KR101484080B1 - Method for preparing liposome preparation containing amphotericin b with increased entrapment efficiency and improved storage stability, and liposome preparation obtained therefrom - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a method for preparing a liposome preparation containing amphotericin B, and a liposome preparation containing amphotericin B prepared thereby. According to the preparation method of the present invention, provided is a liposome preparation containing amphotericin B, in which free amphotericin B that is not enclosed in the liposome is maintained at a content of less than 1%, and amphotericin B is stably enclosed in the liposome, thereby reducing cytotoxicity to normal cells, increasing enclosing efficiency to improve productivity, and controlling the grain particle distribution to improve storage stability.

Description

봉입률과 저장안정성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법, 및 이로부터 제조된 리포좀 제제 {METHOD FOR PREPARING LIPOSOME PREPARATION CONTAINING AMPHOTERICIN B WITH INCREASED ENTRAPMENT EFFICIENCY AND IMPROVED STORAGE STABILITY, AND LIPOSOME PREPARATION OBTAINED THEREFROM}FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a process for preparing a liposome preparation containing amphotericin B having improved packing density and storage stability, and a liposome preparation prepared therefrom, and a liposome preparation prepared therefrom, and a liposome preparation prepared therefrom THEREFROM}

본 발명은 봉입률과 저장안정성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법, 및 이로부터 제조된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제로서, 봉입률을 증가시키고 입도분포를 안정화하여 저장안정성이 개선된 리포좀 제제를 제조하는 방법, 및 이로부터 제조된 리포좀 제제에 관한 것이다. The present invention relates to a process for preparing a liposome preparation containing amphotericin B with improved encapsulation and storage stability, and a liposomal preparation containing amphotericin B prepared therefrom. More specifically, the present invention relates to a method for producing a liposome preparation containing amphotericin B and having improved storage stability by increasing the inclusion rate and stabilizing the particle size distribution, and a liposome preparation prepared therefrom.

암포테리신 B는 항진균성 폴리엔(polyene)계 항생제의 일종으로서 스트렙토마이세스 노도수스 M4575(Streptomyces nodosus M4575)에서 생산되며, 양쪽성 성질을 가지는 폴리엔 거대분자(polyene macrolide)로 이루어져 있고, 친수성기인 OH부분과 소수성기인 이중결합이 접합(Conjugated)된 형태의 락톤(lactone) 구조를 갖는 거대 환으로 구성되어져 있다. 암포테리신 B의 구조는, 하기 화학식 I과 같다. Amphotericin B is a class of antifungal polyene antibiotics and is known as Streptomyces nodosus M4575), which is composed of a polyene macrolide with amphoteric properties and a large ring with a lactone structure in which a hydrophilic group OH group and a hydrophobic double bond are conjugated Respectively. Amphotericin B has the following structure (I).

Figure 112013077725624-pat00001
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상기 암포테리신 B는 전신성 진균감염, 호중구 감소 환자의 불명열(fever of unknown origin), 면역기능이 있는 성인 및 소아의 내장 리슈마니아증의 1차 치료, 면역결핍환자(HIV양성환자 등)에서 내장 리슈마니아증의 1차 치료에 대한 효능을 지니고 있으며, 세포막에 존재하는 진균의 에르고스테롤(ergosterol)에 작용하여 진균의 사멸 효과를 가진다. The amphotericin B may be used in the treatment of systemic fungal infections, fever of unknown origin in neutropenic patients, first-line treatment of immune-functioning adult and pediatric Richemannia, immunosuppressed patients (HIV-positive patients, etc.) It has the efficacy of first-line treatment of Rishmaniasis and acts on ergosterol of fungi in the cell membrane and has killing effect of fungus.

즉, 에르고스테롤은 진균의 세포막에 존재하는 성분으로 세포막 효소(membrane enzyme)들과 이온교환단백질(ion transport protein)의 특이한 기능을 조절하는 역할을 수행하는데, 암포테리신 B의 폴리엔 부위가 이러한 진균 세포막의 에르고스테롤에 결합하여 세포막에 구멍을 형성하여, 세포 밖으로 Mg2 +와 K+가 흘러나오게 함으로써, 세포대사를 교란시켜, 진균이 사멸하는 직접적인 원인을 제공하게 된다. In other words, ergosterol is a component present in the cell membrane of fungi and plays a role in regulating the specific functions of membrane enzymes and ion transport proteins. It binds to the ergosterol of the fungus cell membrane to form a hole in the cell membrane, allowing Mg 2 + and K + to flow out of the cell, disturbing the cell metabolism and providing a direct cause of the fungal killing.

한편, 포유동물의 세포막에 존재하는 콜레스테롤이 상기 진균 세포막의 에르고스테롤과 구조적으로 매우 비슷하지만 곁사슬이 약간 다르고, 3차원적으로 볼 때 에르고스테롤의 환 구조에서 B링의 이중결합 부분이 약간 더 평면 구조를 띠는 점에서 차이가 있는 바, 암포테리신 B의 폴리엔은, 포유동물 세포막의 콜레스테롤 보다 진균 세포막의 에르고스테롤과 친화력이 더 커서, 진균 세포에서 보다 높은 활성을 나타낸다. 그러나, 에르고스테롤과 콜레스테롤이 구조적으로 매우 유사한 스테롤이라는 점에서, 암포테리신 B는 진균의 숙주인 포유동물의 세포막에 존재하는 콜레스테롤에도 결합함으로써 정상세포와 조직에 대하여 독성을 나타내며, 오한, 발열, 조직괴사, 신독성 및 간독성 등의 부작용을 유발할 수 있다.On the other hand, the cholesterol present in the mammalian cell membrane is structurally very similar to ergosterol in the fungal cell membrane, but the side chains are slightly different and the double bond portion of the B ring in the ring structure of ergosterol is three- Due to differences in structure, the polyenes of amphotericin B have higher affinity for ergosterol in fungal membranes than cholesterol in mammalian cell membranes, indicating higher activity in fungal cells. However, since ergosterol and cholesterol are structurally very similar to sterols, amphotericin B is also toxic to normal cells and tissues by binding to cholesterol present in the cell membrane of mammals, the host of fungi, Tissue necrosis, renal toxicity, and hepatotoxicity.

암포테리신 B는 물과 알콜에 난용성인 성질을 가지고 있어 정맥주사 등의 약학적 제제로 사용하기 위해서는, 염의 형태로 하거나 마이셀, 마이크로 에멀젼, 또는 리포좀으로 제제화함으로써 가용화하여 사용한다. 특히, 암포테리신 B를 리포좀 제제화할 경우 암포테리신 B의 신독성이 감소되는 장점이 있는 것으로 알려져 있다. Amphotericin B is poorly soluble in water and alcohol. For use as a pharmaceutical preparation such as intravenous injection, the amphotericin B is solubilized and used in the form of a salt, or in the form of micelles, microemulsions or liposomes. In particular, it is known that when amphotericin B is formulated into a liposome, the nephrotoxicity of amphotericin B is reduced.

이와 관련하여, 미국특허 제4,981,690호에는 암포테리신 B를 봉입한 리포솜의 제조방법으로서, 인지질과 콜레스테롤을 사용하여 다중막 리포솜 형태로 제조하는 구성이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 체내 투여 시 리포좀의 구조가 불안정하기 때문에 쉽게 파괴되어 봉입되어 있던 암포테리신 B가 급격히 방출되는 문제가 있다. 또한, 한국특허공고 1997-0007187에는, 개선된 암포테리신 B 리포좀 제조법에 관한 기술로서, 난용성 암포테리신 B를 가용화하기 위해 산성화시킨 메탄올과 클로로포름의 혼합용매 내에서 암포테리신 B와 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤을 이온결합하고 리포좀을 형성하는 구성이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허는, 리포좀 내로 봉입되지 않은 유리된 암포테리신 B로 인한 독성문제와, 암포테리신 B의 리포좀 내로의 봉입이 완전하지 못하여, 생체내 투여시 정상세포와 조직에 있어서 안전성(safety)의 문제가 있었다. In this connection, U.S. Patent No. 4,981,690 discloses a method for producing liposomes encapsulating amphotericin B by using a phospholipid and cholesterol to produce a multilamellar liposome. However, since the structure of the liposome is unstable at the time of administration into the body, the above method has a problem that amphotericin B, which has been easily broken down, is rapidly released. Korean Patent Publication No. 1997-0007187 discloses an improved amphotericin B liposome production process. In order to solubilize the poorly soluble amphotericin B, amphotericin B and anionic amphotericin B in a mixed solvent of acidified acidified methanol and chloroform Phosphatidylglycerol, which is a lipid, is ion-bonded and a liposome is formed. However, the above patent discloses that toxicity due to liberated amphotericin B not encapsulated in liposomes and encapsulation of amphotericin B in liposomes are not complete, and therefore, safety in normal cells and tissues in vivo ).

이에, 본 발명자들은, 리포좀 제조공정중에서 유리 암포테리신 B를 충분히 제거하고, 리포좀내에 암포테리신 B를 안정적으로 봉입함으로써, 생체 투여시 안전성이 개선되고, 아울러, 암포테리신 B의 리포좀 내 봉입률을 증가시킴으로써 생산성이 향상된 리포좀 제제를 예의 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have found that amphotericin B is sufficiently removed in the liposome manufacturing process and the amphotericin B is stably enclosed in the liposome, thereby improving the safety in the administration of a living body, The present invention has been accomplished on the basis of extensive studies of a liposome preparation having improved productivity by increasing the ratio of the liposome to the liposome.

