehydrogenase enzyme , The URA3 gene was introduced into the BamH I locus to obtain a 4.7 kb transforming vector pXYL2- URA3 .

프라이머 F: 5'-aatggtcttgggtcacgaatcc-3'(서열번호 9)Primer F: 5'-aatggtcttgggtcacgaatcc-3 '(SEQ ID NO: 9)

프라이머 R: 5'-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3'(서열번호 10)Primer R: 5'-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3 '(SEQ ID NO: 10)

상기에서 수득한 벡터 pXYL2-URA3을 캔디다 트로피칼리스에 도입하고, 이를 우라실(uracil)이 결핍된 선별용 고체 배지[효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L]에 도말하고 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 그런 다음, 고체 배지에서 형성된 콜로니를 자일로스가 포함된 고체 배지[효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L]와 포도당이 포함된 고체 배지[효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L]에 각각 접종하여 30℃에서 2일간 정치배양 하고, 자일로스가 포함된 고체 배지에서는 자라지 못하고, 포도당이 포함된 고체 배지에서만 자라는 균주를 선별하여, 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스를 수득하였다.
The vector pXYL2- URA3 obtained above was introduced into Candida tropiculis, and the resultant solid medium (yeast nitrogen base (amino acid) 6.7 g / L, glucose 20 g / L, agar powder 15 g / L] and cultured at 30 DEG C for 2 days. Then, the colonies formed in the solid medium were suspended in a solid medium (yeast nitrogen base (no amino acid) 6.7 g / L, glucose 20 g / L, agar powder 15 g / L) containing xylose and solid medium (6 g / L of yeast nitrogen base (no amino acid), 20 g / L of glucose, 15 g / L of agar powder]] and cultured at 30 ° C for 2 days. In the solid medium containing xylose, Were selected to obtain Candida tropicallis from which the xylitol dehydrogenase had been removed.

<2-2> <2-2> 자일리톨Xylitol 탈수소효소가 제거된 캔디다  Candida with dehydrogenase removed 트로피칼리스Trophy 균주에  In the strain 자일룰로Xylulose 스 The 키나아제Kinase 녹아웃 균주의 구축 Construction of knockout strains

상기 <실시예 1>에서 제조한 각각의 유전자 녹아웃 카세트를 여러 가지 조합으로, 자일로스 환원효소가 항구적으로 발현되는 자일리톨 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에 처리하여 자일룰로스 키나아제(xylulose kinase)가 녹아웃된 균주를 제조하였다. Each of the gene knockout cassettes prepared in Example 1 was treated with Candida tropicalis , a xylitol producing strain which is permanently expressed with xylose reductase, in various combinations, and xylulose kinase ) Was knocked out.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 제조된 선형의 녹아웃 카세트를 잘 알려진 효모의 유전자 도입법인 리튬아세테이트법(YEAST TRANSFORMATION-LIAC METHOD)을 이용하여 캔디다 트로피칼리스 변이주 BSXDH-3(기탁번호: KCTC 11137BP)에 도입하였다.
Specifically, the linear knock-down cassette prepared in Example 1 was transfected with Candida tropicaris mutant BSXDH-3 (accession number: KCTC 11137BP) using the well-known yeast gene introduction method of YEAST TRANSFORMATION-LIAC METHOD ).

<2-3> <2-3> 자일리톨Xylitol 탈수소효소가 제거되고,  The dehydrogenase is removed, 자일룰로스Xylulose 키나아제가Kinase 녹아웃된 캔디다  Knockout candy 트로피칼리스Trophy 균주의 선별 Selection of strains

상기 실시예 <2-2>의 방법으로 구축된 자일리톨 탈수소효소가 제거되고 자일룰로스 키나아제가 녹아웃된 캔디다 트로피칼리스 균주를 선별하였다.The Candida tropicallis strains in which the xylitol dehydrogenase constructed by the method of Example <2-2> was removed and the xylulose kinase was knocked out were selected.

