KR101482165B1 - Rna-specific binding antibody and selecting method for the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 RNA에 결합하는 항체의 선별방법 및 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용되며, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체는 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 관련 의약분야에 다양하게 적용될 수 있다.The present invention relates to a method of selecting an antibody binding to RNA and an antibody specifically binding to BC200 RNA. The screening method of the present invention is useful for the production of human antibodies recognizing the structure of functional RNA. Antibodies specifically binding to BC200 RNA can recognize BC200 RNA or control its action, Can be applied.

Description

ＲＮＡ에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 선별방법{RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME}RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME <br> <br> <br> Patents - stay tuned to the technology RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME

본 발명은 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용되며, RNA에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 관련 의약분야에 다양하게 적용될 수 있다. The present invention relates to an antibody that specifically binds to RNA and a method of screening the same. The screening method of the present invention is useful for the production of human antibodies recognizing the structure of functional RNA. Antibodies specifically binding to RNA can be used to recognize target RNA or to control its action, .

RNA가 단순히 유전정보로의 전달자로서의 역할 뿐만 아니라, 2차 혹은 3차 구조를 가짐으로써 다양한 세포내 기능을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 즉, RNA가 세포 내에서 기능을 하기 위해서는 이에 필요한 2차 또는 3차 구조를 가지고 있어야만 한다. 그러므로 세포에는 같은 염기서열을 가지고 있지만 2차 또는 3차 구조가 다른 RNA가 존재한다. 그러나 현재까지 RNA를 분석하기 위해서 기본적으로 사용하는 방법은 혼성체화(hybridization)인데, 혼성체화 조건에서는 RNA의 2차 또는 3차 구조가 유지 되기 어렵기 때문에 이 방법으로 염기서열은 같으나 구조가 다른 RNA를 구별할 수 없었다.It has been shown that RNA has a variety of intracellular functions by simply having a secondary or tertiary structure as well as a role as a messenger to genetic information. That is, RNA must have a secondary or tertiary structure that is necessary to function in cells. Therefore, there are RNAs of the same or different secondary or tertiary structure in the cell. However, to date, the basic method used to analyze RNA is hybridization. Since the secondary or tertiary structure of RNA is difficult to maintain under hybridization conditions, this method uses RNAs with the same nucleotide sequence but different structures Could not be distinguished.

BC200 RNA(brain cytoplasmic 200)를 비롯하여 여러 기능성 RNA의 중요성이 확대되고, 그 이해가 절대적으로 요구되고 있다. 새로운 기능성 생체 분자로 대두되고 있는 RNA의 구조를 인지할 수 있는 항체가 개발된다면, 학문적으로는 세포에서 일어나는 RNA-단백질 상호작용 원리의 기본적인 개념을 도입할 수 있고, 세포 내 RNA 기능을 구조적인 측면에서 조사할 수 있을 뿐만 아니라, 분자 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적인 활용을 기대할 수 있다.The importance of various functional RNAs including BC200 RNA (brain cytoplasmic 200) has been expanded and its understanding is absolutely required. If an antibody capable of recognizing the structure of the RNA being expressed as a new functional biomolecule is developed, it can academically introduce the basic concept of the RNA-protein interaction principle occurring in the cell, In addition, it can be expected to be effective for the development of diagnostic and therapeutic agents as well as biochips and biosensors as a new technology of molecular recognition.

RNA를 인식하는 항체의 중요성이 알려진 후, RNA와 결합하는 항체를 찾으려는 노력이 계속되고 있다. Efforts are underway to find antibodies that bind to RNA after the importance of antibodies recognizing RNA is known.

