KR101486149B1

KR101486149B1 - Method of detecting a marker for diagnosing a desease using a competetive immunoassay based on a surface-enhanced raman scattering

Info

Publication number: KR101486149B1
Application number: KR20130082103A
Authority: KR
Inventors: 주재범; 전향아; 이상엽
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2015-01-26
Also published as: KR20150008291A

Abstract

본 발명은 시료액을 준비하고; 질병 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자를 준비하고; 질병 마커에 해당하는 항원과 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자를 준비하고; 상기 시료액에 상기 항체가 고정화된 자성 입자를 첨가하여, 상기 시료액과 상기 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 제1 면역반응을 유도하고; 상기 제1 면역 반응이 유도된 후에, 상기 시료액에 상기 할로우 금 나노입자를 첨가하여, 상기 시료액이 상기 자성 입자 및 상기 할로우 금 나노입자와 경쟁적으로 면역반응을 하도록 제2 면역반응을 유도하고; 상기 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 자성 입자를 제외한 시료의 여액에 레이저 광을 조사하고; 그리고 상기 레이저광 조사 이후에 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering: SERS) 신호를 측정하여 상기 마커를 확인하는 단계;를 포함하는 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 제공한다.
The present invention relates to a method for preparing a sample solution, Preparing magnetic particles to which an antibody that specifically binds to an antigen corresponding to a disease marker is immobilized; Preparing hollow gold nanoparticles in which an antigen corresponding to a disease marker and a Raman reporter molecule are bound; Adding the magnetic particles immobilized with the antibody to the sample solution to induce a first immune reaction between the sample solution and the magnetic particles to which the antibody is immobilized; After the first immune response is induced, the second gold nanoparticle is added to the sample solution to induce a second immune response so that the sample solution competitively reacts with the magnetic particles and the hollow gold nanoparticle ; After completion of the second immune reaction, irradiating the filtrate of the sample excluding the magnetic particles with laser light; And detecting the marker by measuring a surface-enhanced Raman scattering (SERS) signal after the irradiation of the laser light, thereby providing a marker detection method for disease diagnosis based on SERS do.

Description

경쟁 면역반응을 이용한 표면-증강 라만 산란 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법{METHOD OF DETECTING A MARKER FOR DIAGNOSING A DESEASE USING A COMPETETIVE IMMUNOASSAY BASED ON A SURFACE-ENHANCED RAMAN SCATTERING} FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a method for detecting a marker for disease diagnosis based on surface-enhanced Raman scattering using a competitive immune response,

본 발명은 표면-증강 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Sacattering; 이하, ‘SERS’라고 함)에 기반하고 경쟁 면역반응을 이용한 질병 진단용 마커 검출 방법에 대한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a marker for disease diagnosis based on surface-enhanced Raman scattering (hereinafter referred to as "SERS") and using a competitive immune response.

ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 마이크로어레이는 바이오 마커 후보를 확인하는 도구로 널리 사용되었다. 이 기술을 이용하면 적은 부피를 가지는 샘플 내 수 개의 단백질의 농도를 동시에 측정할 수 있다. 게다가, ELISA 방법은 종래의 방법보다 단번에 많은 양을 처리할 수 있고(high-throughput performance), 비용이 적게 들고, 그리고 임상에 쉽게 적용할 수 있는 이점이 있다. ELISA 분석에서는, 각각의 어레이 웰에 고정된 바이오 마커 샘플을 수득하기 위해서 형광-기반 마이크로어레이 스캐너가 사용된다. 그러나 이 형광 이미징 기술은 신호 대 노이즈 비율이 좋지 않고 검출 한계값도 좋지 않은 단점이 있다(Bally, M. et al., 2006. Surf. Interface Anal. 38, 1442-1458). 또한 이 방법은 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) microarrays have been widely used as tools for identifying biomarker candidates. Using this technique, the concentration of several proteins in a sample with a small volume can be measured simultaneously. In addition, the ELISA method has advantages of high-throughput performance, low cost, and easy clinical applicability over conventional methods. In an ELISA assay, a fluorescence-based microarray scanner is used to obtain biomarker samples immobilized in each array well. However, this fluorescence imaging technique has the disadvantage of poor signal-to-noise ratio and poor detection limit (Bally, M. et al., 2006. Surf. Interface Anal. 38, 1442-1458). This method also has a drawback that it takes a long time.

바이오 마커를 검출하기 위해서 제1결합 항체와 제2 결합 항체가 항원을 사이에 두고 각각 항원과 결합하여 샌드위치 면역복합체를 형성하기도 한다. 그러나 이 샌드위치 면역분석법은 제1결합 항체, 항원, 제2결합 항체가 마커에 결합하는 사이트(epitope) 및 결합력(binding affinity), 그리고 항체가 생산되는 기원 동물(host)등에 의한 특이성(specificity), 민감도(sensitivity) 및 상호 반응성(cross-reactivity)의 문제가 발생할 수 있다.In order to detect a biomarker, a first binding antibody and a second binding antibody bind each antigen with an antigen to form a sandwich immunoconjugate. However, in this sandwich immunoassay, the specificity of the first binding antibody, the antigen, the second binding antibody binding to the marker, the epitope and binding affinity, and the host from which the antibody is produced, Sensitivity and cross-reactivity may arise.

표면-증강 라만 산란(SERS)-기반 검출 방법은 고감도 분석법으로 각광을 받고 있다. 다클론 항체(PAb)가 고체 기판에 고정되고, 그 다음 항원 용액 및 라만 리포터가 붙은 면역-금 나노입자가 연속적으로 첨가된다. 리포터 분자의 특징적인 SERS 피크의 세기(intensity) 변화를 측정하여 항원 바이오 마커를 정량적으로 분석할 수 있다. 리포터 분자가 거친 금속 표면에 흡착되고 여기광(레이저 광)에 노출되면, “측정 접점(hot junction)”이라고 알려진 리포터 분자의 SERS 활성 사이트에서 전자기적이고 화학적인 증강이 발생하여 SERS 신호가 대폭 증가한다(Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett. 6, 2225-2231). 이 증강 효과는 종래 라만 및 형광 검출법이 가지는 단점인 저감도성의 문제를 해결해 줄 것으로 기대되었다.The surface-enhanced Raman scattering (SERS) -based detection method is in the spotlight as a high sensitivity analysis method. The polyclonal antibody (PAb) is immobilized on a solid substrate, and then immune-gold nanoparticles with antigen solution and Raman reporter are added successively. The antigen biomarker can be quantitatively analyzed by measuring the intensity change of the characteristic SERS peak of the reporter molecule. When a reporter molecule is adsorbed to a rough metal surface and exposed to excitation light (laser light), electromagnetic and chemical enhancement occurs at the SERS active site of the reporter molecule known as a " hot junction " (Kneipp, J. et al., 2006. Nnao Lett., 6, 2225-2231). This enhancement effect is expected to solve the problem of low sensitivity which is a disadvantage of conventional Raman and fluorescence detection methods.

이에 본 발명자들은 연구를 계속하여 라만 스펙트럼과 경쟁 면역분석 방법을 이용하여 질병 마커를 빠른 시간 내에 검출할 수 있는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors continued their research and developed a method for detecting disease markers in a short time using a Raman spectrum and competitive immunoassay, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 경쟁 면역반응을 이용하여 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for detecting a marker for disease diagnosis based on SERS using a competitive immune response.

본 발명의 다른 목적은 두 가지 이상의 질병 진단용 마커를 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있는 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a marker detection method for disease diagnosis based on SERS capable of simultaneously and rapidly detecting two or more disease diagnosis markers.

본 발명은 다음 단계를 포함하는 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 제공한다:The present invention provides a marker detection method for disease diagnosis based on SERS using a competitive immune response comprising the following steps:

시료액을 준비하고;Prepare a sample solution;

질병 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자를 준비하고;Preparing magnetic particles to which an antibody that specifically binds to an antigen corresponding to a disease marker is immobilized;

질병 마커에 해당하는 항원과 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자를 준비하고;Preparing hollow gold nanoparticles in which an antigen corresponding to a disease marker and a Raman reporter molecule are bound;

상기 시료액에 상기 항체가 고정화된 자성 입자를 첨가하여, 상기 시료액과 상기 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 제1 면역반응을 유도하고;Adding the magnetic particles immobilized with the antibody to the sample solution to induce a first immune reaction between the sample solution and the magnetic particles to which the antibody is immobilized;

상기 제1 면역 반응 유도된 후에, 상기 시료액에 상기 할로우 금 나노입자를 첨가하여, 상기 시료액이 상기 자성 입자 및 상기 할로우 금 나노입자와 경쟁적으로After the first immunoreaction is induced, the hollow gold nanoparticles are added to the sample solution, and the sample solution is mixed with the magnetic particles and the hollow gold nanoparticles competitively

면역반응을 하도록 제2 면역반응을 유도하고;Inducing a second immune response to cause an immune response;

상기 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 자성 입자를 제외한 시료의 여액에 레이저 광을 조사하고;After completion of the second immune reaction, irradiating the filtrate of the sample excluding the magnetic particles with laser light;

상기 레이저광 조사 이후에 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering: SERS) 신호를 측정하여 상기 마커를 확인하는 단계.And measuring the surface-enhanced Raman scattering (SERS) signal after the laser light irradiation to identify the marker.

상기 시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.The sample liquid may be selected from the group consisting of tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, It is not.

상기 시료액에는 적어도 한 개의 질병 마커에 해당하는 항원이 포함될 수 있는데, 복수 개의 질병 마커 항원이 포함되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 상기 질병은 암일 수 있다. 더더욱 바람직하게는 상기 질병은 심근경색증일 수 있다.The sample liquid may include an antigen corresponding to at least one disease marker, and preferably includes a plurality of disease marker antigens. More preferably, the disease can be cancer. Even more preferably, the disease may be myocardial infarction.