구체적으로, 우라실(uracil)이 결핍된 선별용 고체 배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천 가루 20 g/L)에 도말한 후 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 우라실 결핍 배지에서 생존한 균주들을 대상으로 PCR을 수행하였으며 상기의 카세트들이 유전체에 정상적으로 삽입된 균주를 선별하여 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) 변이주들을 수득하였다. Specifically, the cells were plated on a selective solid medium (yeast nitrogen base (amino acid-free) 6.7 g / L, glucose 20 g / L, agar powder 20 g / L) deficient in uracil and allowed to stand for 2 days at 30 ° C. Lt; / RTI &gt; PCR was performed on the strains that survived in the uracil-deficient medium, and the strains in which the cassettes were normally inserted into the genome were selected, and Candida tropicallis tropicalis mutants were obtained.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, XK12K 균주는 XK 이배체가 모두 녹아웃된 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in Fig. 4, it was confirmed that XK12K strain knocked out all the XK diploids.

<< 실시예Example 3> 선별된 균주의 발효 생리학적 특성 분석 3> Analysis of fermentation physiological characteristics of selected strains

상기 <실시예 2>의 방법으로 수득된 자일리톨 탈수소효소가 제거되고, 자일룰로스 키나아제가 녹아웃된 균주의 발효 생리학적 특성을 분석하였다.The xylitol dehydrogenase obtained by the method of Example 2 was removed and the fermentation physiological characteristics of the strain knocked out with xylulose kinase were analyzed.

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 유전자형을 확인한 XK12K 균주의 자일리톨 생산속도를 측정하기 위하여, 자일로스 50 g/L, 포도당 20 g/L, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 5 g/L, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.2 g/L 및 효모추출물 10 g/L가 포함된 배지에서 30℃, 200 rpm에 42시간 동안 배양하였다. 이때, 탄소원으로는 포도당 1.25 g/L를 배양 후 13시간 뒤부터 1시간 간격으로 총 8회 첨가하였다. Specifically, in order to measure the xylitol production rate of the XK12K strain in which the genotype was confirmed in Example 2, 5 g / L of xylose, 20 g / L of glucose, 20 g / L of potassium dihydrogenphosphate (KH 2 PO 4 ) L, 0.2 g / L of magnesium sulfate (MgSO 4揃 7H 2 O) and 10 g / L of yeast extract were incubated at 30 ° C and 200 rpm for 42 hours. At this time, 1.25 g / L of glucose was added as a carbon source for 8 hours from 1 hour after 13 hours.

그 결과, 도 7에서 나타낸 바와 같이 발효를 시작한 지 42시간이 지나면 배양액 내의 모든 자일로스가 자일리톨로 전환되는 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in Fig. 7, it was confirmed that all of the xylose in the culture broth was converted to xylitol after 42 hours from the start of fermentation.

<< 실시예Example 4> 높은  4> High 자일리톨Xylitol 수율을 유지할 수 있는 균주 및 공정의 개발 Development of strains and processes that can maintain yields

또한, 상기 <실시예 2>의 방법으로 수득된 균주를 이용하여 높은 자일리톨 수율을 유지할 수 있는 공정을 확립하였다. In addition, a process capable of maintaining a high xylitol yield by using the strain obtained by the method of Example 2 was established.