미국특허 제4,981,690호(1991. 1. 1. 등록, LIPOSOME-INCORPORATED MEPARTRICIN)U.S. Patent No. 4,981,690 (registered Jan. 1, 1991, LIPOSOME-INCORPORATED MEPARTRICIN) 한국공고특허 1997-0007187(1997. 5. 7. 공고, 개선된 암포테리신 B 리포좀 제조법)Korean Patent Publication No. 1997-0007187 (issued on May 7, 1997, an improved amphotericin B liposome manufacturing method)

본 발명의 목적은, 유리 암포테리신 B의 리포좀 내 봉입률을 증가시켜 생산성을 향상시키고, 입도분포를 조절함으로써 저장안정성을 개선시키는 리포좀 제제의 제조방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a method for producing a liposome preparation which improves the storage stability by increasing the inclusion rate of free amphotericin B in the liposome and improving the productivity and controlling the particle size distribution.

또한, 본 발명의 목적은, 생체 내 투여시 정상 숙주 세포에 대한 독성이 감소됨으로써 안전성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a liposome preparation containing amphotericin B whose safety is improved by decreasing toxicity to normal host cells in vivo.

이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법은, In order to achieve this object, the present invention provides a method for producing a liposome preparation containing amphotericin B,

암포테리신 B에 유기용매를 첨가하여 생성된 현탁액을, 포스파티딜글리세롤을 유기용매 및 산에 용해하여 생성된 pH 1~3의 용액과 혼합하여, 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을 생성하는 단계(1단계);A suspension produced by adding an organic solvent to amphotericin B is mixed with a solution of pH 1 to 3 produced by dissolving phosphatidylglycerol in an organic solvent and an acid to produce a solution containing amphotericin B and phosphatidyl glycerol (Step 1);

상기 1단계에서 생성된 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 첨가하여 생성된 용액과 혼합하여 얻은 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에 염기를 첨가하여 pH 4~5.5로 조절하는 단계(2단계); A solution containing amphotericin B and a lipid complex obtained by mixing the solution containing amphotericin B and phosphatidyl glycerol produced in the above step 1 with a solution produced by adding phosphatidylcholine, sterol, and an antioxidant to an organic solvent Adding a base to adjust the pH to 4 to 5.5 (Step 2);

상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에서 유기용매를 휘산하고, 건조물을 얻는 단계(3단계); Volatilizing the organic solvent in the solution containing the amphotericin B and the lipid complex to obtain a dried product (step 3);

완충액에 무기염을 첨가한 후, 상기 건조물을 넣고 나서 상기 건조물을 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계); Adding an inorganic salt to the buffer solution, adding the dried product, and hydrating the dried product to obtain a liposome dispersion (step 4);

상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화 하는 단계(5단계); Homogenizing the liposome dispersion with a homogenizer (step 5);

상기 균질화된 리포좀 분산액에, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계); 및Applying gel column chromatography to the homogenized liposome dispersion to remove glass amphotericin B (step 6); And

여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동시키는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계);를 포함한다. And repeating the cycle of freezing and thawing the filtered liposome dispersion three or more times (step 7).

상기 유기용매는 클로로포름과 메탄올을 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합한 혼합용매인 것이 바람직하다. The organic solvent is preferably a mixed solvent of chloroform and methanol in a volume ratio of 0.5: 2 to 2: 0.5.

상기 포스파티딜글리세롤은 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. The phosphatidyl glycerol may be at least one member selected from the group consisting of distearoyl phosphatidyl glycerol, di-myristoyl phosphatidyl glycerol, dilauryl phosphatidyl glycerol, and dipalmitoyl phosphatidyl glycerol.

상기 포스파티딜콜린은, 수소화대두포스파티딜콜린, 난황포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디팔미토일포스파티딜콜린로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. The phosphatidylcholine may be at least one selected from the group consisting of hydrogenated soybean phosphatidylcholine, yolk phosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, and dipalmitoylphosphatidylcholine.

상기 스테롤은 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 에르고스테롤, 및 라노스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. The sterol may be at least one selected from the group consisting of cholesterol, cholesterol hexasuccinate, ergosterol, and lanosterol.

상기 4단계에 있어서, 무기염은 약제학적으로 사용가능한 무기염으로서, 탄산나트륨, 염화마크네슘, 염화칼륨, 및 염화나트륨으로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.In the above step 4, the inorganic salt may be at least one selected from the group consisting of sodium carbonate, magnesium chloride, potassium chloride, and sodium chloride as pharmaceutically usable inorganic salts.

상기 5단계에 있어서, 균질화는 1,000~1,500bar에서 8회~15회의 범위에서 반복적으로 수행할 수 있고, 이로써, 제조된 리포좀 제제의 스판(Span)값을 1.0~1.5 사이로 조절할 수 있다. In the above step 5, the homogenization can be repeatedly carried out at a range of 8 to 15 times at 1,000 to 1,500 bar, whereby the span value of the prepared liposome preparation can be adjusted to a value between 1.0 and 1.5.

상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클은, 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지할 수 있다. In the step 7, the cycle of freezing and thawing is maintained at -50 to -10 deg. C by cooling down for 30 minutes to 24 hours, and then the temperature is raised to maintain the thawing condition at 55 to 65 deg. C for 30 minutes to 12 hours .

상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클을 3회~10회 반복 수행할 수 있다. In the step 7, the cycle of freezing and thawing can be repeated 3 to 10 times.

상기 6단계와 7단계 사이, 또는 상기 7단계 직후에, 리포좀 분산액을 여과하는 단계를 수행할 수 있다. Between steps 6 and 7, or immediately after step 7, filtration of the liposome dispersion may be performed.

또한, 본 발명은, 다른 양태에 따르면, 상기 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법에 의해 제조된, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제에 관한 것이다. Further, the present invention relates to a liposome preparation containing amphotericin B, which is produced by a method for producing a liposome preparation containing amphotericin B, according to another aspect.

이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은, 봉입률과 저장안정성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법에 관한 발명으로서, 여기서의 ‘저장안정성’이란, 제조된 리포좀 제제의 저장기간 중 또는 사용기간 중 리포좀의 자기부착으로 인한 엉김(aggregation) 현상을 방지하는 것을 의미한다. The present invention relates to a method for producing a liposome preparation containing amphotericin B having an improved encapsulation rate and storage stability, wherein the 'storage stability' means that the liposome during storage or during use of the liposome preparation, To prevent the aggregation phenomenon due to the self-adhesion of the substrate.

본 발명의 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법은, 우선, 암포테리신 B를 유기용매에 넣어 현탁액을 제조하고, 이와 별도로, 포스파티딜글리세롤을 용매 및 산 용액에 용해하여 pH 1~3의 용액을 생성하고 나서, 상기 현탁액과 혼합하는 단계(1단계)를 거친다. In the method for producing a liposome preparation containing amphotericin B of the present invention, amphotericin B is first added to an organic solvent to prepare a suspension, phosphatidyl glycerol is dissolved in a solvent and an acid solution separately, And then mixing with the suspension (step 1).

상기 유기용매로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 에테르, 디클로로메탄, 디메틸설폭시드, 및 클로로포름 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 메탄올과 클로로포름을 혼합하여 사용한다. 메탄올과 클로로포름은 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합되는 것이 바람직하며, 1:1의 부피비로 혼합되는 것이 보다 바람직하다. 상기 유기용매에 암포테리신 B를 첨가한 후, 750와트 강도의 초음파기를 사용하여 현탁액을 제조한다. The organic solvent may be at least one selected from the group consisting of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, ether, dichloromethane, dimethyl sulfoxide and chloroform, preferably methanol and chloroform. The methanol and chloroform are mixed preferably in a volume ratio of 0.5: 2 to 2: 0.5, and more preferably mixed in a volume ratio of 1: 1. After adding amphotericin B to the organic solvent, a suspension is prepared using an ultrasonic machine with a 750-watt intensity.

상기 포스파티딜글리세롤로는, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 디스테아로일포스파티딜글리세롤을 사용하는 것이 보다 바람직하다. As the phosphatidylglycerol, at least one selected from the group consisting of distearoylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dilaurylphosphatidylglycerol, and dipalmitoylphosphatidylglycerol is preferably used, It is more preferable to use roheylphosphatidylglycerol.

상기 포스파티딜글리세롤을 유기용매에 용해하면서, 동시에 또는 순차적으로, 산 용액을 넣어 산성조건이 되도록 한 후, 암포테리신 B 함유 현탁액과 혼합하는데, 이는 산성 조건하에서 포스파티딜글리세롤과 암포테리신 B가 강한 이온결합을 형성할 수 있기 때문이다. 상기와 같은 산성조건을 만들기 위한 산으로서는, 염산, 인산, 황산 또는 아세트산 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 염산을 사용한다. The phosphatidylglycerol is dissolved in an organic solvent and simultaneously or sequentially an acid solution is added to the acid solution to mix with the amphotericin B-containing suspension. This is because phosphatidylglycerol and amphotericin B form a strong ion Bonds can be formed. As the acid for making such an acidic condition, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid or acetic acid can be used, and hydrochloric acid is preferably used.

즉, 포스파티딜글리세롤을 용해한 용매에 염산을 첨가하여 산성조건을 만드는데, 바람직하게는 pH 1~3이 되도록 하며, 보다 바람직하게는, pH 1.2~1.5가 되도록 한다. 만일, pH 3을 초과하면, 포스파티딜글리세롤과 암포테리신 B가 이온화되지 않아 강한 이온결합을 형성하지 못하여 불투명한 노란색의 현탁 상태가 되며, pH 1 미만이면 암포테리신 B가 분해되는 문제가 있어 바람직하지 못하다. 이때 산성용액의 유지시간은 25~65℃에서 15분 이내로 유지하고 이후 단계로 진행한다. 만약 15분이 초과하게 되면 암포테리신 B가 강한 산성화로 인해 분해되게 된다. That is, hydrochloric acid is added to a solvent in which phosphatidylglycerol is dissolved to make acidic conditions, preferably pH 1 to 3, and more preferably pH 1.2 to 1.5. If the pH is higher than 3, phosphatidylglycerol and amphotericin B are not ionized to form strong opaque yellow bonds, and when pH is less than 1, amphotericin B is degraded I can not. At this time, the holding time of the acidic solution is maintained at 25 to 65 ° C. within 15 minutes, and the process proceeds to the subsequent step. If it exceeds 15 minutes, amphotericin B is degraded by strong acidification.