그러나, 항체는 항원(antigen)과의 반응에서 고도의 친화성과 특이성을 나타내므로, 항체를 RNA 구조를 인지하는 분자로 개발할 수 있지만 동물을 이용하는 기존의 방법으로 항체를 제조할 수 없다. 그 이유는 RNA가 매우 불안정하여 동물에 주입하는 순간 분해되기 때문이다. 이러한 이유에서 RNA 구조를 인지하는 항체 제조 연구는 거의 시도되지 않았다. 하지만 최근 개발되고 있는 인간 항체 라이브러리를 이용하면 시험관내에서 특정 분자의 구조를 인지하는 항체를 창출할 수 있기 때문에, 인간 항체 라이브러리는 RNA의 불안정성 문제점을 극복하고 RNA의 구조를 인지하는 인간 항체의 창출에 이용될 수 있다.However, since the antibody exhibits high affinity and specificity in the reaction with the antigen, the antibody can be developed as a molecule recognizing the RNA structure, but an antibody can not be produced by an existing method using an animal. The reason for this is that the RNA is very unstable and decomposes on the moment of injection into the animal. For this reason, little research into the production of antibodies recognizing RNA structures has been attempted. However, since recently developed human antibody library can generate an antibody recognizing the structure of a specific molecule in vitro, the human antibody library can overcome the problem of instability of RNA and create a human antibody recognizing the structure of RNA Lt; / RTI &gt;

RNA와 결합하는 항체를 찾는 방법으로는, 예를 들어, Jing-Dong Y., et al.(PNAS, 2007)에는 자성 비드(magnetic bead)를 사용하여 패닝하는 방법이 개시되어 있으나, 상기 선행논문은 자성 비드가 가지고 있는 유동성 때문에 용액 분리 과정에서 비특이성의 문제점을 가지고 있으며, 더구나 패닝 차수(round)가 늘어남에도 동일한 횟수로 세척할 경우 항원에 대한 친화력이 강하고 특이적인 항체 선별에 있어 단점이 있다. 또한 합성 라이브러리를 사용하고 있기에 상기 언급한 활용에 있어 큰 제한이 있을 수 있으며, 현재까지 상기 문제점들을 보완한 선별 방법은 개발되고 있지 않은 실정이다.For example, Jing-Dong Y., et al. (PNAS, 2007) discloses a method of detecting an antibody that binds to RNA using a magnetic bead. However, Has the problem of non-specificity in solution separation process due to the fluidity of the magnetic beads, and even when the number of rounds is increased, the affinity to the antigen is strong and the specific antibody is disadvantageous . In addition, since the synthetic library is used, there is a great limitation in the above-mentioned utilization, and a selection method that has not been developed so far has not been developed yet.

이에, 본 발명은 RNA 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적으로 사용하기 위해, RNA에 결합하는 항체의 선별방법, 상기 방법에 의해 선별된 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 BC200 RNA의 탐지용 조성물, 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention provides a method for screening an antibody that binds to RNA, a method for screening an antibody against BC200 selected by the above method, An antibody specifically binding to RNA, a composition for detecting BC200 RNA comprising the antibody, or a composition for diagnosing BC200 RNA-related diseases.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be solved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other matters not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 구현예는 (a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계; (b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계; (c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및 (d) 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파이지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하는, RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법에 관한 것이다. In order to solve the above-mentioned problems, one embodiment of the present invention provides a method for preparing a target nucleic acid comprising: (a) immobilizing target RNA on a fixed-bed support; (b) binding the phage display-human antibody library to the immobilized target RNA; (c) removing the phage expressing the antibody not bound to the target RNA, and (d) separating the antibody expression tag bound to the target RNA and obtaining an antibody. And the like.

본 발명의 다른 구현예는 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.Another embodiment of the invention provides an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to BC200 RNA.

본 발명의 추가 구현예는 상기 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.A further embodiment of the present invention provides a composition for detecting BC200 RNA comprising an antibody or an antigen-binding fragment specifically binding to BC200 RNA or a composition for diagnosing BC200 RNA-related disease.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 명세서에서 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 "패닝(panning)"이라고 한다. In the present specification, only a phage expressing on its surface a peptide having a property of binding to a target molecule (antibody, enzyme, cell surface receptor, etc.) is selected from a phage library displaying a peptide on the coat of the phage The process is referred to as "panning ".