상기 시료액에는 복수 개의 질병 마커 항원이 포함되어 있고; 상기 자성 입자는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 질병 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자이고; 그리고 상기 할로우 금속 나노입자는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 질병 마커 항원과 동일한 적어도 한 개의 항원이 결합된 금속 나노입자로 구성됨으로써 다중 마커 확인이 가능하다.Wherein the sample liquid contains a plurality of disease marker antigens; Wherein the magnetic particles are magnetic particles on which an antibody that specifically binds to a plurality of disease marker antigens contained in the sample solution is immobilized; The hollow metal nanoparticles are composed of metal nanoparticles having at least one antigen bound to the same disease marker antigen contained in the sample solution, thereby enabling identification of multiple markers.

상기 제1 면역반응은 5-15분간 수행될 수 있다.The first immune response may be performed for 5-15 minutes.

상기 제2 면역반응은 5-15분간 수행될 수 있다.The second immune response may be performed for 5-15 minutes.

상기 질병 마커 확인에 소요되는 시간은 10 내지 30분일 수 있다.The time required for identifying the disease marker may be 10 to 30 minutes.

상기 경쟁 면역반응은, 상기 시료액에 포함된 마커 항원 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 면역반응과; 상기 시료액에 포함된 마커 항원과 동일한 항원이 결합된 할로우 금 나노입자 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 면역반응이 경쟁적으로 일어나는 면역반응일 수 있다.Wherein the competitive immunoreaction includes an immune reaction between a marker antigen contained in the sample solution and magnetic particles immobilized with an antibody that specifically binds to the antigen; The immune response between the hollow gold nanoparticles to which the same antigen as the marker antigen contained in the sample solution is bound and the magnetic particles to which the antibody specifically binding to the antigen is immobilized may be competitively caused.

상기 제2 면역반응이 완료된 후 상기 자성 입자를 제외한 시료의 여액에 레이저 광을 조사하는 단계에서, 상기 시료의 여액에 남아 있는 할로우 금 나노입자에 레이저 광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 것일 수 있다.The SERS signal may be measured by irradiating laser light to the hollow gold nanoparticles remaining in the filtrate of the sample in the step of irradiating laser light to the filtrate of the sample after the completion of the second immune reaction .

상기 라만 리포터 분자는 이 기술분야에 공지된 것이라면 어느 것이나 사용가능하며, 예를 들면, 이로 제한되는 것은 아니나, 크리스탈 바이올렛(CV), X-로다민-5-아이소티오시아네이트(XRITC) 또는 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트(MGITC) 일 수 있다.The Raman reporter molecule can be any of those known in the art including, but not limited to, crystal violet (CV), X-rhodamine-5-isothiocyanate (XRITC), or malachite Green isothiocyanate (MGITC).

상기 질병은 암일 수 있다.The disease may be cancer.

상기 암은 폐암, 기관지암, 결장 직장암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌암, 갑상선암, 식도암, 자궁암, 간암, 신장암, 담도암, 및 고환암으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.The cancer may be selected from the group consisting of lung cancer, bronchial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, breast cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, ovarian cancer, bladder cancer, brain cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, uterine cancer, kidney cancer, biliary cancer, However, the present invention is not limited thereto.

상기 질병은 급성심근경색증일 수 있다.The disease may be acute myocardial infarction.

상기 마커는 트로포닌 I(Troponin I) 또는 CK-MB일 수 있다.The marker may be troponin I or CK-MB.

상기 시료액의 양은 10 내지 30 μL일 수 있다.The amount of the sample solution may be 10 to 30 μL.

본 발명에서 사용하는 자성 입자(자성 비드) 및 할로우 금 나노구체는 이 기술분야에 널리 알려져 있다. 구체적으로. 한국등록특허 제10-0979727호 및 한국 공개특허 제10-2012-0017358호에 할로우 금 나노입자 및 자성 입자를 제조하는 방법이 자세히 개시되어 있다.The magnetic particles (magnetic beads) and hollow gold nanospheres used in the present invention are well known in the art. Specifically. Korean Patent No. 10-0979727 and Korean Patent Laid-Open No. 10-2012-0017358 disclose a method for producing hollow gold nanoparticles and magnetic particles.

도 1은 본 발명에 따른 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 나타낸 것이다. 맨 왼쪽 그림은 질병 마커 항원 분자(CK-MB 또는 cTnI)에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들면, 항 CK-MB항체 및 항-cTnI항체)가 고정화된 자성 입자와; CK-MB와 cTnI 항원과 라만 리포터 분자(XRITC)가지는 할로우 금 나노입자를 준비하는 단계를 보여준다. 도 1의 가운데 그림은 시료액에 상기 자성 입자와 상기 할로우 금 나노구체(나노입자)를 첨가하여 경쟁 면역반응을 유도하는 단계를 보여준다. 도 1의 맨 오른쪽 그림은 상기 자성 입자를 제외한 시료 여액에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하여 질병 마커를 확인하는 단계를 보여준다.FIG. 1 shows a marker detection method for disease diagnosis based on SERS according to the present invention. The left-most image shows magnetic particles on which an antibody (for example, anti-CK-MB antibody and anti-cTnI antibody) specifically binding to a disease marker antigen molecule (CK-MB or cTnI) is immobilized; Figure 1 shows the preparation of hollow gold nanoparticles with CK-MB, cTnI antigen and Raman reporter molecule (XRITC). 1 shows a step of inducing a competitive immune response by adding the magnetic particles and the hollow gold nanospheres (nanoparticles) to a sample solution. 1 shows a step of checking a disease marker by measuring a SERS signal by irradiating laser light onto a sample filtrate except for the magnetic particles.

종래에는 “샌드위치 면역복합체”를 주로 이용하였다. “샌드위치 면역복합체"란 항체-항원-항체 반응을 통해 결합된 면역복합체를 의미한다. 항원이 항체 중간에 삽입되어 샌드위치 모양을 나타내기 때문에 붙여진 이름이다. 그러나 본 발명에서는 자성 입자에 고정화된 항체에, 할로우 금 나노입자에 결합된 항원과 환자의 혈액(시료액)에 존재하는 항원이 경쟁적으로 반응하게 하는 “경쟁 면역반응”을 이용하였다. 즉, 본원발명은 샌드위치 면역복합체를 형성하지 않고 진단 절차를 단순화하여 10분 내지 30분 이내에 검출이 완료되도록 하였다.Conventionally, " sandwich immunoconjugate " was mainly used. The term " sandwich immunoconjugate "refers to an immunoconjugate bound through an antibody-antigen-antibody reaction. The name is given because the antigen is inserted in the middle of the antibody and shows a sandwich shape. Competitive immunoassay " in which the antigen bound to the hollow gold nanoparticle and the antigen present in the patient ' s blood (sample fluid) are competitively reacted. In other words, the present invention provides a diagnostic immunoassay And the detection was completed within 10 minutes to 30 minutes.

본 발명은 상기 “경쟁 면역반응”을 이용하는 과정 중에 반응 효율이 감소되는 것을 방지하기 위하여, 충분한 시간(예, 7분) 동안, 환자의 혈액에 존재하는 항원과 자성 입자와의 제1 면역반응을 유도하고; 그 다음에 나노입자가 결합된 항원을 첨가하여 다시 충분한 시간 (예, 7분) 동안 제2 면역반응을 유도하여 반응의 효율성을 높였다. 즉, 두 단계(two step)의 면역반응을 수행하였다. 구체적으로 도 2를 보면, 시료액과 자성 입자의 제1 면역반응이 일어나면 자성 입자의 항체와 시료액의 항원이 먼저 면역반응을 일으킨다. 그 다음 항원이 결합된 할로우 금 나노입자를 첨가하여 자성 입자의 항체와 제2 면역반응을 유도하는데, 금 나노입자가 시료액의 항원과 충분히 결합하지 못하고 시료액에 존재하게 된다. 시료액의 항원이 이미 자성 입자의 항체와 면역반응을 일으켰기 때문이다. 그 다음 도 2에 나타난 바와 같이, 자성 입자를 제외한 시료 여액에 레이저 광을 조사하면 할로우 금 나노입자에 결합된 라만 리포터 분자에 의해 SERS 신호를 측정할 수 있다.The present invention provides a method for detecting a first immune response between an antigen present in the blood of a patient and a magnetic particle for a sufficient time (for example, 7 minutes) in order to prevent the reaction efficiency from being decreased during the course of using the " competitive immunoreaction "Induce; The nanoparticle-bound antigen was then added to induce a second immune response again for a sufficient time (eg, 7 minutes) to increase the efficiency of the reaction. That is, two steps of immune response were performed. Specifically, referring to FIG. 2, when the first immune reaction between the sample solution and the magnetic particles occurs, the antibody of the magnetic particle and the antigen of the sample solution first cause an immune reaction. Next, the gold nanoparticles are bound to the antigen of the sample solution, and the gold nanoparticles are present in the sample solution. This is because the antigen of the sample solution has already reacted with the antibodies of the magnetic particles. As shown in FIG. 2, when the laser light is irradiated on the sample filtrate except the magnetic particles, the SERS signal can be measured by Raman reporter molecules bound to the hollow gold nanoparticles.