다음으로, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 넣어 용해한 후, 이전 단계에서 생성된 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액과 혼합하고 나서, 염기를 첨가하여 pH 4~5.5가 되도록 조절하여, 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액을 얻고 나서(2단계), 사용된 용매혼합액을 휘산하고, 건조필름 형태의 건조물을 얻는다(3단계). Next, the phosphatidylcholine, the sterol, and the antioxidant are dissolved in an organic solvent and mixed with a solution containing amphotericin B and phosphatidylglycerol produced in the previous step. Then, a base is added to adjust the pH to 4 to 5.5 After obtaining a solution containing amphotericin B and a lipid complex (step 2), the solvent mixture used is volatilized to obtain a dried film-like dried product (step 3).

포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질을 추가함으로써, 리포좀 막의 유동성을 조절하여 리포좀이 보다 안정적으로 유지될 수 있는 효과가 있다. 특별히 한정되지는 않으나, 상기 포스파티딜콜린으로서는, 수소화 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디팔미토일포스파티딜콜린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 상기 스테롤로서는, 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 에르고스테롤, 및 라노스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. By adding lipids such as phosphatidylcholine and sterol, it is possible to control the flowability of the liposome membrane and to maintain the liposome more stably. As the phosphatidylcholine, there may be used at least one selected from the group consisting of hydrogenated soybean phosphatidylcholine, yolk phosphatidylcholine, distearoylphosphatidylcholine, and dipalmitoylphosphatidylcholine. Examples of the sterol include cholesterol, cholesterol, At least one member selected from the group consisting of N, ergosterol, and lanosterol can be used.

본 발명에서는, 포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질류를 첨가하면서, 지질의 산화를 방지하여, 지질의 리포좀 안정화 효과를 극대화하기 위하여, 항산화제를 함께 사용한다. 이때, 사용되는 항산화제로서는 동 기술분야에서 공지된 것을 사용할 수 있다. 예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 베타카로틴, 알파토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(TPGS), 알파토코페롤 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알파토코페롤을 사용한다. In the present invention, an antioxidant is used together with lipids such as phosphatidylcholine and sterol while adding lipids to prevent oxidation of the lipid and maximize liposome stabilizing effect of the lipid. At this time, as the antioxidant to be used, those known in the art can be used. For example, vitamin C, vitamin E, beta carotene, alpha tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS), alpha tocopherol and the like can be used, and alpha tocopherol is preferably used.

상기 2단계에서 사용되는 유기용매로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 에테르, 디클로로메탄, 디메틸설폭시드 및 클로로포름 중에서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 1단계에서 사용된 유기용매와 마찬가지로, 메탄올과 클로로포름을 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. The organic solvent used in step 2 may be a mixture of two or more of methanol, ethanol, isopropyl alcohol, ether, dichloromethane, dimethyl sulfoxide and chloroform. As with the organic solvent used in step 1, Methanol and chloroform in a volume ratio of 0.5: 2 to 2: 0.5.

상기 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 용해한 용액과, 1단계에서 생성된 포스파티딜글리세롤 및 암포테리신 B를 함유한 용액을 혼합하면, 투명한 오렌지색의 용액이 얻어지는데, 이 용액에, NaOH 용액과 같은 염기를 첨가하여 pH를, 바람직하게는 pH 4.0~5.5, 보다 바람직하게는 pH 4.0~5.0, 가장 바람직하게는 pH 4.0~4.5로 조절한다. 상기 투명한 오렌지 색의 용액은, 메탄올 및 클로로포름의 혼합용매에, 암포테리신 B가 인지질인 포스파티딜글리세롤과 결합되어 가용화되고, 안정화제로서 포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질류가 포함되어 있는 것으로서, 이 용액을, 본 명세서에서, ‘암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액’이라고도 칭한다. When a solution containing phosphatidylcholine, a sterol, and an antioxidant dissolved in an organic solvent and a solution containing phosphatidylglycerol and amphotericin B produced in Step 1 are mixed, a transparent orange-colored solution is obtained. To this solution is added NaOH solution Is added to adjust the pH, preferably pH 4.0 to 5.5, more preferably pH 4.0 to 5.0, and most preferably pH 4.0 to 4.5. The transparent orange color solution is prepared by mixing amphotericin B with phosphatidylglycerol which is a phospholipid and solubilized in a mixed solvent of methanol and chloroform and containing lipids such as phosphatidylcholine and sterol as a stabilizer, , Also referred to herein as a " solution containing amphotericin B and a lipid complex ".

상기 1단계 및 2단계에 있어서, 암포테리신 B:포스파티딜글리세롤:포스파티딜콜린:스테롤은 1:0.5~3:0.5~9:0.5~6의 몰비로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 1:1~3:1~9:1~6의 몰비로 사용되고, 보다 바람직하게는, 1:1~2.5:1~6:1~3의 몰비로 사용된다. Amphotericin B: phosphatidylglycerol: phosphatidylcholine: sterol may be used in a molar ratio of 1: 0.5 to 3: 0.5 to 9: 0.5 to 6 in the first and second steps. Is preferably used in a molar ratio of 1: 1 to 3: 1 to 9: 1 to 6, and more preferably 1: 1 to 2.5: 1 to 6: 1 to 3.

상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액을, 회전식 용매 증발장치에 담아, 사용된 용매를 휘산하여, 건조 필름 형태의 건조물을 얻게 된다. The solution containing the amphotericin B and the lipid complex is placed in a rotary solvent evaporator, and the solvent used is volatilized to obtain a dry product in the form of a dry film.

그리고 나서, 완충액에 무기염을 첨가한 후, 상기 건조물을 가하여 건조물을 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계), 및 상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화하는 단계(5단계)를 거치게 된다. Then, an inorganic salt is added to the buffer solution, and then the dried product is hydrated to obtain a liposome dispersion (step 4), and the liposome dispersion is homogenized with a homogenizer (step 5).

본 발명에 있어서, 완충액으로서는, 당류가 포함된 완충액이 사용되며, 특히, 당류가 포함된 숙신산 완충액이 바람직하게 사용된다. In the present invention, a buffer solution containing a saccharide is used as the buffer solution, and a succinic acid buffer solution containing a saccharide is particularly preferably used.

상기 완충액에 포함되는 당류로는, 특별히 제한되지는 않으나, 백당, 락토오스, 말토오스 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는, 백당이 사용된다. The saccharide contained in the buffer solution is not particularly limited, but saccharide, lactose, maltose and the like can be used, and preferably, saccharide is used.

본 발명에서는, 이처럼 당류가 포함된 완충액으로 수화할 때, 무기염(inorganic salt)을 첨가함으로써, 리포좀 안에 봉입되는 암포테리신 B의 양을 증가시키는 효과가 있다. 즉, 수화 단계에서 리포좀 안에 봉입되는 암포테리신 B의 양이 증가함으로써, 이후 단계를 통해 제거되는 유리 암포테리신 B의 상대적 양이 적어지게 되므로, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 높은 수율로 얻을 수 있어 생산성이 현저히 향상될 수 있게 된다. In the present invention, when an inorganic salt is added when hydrating with a buffer solution containing such a saccharide, the amount of amphotericin B encapsulated in the liposome is increased. That is, since the amount of amphotericin B encapsulated in the liposome is increased in the hydration step, the relative amount of free amphotericin B to be removed through the subsequent step becomes small, so that the liposome preparation containing amphotericin B can be obtained at a high yield So that the productivity can be remarkably improved.

수화 단계에서 첨가되는 무기염으로는, 약제학적으로 허용가능한 무기염을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 탄산나트륨, 염화마그네슘, 염화칼륨, 및 염화나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있으며, 특히, 염화나트륨이 적당하게 사용될 수 있다. 이 때 사용되는 무기염의 농도는, 10~50mM의 범위에서 사용하는 것이 최상의 봉입률을 얻는 데 바람직하다. 무기염의 농도가 10mM 미만일 때는 무기염의 미첨가시와 봉입률의 차이가 없어 바람직하지 않고, 50mM 초과일 때는 삼투압 효과에 의해 인지질의 이온 강도를 약화시켜 봉입률의 저하를 초래하므로 바람직하지 않다. As the inorganic salt to be added in the hydration step, a pharmaceutically acceptable inorganic salt may be used, and preferably at least one selected from the group consisting of sodium carbonate, magnesium chloride, potassium chloride, and sodium chloride may be used, Sodium chloride can be suitably used. The concentration of the inorganic salt used at this time is preferably in the range of 10 to 50 mM to obtain the best encapsulation rate. When the concentration of the inorganic salt is less than 10 mM, the inclusion rate of the inorganic salt is not different from that of the inorganic salt. When the concentration of the inorganic salt is more than 50 mM, the ionic strength of the phospholipid is weakened due to the osmotic effect.

상기의 수화 공정은 55~65℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 60~65℃에서 수행되는 것이 보다 바람직하다.The hydration process is preferably performed at 55 to 65 ° C, and more preferably at 60 to 65 ° C.

상기 수화된 용액을 호모게나이저(homogenizer)로 균질화하는 단계를 통해, 리포좀 입자가 형성되는데, 이때 균질화를, 1000~1500bar에서 반복적으로 수행하며, 바람직하게는 8회 이상, 보다 바람직하게는 8회~15회, 가장 바람직하게는 8회~12회를 수행한다. Through the homogenization of the hydrated solution with a homogenizer, the liposome particles are formed, wherein the homogenization is repeatedly carried out at 1000 to 1500 bar, preferably at least 8 times , more preferably at 8 times To 15 times, and most preferably from 8 times to 12 times.