24시간마다, 상기 <실시예 3>의 배지를 5 L 발효 중인 배양액과 100 mL씩 교체하여 이를 50회 반복하였다.The medium of Example 3 was replaced with 100 ml of the culture broth in which 5 L of fermentation was being performed every 24 hours, and this was repeated 50 times.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 최종적으로 반복적인 발효공정에도 5 L의 실험실 배치규모(lab scale)에서 90시간 유가배양(fed-batch)하였을 때, 최종 자일리톨 농도가 200 g/L, 생산성 4 내지 5 g/L-hr, 수율은 98%를 유지할 수 있는 유전체가 안정된 균주 및 공정을 개발하였다. As a result, as shown in FIG. 8, when the final fermentation process was fed-batch for 90 hours on a laboratory scale of 5 L, the final xylitol concentration was 200 g / L, productivity was 4 To 5 g / L-hr, and a yield of 98%.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Xylitol producing microorganism deleted xylulose kinase gene and method of producing xylitol with high-yield using thereof <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1667 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> patial XK gene <400> 1 ggagaagatg gtgaagttat aagtcctgtc gccatgtggc tcgactccct caactacgtc 60 ttcaactcca tgaaacagga caagttccca tttggtaaag tcgtgggtat cagtggatcc 120 ggacagcagc atgggtccgt gtactggagc aaacaagcta atgagctctt atctgacttg 180 aagccaaacg aggacttggc agagcagttg aaagacgcgt tctcgtggga gtactcacca 240 aactggcaag accactcaac tttgaaagaa gccgatgcat tccatgaagc cgtgggtaag 300 gagaacttgg cgaagattac tggatccaga gcacatttga gattcaccgg gttgcagatt 360 aggaaattcg ccaccagatc acacccagag gagtatgctg aaacctcgag gatctccttg 420 gtgtcgtcgt tccttactag tgtgttgatt ggtcaggttg cgggcttgga agagagcgat 480 gcctgtggta tgaacttgta tgatattaca aagagtgagt acaatgaaga gttgttggct 540 ttgggtgctg gtgtgcatcc aaagatcgat ggtgttgaga agagtgatcc 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1440 ccagtgaatg ggaactataa agtcgagatc cctaatgcgt gtgccttagg tggtgcatac 1500 aaggccagct ggtcgtatgc atgtgagcaa aagggcaaga tgattagcta cggagagtac 1560 attaacaagt tgtttgatac gaatgacgag ttggaccagt tcaaggtgga cgacaggtgg 1620 gtggagtatt ttgaaggtgt cggtatgtta gctaagatgg aagagac 1667 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1F <400> 2 aactacgtct tcaactccat gaaacaggac aagttcccat ttggtaaagt cgtgggtatc 60 agt 63 <210> 3 <211> 1692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3 <400> 3 gatctggttt ggattgttgg agaatttcaa gaatctcaag atttactcta acgacgggta 60 caacgagaat tgtattgaat tgatcaagaa catgatcttg gtgttacaga acatcaagtt 120 cttggaccag actgagaatg cacagatata caaggcgtca tgtgataaaa tggatgagat 180 ttatccacaa ttgaagaaag agtttatgga aagtggtcaa ccagaagcta aacaggaaga 240 agcaaacgaa gaggtgaaac aagaagaaga aggtaaataa gtattttgta ttatataaca 300 aacaaagtaa ggaatacaga tttatacaat aaattgccat actagtcacg tgagatatct 360 catccattcc ccaactccca agaaaaaaaa aaagtgaaaa aaaaaatcaa acccaaagat 420 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atattgtaat aaataggtct atatacatac actaagcttc taggacgtca 1320 ttgtagtctt cgaagttgtc tgctagttta