도 3의 상단 그림에 나타낸 바와 같이, 시료액에서 한 단계의 면역반응만 일어난다면 라벨링이 된 항원(Ag*, 예를 들면 본 발명의 할로우 금 나노입자에 결합된 항원)과 시료의 항원(Ag)이 한정된 양의 항체를 두고 서로 경쟁하게 된다. 반면에, 도 3의 하단 그림에 나타낸 두 단계의 면역반응은 다음과 같다: 제1단계로 항원을 포함하는 시료액과 항체를 반응시킨다. 그 다음 제2단계로 라벨이 붙은 항원을 추가로 시료액에 첨가하여 반응시킨다. 이 때 시료액의 항원과 라벨이 붙은 항원이 서로 경쟁적으로 반응하게 되는데, 라벨이 붙은 항원이 면역반응을 많이 못할수록 시료액 내에 항원이 많이 존재하는 것이다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 시료액에 항원이 많이 존재하였다면 이미 제1단계 면역반응시 항체와 충분히 반응을 해버렸기 때문이다. 따라서 본 발명의 두 단계의 경쟁 면역반응을 이용하면 시료액 내 타겟 항원의 농도를 정확하게 알 수 있다. 또한 한 번의 면역반응만 수행할 때보다 진단 정확도가 매우 높아진다.(Ag *, for example, an antigen bound to the hollow gold nanoparticle of the present invention) and an antigen of the sample (Ag *, for example), if only a single step of the immune response occurs in the sample solution, ) Compete with each other for a limited amount of antibody. On the other hand, the two-step immunoreaction shown in the lower figure of Fig. 3 is as follows: In the first step, the sample solution containing the antigen is reacted with the antibody. Then, the antigen labeled with the second step is added to the sample solution to react. At this time, the antigen of the sample solution and the labeled antigen are competitively reacted with each other, and the more the labeled antigen is immune to the immune response, the more antigens are present in the sample solution. As shown in FIG. 4, if a lot of antigens existed in the sample solution, the antibody reacted sufficiently with the antibody in the first step immunity reaction. Therefore, the concentration of the target antigen in the sample solution can be accurately determined by using the competition immunity reaction of the two steps of the present invention. In addition, diagnostic accuracy is much higher than when only one immune response is performed.

이를 좀 더 구체적으로 도 5를 이용하여 설명하기로 한다. 도 5의 A는 항체가 고정화된 자성 입자(capture bead)와 항원이 결합된 금 할로우 나노입자 (나노입자에는 라만 신호를 낼 수 있는 라만 리포터 분자가 붙어 있음)를 준비한 것이다. B는 시료액, 예를 들면 환자의 혈액에 질병 마커 항원이 없는 경우를 나타낸 것이다. 환자의 혈액에 자성 입자를 첨가하면 환자의 혈액에 항원이 없기 때문에 자성 입자가 면역반응을 하지 않는다. 그 다음 나노입자를 첨가하면 나노입자에 붙어있는 항원과 자성 입자가 결합하여 면역반응을 일으킨다. 이 자성 입자를 따로 분리하고(예를 들어, 도면을 보면 자석을 이용해 따로 모아 분리하였음), 시료 여액(상층액)에 레이저광을 조사하여 SERS 신호를 측정하면, 시료 여액에 나노입자가 없거나 거의 존재하지 않으므로 라만 신호가 측정되지 않거나 매우 약하게 측정된다. C는 환자의 혈액에 항원이 있는 경우를 나타낸다. 환자의 혈액에 항원이 존재하므로, 항체가 고정화된 자성 입자를 첨가하였을 때 제1 면역반응이 일어난다. 그 후 나노입자를 첨가하면 이미 제1 면역반응이 일어난 후이기 때문에 나노입자에 붙어 있는 항원이 항체와 결합하지 못하고 시료의 상층액에 존재하게 된다. 이 상층액에 레이저광을 조사하면 라만 신호가 강하게 측정됨으로써 시료 내 질병 마커를 확인할 수 있다.This will be described in more detail with reference to FIG. FIG. 5A shows preparation of antibody-immobilized magnetic beads and antigen-bound gold-hollow nanoparticles (nanoparticles have Raman reporter molecules capable of generating Raman signals). B is a sample fluid, for example, a case where there is no disease marker antigen in the blood of a patient. When the magnetic particles are added to the blood of the patient, the magnetic particles do not react with the immune response because the blood of the patient has no antigen. Next, when nanoparticles are added, the antigen attached to the nanoparticles and the magnetic particles combine to produce an immune response. When the SERS signal is measured by irradiating a laser light to the sample filtrate (supernatant) separately, the magnetic particles are separated separately (for example, they are collected separately using a magnet in the figure) Since it does not exist, the Raman signal is not measured or is measured very weakly. C indicates a case where the blood of the patient has an antigen. Since the antigen exists in the blood of the patient, the first immune response occurs when the antibody-immobilized magnetic particles are added. Since the addition of the nanoparticles is already after the first immune reaction, the antigen attached to the nanoparticles fails to bind to the antibody and is present in the supernatant of the sample. When the laser light is irradiated to the supernatant, the Raman signal is strongly measured, thereby confirming the disease marker in the sample.

본 발명은 질병 마커를 조기에 진단할 수 있는 검출 방법을 제공한다. 구체적으로 급성심근경색증의 조기 진단을 위해 심근경색 마커의 양을 정확하고 신속하게 검출하는 방법을 제공한다.The present invention provides a detection method capable of early diagnosis of a disease marker. Specifically, it provides a method for accurately and rapidly detecting the amount of myocardial infarction markers for early diagnosis of acute myocardial infarction.

보다 구체적으로, 본 발명은 심근경색 발병 후 가장 초기에 혈액에 유출되는 조기 진단 마커인 트로포닌 I(Troponin I) 및/또는 CK-MB를 신속하게 검출하는 방법을 제공한다. 트로포닌 I 및/또는 CK-MB가 환자의 혈액에 존재하는지 확인하기 위해, 트로포닌 I 및/또는 CK-MB가 결합된 할로우 금 나노입자와 항트로포닌 I 항체 및/또는 항 CK-MB 항체가 고정화된 자성 입자를 준비하여 상기 환자의 혈액에 자성 입자를 첨가하여 제1 면역반응을 유도하고 그 다음 나노입자를 첨가하여 제2 면역반응을 유도한다. 두 단계 경쟁 면역반응 후에 자성 입자를 제외한 시료 여액에 레이저광을 조사한다. 만약 시료 여액에서 SERS 신호가 강하게 검출된다면 환자의 혈액에 트로포닌 I 및/또는 CK-MB가 다량 존재하는 것을 의미한다.More specifically, the present invention provides a method for rapidly detecting Troponin I (Troponin I) and / or CK-MB, which is an early diagnostic marker that flows out to the earliest after the onset of myocardial infarction. In order to confirm whether troponin I and / or CK-MB is present in the blood of a patient, hollow gold nanoparticles combined with troponin I and / or CK-MB and anti-troponin I antibody and / or anti-CK-MB antibody And magnetic particles are added to the blood of the patient to induce a first immune response, and then the nanoparticles are added to induce a second immune response. The laser light is irradiated to the sample filtrate except for the magnetic particles after the two-stage competitive immunity reaction. If the SERS signal is strongly detected in the sample filtrate, it means that there is a large amount of troponin I and / or CK-MB in the blood of the patient.

또한, 본 발명을 이용하면 환자의 혈액 내에 존재하는 복수 개의 질병 마커 항원을 동시에 검출할 수 있다. 구체적으로 환자의 혈액 내에 항원 A와 항원 B가 동시에 존재한다면 다음과 같이 다중 검출을 수행할 수 있다. 먼저 항원 A 및 B에 대응하는 항A 항체 및 항B 항체가 각각 개별적으로 고정화된 자성 입자를 준비한다. 그리고 항원 A 및 항원 B를 각각 개별적으로 가지는 나노입자를 준비하여 환자의 혈액과 반응시키면 항원 A와 B를 동시에 검출할 수 있다.In addition, the present invention can simultaneously detect a plurality of disease marker antigens present in the blood of a patient. Specifically, if antigen A and antigen B are present in the blood of a patient at the same time, multiple detection can be performed as follows. First, magnetic particles in which the anti-A and anti-B antibodies corresponding to the antigens A and B, respectively, are immobilized are prepared. Antigen A and B can be simultaneously detected by preparing nanoparticles having antigen A and antigen B individually and reacting with the patient's blood.

종래에는 항원-항체 반응으로 형성된 마이크로 사이즈의 면역복합체의 SERS 신호를 측정하였다. 그러나 본 발명은 상기 면역복합체의 SERS 신호를 측정하는 것이 아니라 면역복합체를 형성하고 난 후의 여액(콜로이드)에 남아 있는 나노입자의 SERS 신호를 측정하여 재현성 및 신뢰도 높은 결과를 구현하였다.Previously, the SERS signal of a microsized immune complex formed by an antigen-antibody reaction was measured. However, the present invention does not measure the SERS signal of the immunoconjugate but measures the SERS signal of the nanoparticles remaining in the filtrate (colloid) after forming the immunocomplex, thereby realizing reproducible and reliable results.

본 발명에 이용된 금 할로우 나노입자는 표면 증강 라만 산란 효과가 매우 우수하여 질병 마커의 농도를 결정하는 데 용이하게 사용될 수 있다. 보편적으로 사용되는 효소면역측정법에 비해 본 발명은 10-100배 발전된 민감도를 나타내었다.The gold-hollow nanoparticles used in the present invention are very excellent in the surface enhanced Raman scattering effect and can be easily used to determine the concentration of a disease marker. Compared to commonly used enzyme immunoassay methods, the present invention exhibits 10-100 times more sensitive sensitivity.

또한 본 발명은, 고체 기판 상에, 제1결합 항체- 항원-제2결합 항체로 구성된 면역복합체를 형성하는 종래의 샌드위치 검출법에 비해, 자성 입자에 고정화된 항체가 금 할로우 나노입자에 형성된 항원 및 혈중 항원과 항원-항체 반응을 하여 면역복합체를 형성하는 방식으로 단계를 단순화하여 분석 시료의 양을 10 내지 30 uL 로 줄였다. 또한 본 발명은 단계를 단순화함으로써 세척 과정 없이 진단 시간을 10 내지 30분 이내로 단축할 수 있다는 장점이 있다.The present invention also relates to a method for detecting an antigen immobilized on magnetic particles in gold hollow nanoparticles and a method for detecting an antigen immobilized on gold nanoparticles, The amount of the analytical sample was reduced to 10 to 30 uL by simplifying the steps in a way that an immune complex was formed by an antigen-antibody reaction with the serum antigen. Further, the present invention has the advantage that the diagnosis time can be shortened to 10 to 30 minutes or less without the washing process by simplifying the steps.