완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. A complete antibody is a structure with two full length light chains and two full length heavy chains, each light chain linked by a heavy chain and a disulfide bond. The constant region of the antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region and the heavy chain constant region has the type of gamma, mu, alpha, delta and epsilon, Gamma 1, gamma 2, gamma 3, gamma 4, alpha 1, and alpha 2, respectively. The constant region of the light chain has kappa (kappa) and lambda (lambda) types.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.The term "heavy chain" includes a variable region domain VH comprising an amino acid sequence with a sufficient variable region sequence to confer antigen specificity, and three constant region domains CHl, CH2 and CH3 and a hinge Quot; is interpreted to mean both a full-length heavy chain and fragments thereof. In addition, the term "light chain" includes both a light chain light chain comprising a variable region domain VL comprising an amino acid sequence having a sufficient variable region sequence for imparting specificity to an antigen and a constant region domain CL and fragments thereof It is interpreted as meaning.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.The term "CDR (complementarity determining region)" refers to the amino acid sequence of the heavy chain of the immunoglobulin and the hypervariable region of the light chain. The heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). The CDRs may provide the major contact residues for binding of the antibody to the antigen or epitope. In the present specification, the terms "specifically binding" or "specifically recognizing" are the same as those conventionally known to those skilled in the art, and the antigen and the antibody specifically interact to effect an immunological reaction .

일 구체예에 따르면, 상기 항체는 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 결합 단편일 수 있다. 용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. According to one embodiment, the antibody may be an antigen binding fragment selected from the group consisting of scFv, (scFv) ₂ , Fab, Fab 'and F (ab') ₂ . The term "antigen binding fragment" refers to a fragment of a polypeptide comprising an immunoglobulin entire structure and a portion to which an antigen can bind. But are not limited to, for example, scFv, (scFv) ₂ , Fab, Fab 'or F (ab') ₂ .

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.The antigen-binding fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, when the whole antibody is restricted to papain, a Fab can be obtained and when cut with pepsin, an F (ab ') ₂ fragment can be obtained) Can be produced through recombinant DNA technology.

본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 구조를 가진 기능성 RNA를 인식하는 인간항체의 선별 방법을 개발하였고, 표적항원으로서 BC200 RNA에 인식하는 인간 항체를 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention developed a screening method of human antibodies recognizing functional RNA having a structure in order to solve the problems of the prior art and completed the present invention by identifying a human antibody recognized in BC200 RNA as a target antigen.

구제적으로 본 발명자들은 인간 항체 라이브러리를 이용하여 파아지 디스플레이 기법(phage display technology)에 따라 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 항체(Fab form monoclonal antibody)를 수득하였다. 염기서열 분석을 통해 최종적으로 선별된 Fab 형태의 단일 클론 항체를 인간 IgG1의 불변영역과 카파(kappa) 경쇄의 불변영역을 가지고 있는 벡터의 위쪽에 각각 클로닝하여 전체 IgG1 형태의 인간 항체로 전환하고 HEK293T 세포에서 발현시킨 후 protein G 를 이용하여 정제한 다음 BC200 RNA에 특이적으로 결합함을 확인하였다.As a remedy, the present inventors obtained a Fab form monoclonal antibody displayed on a phage according to phage display technology using a human antibody library. The finally selected Fab-type monoclonal antibody was cloned at the base of the vector having the constant region of human IgG1 and the constant region of kappa light chain to convert it into a human IgG1-type human antibody and sequenced by HEK293T After expression in cells, it was purified using protein G and then confirmed to specifically bind to BC200 RNA.

종래 고정상 지지체가 아닌 유동상 지지체를 사용하는 경우 집합(aggregation)이 쉽게 일어나는 단점을 보였다. 보다 구체적으로 유동상 지지체의 한 예인 자성비드는 유동성을 가져 비드끼리 집합이 쉽게 일어나며, 세척과정에서 스트렙트아비딘에 결합한 파아지가 효과적으로 제거되지 않으며, 또한 용출단계에서도 RNA에 결합한 파아지를 모두 용출할 수 없었다. 이에 본 발명자들은 고정상 지지체를 사용하여 상기 문제점을 극복하였다.Conventionally, aggregation has been disadvantageous when using a fluidized bed support other than a stationary bed support. More specifically, a magnetic bead, which is an example of a fluidized bed support, has fluidity and aggregation of beads easily occurs. In addition, phage bound to streptavidin can not be effectively removed during washing, and all the phage bound to RNA can be eluted There was no. Thus, the present inventors overcome the above problems by using a fixed bed support.

본 발명의 일 구현예는 (a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계; (b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계; (c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및 (d) 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파이지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하는, RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법에 관한 것이다. One embodiment of the present invention is a method of constructing a solid support comprising: (a) immobilizing target RNA on a fixed bed support; (b) binding the phage display-human antibody library to the immobilized target RNA; (c) removing the phage expressing the antibody not bound to the target RNA, and (d) separating the antibody expression tag bound to the target RNA and obtaining an antibody. And the like.