이처럼, 균질화를 8회 이상 수행하는 것은, 수화(hydration) 공정이 완료된 직후에 생성된 다량의 유연물질을 현저하게 감소시키는 효과와, 입도분포의 스판(span)값을 1.0~1.5사이로 조절시키는 효과가 있다. As described above, the homogenization is carried out eight times or more. This is because the effect of significantly reducing the amount of the large amount of the flexible material immediately after the completion of the hydration process and the effect of controlling the span value of the particle size distribution to be in the range of 1.0 to 1.5 .

상기 다량의 유연물질은 다이머(dimer) 또는 테트라머(tetramer) 형태로 존재하는 암포테리신 B가 대부분이라고 볼 수 있는데, 이러한 유연물질이 적을수록, 리포좀 분산액으로부터 제거되는 유리 암포테리신 B의 양이 적어지고, 이에 따라, 원료 암포테리신 B의 공급량 대비, 최종 생성된 리포좀 제제 내에 봉입된 암포테리신 B의 함량이 증가하게 되므로, 생산효율이 향상되는 효과가 있다. The large amount of the flexible substance is mostly amphotericin B in the form of a dimer or a tetramer. The smaller the amount of the flexible substance, the more the quantity of the glass amphotericin B removed from the liposome dispersion And thus the content of amphotericin B encapsulated in the liposome preparation ultimately produced relative to the supply amount of the raw amphotericin B is increased, so that the production efficiency is improved.

또한, 스판값을 1.5이하로 조절하는 것은 리포좀 입자의 크기를 최적으로 균일하게 조절함으로써 저장안정성을 향상시키고, 인체에 투여시 혈관의 막힘현상을 줄일 수 있는 장점이 있다. 본 발명에 있어서 리포좀의 평균입자 사이즈는 제조된 입자의 전체중량을 100%로 하여 입도분포의 누적곡선을 구하고, 이 누적 곡선이 10%, 50%, 및 90%가 되는 점의 입경을 D10, D50, D90라 할 때, 이 D10이 70nm이하이고, D50이 80~130nm이며, D90이 230nm이하인 것이 바람직하다. 이때 스판(span)값은 시료의 분포 폭을 의미하는 것으로서, 다음과 같이 정의된다. In addition, controlling the span value to 1.5 or less has the advantage of improving the storage stability by optimally and uniformly controlling the size of the liposome particles and reducing clogging of blood vessels when administered to a human body. The average particle size of the liposome in the present invention the particle size of which is the total weight of the produced particles, to obtain a cumulative curve of particle size distribution to make 100%, the 10% cumulative curve of 50%, and 90% points D 10 , D 50 and D 90 , it is preferable that D 10 is 70 nm or less, D 50 is 80 to 130 nm, and D 90 is 230 nm or less. In this case, the span value means the distribution width of the sample, which is defined as follows.

[식 I][Formula I]

Figure 112013077725624-pat00002
Figure 112013077725624-pat00002

상기 스판값이 1.0이라는 것은, 입도의 중간값을 기준으로 할 때 좌우 완전대칭임을 의미하며, 그 이상일때는 입자 중간값으로부터 좌우 어느한쪽이 비대칭을 의미한다. 본 발명에서는, 균질화를 8회 이상 수행함으로써, 스판값이 1.0~1.5의 범위로 조절될 수 있어 저장안정성을 향상시킬 수 있다. 여기서의 저장안정성이란 제조된 리포좀 제제의 저장기간 중 또는 사용기간 중 리포솜의 자기부착으로 인한 엉김 현상을 방지하는 것을 의미한다. 저장안정성이 향상된 리포좀 제제는, 리포좀 입자가 커지는 것을 억제하므로, 환자에 정맥투여시 혈관막힘 현상을 방지하는 효과가 있다. The span value of 1.0 means that the particle is completely symmetrical with respect to the median value of the particle size. When the particle size is larger than the mean value, either of the left and right sides of the particle mean asymmetry. In the present invention, by performing the homogenization at least 8 times, the span value can be adjusted to the range of 1.0 to 1.5, and the storage stability can be improved. Herein, the storage stability means prevention of entanglement due to self-adhesion of the liposome during storage or during use of the prepared liposome preparation. The liposome preparation having improved storage stability suppresses the liposome particles from becoming large, and thus has the effect of preventing the clogging of blood vessels when the patient is intravenously administered.

또한, HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피) 분석결과, 수화 공정 후 리포좀 분산액을 균질화기로 반복처리했을 때, 특히, 1,000~1,500bar에서 8회 이상 균질화 처리하는 경우에는, 유연물질의 양이 2% 이하로 감소되는 효과가 있어 바람직하다. 한편, 균질화를 15회 초과하는 경우, 리포좀이 깨질 우려가 있어 적절하지 않다. 또한, 균질화시의 원심분리기의 압력을 2000bar로 5회 이상 균질화하면 강한 압력 때문에 리포좀이 깨지게 되는 문제가 있어 바람직하지 않다. In addition, as a result of HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis, when the liposome dispersion after the hydration process is repeatedly treated with the homogenizer, particularly when the homogenization is performed 8 times or more at 1,000 to 1,500 bar, Is reduced to 2% or less. On the other hand, if the homogenization exceeds 15 times, the liposome may break, which is not appropriate. In addition, if the pressure of the centrifugal separator at homogenization is homogenized more than 5 times at 2000 bar, there is a problem that the liposome is broken due to strong pressure, which is not preferable.

상기와 같이 리포좀 입자가 형성되어 분산된 리포좀 분산액을, 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계)를 거친 후, 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계)를 수행한다. After the liposome dispersion in which the liposome particles are formed and dispersed is subjected to a step of removing the glass amphotericin B by gel column chromatography (step 6), the cycle of freezing and thawing is repeated three or more times (Step 7).

한편, 리포좀 분산액을 제균필터로 여과하는 공정을, 상기 6단계와 7단계 사이에, 또는 상기 7단계 직후에 수행할 수 있다. On the other hand, the step of filtering the liposome dispersion through a filtering filter can be carried out between steps 6 and 7, or immediately after step 7.

본 발명자들은, 리포좀 분산액을 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계와, 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계를 동시에 수행함으로써, 최종적으로 생성된 리포좀 제제의 정상세포에 대한 독성이 현저히 감소되는 효과가 있음을 확인하였다. The present inventors have found that by simultaneously carrying out a step of removing free amphotericin B by gel column chromatography and a step of performing freezing and thawing cycles three or more times in the liposome dispersion, It was confirmed that the toxicity to normal cells was remarkably reduced.

상기 겔 칼럼 크로마토그래피 적용시, 겔여과용 담체로서, 시판되는 공지의 겔여과용 담체를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는, 특히, 세파덱스(Sephadex) G-25 미세(fine) 수지를 사용함으로써, 유리 암포테리신 B를 99% 이상 제거하는 효과를 얻을 수 있다. 상기 세파덱스 G-25 수지, 또는 이와 동등한 정도의 입자 크기를 갖는 겔여과용 담체를 빈 칼럼에 충진한 후, 당류가 포함된 완충액, 바람직하게는, 수화 공정에서 사용된 것과 동일한 종류의 완충액을 사용하여 칼럼을 세척하고 나서, 균질화 처리된 암포테리신 B를 로딩한 후, 로딩이 완료되면 상기 완충액으로 세척하면서, 칼럼 밖으로 분획된 리포좀 분산액을 수득하게 된다. In the gel column chromatography application, a commercially available known gel filtration carrier can be used as the gel filtration support. In the present invention, by using a Sephadex G-25 fine resin, The effect of removing more than 99% of the glass amphotericin B can be obtained. The empty column is filled with the above Sephadex G-25 resin or a gel filtration carrier having an equivalent particle size, and then a buffer solution containing the saccharide, preferably the same kind of buffer used in the hydration step, After the column is washed using the homogenized amphotericin B, the liposome dispersion separated out of the column is obtained while washing with the buffer after completion of loading.

그리고 나서, 여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행함으로써, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정성 있게 봉입되게 되어, 진균류 등의 숙주인 인체 또는 포유동물의 정상 세포에 대한 독성을 효과적으로 감소시킨 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 수득할 수 있다. Then, by repeatedly performing the cycle of freezing and thawing the filtered liposome dispersion liquid three or more times, amphotericin B is stably contained in the liposome, and the toxicity to the normal cells of the human or mammalian host such as fungi A liposome preparation containing amphotericin B effectively reduced can be obtained.

특히, 본 발명에서는, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하는 단계 이후에, 리포좀 분산액을 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행함으로써, 균질화처리에 의해 리포좀 내로 봉입되었던 암포테리신 B가, 다시 불안정한 봉입 상태로 되는 문제도 해결하는 효과가 있다. In particular, in the present invention, amphotericin B encapsulated in liposomes by homogenization treatment is repeatedly subjected to a cycle of freezing and thawing the liposome dispersion three or more times after gel column chromatography, There is an effect of solving the problem of becoming a state.