본 발명에 따른 질병 마커 검출방법을 이용하면, 검사 시간을 단축시킬 수 있다. 또한 본 발명에 따른 방법을 이용하면 여러 가지 마커를 한번에 검출할 수 있는 다중 검출 방법을 이용해 진단의 정확성을 더 높일 수 있다.By using the disease marker detection method according to the present invention, the inspection time can be shortened. Further, by using the method according to the present invention, the accuracy of diagnosis can be further improved by using a multiple detection method capable of detecting various markers at a time.

도 1 본 발명에 따른 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 경쟁 면역반응을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 따른 두 단계의 경쟁 면역반응과 한 단계의 경쟁 면역반응을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 두 단계의 면역반응의 모식도이다.
도 5는 본 발명에 따른 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반 질병 진단용 마커 검출 방법의 원리를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따른 급성심근경색 마커 트로포닌 I(Troponin I) 및/또는 CK-MB 검출 결과(A) 및 라만 측정 결과(B)이다.
도 7은 본 발명의 검출 방법을 시간대별로 모니터링 한 결과로, 약 7분 반응하면 충분한 것으로 나타났다. 검정색은 cTnI, 빨간색은 CK-MB이다.
도 8은 사이즈 코딩(size coding)을 통한 마커 트로포닌 I(Troponin I) 및 CK-MB 다중 검출 결과를 STEM 이미지로 나타낸 것이다. 1 μm 지름의 cTnI 항체가 고정된 자성 입자와 3 μm 지름의 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자가 사용되었다(A. Blank 시료, B. 100 ng/mL의 cTnI와 CK-MB가 포함된 시료, C. 100 ng/mL의 cTnI가 포함된 시료, D. 100 ng/m의 CK-MB가 포함된 시료).
도 9는 각 cTnI와 CK-MB의 농도에 따른 검량 곡선 및 다른 항원에 대한 교차반응성(cross-reactivity) 검증 결과를 나타낸 것이다[A. cTnI에 대한 검량곡선과 CK-MB의 교차반응성 검증(위) 및 라만 데이터(아래), B. CK-MB 에 대한 검량곡선과 cTnI의 교차반응성 검증(위) 및 라만 데이터(아래).
도 10A는 각 리포터 CK-MB(빨강)와 cTnI(검정)의 라만 신호 및 각 리포터 나노입자의 1:1 혼합물의 라만 신호를 나타낸 것이고; 10B는 CK-MB와 cTnI를 모두 가지고 있고 농도가 다른 5가지 시료에 관한 어세이 측정 결과를 나타낸 것이고; 그리고 10C는 B에 대한 검량곡선이다(10 % FBS 매트릭스의 모델을 사용함).
도 11은 9개의 인간 혈청을 이용하여 CK-MB 및 cTnI을 면역분석한 임상 결과를 나타낸 것이다. 각각의 low (blue), low-positive (black) 및 high-positive (red)를 얻었고 기준값은 cTnI는 0.3 ng/mL, CK-MB는 4.87 ng/mL이다.
도 12는 1단계 면역반응과 2단계 면역반응을 하였을 때 혈액 내 cTnI가 있을 때(On)와 없을 때(Off)의 신호 차이를 나타낸 것이다.
도 13은 cTnI과 CK-MB 마커에 대해 ELISA 측정한 결과를 나타낸 것이다.
1 is a schematic diagram schematically showing a marker detection method for disease diagnosis based on SERS according to the present invention.
Figure 2 is a schematic representation of a competitive immune response according to the present invention.
Figure 3 compares two competing immune responses and one competing immune response according to the invention.
4 is a schematic diagram of the two-step immunity reaction according to the present invention.
FIG. 5 shows the principle of a marker detection method for diagnosing disease based on SERS using a competitive immune response according to the present invention.
FIG. 6 is a graph showing the results (A) and (B) of the acute myocardial infarction markers troponin I and / or CK-MB according to Example 2 of the present invention.
FIG. 7 shows the result of monitoring the detection method of the present invention by time zone. Black is cTnI, and red is CK-MB.
Figure 8 shows STEM images of Troponin I and CK-MB multiplex detection results through size coding. Magnetic particle with 1 μm diameter cTnI antibody fixed and magnetic particle with 3 μm diameter CK-MB antibody immobilized (A. Blank sample, B. 100 ng / mL sample containing cTnI and CK-MB , A sample containing 100 ng / mL of cTnI, and a sample containing 100 ng / m of CK-MB).
FIG. 9 shows a calibration curve according to the concentration of each of cTnI and CK-MB and a cross-reactivity test result for other antigens [A. (c) Cross-reactivity verification of cTnI and CK-MB (above) and Raman data (below), B. Cross-reactivity verification of cTnI versus calibration curves for CK-MB (top) and Raman data (bottom).
Figure 10A shows the Raman signal of each reporter CK-MB (red) and cTnI (black) and the Raman signal of a 1: 1 mixture of each reporter nanoparticle; 10B shows assay results for five samples with both CK-MB and cTnI concentrations; And 10C is the calibration curve for B (using a 10% FBS matrix model).
Figure 11 shows clinical results of immunoassay of CK-MB and cTnI using 9 human serum. (Low), low-positive (black), and high-positive (red), respectively. The baseline values were 0.3 ng / mL for cTnI and 4.87 ng / mL for CK-MB.
FIG. 12 shows signal differences when cTnI is present (On) and when there is no (Off) in the blood when the first-stage immunity and the second-stage immune response are performed.
Fig. 13 shows the results of ELISA measurement of cTnI and CK-MB markers.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.It is to be understood that both the foregoing general description and the following detailed description of the present invention are exemplary and explanatory and are intended to be exemplary and explanatory only and are not restrictive of the invention, It is obvious to those skilled in the art that such variations and modifications fall within the scope of the appended claims.

실시예Example 1: 재료 및 실험 방법 1: Materials and Experimental Methods

1-1: 실험 재료1-1: Experimental material

염화코발트[Cobalt(II) chloride (Sigma)], 염화금[Gold(III) chloride (Sigma)], 소듐 보로하이드라이드[Sodium borohydride (Sigma)], 소듐 시트레이트 디하이드레이트[Sodium citrate dehydrate (Aldrich)], MGITC (Invitrogen), XRITC (Invitrogen), 디하이드로리포익산 (DHLA, Sigma), 메르캅토에탄올(Sigma), EDC (Sigma), NHS (Sigma), anti cTnI (ab72002, abcam), cTnI (ab9936, abcam) CK-MB (ab72002, abcam), 크레아틴 키나아제 MB 프로테인[Creatine Kinase MB protein (ab73649, abcam)], 다이나비드 마이온 C1[Dynabeads Myone C1 (Invitrogen)] 및 에탄올 아민[Ethanol amine (Sigma)]을 준비하였다.Sodium citrate dehydrate (Aldrich)], sodium borohydride (Sigma), sodium citrate dehydrate (Aldrich)], sodium chloride [Sigma] (Sigma), EDC (Sigma), NHS (Sigma), anti cTnI (ab72002, abcam), cTnI (ab9936, (abcam) CK-MB (ab72002, abcam), Creatine Kinase MB protein (ab73649, abcam), Dynabeads Myone C1 (Invitrogen) and Ethanol amine Were prepared.

1-2: 항원이 1-2: Antigen 결합된Combined 할로우Hollow 금 나노입자와 자성 입자 준비 Preparation of gold nanoparticles and magnetic particles

SERS 프로브인 HGNs(Hollow gold nanoparticles)에 부착되는 항원 컨쥬게이션(conjugation)은 공지된 문헌에 기재된 방법에 따라 준비하였다(Lee, S. et. al., Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 2260-2263; Schwartzberg, A. M et. al., Anal. Chem. 2006, 78, 4732-4736; Wang, H et. al., J. Phys. Chem. B 2005, 109, 11083-11087). 간단하게 설명하면, N2 퍼징(purging) 조건 하에서 NaBH4를 이용하여 CoCl2 를 환원시킴으로써 코발트 나노입자를 합성하고, 이를 HGNs의 주형(template)으로 사용하였다. 50 ㎕씩 분주하여(aliquot) 0.1 M HAuCl4 를 10 번 첨가하였다. 여기서, 금 원자를 핵형성시키고 코발트 주형을 둘러싼 작은 껍질(shell)로 성장시켰다. N2 퍼징을 중단하여 상기 용액을 대기 조건에 노출시켰을 때, 코발트가 완전히 용해되고 할로우 내부 구조가 형성되었다. 이 단계에서, 용액의 색상이 암갈색(dark brown)에서 진청색(deep blue)로 변화하였다. HAuCl4 의 농도를 변화시켜서 껍질 두께를 제어할 수 있었다. 본 발명자들이 측정한 바에 따르면, HGN의 직경 및 껍질 두께는 각각 약 45±5 nm 및 15±3 nm 이었다.Antigen conjugation attached to the SERS probe, HGNs (Hollow gold nanoparticles), was prepared according to the method described in known literature (Lee, S. et al., Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 2260-2263 Wang, H. et al., J. Phys. Chem. B 2005, 109, 11083-11087). &Lt; / RTI > Briefly, cobalt nanoparticles were synthesized by reducing CoCl 2 with NaBH 4 under N 2 purging conditions and used as a template for HGNs. 50 μl aliquot 0.1 M HAuCl 4 was added 10 times. Here, the gold atoms were nucleated and grown into a small shell surrounding the cobalt template. When the N2 purging was stopped and the solution was exposed to atmospheric conditions, the cobalt was completely dissolved and the hollow internal structure was formed. At this stage, the color of the solution changed from dark brown to deep blue. The shell thickness could be controlled by varying the concentration of HAuCl4. According to the inventors' measurements, the diameter and shell thickness of HGN were about 45 ± 5 nm and 15 ± 3 nm, respectively.