gttctcatga tttcgaaaac caataacgca 1380 atggatgtag cagggatggt ggttagtgcg ttcctgacaa acccagagta cgccgcctca 1440 aaccacgtca cattcgccct ttgcttcatc cgcatcactt gcttgaaggt atccacgtac 1500 gagttgtaat acaccttgaa gaacggcttc gtctgaccct tgagcttcgc ctcgttgtaa 1560 tgattataca catccaacgc ttccaacctc gataaatgga tcttctgcac ttttgaaatc 1620 gggtactgga tcgcaagcaa cgagaacgcc gccgatgctc cggcaagcaa cacaaacgag 1680 gacttcaaga tc 1692 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1R <400> 4 gattagctac ggagagtaca ttaacaagtt gtttgatacg aatgacgagt tggaccagtt 60 60 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2F <400> 5 gggtccgtgt actggagcaa acaagctaat gagctcttat ctgacttgaa gccaaa 56 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2R <400> 6 catcaagaaa atgggttcca ttttcggacc agtgaatggg aactataaag tcgagatccc 60 60 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XK_F <400> 7 ggagaagatg gtgaagttat aagtcc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XK_R <400> 8 gtctcttcca tcttagctaa catacc 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_F <400> 9 aatggtcttg ggtcacgaat cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_R <400> 10 gctctgacca agtcgtaggc ttc 23 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Xylitol producing microorganism deleted xylulose kinase gene and          method of producing xylitol with high-yield using thereof <160> 10 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 1667 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> patial XK gene <400> 1 ggagaagatg gtgaagttat aagtcctgtc gccatgtggc tcgactccct caactacgtc 60 ttcaactcca tgaaacagga caagttccca tttggtaaag tcgtgggtat cagtggatcc 120 ggacagcagc atgggtccgt gtactggagc aaacaagcta atgagctctt atctgacttg 180 aagccaaacg aggacttggc agagcagttg aaagacgcgt tctcgtggga gtactcacca 240 aactggcaag 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agaagacggt aagatcgtcg catgtgacat ggacagccat 1140 ggattcaccg tggacgacga cgcaaacgcc attgttgaat cccaaacctt gagttgtaga 1200 ttaagagcag gtcctatgtt gagcaactcg tctgattcat ccagcgacaa cgagtcctct 1260 gaatccacca aggacttaga acgcatctac tccgacttga ccaagaagtt cggtgacttg 1320 tacactgacg gcaagaagca gtcctttgag tccttgaccg ccagaccaaa cagatgctac 1380 tatgttggag gtgcatcgaa caaccccagc atcatcaaga aaatgggttc cattttcgga 1440 ccagtgaatg ggaactataa agtcgagatc cctaatgcgt gtgccttagg tggtgcatac 1500 aaggccagct ggtcgtatgc atgtgagcaa aagggcaaga tgattagcta cggagagtac 1560 attaacaagt tgtttgatac gaatgacgag ttggaccagt tcaaggtgga cgacaggtgg 1620 gtggagtatt ttgaaggtgt cggtatgtta gctaagatgg aagagac 1667 <210> 2 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1F <400> 2 aactacgtct tcaactccat gaaacaggac aagttcccat ttggtaaagt cgtgggtatc 60 agt 63 <210> 3 <211> 1692 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> URA3 <400> 3 gatctggttt ggattgttgg agaatttcaa gaatctcaag atttactcta acgacgggta 60 caacgagaat