상기 동결 및 해동하는 사이클은, 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 유리 암포테리신 B를 제거하거나 또는 리포좀 분산액을 제균필터로 여과한 상태의 온도인 20~40℃에서, 0.1~5℃/min 속도로 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지하는 사이클을 3회 이상 반복하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명에 있어서, 포스파티딜글리세롤로서 디스테아로일포스파티딜글리세롤을 사용하는 경우에, 60~65℃로 승온하고, 60~65℃의 해동상태를 30분~12시간, 보다 바람직하게는 30분~6시간 동안 유지하는 것이 바람직하다. 해동시의 온도가 55℃ 미만이면, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정적으로 봉입된 리포좀 형성이 불충분하며, 65℃를 초과하면, 리포좀 막이 파괴되어 숙주세포에 대한 세포독성이 증가하는 문제가 있어 바람직하지 않다.The above-mentioned freezing and thawing cycles are carried out at a temperature of 20 to 40 ° C, at a temperature of 0.1 to 5 ° C / min, at which the glass amphotericin B is removed by gel column chromatography or the liposome dispersion is filtered with a sterilizing filter It is preferable to repeat the cycle of holding the frozen state at -50 to -10 캜 for 30 minutes to 24 hours, then raising the temperature and maintaining the thawing state at 55 to 65 캜 for 30 minutes to 12 hours three times or more. Particularly, in the present invention, when distearoylphosphatidylglycerol is used as the phosphatidylglycerol, the temperature is raised to 60 to 65 ° C and the thawing condition at 60 to 65 ° C is maintained for 30 minutes to 12 hours, more preferably 30 minutes To 6 hours. If the temperature at thawing is less than 55 캜, formation of liposomes in which amphotericin B is stably encapsulated in liposomes is insufficient, and when the temperature exceeds 65 캜, the liposome membrane is destroyed and cytotoxicity against host cells increases. I do not.

동결 및 해동하는 사이클은 3회 이상, 바람직하게는, 3회~7회, 보다 바람직하게는 3회~5회 반복한다. 이때, 상기 사이클이 3회 미만인 경우에는, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정적으로 봉입됨으로써 발생하는 세포독성의 감소 효과를 충분히 얻을 수 없으며, 상기 사이클이 7회를 초과하는 경우에는, 공정소요시간의 장기화로 오염에 의한 이물질의 혼입 가능성이 커져 바람직하지 않다. The cycle of freezing and thawing is repeated three times or more, preferably three times to seven times, more preferably three times to five times. When the cycle is less than 3 times, the effect of reducing the cytotoxicity caused by the stable encapsulation of amphotericin B in the liposome can not be sufficiently obtained. When the cycle is more than 7 times, The possibility of incorporation of foreign matter due to contamination due to prolonged period of time is increased.

상기와 같은 제조방법에 따라 제조된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제는, 진균류의 숙주에 해당하는 포유동물의 정상세포에 대한 독성이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, 진균 감염을 치료하는 데에 있어서, 종래 공지된 리포좀 제제, 예컨대, 암비솜(AmBisome) 주사와 비교했을 때, 동등 이상의 치료 효과를 발휘함을 확인하였다. The liposome preparation containing amphotericin B prepared according to the above-mentioned preparation method has remarkably decreased toxicity to normal cells of a mammal corresponding to a host of fungi, , And the same therapeutic effect as that of the conventional liposome preparation, for example, AmBisome injection, was demonstrated.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 리포좀 제제는 정맥주사제, 경피, 경비, 및 폐로의 약물송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는, 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있는 것을 사용할 수 있다. The liposome formulations prepared according to the preparation method of the present invention can be used for intravenous injection, percutaneous, expen- sive, and drug delivery to the lungs. As a carrier, an additive and the like which are necessary for such pharmaceutical preparation and pharmaceutical preparation, those widely known to those having ordinary skill in the pharmaceutical field can be used.

본 발명의 리포좀 제제의 투여량은, 통상 약학적으로 허용되는 양으로 투여될 수 있으나, 치료되는 상태 또는 대상 질환, 예컨대, 전신성 진균 감염, 호중구 감소 환자의 불명열, 내장리슈마니아증 등을 고려하여 조정된 용량이 투여될 수 있으며, 바람직하게는 체중 1kg당 0.01~10mg(역가)/day, 보다 바람직하게는 0.05~5mg(역가)/day, 가장 바람직하게는 1~5mg(역가)/day의 범위에서 투여될 수 있다. The dosage of the liposome preparation of the present invention can be generally administered in a pharmaceutically acceptable amount, but it may be administered in a pharmaceutically acceptable amount depending on the condition to be treated or the target disease, for example, systemic fungal infections, unspecified degree of neutrophil- The adjusted dose may be administered and is preferably from 0.01 to 10 mg (titer) / day, more preferably from 0.05 to 5 mg (titer) / day, most preferably from 1 to 5 mg (titer) / day Lt; / RTI >

본 발명에 따르면, 리포좀 제제내에서 유리 암포테리신 B가 1% 미만으로 존재하면서, 암포테리신 B가 리포좀 내에 안정적으로 봉입될 수 있어, 생체내 안전성이 증가한 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 얻을 수 있다. According to the present invention, it is possible to provide a liposome preparation containing amphotericin B in which amphotericin B can be stably enclosed in liposomes in an amount of less than 1% of free amphotericin B in the liposome preparation, Can be obtained.

또한, 본 발명에 따르면, 유리 암포테리신 B의 리포좀 내 봉입률를 증가시켜 리포좀 제제의 생산성과 저장안정성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다. Further, according to the present invention, the productivity of the liposome preparation and the storage stability can be improved by increasing the inclusion rate of the free amphotericin B in the liposome.

도 1은 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 8, 및 대조군으로서 암비솜(AmBisome®, Gilead Sciences)약물을 마우스 모델에 단일투여하여 독성시험한 결과를 나타내는 치사량(%) 그래프이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 8, 및 대조군으로서 암비솜(AmBisome®, Gilead Sciences)약물을 각각 처리한 SAEC(Small Airway Epithelial Cell)의 MTT 어세이 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 8, 및 대조군으로서 암비솜 약물을 토끼의 탈 섬유세포(RBC)에 처리한 용혈시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 따른 공정 중 수화 공정 직후의 유연물질의 정도(a)와, 균질화 처리 공정의 반복 횟수에 따른, 즉, 비교예 16(b), 실시예 1(c), 실시예 6(d)에 따른 유연물질의 감소 정도를 HPLC 분석을 통해 확인한 데이터이다.
도 5는 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1과 실시예 6, 및 비교예 14 내지 16의 입도 변화 그래프이다. 1 is a graph showing lethal dose (%) showing the results of toxicity test of Example 1, Comparative Example 8, and a control group of AmBisome ® , Gilead Sciences, .
FIG. 2 is a graph showing the MTT assay results of SAEC (Small Airway Epithelial Cell) treated with AmBisome ® and Gilead Sciences drugs as control groups according to Example 1 and Comparative Example 8, to be.
FIG. 3 is a graph showing the hemolysis test results of Example 1 and Comparative Example 8 according to the production method of the present invention, and treating hemicellulosic drug (RBC) of rabbit as a control group.
4 is a graph showing the relationship between the degree of the softening material immediately after the hydration process (a) and the number of repetitions of the homogenization treatment process, that is, Comparative Example 16 (b), Example 1 (c) And the degree of reduction of the flexible substance according to Example 6 (d) was confirmed by HPLC analysis.
Fig. 5 is a graph of particle size variation of Example 1, Example 6, and Comparative Examples 14 to 16 according to the production method of the present invention.

이하, 본 발명을, 바람직한 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to preferred embodiments. However, the present invention is not limited to the embodiments described herein but may be embodied in other forms. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, and will fully convey the scope of the invention to those skilled in the art.

(1) (One) 실시예 1: 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조Example 1: Preparation of a liposome preparation containing amphotericin B

암포테리신 B(노스차이나 파마슈티컬사) 10g을 클로로포름과 메탄올이 동일한 부피로 혼합된 용매혼합액 240ml에 넣고 750와트 강도의 초음파기(VCX-750, 바이오소닉사, 미국)로 미세현탁액을 만든다. 새로운 용기에 16.8g의 디스테아로일포스파티딜글리세롤(리포이드사)을 칭량하고, 클로로포름과 메탄올이 동일한 부피로 혼합된 용매혼합액 210ml와 2.5M HCl 용액 8ml에 가한 후 65℃에서 녹인다. 상기 암포테리신 B 미세현탁액을 디스테아로일포스파티딜글리세롤 용액에 혼합하여 맑은 오렌지색의 용액을 얻었다. 이때의 반응시간은 15분 이내로 조절하여, 산성조건에서 불안정한 암포테리신 비의 분해를 최소화하였다. 10 g of Amphotericin B (North China Pharmacist) is added to 240 ml of a mixed solvent mixture of chloroform and methanol having the same volume, and a fine suspension is made with a 750 watt intensity ultrasonic machine (VCX-750, Biosonic, USA). 16.8 g of distearoylphosphatidylglycerol (lipofusa) is weighed into a new container and dissolved in 210 ml of a mixed solvent mixture of chloroform and methanol in the same volume and 8 ml of 2.5 M HCl solution, followed by dissolving at 65 ° C. The amphotericin B microsuspension was mixed with a distearoylphosphatidylglycerol solution to obtain a clear orange solution. The reaction time was controlled within 15 minutes to minimize decomposition of unstable amphotericin ratio under acidic conditions.

별도로, 수소화대두포스파티딜콜린(리포이드사) 42.6g, 콜레스테롤(일본정화사) 10.4g과 알파-토코페롤 0.128g을 칭량하여 210ml의 용매혼합액을 넣어 65℃에서 녹인 다음, 위에서 제조된 오렌지색의 용액과 혼합하여 투명한 오렌지 색의 용액을 얻는다. 이 용액에 추가적으로 4.64ml의 2.5M NaOH 용액을 첨가하여 pH를 약 4.5로 하고, pH를 4.5로 조절한 용액을 회전식용매증발장치(Buchi)에 담아 용매를 휘산하였다. Separately, weigh 42.6 g of hydrogenated soybean phosphatidylcholine (Lipofusa), 10.4 g of cholesterol (Japan Cleansing Yarn) and 0.128 g of alpha-tocopherol, 210 ml of a solvent mixture was added and dissolved at 65 ° C and then mixed with the orange solution prepared above A clear orange solution is obtained. An additional 4.64 ml of 2.5 M NaOH solution was added to this solution to adjust the pH to about 4.5 and the pH to 4.5, and the solvent was evaporated in a rotary evaporator (Buchi).