라만 리포터 분자와 항원의 HGNs으로의 컨쥬게이션(conjugation)은 공지된 문헌에 기재된 대로 수행하였다(Chon, H et. al., Anal. Chem. 2009, 81, 3029-3034). 라만 리포터 분자인, MGITC(malachite green isothiocyanate)를 HGNs 표면에 흡착시켰다(CK-MB 항원을 타겟으로 하는 경우 XRITC, cTnI 항원 타겟의 경우 MCITC를 사용할 수 있다). MGITC (1.0 μL 의 5 × 10^-5 M)가 1 mL의 0.7 nM HGN에 첨가되었고, 상기 혼합물을 교반하면서 2 시간 동안 반응시켰다. 입자 당 흡수된 MGITC 분자의 수는 약 70이었다.Conjugation of the Raman reporter molecule and the antigen to HGNs was performed as described in the known literature (Chon, H. et al., Anal. Chem. 2009, 81, 3029-3034). MGITC (malachite green isothiocyanate), a Raman reporter molecule, was adsorbed onto the surface of HGNs. (MCITC can be used for XRITC and cTnI antigen targets when targeting CK-MB antigen). MGITC (1.0 μL of 5 × 10 ^-5 M) was added to 1 mL of 0.7 nM HGN and the mixture was allowed to react for 2 hours with stirring. The number of MGITC molecules absorbed per particle was about 70.

그 다음 항원 컨쥬게이션은 디하이드로리포익산(DHLA)을 사용하였다. DHLA 의 두 개의 -SH 말단기가 절단되어 HGN 표면에 화학적으로 결합하였다. 2.5 ㎕ 의 5 ㎍/mL DHLA가 1mL의 0.7 nM 염료-흡착 HGN에 첨가되었고 1 시간 동안 반응시켰다. 잔존하는 비특이적 부위를 2.5 ㎕ 의 2.5 mM 메르캅토에탄올로 코팅하여 응집을 방지하였다. 상기 용액을 원심분리하여, 용액 내에서 과도하게 비특이적 결합을 한 메르캅토에탄올을 제거하고 침전물을 PBS 완충액으로 2회 세척한 후, 초음파분쇄기를 사용하여 재현탁시켰다. 그 결과, 나노 입자 응집 및 HGNs와 다른 단백질들 사이의 비특이적 반응을 효과적으로 막을 수 있다. -COOH 말단기의 활성화를 위하여, 1.0 ㎕ 의 1.0 mM1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 1.0 ㎕ 의 1.0 mM N-하이드록시숙신이미드(NHS)를 첨가하고 1 시간 동안 반응시켰다. NHS의 EDC와의 에스테르화시의 공유결합에 의한 단백질을 안정적 고정화를 위해, 카르복실레이트-말단화된 HGNs을 사용하였다. 마지막으로, 1.0 ㎕ 의 10 μM 과다량(즉, 나노입자 표면의 COOH 기능기보다 많은 숫자의 항원을 (CK-MB와 cTnI) NHS-활성화된 HGNs에 첨가하였고, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 여기서, 항원의 리신 잔기에 의한 NHS 기의 전위(displacement)에 의하여 항원이 HGN 상으로 고정화되었다. HGNs 표면에서 반응하지 않은 NHS 기는, 2 시간 동안, 1.0 μL의 1 mM 에탄올 아민(ethanol amine)을 이용하여 불활성화(deactivation)시켰다. 원심분리에 의하여 비특이적 결합 화학물질 및 항체를 제거하고, PBS 버퍼로 최종 나노 프로브를 2회 세척하였다. The next antigen conjugation used dihydro lipoic acid (DHLA). The two -SH end groups of DHLA were cleaved and chemically bound to the HGN surface. 2.5 μl of 5 μg / ml DHLA was added to 1 ml of 0.7 nM dye-adsorbed HGN and allowed to react for 1 hour. The remaining non-specific sites were coated with 2.5 [mu] l of 2.5 mM mercaptoethanol to prevent aggregation. The solution was centrifuged to remove excess nonspecific binding mercaptoethanol in the solution, the precipitate was washed twice with PBS buffer, and resuspended using an ultrasonic mill. As a result, nanoparticle aggregation and nonspecific reactions between HGNs and other proteins can be effectively prevented. (EDC) and 1.0 μl of 1.0 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) were added to 1.0 μl of 1.0 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride Was added and reacted for 1 hour. Carboxylate-terminated HGNs were used for stable immobilization of proteins by covalent bonding during esterification of NHS with EDC. Finally, 1.0 μl of an excess of 10 μM (ie, more of the antigen (CK-MB and cTnI) than the COOH functional group on the surface of the nanoparticles was added to NHS-activated HGNs and reacted overnight at 4 ° C. Here , The antigen was immobilized on the HGN surface by the displacement of the NHS group by the lysine residue of the antigen The NHS group that did not react on the surface of the HGNs was treated with 1.0 μL of 1 mM ethanolamine for 2 hours The nonspecific binding chemistry and antibody were removed by centrifugation and the final nano-probe was washed twice with PBS buffer.

SERS 프로브인 자성 비드(Magnetic Bead, 직경 1 μm)에 항체(anti CK-MB, anti cTnI)를 컨쥬게이션 하는 방법은 공지된 문헌에 기재된 방법에 따라 수행하였다(Chon, H.et al., Anal. Chem. 2009, 81, 3029-3034).Methods for conjugating antibodies (anti CK-MB, anti cTnI) to magnetic beads (diameter 1 μm) as SERS probes were performed according to the methods described in the known literature (Chon, H. et al., Anal Chem., 2009, 81, 3029-3034).

1-3: 1-3: SERSSERS 신호 측정 방법 Signal measurement method

레니쇼 2000 라만 스펙트로미터(Renishaw 2000 Raman spectrometers, Renishaw, U.K.)가 멜레-그리옷 He-Ne 632.8 nm 레이저(Melles Griot He-Ne 632.8 nm laser)와 함께 사용되었다. 콜렉션 패스(collection path)에 위치한 할로그래픽 노치 필터를 사용하여 레일레이 선(Rayleigh line)을 제거하였다. 모든 스펙트럼이 모이기 전에, 521.01 cm-1에서 실리콘 레퍼런스 피크 위치를 측정하고 필요할때 마다 옵셋 보정을 수행하고, 각각의 스펙트로미터는 매일 계산하였다. 633 nm에서 30 mW 레이저 출력을 이용하여 1700-700 cm^-1 영역에서 익스탠디드 스캔을 통해 레이저 방사선 스펙트럼을 수집하였다. 10 s의 수집시간과 20 x 대물렌즈를 사용하여 레이저 스팟에 초점을 맞추었다. 라만 산란은 CCD(charge coupled device) 카메라를 사용하여 스펙트럼 해상도 4 cm-1에서 수집하였다. 광학 이미지를 얻기 위해 광학 현미경에 CCD 카메라를 추가로 장착하였다. 모든 스펙트럼 데이터를 GRAM 소프트웨어로 처리하였다. 기준선은 이항 스무딩 알고리즘(binomial smoothing algorithm)을 이용한 스무딩 처리 후에, 750 및 1720 cm-1에서 2점값 기준선 보정(two point level baseline correction)에 의해 조절되었다.A Renishaw 2000 Raman spectrometer (Renishaw, UK) was used with a Melle-Griff He-Ne 632.8 nm laser (Melles Griot He-Ne 632.8 nm laser). The Rayleigh line was removed using a halo graphic notch filter located in the collection path. Before all the spectra were collected, the silicon reference peak position was measured at 521.01 cm-1, offset correction was performed as needed, and each spectrometer was calculated daily. The laser radiation spectra were collected through an expedited scan at 1700-700 cm ^-1 using a 30 mW laser output at 633 nm. We focused on the laser spot using a collection time of 10 s and a 20 x objective. Raman scattering was collected at a spectral resolution of 4 cm < -1 > using a charge coupled device (CCD) camera. To obtain an optical image, an additional CCD camera was attached to the optical microscope. All spectral data were processed with GRAM software. The baseline was adjusted by two point level baseline correction at 750 and 1720 cm-1 after smoothing with a binomial smoothing algorithm.

실시예Example 2: 경쟁 면역반응을 이용한 급성심근경색 2: acute myocardial infarction using competitive immune response 마커Marker 트로포닌Troponin I( I ( cTnIcTnI ) 및/또는 CK-MB 검출) And / or CK-MB detection

고려대학교 병원(대한민국 경기도 안산) 진단검사과에서 병원윤리위원회(IRB)를 통과한 혈액 샘플을 100 내지 300 μL 얻어 사용하였다. 각 타겟 물질, CK-MB와 트로포닌 I(cTnI)에 대하여 low, low-positive, high-positive 시료 3개씩, 각 타겟 물질에 대하여 9개, 총 18명의 환자의 혈액을 수집하였다. 검사에 사용되는 시료의 양은 10 μL 이었다.Blood samples passed through the Hospital Ethics Committee (IRB) were used in the Diagnostic Examination Department of Korea University Hospital (Ansan, Gyeonggi-do, Korea) from 100 to 300 μL. A total of 18 blood samples were collected for each target substance, 3 low, low-positive and high-positive samples for CK-MB and troponin I (cTnI), and 9 for each target substance. The amount of sample used in the test was 10 μL.

혈액에 녹아 있는 검사하고자 하는 타겟 항원 마커와 나노입자로 표지된 항원 마커의 경쟁 반응을 최소화하고자 2번에 걸쳐서 분석을 수행하였다. 1차적으로 혈액에 녹아 있는 타겟과 자성 입자를 7분 동안 충분히 반응시킨 후, 2 차적으로 나노입자가 표지된 항원을 반응시켰다. 이와 같이 두 단계 반응을 수행하여 혈액에 녹아있는 타겟 항원 마커와 자성 입자에 고정화된 항체의 반응을 방해하지 않았다.Analysis was performed over two runs to minimize the competition of target antigen marker and nanoparticle-labeled antigen marker in blood. Firstly, the target dissolved in the blood and the magnetic particles were sufficiently reacted for 7 minutes, and then the nanoparticle-labeled antigen was reacted. This two-step reaction did not interfere with the reaction of the antibody immobilized on the magnetic particle with the target antigen marker dissolved in the blood.