구체적으로, 상기 고정하는 단계는 표적 RNA를 바이오틴화 하고 스트렙트아비딘이 코팅된 고정상 지지체에 RNA를 고정할 수 있다.Specifically, the securing step may biotinylate the target RNA and immobilize the RNA on a streptavidin-coated, fixed-bed support.

상기 (b), (c) 및 (d)단계에서, 고정상 지지체에 표적 RNA에 고정하는 단계 후에, 파아지에 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 고정된 RNA와 반응시키는 결합단계; 상기 결합단계 후 결합하지 않은 항체를 제거하는 세척단계; 상기 세척단계 후 RNA에 결합된 파아지에 디스플레이된 항체를 용출(Elution)시키고, 항체를 얻는 단계를 수행한다. 상기 용출단계에서 용출과정은 효모 전체 RNA(yeast total RNA)를 넣어 용출시킬 수 있으나 특별히 이에 한정되지는 않는다.In the steps (b), (c), and (d), after the step of immobilizing the target RNA to the target RNA, the phage is reacted with the fixed RNA with the display-human antibody library. A washing step of removing unbound antibody after the binding step; After the washing step, the antibody displayed on the phage bound to the RNA is eluted and the step of obtaining the antibody is performed. In the elution step, the yeast total RNA (yeast total RNA) may be eluted, but the present invention is not limited thereto.

RNA와 강한 특이성을 갖는 항체를 선별하기 위해 상기 상기 (b), (c) 및 (d)단계를 1 내지 5회 반복할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 반복할 수 있다.The above steps (b), (c) and (d) may be repeated one to five times, more preferably three to five times, in order to select an antibody having strong specificity to RNA.

상기 RNA는 2차 또는 3차 구조를 가진 RNA를 모두 포함하며, 바람직하게는 BC200 RNA일 수 있다.The RNA includes all of the RNAs having a secondary or tertiary structure, preferably BC200 RNA.

BC200(brain cytoplasmic 200) RNA는 본래 영장류의 뇌에서 발현되는 신경세포 특이적 ncRNA(non-coding RNA)로서 처음 발견되었으며(Tiedge, H., et al., J Neurosci, 1993 및 Watson, J.B. and Sutcliffe, J.G., Mol Cell Biol, 1987), 신경세포의 수상돌기에서 국부적으로 단백질 합성을 조절하는 인자로 여겨지고 있다(Lin, D., et al., Mol Cell Biol, 2008). 또한 BC200 RNA가 신경 조직 외에 다양한 유래의 종양 조직에서도 발현되며 특히, 유방암의 경우에는 양성 종양에 비해서 전이성 유방암에서 더 높은 발현을 보인다는 것이 보고되었다(Chen, W., et al., J Pathol, 1997 및 Iacoangeli, A., et al., Carcinogenesis, 2004). 더불어 알츠하이머병과 같은 신경관련 질환에서도 많은 BC200 RNA가 발견되는 것으로 알려지고 있다(Lukiw, W.J., et al., Neurochem Res, 1992 및 Mus, E., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007).BC200 (brain cytoplasmic 200) RNA was originally discovered as a neuron-specific ncRNA (non-coding RNA) originally expressed in the brain of a primate (Tiedge, H., et al., J Neurosci, 1993 and Watson, JB and Sutcliffe , JG, Mol Cell Biol, 1987), and is considered to be a factor regulating local protein synthesis in dendritic cells of neurons (Lin, D., et al., Mol Cell Biol, 2008). In addition, BC200 RNA has been reported to be expressed in various tumor tissues besides nerve tissue, and especially in breast cancer, higher expression in metastatic breast cancer than in benign tumors (Chen, W., et al., J Pathol, 1997 and Iacoangeli, A., et al., Carcinogenesis, 2004). In addition, many BC200 RNAs are known to be found in neuronal diseases such as Alzheimer's disease (Lukiw, W. J., et al., Neurochem Res, 1992 and Mus, E., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2007).

따라서, 본 발명의 일 구현예는 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.Thus, one embodiment of the invention provides an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to BC200 RNA.