완충액으로서 9%(w/v%)의 백당이 포함된 10mM 숙신산 수용액 2000mL(백당 180g에 수용액 2000mL이면 9%가 되고 숙신산 5.4g/2000mL이면 10mM임)를 준비하고, 여기에, NaCl을 첨가하여 NaCl의 농도가 25mM이 되도록 조정한 후, 상기 용매가 휘산된 건조물을 첨가한 후, 65℃에서 3~12시간 상기 건조물을 수화하였다. 생성된 수화물을, 호모게나이저(SPX-2000)를 사용하여 8회 동안 반복적으로 균질화처리하여, 리포좀 입자가 형성된 분산액을 수득하였다. 2000 mL of a 10 mM succinic acid aqueous solution containing 9% (w / v%) of white sugar as a buffer solution (9% for 180 mL of the aqueous solution and 10 mM for succinic acid 5.4 g / 2000 mL) was prepared, After adjusting the concentration of NaCl to 25 mM, the dried material with the solvent was added, and the dried material was hydrated at 65 DEG C for 3 to 12 hours. The resulting hydrate was repeatedly homogenized for 8 times using a homogenizer (SPX-2000) to obtain a dispersion in which the liposome particles were formed.

그리고나서, 수득된 리포좀 분산액을 sephadex G-25 fine(GE Healthcare) 수지 100g이 패킹되어 있는 칼럼에 로딩하여 노란색으로 형성된 띠부분을 분획한 후, 분획된 리포좀 분산액을 50℃로 가열하고, 0.2um의 제균필터로 여과한다. Then, the resulting liposome dispersion was loaded on a column packed with 100 g of sephadex G-25 fine (GE Healthcare) resin to fractionate the yellow-formed band portion, and then the fractionated liposome dispersion was heated to 50 캜 and 0.2um Lt; / RTI > filter.

이후, 여과된 리포좀 분산액을 20℃에서 0.5℃/분 속도로 -40℃로 냉각하여 -40℃에서 동결상태를 30분간 유지한 후, 0.5℃/분 속도로 65℃까지 승온하여 65℃에서 해동상태를 30분간 유지한 후, 다시 -40℃로 동결 및 65℃로 해동하는 과정을 총 3회 반복한다. 최종적으로 10ml의 노란색의 현탁액을 20ml 동결건조용 바이알에 충진하고 동결건조하여 노란색의 케이크를 얻는다. 이를 부틸고무마개(butyl rubber stopper)와 알루미늄 캡으로 캡핑(capping)하여 리조좀 제제를 완성한다.Thereafter, the filtered liposome dispersion was cooled to -40 deg. C at 20 deg. C / min at a rate of 0.5 deg. C / min, kept frozen at -40 deg. C for 30 min, elevated to 65 deg. C at 0.5 deg. C / After the state is maintained for 30 minutes, the process of freezing to -40 ° C and thawing to 65 ° C is repeated three times in total. Finally, 10 ml of the yellow suspension is filled in a 20 ml freeze-drying vial and lyophilized to obtain a yellow cake. This is capped with a butyl rubber stopper and an aluminum cap to complete the zymosan preparation.

(2) (2) 실시예 2~실시예 3, 및 비교예 1~비교예 7: 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조Examples 2 to 3 and Comparative Examples 1 to 7: Preparation of a liposome preparation containing amphotericin B

상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, 수화단계에서의 NaCl의 농도를 10mM 및 50mM로 달리하여, 실시예 2 및 3의 리포좀 제제를 제조하였다. The liposome preparations of Examples 2 and 3 were prepared in the same manner as in Example 1 except that the concentration of NaCl in the hydration step was changed to 10 mM and 50 mM.

또한, 실시예 1과 동일하게 제조하되, 수화단계에서의 NaCl의 농도를 각각 0mM, 5mM, 75mM, 100mM, 125mM, 150mM, 200mM로 달리하여, 비교예 1~비교예 7의 리포좀 제제를 제조하였다. The liposome preparations of Comparative Examples 1 to 7 were prepared in the same manner as in Example 1 except that the concentration of NaCl in the hydration step was changed to 0 mM, 5 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM and 200 mM, respectively .

(3) (3) 실시예 4~실시예 5, 및 비교예 8~비교예 13: 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조Examples 4 to 5 and Comparative Examples 8 to 13 Preparation of a liposome preparation containing amphotericin B

상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, 동결 및 해동처리 단계의 조건을 하기 표 1와 같이 달리하여, 실시예 4 및 실시예 5의 리포좀 제제를 제조하였다. The liposome preparation of Example 4 and Example 5 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the conditions of the freezing and thawing treatment steps were changed as shown in Table 1 below.

또한, 비교예 8로서, 실시예 1과 동일하게 제조하되, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계를 실시하지 않고, 동결 및 해동을 반복하는 단계를 실시하지 않은 것만을 달리하여, 리포좀 제제를 제조하였다. As Comparative Example 8, the same procedure as in Example 1 was carried out except that the gel column chromatography step using the sephadex G-25 resin was not carried out and only the step of repeating freezing and thawing was not carried out, The formulation was prepared.

또한, 비교예 9~13으로서, 실시예 1과 동일하게 제조하되, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계 및/또는 동결 및 해동을 반복하는 단계를, 하기 표 1과 같이, 실시예 1과 달리하여, 리포좀 제제를 제조하였다. As Comparative Examples 9 to 13, the gel column chromatography step using sephadex G-25 resin and / or the step of repeating freezing and thawing were carried out in the same manner as in Example 1, 1, a liposome preparation was prepared.

구분division G-25
칼럼
크로마토
그래피
단계G-25
column
Chromatography
Graphic
step 동결-해동 단계Freeze-Thaw Phase 동결시
온도 및 유지시간During freezing
Temperature and holding time 해동시
온도 및 유지시간Thawing
Temperature and holding time 강온 및 승온
속도
(℃/min)Cooling and heating
speed
(° C / min) 동결 및 해동
처리의
반복 횟수
(회)Freeze and Thaw
Of treatment
Number of repetitions
(time) 온도(℃)Temperature (℃) 시간(min)Time (min) 온도(℃)Temperature (℃) 시간(min)Time (min) 실시예 1Example 1 ○○ ○○ -40   -40 3030 6565 3030 0.50.5 33 실시예 4Example 4 ○○ ○○ -40   -40 3030 6565 3030 0.50.5 55 실시예 5Example 5 ○○ ○○ -20   -20 6060 6060 6060 0.50.5 33 비교예 8Comparative Example 8 XX XX -- -- -- -- -- -- 비교예 9Comparative Example 9 ○○ XX -- -- -- -- -- -- 비교예 10Comparative Example 10 XX ○○ -40   -40 3030 6565 3030 0.50.5 33 비교예 11Comparative Example 11 ○○ ○○ -40-40 3030 6565 3030 0.50.5 22 비교예 12Comparative Example 12 ○○ ○○ -40-40 120120 6565 120120 0.50.5 1One 비교예 13Comparative Example 13 ○○ ○○ -40-40 3030 7070 3030 0.50.5 33

(4) (4) 실시예Example 6 및  6 and 비교예Comparative Example 14~16:  14-16: 암포테리신Amphotericin B를 함유한  B-containing 리포좀Liposome 제제의 제조 Manufacture of pharmaceutical preparations

실시예 6는, 실시예 1과 동일하게 제조하되, 균질화처리 단계에서 균질화 반복 정도를 각각 총 12회 수행하여, 암포테리신 B를 함유한 리포좀을 제조하였다. Example 6 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the degree of homogenization was 12 times in total in the homogenization treatment step to prepare a liposome containing amphotericin B.

한편, 비교예 14, 15 및 16은, 실시예 1과 동일하게 제조하되, 균질화처리 단계에서 균질화 반복 정도를 총 1회, 3회 및 5회 수행하여, 암포테리신 B를 함유한 리포좀을 제조하였다. On the other hand, Comparative Examples 14, 15 and 16 were prepared in the same manner as in Example 1 except that the degree of homogenization was repeated once, three times, and five times in the homogenization treatment step to prepare a liposome containing amphotericin B Respectively.

<< 시험예Test Example 1> 수화단계에서의 염화나트륨의 농도에 따른 봉입률 확인 시험 1> Determination of the inclusion rate according to the concentration of sodium chloride in the hydration stage

수화단계에서, 숙신산 용액의 농도는 모두 동일한 상태에서, 염화나트륨의 농도를 실시예 1 내지 3과, 비교예 1 내지 7에서와 같이 달리하여, 이후 단계를 진행한 후, 최종 동결건조 후 리포좀의 함량을 HPLC(High Performace Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)로 다음 조건하에서 분석하였다. In the hydration step, the concentrations of the succinic acid solution were all the same, and the concentration of sodium chloride was changed as in Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 7, and after the subsequent steps, the content of the liposome after the final lyophilization Was analyzed by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) under the following conditions.

검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 405 nm)Detector: Ultraviolet absorptiometer (measuring wavelength 405 nm)

칼럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 250 mm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.Column: Fill a stainless steel tube with an internal diameter of about 4.6 mm and a length of about 250 mm with octadecylsilyl silica gel for a liquid chromatograph of 5 μm.

이동상 : 메탄올ㆍ2.5 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이수소디나트륨용액ㆍ아세토니트릴 혼합액(50 : 30 : 25)Mobile phase: methanol ㆍ 2.5 mol / L diethylenediaminetetraacetic acid dihydrogen disodium solution ㆍ acetonitrile mixture (50: 30: 25)

유량 : 1.5 mL/분Flow rate: 1.5 mL / min

위에서 분석된 리포좀 내 암포테리신 B의 중량을 구하여, 최초 제조시 사용된 암포테리신 B의 중량을 기준으로 백분율로 계산했을 때의 봉입률은 다음과 같다. The amphotericin B in the liposome analyzed above was weighed and the percent incorporation was calculated as a percentage based on the weight of amphotericin B used in the initial preparation.