도 6은 100 ng/mL의 cTnI 항원 마커가 시료, 즉 혈액 샘플 내에 존재하는 상등액과 cTnI 항원 마커가 존재하지 않는 상등액을 이용한 경쟁 면역반응분석 및 이에 대응하는 SERS 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 6에 나타난 것과 같이, 경쟁 면역반응분석은 다음 단계로 이루어진다. 먼저, cTnI 항원 마커가 없는 10 μL 혈청과 100 ng/mL의 cTnI 항원 마커를 포함하는 10 μL 혈청 용액을 준비하였다. 두 번째로 상기 각각의 혈청 용액에 10 μL 의 자성 입자 용액(항cTnI 항체 고정화됨)을 첨가하여 혼합하였다. 세 번째로, 상기 첨가 후에 상기 각각의 용액을 실온에서 7분 동안 반응시켰고 cTnI 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자를 상기 각각의 혈청 용액에 첨가하였다. 그 다음 7분 동안 실온에서 상기 각각의 용액을 반응시켰다. 그 다음 작은 자석을 사용하여 상기 자성 입자를 분리하였다. 그 다름 각각의 용액에서 자성 입자를 제외한 시료 여액을 모세관 튜브에 옮겨 레이저 광을 조사한 후 SERS 신호를 측정하였다. 도 6의 아래 왼쪽 그림은 cTnI 항원 마커가 없는 혈청 용액을, 오른쪽 그림은 cTnI 항원 마커가 존재하는 혈청 용액의 SERS 신호 측정 결과를 보여준다. cTnI 항원 마커가 없는 혈청 용액의 경우, cTnI 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자의 대부분이 항cTnI 항체가 고정화된 자성 입자와 결합하기 때문에, 자성 입자를 분리하고 남은 여액의 SERS 신호는 매우 약하게 나타난다. 그러나 100 ng/mL의 cTnI 항원 마커를 포함하는 혈청 용액의 경우, 반대로, SERS 신호가 매우 강하게 관찰됨을 알 수 있다.Figure 6 shows the competitive immunoassay analysis with a supernatant of 100 ng / mL of cTnI antigen marker in the sample, i.e., a blood sample, and a supernatant free of cTnI antigen marker, and the corresponding SERS spectrum. As shown in FIG. 6, the competitive immune response assay consists of the following steps. First, a 10 μL serum solution containing 10 μL serum without cTnI antigen marker and 100 ng / mL cTnI antigen marker was prepared. Secondly, 10 μL of magnetic particle solution (with anti-cTnI antibody immobilized) was added to each of the above serum solutions and mixed. Third, after the addition, each of the solutions was reacted at room temperature for 7 minutes, and hollow gold nanoparticles bound with cTnI antigen marker and Raman reporter molecule were added to each of the serum solutions. The respective solutions were then reacted at room temperature for 7 minutes. The magnetic particles were then separated using a small magnet. The SERS signal was measured after transferring the sample filtrate except the magnetic particles in each solution to the capillary tube and irradiating the laser light. 6 shows the results of the SERS signal measurement of the serum solution in which the cTnI antigen marker is present and the right figure shows the serum solution in which the cTnI antigen marker is present. In the case of the serum solution without the cTnI antigen marker, since most of the hollow gold nanoparticles in which the cTnI antigen marker and the Raman reporter molecule are bound are combined with the magnetic particle to which the anti-cTnI antibody is immobilized, the magnetic particles are separated and the remaining SERS signal Is very weak. However, in the case of serum solutions containing 100 ng / mL of cTnI antigen marker, conversely, it can be seen that the SERS signal is very strongly observed.

CK-MB 항원 마커의 경우도 위와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.In the case of the CK-MB antigen marker, experiments were carried out as described above.

하기 표 1은 본 발명에 따른 경쟁 면역반응 기반 SERS 분석법의 구체적인 성능 평가 결과를 나타낸 것이다. cTnI와 CK-MB를 모델 시스템으로 분석하였다. 구체적으로 혈액 시료 내에 검출 한계를 비교하면, cTnI의 LOD(Limit of Detection)는 33.7 pg/mL, CK-MB는 42.5 pg/mL이다. Intra-assay SD 의 경우, 같은 batch에서 3번 면역분석하여 측정한 오차 범위이고, Inter-assay SD 의 경우, 각 3번의 batch에서 3번 면역분석하여 얻은 결과이다. 하기 표 1을 통해 총 분석 시간은 15분으로 매우 빠르고 LOD 값이 낮음을 알 수 있다.Table 1 below shows the specific performance evaluation results of the competition immunity-based SERS assay according to the present invention. cTnI and CK-MB were analyzed by the model system. Specifically, when the detection limits in blood samples are compared, the limit of detection (LOD) of cTnI is 33.7 pg / mL and the CK-MB is 42.5 pg / mL. In the case of Intra-assay SD, the error range was measured by immunization three times in the same batch. In the case of the inter-assay SD, the results were obtained by three immunizations in each batch. Table 1 shows that the total analysis time is 15 minutes and the LOD value is very low.

[표 1][Table 1]

또한 도 7은 본 발명의 검출 방법을 시간대별로 모니터링 한 결과를 나타내고 있다. 도 7에 나타난 것과 같이, 약 7분 동안의 반응 시간이 충분함을 알 수 있다.FIG. 7 shows the result of monitoring the detection method of the present invention by time zone. As shown in FIG. 7, it can be seen that the reaction time for about 7 minutes is sufficient.

실시예Example 3: 급성심근경색 3: Acute myocardial infarction 마커Marker 트로포닌Troponin I( I ( cTnIcTnI ) 및 ) And CKCK -- MBMB 다중 검출 Multiple detection

cTnI 및 CK-MB의 다중 검출 가능성을 확인하기 위하여, 먼저, 각각의 면역복합체가 간섭 영향이 없다는 것을 확인하고자 했다. 이를 위해, 크기가 다른 두 가지 자성 입자를 모두 사용하여 면역분석을 진행하였다. 1 μm 지름의 cTnI 항체가 고정된 자성 입자와 3 μm 지름의 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자가 사용되었고 면역분석방법은 실시예 2의 방법으로 수행되었다. 구체적으로, cTnI 항원 마커(또는CK-MB 항원 마커)와 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자는 실시예 2에 기재된 방법으로 준비하였다. 그리고 시료 내에 cTnI 항체가 고정된 자성 입자 및 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자를 첨가하여 7분 동안 반응시키고, cTnI 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자와 CK-MB 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자를 첨가하여 7분 동안 반응시켰다. 그 다음에 자성 입자를 분리하고 남은 시료 여액에서 SERS를 측정하였다.To confirm the multiple detection possibilities of cTnI and CK-MB, we first tried to confirm that each immunocomplex had no interference effect. For this purpose, immunoassay was performed using both magnetic particles of different sizes. Magnetic particles having a 1 μm diameter cTnI antibody immobilized thereto and magnetic particles having a 3 μm diameter CK-MB antibody immobilized thereto were used, and immunoassay was performed according to the method of Example 2. Specifically, hollow gold nanoparticles in which a cTnI antigen marker (or CK-MB antigen marker) and a Raman reporter molecule were bound were prepared by the method described in Example 2. The magnetic particles with cTnI antibody immobilized in the sample and the magnetic particles with the CK-MB antibody immobilized thereto were added for 7 minutes, and the hollow gold nanoparticles combined with the cTnI antigen marker and the Raman reporter molecule and the CK-MB antigen marker Hollow gold nanoparticles bound with Raman reporter molecules were added and reacted for 7 minutes. The magnetic particles were then separated and the SERS was measured in the remaining sample filtrate.

그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8A에 나타난 것과 같이, cTnI 및 CK-MB 항원 마커가 없는 시료의 경우, 자성 입자와 나노입자 사이의 반응이 방해받지 않기 때문에 cTnI 항체가 고정된 자성 입자와 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자는 모두 나노입자와 면역복합체를 형성하였다. 또한, 도 8B에 나타난 것과 같이 cTnI 및 CK-MB 항원 마커가 모두 존재하는 시료의 경우, 시료 내에 이미 존재하는 cTnI 및 CK-MB 항원 마커와 cTnI 항체가 고정된 자성 입자 및 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자가 각각 결합하기 때문에, cTnI 항체가 고정된 자성 입자와 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자는 나노입자와는 거의 면역복합체를 형성하지 못한다. 도 8C 및 도 8D와 같이, cTnI 항원 마커 및 CK-MB 항원 마커 중 하나의 마커만을 포함한 시료의 경우 한 종류의 자성 입자(항cTnI 항체 또는 항CK-MB 항체를 가지는 자성 입자)와 나노입자가 면역복합체를 형성한 모습을 보여준다, 이를 통해 자성 입자-나노입자의 면역복합체의 형성은 시료(예, 혈액) 내의 특정 항원 마커의 농도에 의해 조절되는 것을 알 수 있다. 또한 도 8의 결과를 통해 본 발명의 면역분석방법은 다중 검출이 가능한 면역반응이며, 제1항원 타겟의 반응이 제2 항원 타겟의 반응에 영향을 주지 않고 각각의 항원-항체 반응이 서로 유효함을 알 수 있다. 즉, cTnI 항체가 고정화된 자성 입자와 cTnI 항원이 결합된 나노입자가 서로 반응하여 면역복합체를 형성하는 반응과; CK-MB 항체-항원의 면역복합체 형성 반응은 서로 영향을 주지 않고 각각의 반응이 유효하게 일어나므로 다중 검출이 가능함을 알 수 있다.The results are shown in Fig. As shown in Fig. 8A, in the case of the sample lacking the cTnI and CK-MB antigen markers, since the reaction between the magnetic particles and the nanoparticles is not disturbed, the cTnI antibody-immobilized magnetic particles and the magnetic particles All formed immune complexes with nanoparticles. As shown in FIG. 8B, in the case of the sample in which all the cTnI and CK-MB antigen markers were present, the magnetic particles and the CK-MB antibody immobilized with cTnI and CK-MB antigen marker and cTnI antibody already present in the sample were fixed Since the magnetic particles are bound to each other, the magnetic particle to which the cTnI antibody is immobilized and the magnetic particle to which the CK-MB antibody is immobilized can hardly form an immunocomplex with the nanoparticle. As shown in Figs. 8C and 8D, in the case of a sample containing only one marker of cTnI antigen marker and CK-MB antigen marker, one kind of magnetic particle (magnetic particle having anti-cTnI antibody or anti-CK-MB antibody) Showing that the formation of the immunocomplex of the magnetic particle-nanoparticles is controlled by the concentration of the specific antigen marker in the sample (e.g., blood). 8, the immunoassay of the present invention is an immune response capable of multiple detection, and the reaction of the first antigen target does not affect the reaction of the second antigen target, and the respective antigen-antibody reactions are mutually effective . That is, a reaction in which a magnetic particle to which cTnI antibody is immobilized and a nanoparticle to which cTnI antigen is bound react with each other to form an immunocomplex; Immunoconjugate formation of CK-MB antibody-antigen does not affect each other, and each reaction is effective, so multiple detection is possible.