상기 BC200 RNA은 서열번호 13(ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc aacaaccccc cccccccuuu)의 염기서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 13으로 이루어진 염기서열일 수 있다.The BC200 RNA is SEQ ID NO: 13 may include the nucleotide sequence of (ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc aacaaccccc cccccccuuu) and, most preferably, the nucleotide sequence one consisting of SEQ ID NO: 13 .

바람직한 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 1(Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 상보성결정영역 1 (CDR1), 서열번호 2(Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 3(Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Gly Val Trp)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H); 및,In one preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment comprises a complementarity determining region 1 (CDR1) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr) A heavy chain variable region (V _H ) containing CDR3 having the amino acid sequence of CDR2 having amino acid sequence and SEQ ID NO: 3 (Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Met Gly Val Trp); And

서열번호 4(Gln Ser Ile Asn Asn Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 5(Ala Thr Ser)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 6(Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (Gln Ser Ile Asn Asn Tyr), CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (Ala Thr Ser) and SEQ ID NO: 6 (Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe) Binding fragment that comprises a light chain variable region (V _L ) containing CDR3 having an amino acid sequence.

다른 바람직한 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 서열번호 7(Gly Tyr Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 8 (Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 9(Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H); 및,In another preferred embodiment, the antibody or antigen-binding fragment comprises CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr) And a heavy chain variable region (V _H ) comprising CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp); And

서열번호 10(Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr)의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 11(Arg Asn Asn)의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 12(Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly)의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편일 수 있다.CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 (Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr), CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (Arg Asn Asn) and SEQ ID NO: 12 (Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly) Or a light chain variable region (V _L ) containing CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO:

상기 항체는 전체 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')₂ 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.The antibodies may be in the form of whole antibodies as well as functional fragments of antibody molecules. The whole antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond. Examples of the antibody fragment include (i) a variable region (VL) of a light chain and a variable region (VH) of a heavy chain, an invariant region (CL) of a light chain, and A Fab fragment consisting of the first constant region (CH1) of the heavy chain; (ii) an Fd fragment consisting of the VH and CH1 domains; (iii) an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single antibody; (iv) a dAb fragment consisting of the VH domain (Ward ES et al., Nature 341: 544-546 (1989)); (v) an isolated CDR region; F (ab ') ₂ fragments; (vii) VH domain and VL domain is a single chain Fv molecules (scFv) coupled by a peptide linker to combine to form the antigen binding site; is a single, (viii) bispecific chain Fv dimers (PCT / US92 / 09965) and (ix) diabody WO94 / 13804 which is a polyvalent or multispecific fragment produced by gene fusion.

상기 항체들은 BC200 RNA에 특이적으로 결합할 수 있으므로 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절하는데 활용할 수 있다. 따라서 BC200 RNA에 특이적으로 결합할 수 있는 특성으로 인해 BC200 RNA 관련 질환의 진단 또는 치료에 크게 응용될 수 있으며, 본 발명의 다른 일례로 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.Since the antibodies can bind specifically to BC200 RNA, they can be used to recognize BC200 RNA or regulate its action. Therefore, it can be applied to the diagnosis or treatment of BC200 RNA-related diseases due to its ability to specifically bind to BC200 RNA. In another example of the present invention, BC200 RNA-related diseases including the antibody or antigen- A pharmaceutical composition for therapeutic use is provided.

상기 BC200 RNA 관련 질환으로 이에 한정되지 않지만, BC200 RNA 관련 질환으로 알려진 질환들을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 유방암, 알츠하이머병(신경퇴행성질환), 자궁경부암, 식도암, 폐암, 난소암, 귀밑샘암 및 혀암(설암)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.The BC200 RNA-related diseases include, but are not limited to, diseases known as BC200 RNA-related diseases, and preferably include diseases such as breast cancer, Alzheimer's disease (neurodegenerative disease), cervical cancer, esophageal cancer, lung cancer, ovarian cancer, Tongue cancer (tongue cancer).

상기 약학 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. The pharmaceutical composition may be administered to mammals including human in various routes and may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) depending on the intended method , The dose varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the drug form, the administration route and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.