구분division 염화나트륨의 농도(mM)Concentration of sodium chloride (mM) 봉입률(%)Filling rate (%) 실시예 1Example 1 10         10 9595 실시예 2Example 2 25         25 9999 실시예 3Example 3 50         50 9898 비교예 1Comparative Example 1 0         0 9090 비교예 2Comparative Example 2 5         5 90 90 비교예 3Comparative Example 3 75         75 9292 비교예 4Comparative Example 4 100         100 9090 비교예 5Comparative Example 5 125         125 8585 비교예 6Comparative Example 6 150         150 7575 비교예 7Comparative Example 7 200         200 6565

상기 표 2를 통해, 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 3의 리포좀 제제가 95% 이상의 우수한 봉입률을 나타냄이 확인되었다. From Table 2, it was confirmed that the liposome preparations of Examples 1 to 3 of the present invention exhibited an excellent filling rate of 95% or more.

<< 시험예Test Example 2> 동물모델에서의 단일투여 독성시험( 2> Single dose toxicity study in animal models LDLD 5050 ))

8주령의 ICR 웅성 마우스를 5마리씩 30그룹으로 나누었다. 상기 마우스의 꼬리정맥으로 실시예 1, 4 및 5의 리포좀 제제와, 양성대조군으로서 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences)을 각각 50, 75, 100mg/kg의 용량으로 투여하였고, 비교예 8~13에서 제조된 리포좀 제제를 10, 20, 30mg/kg의 용량으로 투여하였다(Probit법). 투여 볼륨은 12mL/kg으로 하였다. ICR male mice at 8 weeks of age were divided into 30 groups of 5 mice each. The liposome preparations of Examples 1, 4 and 5 and AmBisome (Gilead Sciences) were administered as the positive control group at the dose of 50, 75 and 100 mg / kg to the tail vein of the mice, respectively. In Comparative Examples 8 to 13 The prepared liposome preparation was administered at a dose of 10, 20, 30 mg / kg (Probit method). The administration volume was 12 mL / kg.

구분division 투여
용량
(mg/kg)administration
Volume
(mg / kg) 생존율(%)Survival rate (%) 00 1일1 day 2일2 days 3일3 days 4일4 days 7일7 days 14일14 days 실시예 1Example 1 5050 100    100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 7575 100    100 8080 8080 8080 8080 8080 8080 100100 100    100 8080 4040 4040 4040 00 00 실시예 4Example 4 5050 100    100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 7575 100    100 100100 8080 8080 8080 8080 8080 100100 100    100 8080 6060 4040 4040 00 00 실시예 5Example 5 5050 100    100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 7575 100    100 8080 8080 8080 8080 8080 8080 100100 100    100 8080 4040 4040 4040 00 00 비교예 8Comparative Example 8 1010 100    100 100100 8080 8080 8080 8080 8080 2020 100    100 6060 6060 2020 00 00 00 3030 100    100 00 00 00 00 00 00 비교예 9Comparative Example 9 1010 100   100 100100 100100 8080 8080 8080 8080 2020 100100 6060 6060 2020 2020 00 00 3030 100100 2020 00 00 00 00 00 비교예 10Comparative Example 10 1010 100   100 100100 100100 100100 8080 8080 8080 2020 100100 6060 6060 6060 2020 2020 2020 3030 100100 4040 2020 2020 00 00 00 비교예 11Comparative Example 11 1010 100   100 100100 100100 100100 8080 8080 8080 2020 100100 6060 4040 4040 2020 2020 2020 3030 100100 2020 2020 00 00 00 00 비교예 12Comparative Example 12 1010 100   100 100100 100100 8080 8080 8080 8080 2020 100100 8080 4040 4040 2020 00 00 3030 100100 2020 2020 00 00 00 00 비교예 13Comparative Example 13 1010 100100 8080 8080 6060 6060 6060 6060 2020 100100 4040 2020 00 00 00 00 3030 100100 00 00 00 00 00 00 AmBisome® AmBisome ® 5050 100   100 100100 100100 100100 100100 100100 100100 7575 100100 100100 6060 6060 6060 6060 6060 100100 100100 6060 00 00 00 00 00

상기 표 3의 시험결과 중, 실시예 1, 비교예 8 및 대조군인 암비솜에 대해서는, 치사량(%) 시험 그래프를 도 1에 도시하였다. Among the test results shown in Table 3, the lethal dose (%) test graph is shown in Fig. 1 for Example 1, Comparative Example 8, and control arm cancerous.

상기 표 3 및 도 1을 통해, 본 발명의 제조방법과 같이, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계와 동결 및 해동을 반복하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 실시예 1, 4 및 5의 리포좀 제제가, 겔 칼럼 크로마토그래피 단계 및/또는 동결 및 해동 공정을 3회 이상 반복하는 단계를 거치지 않은 비교예 8 내지 비교예 12의 리포좀 제제나, 대조군으로 사용된 암비솜 주사에 비해 독성이 감소한 효과가 있음을 확인하였다. 1 and 2, the gel column chromatography step using sephadex G-25 resin and the step of repeating freezing and thawing, as in the production method of the present invention, The liposome preparation of Comparative Examples 8 to 12 in which the liposome preparation of Example 5 was not subjected to the step of gel column chromatography and / or the freezing and thawing process three times or more was more toxic than the liposome preparation of Comparative Examples 8 to 12, Of the total number of patients.

또한, 비교예 13과 같이, 본 발명의 해동시의 온도 상한값인 65℃를 초과하여, 70℃에서 30분 동안 유지하는 경우에는, 리포좀이 파괴되어 암포테리신 B가 안정적으로 리포좀 내에 봉입되지 못하는 현상으로 인해, 독성이 높은 점을 확인하였다. In addition, as in the case of Comparative Example 13, when the temperature was maintained at 70 DEG C for 30 minutes in excess of the temperature upper limit value of 65 DEG C of the present invention, the liposome was broken and the amphotericin B could not be stably embedded in the liposome It was confirmed that toxicity was high due to the phenomenon.

<< 시험예Test Example 3> 세포독성 시험 3> Cytotoxicity test

96 well plate에 SAEC(Small Airway Epithelial Cell)를 씨딩(seeding)하고 2시간 안정화시킨 후, 2, 4, 8, 16, 32μg/ml의 농도로 실시예 1, 및 비교예 8의 리포좀 제제와 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences) 약물을 처리하였다. 약물을 처리하고 나서 24시간이 경과한 후에 MTT 어세이를 진행한 후, 그 결과를 도 2에 세포생존율(survival(%))로 나타내었다. 상기 도 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 리포좀 제제는, 약물의 농도가 높을수록, 비교예 8 및 대조군인 암비솜에 비하여, 세포독성이 감소하였다. After seeding with SAEC (Small Airway Epithelial Cell) on a 96-well plate and stabilizing for 2 hours, the liposome preparation of Example 1 and Comparative Example 8 and the cancer of Comparative Example 8 were cultured at a concentration of 2, 4, 8, The AmBisome, Gilead Sciences drug was treated. MTT assay was performed after 24 hours from the treatment of the drug, and the results are shown in Fig. 2 as the cell survival rate (%). As can be seen from FIG. 2, the liposome preparation of Example 1 had a lower cytotoxicity as the concentration of the drug was higher than that of Comparative Example 8 and the control group, armbosom.

<< 시험예Test Example 4> 용혈( 4> hemolysis hemolysishemolysis )시험)exam

PBS를 사용하여 각각의 농도별로 희석된 샘플 10ml에 토끼의 탈 섬유세포(RBC) 0.2mL를 첨가하여 37℃에서 4시간 반을 유지시킨 후, 3,000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 576nm에서 흡광도를 측정하여 용혈율을 확인하고, 이를, 도 3에 도시하였다. 도 3에서의 용혈율(%)은 다음의 기준에 따라 판정하였다.Using PBS, 0.2 ml of rabbit deciduous cells (RBC) was added to 10 ml of each diluted sample. The mixture was maintained at 37 ° C for 4 and a half hours, centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes, and the supernatant was centrifuged at 576 nm The absorbance was measured to confirm the hemolysis rate, which is shown in Fig. The hemolysis rate (%) in Fig. 3 was determined according to the following criteria.

용혈율(%)Hemolysis rate (%) 판정Judgment 용혈율≤2  Hemolysis rate ≤2 비용혈Cost of blood 2<용혈율≤10  2 <hemolysis rate ≤ 10 경도의 용혈성 있음Has a hardness of hemolysis 10<용혈율≤20  10 <hemolysis rate ≤20 중등도의 용혈성 있음Has moderate hemolysis 20<용혈율≤40  20 <hemolysis rate ≤ 40 강한 용혈성 있음Has strong hemolysis 40<용혈율  40 <hemolysis rate 대단히 강한 용혈성 있음 Extremely strong hemolysis

도 3을 살펴보면, 30~40ug/mL의 농도에서, 실시예 1의 리포좀 제제는 비용혈을 나타내는 반면, 비교예 8의 리포좀 제제는 경도의 용혈성을 나타내었고, 40ug/mL 이상의 농도에서도, 비교예 8의 리포좀 제제의 용혈율이 실시예 1의 리포좀 제제 대비 약 170~250% 이고, 암비솜의 용혈율이 실시예 1의 리포좀 제제 대비 최대 약 180% 정도로, 실시예 1의 세포독성이 비교예 또는 암비솜에 비해 감소되었음이 확인되었다. 3, at a concentration of 30 to 40 ug / mL, the liposome preparation of Example 1 exhibited a cost of blood, whereas the liposome preparation of Comparative Example 8 showed a hardness of hemolysis, and even at concentrations of 40 ug / mL or higher, The hemolysis rate of the liposome preparation of Example 1 was about 170 to 250%, the hemolysis rate of the cancerous bitumen was about 180% of the maximum of the liposome preparation of Example 1, and the cytotoxicity of Example 1 was compared with that of the liposome preparation of Comparative Example Or amosomes, respectively.