tgtattgaat tgatcaagaa catgatcttg gtgttacaga acatcaagtt 120 cttggaccag actgagaatg cacagatata caaggcgtca tgtgataaaa tggatgagat 180 ttatccacaa ttgaagaaag agtttatgga aagtggtcaa ccagaagcta aacaggaaga 240 agcaaacgaa gaggtgaaac aagaagaaga aggtaaataa gtattttgta ttatataaca 300 aacaaagtaa ggaatacaga tttatacaat aaattgccat actagtcacg tgagatatct 360 catccattcc ccaactccca agaaaaaaaa aaagtgaaaa aaaaaatcaa acccaaagat 420 caacctcccc atcatcatcg tcatcaaacc cccagctcaa ttcgcaatgg ttagcacaaa 480 aacatacaca gaaagggcat cagcacaccc ctccaaggtt gcccaacgtt tattccgctt 540 aatggagtcc aaaaagacca acctctgcgc ctcgatcgac gtgaccacaa ccgccgagtt 600 cctttcgctc atcgacaagc tcggtcccca catctgtctc gtgaagacgc acatcgatat 660 catctcagac ttcagctacg agggcacgat tgagccgttg cttgtgcttg cagagcgcca 720 cgggttcttg atattcgagg acaggaagtt tgctgatatc ggaaacaccg tgatgttgca 780 gtacacctcg ggggtatacc ggatcgcggc gtggagtgac atcacgaacg cgcacggagt 840 gactgggaag ggcgtcgttg aagggttgaa acgcggtgcg gagggggtag aaaaggaaag 900 gggcgtgttg atgttggcgg agttgtcgag taaaggctcg ttggcgcatg gtgaatatac 960 ccgtgagacg atcgagattg cgaagagtga tcgggagttc gtgattgggt tcatcgcgca 1020 gggggacatg gggggtagag aagaagggtt tgattggatc atcatgacgc ctggtgtggg 1080 gtggatgat aaaggcgatg cgttgggcca gcagtatagg actgttgatg aggtggttct 1140 gactggtacc gatgtgatta ttgtcgggag agggttgttt ggaaaaggaa gagaccctga 1200 ggtggaggga aagagataca gggatgctgg atggaaggca tacttgaaga gaactggtca 1260 gttagaataa atattgtaat aaataggtct atatacatac actaagcttc taggacgtca 1320 ttgtagtctt cgaagttgtc tgctagttta gttctcatga tttcgaaaac caataacgca 1380 atggatgtag cagggatggt ggttagtgcg ttcctgacaa acccagagta cgccgcctca 1440 aaccacgtca cattcgccct ttgcttcatc cgcatcactt gcttgaaggt atccacgtac 1500 gagttgtaat acaccttgaa gaacggcttc gtctgaccct tgagcttcgc ctcgttgtaa 1560 tgattataca catccaacgc ttccaacctc gataaatgga tcttctgcac ttttgaaatc 1620 gggtactgga tcgcaagcaa cgagaacgcc gccgatgctc cggcaagcaa cacaaacgag 1680 gacttcaaga tc 1692 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR1R <400> 4 gattagctac ggagagtaca ttaacaagtt gtttgatacg aatgacgagt tggaccagtt 60                                                                           60 <210> 5 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2F <400> 5 gggtccgtgt actggagcaa acaagctaat gagctcttat ctgacttgaa gccaaa 56 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HR2R <400> 6 catcaagaaa atgggttcca ttttcggacc agtgaatggg aactataaag tcgagatccc 60                                                                           60 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XK_F <400> 7 ggagaagatg gtgaagttat aagtcc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XK_R <400> 8 gtctcttcca tcttagctaa catacc 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_F <400> 9 aatggtcttg ggtcacgaat cc 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_R <400> 10 gctctgacca agtcgtaggc ttc 23