본 발명에 따른 상기 치료용 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.When the therapeutic composition according to the present invention is formulated, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like which are usually used.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dosage level is determined depending on the type of disease, severity, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient. In general, 0.1 to 100 mg, preferably 0.5 to 10 mg per kg of body weight is administered daily or every other day, Three doses can be administered. However, the dosage may be varied depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc. Therefore, the dosage is not limited to the scope of the present invention by any means.

본 발명은 또한 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, BC200 RNA의 탐지용 조성물, 또는 BC200 RNA 관련 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.The present invention also relates to a composition for detecting BC200 RNA or a composition for diagnosing BC200 RNA-related diseases, which comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically binds to BC200 RNA.

상기 탐지용 조성물은 단백질에 특이적인 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다. 면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. The detection composition may further include reagents known in the art used for immunological analysis in addition to the antibody specific for the protein. Reagents used in immunoassays include labels, solubilizers, and detergents that can generate a detectable signal.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.Immunological analysis may include any method capable of measuring binding between an antigen and an antibody. Such methods are well known in the art and include, for example, immunocytochemistry and immunohistochemistry, radioimmunoassays, enzyme linked immunoabsorbent assays (ELISA), immunoblotting, Farr assay, immunoprecipitation, latex agglutination, erythrocyte agglutination, agglutination, immunodiffusion, counter-current electrophoresis, single-radical immunodiffusion, immunochromatography, protein chip and immunofluorescence.

또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신,이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.In addition, when the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring the enzyme activity and a reaction terminator. A marker capable of generating a detectable signal in the above enables the formation of an antigen-antibody complex to be qualitatively or quantitatively measurable, and examples thereof include an enzyme, a fluorescent substance, a ligand, a luminescent material, a microparticle, a redox molecule And radioactive isotopes. Examples of the enzymes include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glycosidoxidase, hexokinase, malate dehydrogenase, glucose-6 Phosphoric acid dehydrogenase, invertase and the like can be used. Examples of the minerals include fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, phycocyanin, allophycocyanin, fluorine synthase, and the like. Examples of the ligand include biotin derivatives, and examples of the luminescent material include acridinium ester, luciferin, and luciferase. Examples of the fine particles include colloidal gold and colored latex. Examples of redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, viologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone and the like. Radioactive isotopes include ³ H, ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S, ³⁶ Cl, ⁵¹ Cr, ⁵⁷ Co, ⁵⁸ Co, ⁵⁹ Fe, ⁹⁰ Y, ¹²⁵ I, ¹³¹ I and ¹⁸⁶ Re. However, in addition to those exemplified above, any of them can be used as long as they can be used for immunological assays.

한편, 상기 탐지용 조성물은 탐지의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다 (Antibodies: A Labotory Manual, Harlow＆Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.On the other hand, the detection composition may be provided in an immobilized state using various methods known in the art on a suitable carrier or supporter in order to increase the speed and convenience of detection (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow &amp;Lane; Cold Spring Harbor , 1988). Examples of suitable carriers or supports are agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposomes, carboxymethylcellulose, polyacrylamide, polysterine, gabapentin, filter paper, ion exchange resins, , Glass, polyamine-methyl vinyl ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer, ethylene-maleic acid copolymer, nylon, cup, flat packs and the like. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any possible shape, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or well inner surface), planar (sheet, test strip).

바람직하게는, 상기 탐지용 또는 진단용 조성물은 탐지용 또는 진단용 키트, 마이크로어레이, 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다. 상기 진단용 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드 (sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 (예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.Preferably, the detection or diagnostic composition may be provided in the form of a detection or diagnostic kit, microarray, protein chip. The diagnostic kit may be provided, for example, in the form of a lateral flow assay kit based on immunochromatography to detect a specific protein in a sample. The lateral flow assay kit comprises a sample pad applied to the sample, a releasing pad coated with the detection antibody, a developing membrane where the sample migrates and separates and an antigen-antibody reaction takes place (for example, nitro Cellulose) or strip, and an absorption pad.

본 발명에 따른 BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 BC200 RNA를 인지하거나 그 작용을 조절할 수 있어 BC200 RNA 관련 질환의 진단 및 치료에 유용하게 응용될 수 있다.The antibody or antigen-binding fragment specifically binding to the BC200 RNA according to the present invention can recognize the BC200 RNA or regulate its action, and thus can be usefully applied to the diagnosis and treatment of BC200 RNA-related diseases.