서로 다른 항원끼리 반응하는 교차반응성이나 간섭이 일어나지 않아야 다중검출 면역분석의 선택성을 높일 수 있다. 본 발명의 면역분석방법에서 이를 확인하기 위해, 항 cTnI 항체가 고정된 자성 입자, 항 CK-MB 항체가 고정된 자성 입자, cTnI 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 cTnI 할로우 금 나노입자, 및 CK-MB 항원 마커와 라만 리포터 분자가 결합된 CK-MB 할로우 금 나노입자를 사용하여, 하나의 항원 타겟의 농도를 0 pg/mL 에서 1 μg/mL 로 변화시켠서 SERS 신호 변화를 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 것과 같이, cTnI 또는 CK-MB 항원 타겟의 농도가 증가함에 따라, 농도가 증가하는 항원 타겟의 SERS 신호만이 증가하였다. 존재하지 않는 항원 타겟에 대해서는 변화가 없다는 것을 확인할 수 있다. 따라서 다중 검출시 서로 다른 항원끼리 반응하는 교차반응이나 간섭이 일어나지 않음을 알 수 있다.Cross-reactivity or interference that reacts with different antigens should be avoided to increase the selectivity of multiple detection immunoassays. In order to confirm this in the immunoassay method of the present invention, a magnetic particle to which an anti-cTnI antibody is immobilized, a magnetic particle to which an anti-CK-MB antibody is immobilized, a cTnI hollow gold nanoparticle to which a cTnI antigen marker and a Raman reporter molecule are bound, Using the CK-MB hollow gold nanoparticles conjugated with the MB antigen marker and the Raman reporter molecule, the SERS signal change was confirmed by changing the concentration of one antigen target from 0 pg / mL to 1 μg / mL. The results are shown in Fig. As shown in Fig. 9, as the concentration of cTnI or CK-MB antigen target was increased, only the SERS signal of the antigen target with increasing concentration was increased. It can be seen that there is no change for non-existing antigen targets. Thus, it can be seen that cross-reacting or interfering reaction between different antigens does not occur during multiple detection.

도 10A는 각 리포터 CK-MB(빨강)와 cTnI(검정)의 라만 신호 및 각 리포터 나노입자의 1:1 혼합물의 라만 신호를 나타낸 것이다. 이를 통해 두 가지 마커가 동시에 존재하더라도 각각의 신호를 분석하는 데 무리가 없다는 것을 알 수 있다. 도 10B는 두 가지 항원 타겟 혼합물의 조성을 달리한 다섯가지 시료를 준비하여 각각의 신호를 분석한 결과를 나타낸 것이고 10C는 10B의 가장 큰 피크 부분을 확대하여 분석한 것이다. cTnI에 대한 CK-MB의 몰비는 1:0 (red), 3:1 (yellow), 1:1 (green), 3:1 (sky blue) and 0:1 (gray)이었다. 10B의 결과, 오로지 타겟 항원의 농도에 의해서만 신호가 변화되는 것을 확인할 수 있다. 10A shows Raman signals of each reporter CK-MB (red) and cTnI (black) and Raman signal of a 1: 1 mixture of reporter nanoparticles. As a result, it is easy to analyze each signal even if two markers are present at the same time. FIG. 10B shows the result of analyzing each signal by preparing five samples having different compositions of the two antigen target mixtures, and FIG. 10C is an enlarged view of the largest peak portion of 10B. The molar ratios of CK-MB to cTnI were 1: 0 (red), 3: 1 (yellow), 1: 1 (green), 3: 1 (sky blue) and 0: 1 (gray). 10B, it can be confirmed that the signal is changed only by the concentration of the target antigen.

실시예Example 4: 임상실험 결과 4: Clinical trial results

고려대학교병원(경기도 안산)에서 수집된 18명 환자의 혈액을 이용하여, 종래에 사용되는 전기적 화학면역방법을 이용한 검사 결과와 본 발명의 면역분석방법의 검사 결과와 비교하여 보았다. 모든 인간 혈액 샘플은 고려대학교병원의 IRB 프로토콜이 승인한 방법으로 다루었다. 말초 정맥 혈액을 SST 튜브(serum separation tube, Beckton Dickinson, USA) 에 모으고 실온에서 30분 동한 응혈이 일어나도록 하였다. 2000g에서 15분 동안 원심분리 후 혈청을 분리하여 -8°C 에서 보관하였다. 각각 환자의 혈액 샘플의 CK-MB 및 cTnI 레벨은 상업적으로 입수가능한 ECMIA(electrochemiluminescent microparticle immunoassay) Cobas CK-MB and cTnI reagent kits (Roche Cobas E module)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 4.87 ng/ml 값의 CK-MB 및 0.3 ng/ml 값의 cTnI이 병리학적 양성으로 판단되었다. 본 발명에 따른 경쟁 면역반응 기반 SERS 분석도 병행하였다. 라만 리포터가 부착된 나노입자, CK-MB 및 cTnI 마커를 이용한 SERS 분석을 수행하기 전에, 이미 알려진 농도인, FBS 용액 내 CK-MB 및 cTnI 농도로 칼리브레이션 커브를 작성하였다. 서로 다른 각각의 9명의 환자의 혈청으로부터 CK-MB 및 cTnI의 SERS 세기를 1617 cm-1 및 1647 cm-1 에서 측정하였고 CK-MB 및 cTnI의 양은 방정식(calibration fitting equation)을 이용하여 측정하였다.The blood of 18 patients collected from Korea University Hospital (Ansan, Gyeonggi-do) was compared with the test results of the conventional electrochemical immunoassay method and the immunoassay method of the present invention. All human blood samples were handled in a manner approved by Korea University Hospital's IRB protocol. Peripheral venous blood was collected in a SST tube (Beckton Dickinson, USA) and allowed to coagulate for 30 minutes at room temperature. After centrifugation at 2000 g for 15 minutes, the serum was separated and stored at -8 ° C. The CK-MB and cTnI levels of each patient's blood sample were measured according to the manufacturer's protocol using commercially available ECMIA (electrochemiluminescent microparticle immunoassay) Cobas CK-MB and cTnI reagent kits (Roche Cobas E module). According to the manufacturer's protocol, CK-MB of 4.87 ng / ml and cTnI of 0.3 ng / ml were determined to be pathologically positive. SERS analysis based on competition immunity according to the present invention was also performed. Calibration curves were generated at CK-MB and cTnI concentrations in an FBS solution at known concentrations prior to SERS analysis using Raman reporter-attached nanoparticles, CK-MB and cTnI markers. SERS intensities of CK-MB and cTnI were measured at 1617 cm-1 and 1647 cm-1 from sera from 9 different patients, respectively, and the amounts of CK-MB and cTnI were measured using a calibration fitting equation.

그 결과를 도 11에 나타내었다. 종래 검사 방법(X축, ECMIA)은 한 시료에 대한 2번의 검사로 두 가지 항원 타겟의 농도(CK-MB, cTnI)가 결정된 것이고, 개발된 면역분석법 (Y축, SERS based competitive assay)은 한 가지 시료에 대한 단 한번의 검사로 두 가지 항원 타겟에 대한 농도를 한번에 얻은 것이다. 도 11을 통해, 본 발명의 분석방법을 통해서도 종래 검사 결과와 매우 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 방법은 종래 분석 방법과 비교하여 분석에 소모되는 시약의 양이 적고, 분석 시간이 짧으며 혈액 소모량 역시 적으므로 종래 방법보다 매우 우수하다.The results are shown in Fig. In the conventional assay method (X-axis, ECMIA), the concentration of two antigen targets (CK-MB, cTnI) was determined by two tests on one sample and the developed immunological assay (Y-axis, SERS based competitive assay) A single test on the branch samples yielded concentrations for the two antigen targets at once. 11, it can be confirmed that results similar to the conventional test results can be obtained through the analysis method of the present invention. However, the method according to the present invention is superior to the conventional method because the amount of the reagent consumed in the analysis is small, the analysis time is short, and the blood consumption is small as compared with the conventional analysis method.

비교예Comparative Example 1: 1단계 면역반응과 2 단계 면역반응 비교 Comparison of 1: 1 and 2-stage immune responses

1단계 면역반응 방법은, 항체가 고정된 자성 입자에 혈액과 나노입자가 표지된 항원 단백질을 동시에 반응시키는 것이다. 2단계 면역반응 방법은, 항체가 고정된 자성 입자와 혈액을 1차로 충분히 반응시킨 후, 그 다음에 나노입자가 표지된 항원 단백질을 2차적으로 반응시키는 것이다. 1 단계 면역반응 및 2 단계 면역반응에 사용되는 자성 입자, 혈액, 항원 및 나노입자는 실시예 1 및 2에 기재된 방법에 따라 수행하였다.The first step of the immune response method involves reacting blood and nanoparticle-labeled antigen proteins simultaneously with antibody-immobilized magnetic particles. In the second step immunoreaction method, the antibody is firstly reacted with the magnetic particles sufficiently to react with the blood, and then the nanoparticle-labeled antigen protein is reacted secondarily. Magnetic particles, blood, antigens, and nanoparticles used in the first-step immunoreaction and the second-step immunoreaction were performed according to the methods described in Examples 1 and 2.