Claims (15)

서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편, 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 URA3 유전자 및 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 갖는 XK 유전자 단편으로 구성된 유전자 컨스트럭트.
 XK gene fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 and the URA3 gene having the nucleotide sequence described by the XK gene fragment, SEQ ID NO: 3 having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, And a gene construct consisting of a XK gene fragment having the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: XK gene fragment having the nucleotide sequence represented by 5, SEQ ID NO: URA3 gene, and SEQ ID NO: 6 having the nucleotide sequence described by the script.
삭제delete 제 1항의 유전자 컨스트럭트를 자일리톨 탈수소효소가 제거된 자일리톨 생산 균주에 도입하여 제조된 캔디다 속(Candidia sp.) 자일리톨 생산균주.
A production strain of Candidia sp. Xylitol produced by introducing the gene construct of claim 1 into a xylitol producing strain from which xylitol dehydrogenase has been removed.
제 3항에 있어서, 상기 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주.
4. The method of claim 3 wherein the Candida strain is characterized in that in any one of Candida old boiler Mondi (C. guillermondi), selected from the group consisting of Candida chamber hijacking in cis (C. parapsilosis), and Candida Tropical faecalis (C. tropicalis) Xylitol &lt; / RTI &gt;
제 3항에 있어서, 상기 자일리톨 생산균주는 서열번호 1로 기재되는 XK 유전자의 이배체가 녹아웃된 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주.
4. The xylitol producing strain according to claim 3, wherein the xylitol producing strain is knocked out of the diploid of the XK gene of SEQ ID NO: 1.
제 3항에 있어서, 상기 자일리톨 생산균주는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 캔디다 속 균주에 추가적으로 자일룰로스 키나아제를 제거한 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주.
4. The xylitol-producing strain according to claim 3, wherein the xylitol producing strain is a strain of Candida genus in which xylitol dehydrogenase ( XDH ) has been removed, in addition to xylitol dehydrogenase ( XDH ).
제 6항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 속 균주는 기탁번호: KCTC 11137BP로 기재되는 균주인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주.
7. The xylitol producing strain according to claim 6, wherein the Candida genus in which the xylitol dehydrogenase has been removed is a strain described in Accession No. KCTC 11137BP.
1) 제 1항의 컨스트럭트를 이용한 자일룰로스 키나아제 유전자 녹아웃 카세트를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 녹아웃 카세트를 캔디다 속 균주에 형질전환하는 단계: 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환된 균주에서 자일룰로스 키나아제 유전자가 제거된 균주를 선별하는 단계를 포함하는 자일리톨 생산균주 제조방법.
1) preparing a xylulose kinase gene knockout cassette using the construct of claim 1;
2) transforming the knock-out cassette of step 1) into a Candida genus; and
3) selecting a strain from which the xylulose kinase gene has been removed in the transformed strain of step 2).
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주 제조방법.
The method of claim 8, wherein the Candida sp of step 2) is one that is Candida old boiler Mondi (C. guillermondi), selected from the group consisting of Candida chamber hijacking in cis (C. parapsilosis), Candida Tropical and faecalis (C. tropicalis) Wherein the strain is one strain.
제 8항에 있어서, 상기 단계 2)의 캔디다 속 균주는 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase, XDH)가 제거된 캔디다 트로피칼리스인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주 제조방법.
[9] The method according to claim 8, wherein the Candida genus in step 2) is Candida tropicallis from which xylitol dehydrogenase ( XDH ) has been removed.
제 10항에 있어서, 상기 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스는 기탁번호: KCTC 11137BP로 기재되는 균주인 것을 특징으로 하는 자일리톨 생산균주 제조방법.
11. The method for producing xylitol-producing strains according to claim 10, wherein the Candida tropicallis from which the xylitol dehydrogenase has been removed is a strain described in Accession No. KCTC 11137BP.
1) 제 3항의 자일리톨 생산균주를 바이오매스 가수분해물 및 탄소원을 포함한 배지에서 배양하는 단계;
2) 배양된 균주로부터 자일리톨(xylitol)을 생산하는 단계; 및
3) 배양액으로부터 자일리톨을 분리하는 단계를 포함하는 자일리톨 대량 생산방법.
1) culturing the xylitol producing strain of claim 3 in a medium containing a biomass hydrolyzate and a carbon source;
2) producing xylitol from the cultured strain; And
3) isolating xylitol from the culture.
제 12항에 있어서, 단계 1)의 바이오매스 가수분해물은 옥수수속대 가수분해물, 사탕수수속대 가수분해물, 코코넛 부산물, 및 자작나무의 가수분해물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨 대량 생산방법.
The method of claim 12, wherein the biomass hydrolyzate of step 1) is any one selected from the group consisting of corn steep hydrolyzate, hydrolyzate versus sugar cane hydrolyzate, coconut by-product, and hydrolyzate of birch. Production method.
제 12항에 있어서, 단계 1)의 탄소원은 포도당, 글리세롤, 과당, 갈락토스, 설탕, 만노스, 말토스, 셀로바이오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일리톨 대량 생산방법.
13. The method according to claim 12, wherein the carbon source of step 1) is any one selected from the group consisting of glucose, glycerol, fructose, galactose, sugar, mannose, maltose, cellobiose and mixtures thereof. .
제 12항에 있어서, 단계 2)의 자일리톨을 생산하기 위한 기질은 자일로스 및 포도당인 것을 특징으로 하는 자일리톨 대량 생산방법.

13. The method of mass production of xylitol according to claim 12, wherein the substrate for producing xylitol in step 2) is xylose and glucose.

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Yong-Su Jin 등. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. Vol. 68, No. 3, 페이지 1232-1239 (2002) *
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