<< 시험예Test Example 5>  5> 균질화Homogenization 처리 횟수에 따른  Depending on the number of processes 유연물질의Flexible 감소 확인 시험 Reduction confirmation test

실시예 1, 실시예 6, 비교예 16에서 수화공정을 통하여 생성된 수화물을, HPLC(High Performace Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)로 분석하였다. HPLC의 분석 조건은, 시험예 1에서 제시된 바와 같다.The hydrates produced in the hydration process in Examples 1, 6 and Comparative Example 16 were analyzed by HPLC (High Performance Liquid Chromatography). The analytical conditions of the HPLC are as shown in Test Example 1.

도 4.(a) 내지 (d)의 HPLC 분석 프로파일에서 확인되는 바와 같이, 수화공정 직후에, 미지의 유연물질이 HPLC의 전체 피크 면적(peak area)의 15~20%로 생성되었으나, 실시예 1, 및 6에서처럼, 수화물을 균질화기로 1,000bar에서 8회 및 12회 균질화 처리했을 때, 미지의 유연물질이 각각 HPLC의 전체 피크 면적(peak area)의 1~2% 및 0.1~1% 정도로 감소되는 효과가 있는 반면, 비교예 16과 같이, 5회 균질화처리시 미지의 유연물질은 4~5%정도 였다. 실시예 1 및 6을 통해, 균질화처리를 8회 이상, 즉, 8회 및 12회 수행하는 것이 유연물질을 감소시키는데 유리한 효과가 있는 점이 확인되었다. As evidenced by the HPLC analysis profile of Figures 4 (a) - (d), immediately after the hydration process, unknown suppositories were produced with 15-20% of the total peak area of HPLC, 1 and 6, when the hydrates were homogenized 8 times and 12 times at 1,000 bar with a homogenizer, the unknown suppository was reduced to 1-2% of the total peak area of the HPLC and 0.1 to 1%, respectively Whereas, as in Comparative Example 16, the amount of the unknown substance in the homogenization treatment of 5 times was about 4 to 5%. Through Examples 1 and 6, it was confirmed that carrying out the homogenization treatment 8 times or more, that is, 8 times and 12 times has a beneficial effect for reducing the flexible substance.

<< 시험예Test Example 6>  6> 균질화Homogenization 처리 횟수에 따른  Depending on the number of processes 스판값의Of the span value 확인 시험 Confirmation test

실시예 1, 실시예 6, 비교예 14 내지 16의 리포좀의 입자도 분포를 레이저회절 광산란법(Laser diffraction method, Nano-ZS series, Malvern, UK)로 측정하고, 제조된 입자의 전체중량을 100%로 하여 입도분포의 누적곡선을 도 5에서와 같이 구하고, 이 누적 곡선의 D10, D50, 및 D90을 확인한 후, 하기 식 I로 정의되는 스판값을 구하여, 표 5에 다음과 같이 나타내었다. The particle distributions of the liposomes of Examples 1 and 6 and Comparative Examples 14 to 16 were measured by laser diffraction method (Nano-ZS series, Malvern, UK), and the total weight of the prepared particles was determined to be 100 %, The cumulative curve of the particle size distribution is obtained as shown in FIG. 5, and the D 10 , D 50 , and D 90 of the cumulative curve are determined. Then, a span value defined by the following formula I is obtained, Respectively.

[식 I] [Formula I]

Figure 112013077725624-pat00003
Figure 112013077725624-pat00003

구분division 균질화
횟수Homogenization
Number of times D10 /50/90 (nm) D 10/50/90 (nm ) SpanSpan 비교예 14 Comparative Example 14 1    One 77.4/156/63177.4 / 156/631 3.53.5 비교예 15 Comparative Example 15 3    3 81.5/146/98681.5 / 146/986 6.26.2 비교예 16  Comparative Example 16 5    5 75.8/146/28375.8 / 146/283 1.421.42 실시예 1 Example 1 8    8 67.3/115/20367.3 / 115/203 1.181.18 실시예 6 Example 6 12    12 58.1/96.8/15558.1 / 96.8 / 155 1.001.00

<< 시험예Test Example 7> 가속안정성 시험 7> Accelerated stability test

온도 40℃, 상대습도 75%의 챔버안에서 아래 주어진 기간 경과 후의 스판값을 측정하여 가속안정성을 확인하였다. The span values were measured in the chamber at a temperature of 40 DEG C and a relative humidity of 75% after the lapse of the given period to confirm the acceleration stability.

구분division 균질화
횟수Homogenization
Number of times SpanSpan 0개월0 months 2개월2 months 4개월4 months 6개월6 months 비교예 14 Comparative Example 14 1    One 3.553.55 5.685.68 6.566.56 7.027.02 비교예 15 Comparative Example 15 3    3 6.196.19 7.037.03 7.987.98 8.238.23 비교예 16  Comparative Example 16 5    5 1.421.42 3.593.59 4.024.02 4.514.51 실시예 1 Example 1 8    8 1.181.18 1.201.20 1.351.35 1.411.41 실시예 6 Example 6 12    12 1.001.00 1.121.12 1.121.12 1.131.13

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 가속안정성 시험결과, 균질화를 8회 및 12회 반복한 경우에는, 6개월의 기간 경과후에도, 스판값이 1.5 이하의 범위 내여서, 리포좀의 자기부착으로 인한 엉김(aggregation) 현상 억제에 효과가 있음을 확인하였다. As shown in Table 6, when the homogenization was repeated 8 times and 12 times as a result of the acceleration stability test, the span value was within the range of 1.5 or less even after the lapse of 6 months, (Aggregation) phenomenon.

Claims (9)

암포테리신 B를 유기용매에 첨가하여 생성된 현탁액을, 포스파티딜글리세롤을 유기용매 및 산에 용해하여 생성된 pH 1~3의 용액과 혼합하여, 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을 생성하는 단계(1단계);
상기 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 첨가하여 생성된 용액과 혼합하여 얻은, 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에, 염기를 첨가하여 pH 4~5.5로 조절하는 단계;
상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에서 유기용매를 휘산하고, 건조물을 얻는 단계(3단계);
완충액에 무기염을 첨가한 후 상기 건조물을 넣고 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계);
상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화하는 단계(5단계);
상기 균질화된 리포좀 분산액에, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계); 및
여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동시키는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계);를 포함하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법. The suspension produced by adding amphotericin B to an organic solvent is mixed with a solution of pH 1 to 3 produced by dissolving phosphatidylglycerol in an organic solvent and an acid to produce a solution containing amphotericin B and phosphatidylglycerol (Step 1);
To a solution containing amphotericin B and a lipid complex obtained by mixing a solution containing amphotericin B and phosphatidyl glycerol with a solution produced by adding phosphatidylcholine, sterol and an antioxidant to an organic solvent, a base Adjusting the pH to 4 to 5.5;
Volatilizing the organic solvent in the solution containing the amphotericin B and the lipid complex to obtain a dried product (step 3);
Adding an inorganic salt to the buffer solution, adding the dried material and hydrating to obtain a liposome dispersion (step 4);
Homogenizing the liposome dispersion with a homogenizer (step 5);
Applying gel column chromatography to the homogenized liposome dispersion to remove glass amphotericin B (step 6); And
And repeating the cycle of freezing and thawing the filtered liposome dispersion three or more times (step 7). The method for producing a liposome preparation containing amphotericin B, comprising the steps of: 제 1 항에 있어서,
상기 4단계에 있어서, 상기 무기염의 농도는 10~50mM인 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the concentration of the inorganic salt in the step 4 is 10 to 50 mM. 제 1 항에 있어서,
상기 5단계에 있어서, 균질화는 1,000~1,500bar에서 8회~15회의 범위에서 반복적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 리포좀 제제의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the homogenization is repeatedly performed in a range of 8 to 15 times at 1,000 to 1,500 bar in the step 5 above. 제 3 항에 있어서,
상기 리포좀 제제는, 스판(Span)값이 1.0~1.5로 조절되는 것을 특징으로 하는 리포좀 제제의 제조방법.The method of claim 3,
Wherein the liposome preparation has a span value of 1.0 to 1.5. 제 1 항에 있어서,
상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클은, 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법. The method according to claim 1,
In the above step 7, the cycle of freezing and thawing is maintained at -50 to -10 ° C in a freezing state for 30 minutes to 24 hours, and then the temperature is raised to 55 to 65 ° C for 30 minutes to 12 hours Wherein the amphotericin B-containing liposomal preparation is a liposome preparation. 제 1 항에 있어서,
상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클을 3회~7회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법. The method according to claim 1,
The method for producing a liposome preparation containing amphotericin B, wherein the cycle of freezing and thawing is repeated three to seven times in the step 7. 제 1 항에 있어서,
상기 6단계와 7단계 사이, 또는, 상기 7단계 직후에, 리포좀 분산액을 여과하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법. The method according to claim 1,
Wherein the step of filtering the liposome dispersion is performed between steps 6 and 7, or immediately after step 7, wherein the liposome dispersion is filtered. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 의해 제조된, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제. A liposome preparation containing amphotericin B, which is produced by the production method according to any one of claims 1 to 7. 제 8 항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 정맥주사제인 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제. 9. The liposome preparation according to claim 8, wherein the liposome preparation is an intravenous injection.
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