그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12는 1 단계 면역반응과 2단계 면역반응을 하였을 경우, 혈액 내 cTnI가 있을 때 (On) 및 없을 때(Off)의 신호 차이를 보여준다. 혈액의 남은 여액을 SERS 측정하면 2 단계 면역반응을 진행하였을 때, On/Off의 신호 차이가 월등히 크다는 사실을 알 수 있다. 이는 1단계 면역반응만 진행할 경우, 나노입자에 붙어 있는 항원 마커에 의해 방해를 받아서 혈액 내 타겟 항원 마커가 자성 입자에 잘 결합하지 못하기 때문인 것으로 판단된다. The results are shown in Fig. FIG. 12 shows signal differences when cTnI is present (On) and when there is no (Off) in the blood when the first-stage immunity and the second-stage immune response are performed. When the remaining filtrate of the blood is measured by SERS, it can be seen that the signal difference of On / Off is much larger when the second stage immunity reaction is performed. This suggests that when only the first-step immune response is generated, the target antigen marker in the blood can not bind to the magnetic particles due to interference with the antigen marker attached to the nanoparticle.

비교예Comparative Example 2: 2: ELISAELISA 면역분석법 Immunoassay

cTnI 과 CK-MB 마커에 대해 ELISA 측정을 수행하였다. 먼저, 96 웰 플레이트 표면 위에 포획 항체들(capture antibodies)이 고정되었고, 나머지 부분에는 비특이적 결합을 막기 위하여 BSA가 처리되었다. 그 후, 항원들이 첨가되었고, 포획항체와 결합하였다. 마이크로파이펫을 사용하여 세번 세척한 후, 검출 항체들이 더해지고 항원들과 결합하였다. 효소와 연결된 2차 항체들이 첨가되었고, 검출항체들과 결합하였다. 마지막으로, 기질이 더해졌고 효소에 의해 보여질 수 있는 형태로 변환되었다. 도 13은 cTnI 과 CK-MB 의 서로 다른 농도에서의 샌드위치 면합복합체의 형성을 나타내는 ELISA 표준곡선이다.ELISA measurements were performed on cTnI and CK-MB markers. First, capture antibodies were immobilized on the surface of a 96-well plate, and BSA was treated to prevent nonspecific binding in the remaining portion. The antigens were then added and bound to the capture antibody. After three washes using a micropipette, the detection antibodies were added and bound to the antigens. Secondary antibodies linked to the enzyme were added and bound to the detection antibodies. Finally, the substrate was added and transformed into a form that could be seen by the enzyme. Figure 13 is an ELISA standard curve showing the formation of sandwich complexes at different concentrations of cTnI and CK-MB.

ELISA 수행 시간은 약 6시간 정도 소요되었고, 검출한계(Limit of Detection)은 cTnI 와 CK-MB 각각 1-10 ng/mL이었다. 두 가지 마커에 대한 정보를 얻기 위해서는 각각의 ELISA가 진행되어야 하며, 검사에 필요한 최소 부피는 50 μL이었다. 이에 반해 본 발명의 SERS 기반 마커 검출 방법을 이용하면 검사 시간 15분, LOD는 cTnI 33.7 pg/mL, CK-MB는 42.5 pg/mL이었다. 또한 두 가지 마커에 대한 정보를 동시에 얻을 수 있으며, 검사에 필요한 최소 부피는 10 μL이었다.The ELISA run time was about 6 hours and the limit of detection was 1-10 ng / mL for cTnI and CK-MB, respectively. To obtain information on the two markers, each ELISA should be performed and the minimum volume required for the assay was 50 μL. On the other hand, using the SERS-based marker detection method of the present invention, the test time was 15 minutes, the LOD was 33.7 pg / mL, and the CK-MB was 42.5 pg / mL. In addition, information on both markers can be obtained at the same time, and the minimum volume required for the test was 10 μL.

Claims

시료액을 준비하고;
질병 마커에 해당하는 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자를 준비하고;
질병 마커에 해당하는 항원과 라만 리포터 분자가 결합된 할로우 금 나노입자를 준비하고;
상기 시료액에 상기 항체가 고정화된 자성 입자를 첨가하여, 상기 시료액과 상기 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 제1 면역반응을 유도하고;
상기 제1 면역 반응이 유도된 후에, 상기 시료액에 상기 할로우 금 나노입자를 첨가하여, 상기 시료액이 상기 자성 입자 및 상기 할로우 금 나노입자와 경쟁적으로
면역반응을 하도록 제2 면역반응을 유도하고;
상기 제2 면역반응이 완료된 후, 상기 자성 입자를 제외한 시료의 여액에 레이저 광을 조사하고; 그리고
상기 레이저광 조사 이후에 표면-증강 라만 산란(surface-enhanced Raman scattering: SERS) 신호를 측정하여 상기 마커를 확인하는 단계;
를 포함하는 경쟁 면역반응을 이용한 SERS 기반의 질병 진단용 마커 검출 방법.
Prepare a sample solution;
Preparing magnetic particles to which an antibody that specifically binds to an antigen corresponding to a disease marker is immobilized;
Preparing hollow gold nanoparticles in which an antigen corresponding to a disease marker and a Raman reporter molecule are bound;
Adding the magnetic particles immobilized with the antibody to the sample solution to induce a first immune reaction between the sample solution and the magnetic particles to which the antibody is immobilized;
After the first immune response is induced, the hollow gold nanoparticles are added to the sample solution, and the sample solution is mixed with the magnetic particles and the hollow gold nanoparticles competitively
Inducing a second immune response to cause an immune response;
After completion of the second immune reaction, irradiating the filtrate of the sample excluding the magnetic particles with laser light; And
Measuring a surface-enhanced Raman scattering (SERS) signal after the laser light irradiation to identify the marker;
A method for detecting a marker for disease diagnosis based on SERS using a competitive immune response.

제1항에 있어서,
상기 시료액은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액 및 복막액으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the sample liquid is selected from the group consisting of tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, multiple fluid, synovial fluid and peritoneal fluid.

제1항에 있어서,
상기 시료액에는 복수 개의 질병 마커 항원이 포함되어 있고;
상기 자성 입자는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 질병 마커 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자이고; 그리고
상기 할로우 금 나노입자는 상기 시료액에 포함된 복수 개의 질병 마커 항원과 동일한 적어도 한 개의 항원이 결합된 금 나노입자로 구성됨으로써 다중 마커 확인이 가능한 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the sample liquid contains a plurality of disease marker antigens;
Wherein the magnetic particles are magnetic particles on which an antibody that specifically binds to a plurality of disease marker antigens contained in the sample solution is immobilized; And
Wherein the hollow gold nanoparticles are composed of gold nanoparticles having at least one antigen bound to the same disease marker antigen contained in the sample solution so that multiple marker recognition is possible.

제1항에 있어서,
상기 제1 면역반응은 5-15분간 수행되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the first immune response is performed for 5-15 minutes.

제1항에 있어서,
상기 제2 면역반응은 5-15분간 수행되는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the second immune response is performed for 5-15 minutes.

제1항에 있어서, 상기 질병 마커 확인에 소요되는 시간은 10 내지 30분인 방법.
The method according to claim 1, wherein the time required for identifying the disease marker is 10 to 30 minutes.

제1항에 있어서,
상기 경쟁 면역반응은, 상기 시료액에 포함된 마커 항원 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 면역반응과; 상기 시료액에 포함된 마커 항원과 동일한 항원이 결합된 할로우 금 나노입자 및 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 고정화된 자성 입자 사이의 면역반응이 경쟁적으로 일어나는 면역반응인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the competitive immunoreaction includes an immune reaction between a marker antigen contained in the sample solution and magnetic particles immobilized with an antibody that specifically binds to the antigen; Wherein the immune response is competitively generated between the hollow gold nanoparticles to which the same antigen as the marker antigen contained in the sample solution is bound and the magnetic particles to which the antibody specifically binding to the antigen is immobilized.

제1항에 있어서,
상기 제2 면역반응이 완료된 후 상기 자성 입자를 제외한 시료의 여액에 레이저 광을 조사하는 단계에서, 상기 시료의 여액에 남아 있는 할로우 금 나노입자에 레이저 광을 조사하여 SERS 신호를 측정하는 것인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the SERS signal is measured by irradiating laser light to the hollow gold nanoparticles remaining in the filtrate of the sample in the step of irradiating laser light to the filtrate of the sample after the completion of the second immune reaction .

제1항에 있어서,
상기 라만 리포터 분자는 크리스탈 바이올렛(CV), X-로다민-5-아이소티오시아네이트(XRITC) 또는 말라카이트 그린 아이소티오시아네이트(MGITC)인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the Raman reporter molecule is crystal violet (CV), X-rhodamine-5-isothiocyanate (XRITC) or malachite green isothiocyanate (MGITC).

제1항에 있어서, 상기 질병은 암인 방법.
2. The method of claim 1, wherein the disease is cancer.

제10항에 있어서, 상기 암은 폐암, 기관지암, 결장 직장암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 위암, 난소암, 방광암, 뇌암, 갑상선암, 식도암, 자궁암, 간암, 신장암, 담도암, 및 고환암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
The method of claim 10, wherein the cancer is selected from the group consisting of lung cancer, bronchial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, breast cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, ovarian cancer, bladder cancer, brain cancer, thyroid cancer, esophageal cancer, uterine cancer, liver cancer, &Lt; / RTI >

제1항에 있어서, 상기 질병은 급성심근경색증인 방법.
2. The method of claim 1, wherein the disease is acute myocardial infarction.

제1항에 있어서,
상기 마커는 트로포닌 I(Troponin I) 또는 CK-MB인 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the marker is Troponin I or CK-MB.

제1항에 있어서, 상기 시료액의 양은 10 내지 30 μL인 방법.The method according to claim 1, wherein the amount of the sample solution is 10 to 30 μL.

제1항에 있어서,
상기 항원의 검출 한계값은 10 내지 60 pg/mL인 방법. The method according to claim 1,
Wherein the detection limit of the antigen is 10 to 60 pg / mL.