또한 본 발명에 따른 RNA에 결합하는 항체의 선별방법은, 종래에 자성 비드를 이용한 항체의 선별방법에 있어서 자성비드의 유동성 때문에 발생하는 용액 분리 과정의 비특이성 문제점을 극복할 수 있으며, 또한 패닝 차수(round)가 늘어남에도 동일한 횟수로 세척할 경우 항원에 대한 친화력이 강하고 특이적인 항체 선별에 있어 어려운 점을 해결하였다. 따라서 본 발명의 RNA에 결합하는 항체의 선별방법은 기능성 RNA의 구조를 인식하는 인간 항체의 제조에 유용하게 사용될 수 있으며, RNA 인지의 새로운 기술로서 바이오칩(biochip)이나 바이오센서(biosensor)는 물론 진단 및 치료제의 개발 등에 효과적인 활용될 수 있다. The method for screening antibodies binding to RNA according to the present invention can overcome the non-specific problems of the solution separation process caused by the fluidity of the magnetic beads in the conventional method of screening antibodies using magnetic beads, (round), but the same number of times to wash the strong affinity for the antigen and solved the difficulty of specific antibody screening. Therefore, the screening method of antibodies binding to the RNA of the present invention can be useful for the production of human antibodies recognizing the structure of functional RNA. As a new technology of RNA recognition, a biochip, a biosensor, And development of therapeutic agents.

도 1은 시험관 내 전사반응을 통해 BC200RNA를 제작할 수 있는 RNA 발현 플라스미드를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 패닝법을 이용하여 항체 라이브러리부터 항체를 선별하는 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 다클론 Fab 항체 (polyclonal Fab antibody)의 RNA에 대한 결합력을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 패닝법을 이용하여 선별한 파아지에 디스플레이된 Fab 형태의 단일 클론 항체의 RNA에 대한 결합력을 닷 블랏으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석할 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 동물 세포주에서 발현된 항체를 정제한 후 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 단일 클론 항체와 RNA와의 필터 결합법을 도식화한 것이다.
도 8은 전체 IgG 항체의 RNA에 대한 결합력을 필터 결합법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 is a schematic representation of an RNA expression plasmid capable of producing BC200 RNA through in vitro transcription reaction.
FIG. 2 is a diagram illustrating a method of selecting an antibody from an antibody library using a panning method.
FIG. 3 shows the results of ELISA analysis of the binding force of the polyclonal Fab antibody displayed on the phage screened using the panning method to RNA.
FIG. 4 shows the result of dot blot analysis of the binding force of Fab-type monoclonal antibodies displayed on the phage screened using the panning method to RNA.
Figure 5 shows the results of SDS-PAGE analysis after purification of antibodies expressed in animal cell lines.
FIG. 6 shows the results of ELISA after purification of antibodies expressed in animal cell lines.
FIG. 7 is a schematic illustration of a method of binding a monoclonal antibody and RNA to a filter.
Fig. 8 shows the result of analyzing the binding ability of whole IgG antibody to RNA by a filter binding method.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

[실시예][Example]

실시예Example 1.  One. 바이오틴화Biotinization RNARNA 제작 making

1.1 어댑터 1.1 Adapter RNARNA 의 서열을 포함한 Including the sequence of BC200BC200 RNARNA 발현 벡터 제작 Production of expression vector

어댑터 RNA(서열번호 14, ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc)의 서열을 포함한 BC200 RNA(서열번호 13)를 시험관 내 전사반응을 통해 제작하기 위하여, RNA 발현 플라스미드를 구축하였다(도 1). 사람 지노믹 DNA(human genomic DNA, Roche사, 독일)를 주형으로 하여 정방향 프라이머(forward primer)로서 T7 프로모터(T7 promoter) 서열과 BC200 5’ 말단의 일부 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 16, gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg), 및 역방향 프라이머(reverse primer)로서 BC200 3’말단의 일부 서열, 어댑터 RNA의 서열 및 StuI 부위의 서열을 포함한 올리고뉴클레오티드(서열번호 17, cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg gggggg)를 이용하여 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)로 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 95℃ 에서 3분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응시킴으로써 이루어졌다. An RNA expression plasmid was constructed to produce BC200 RNA (SEQ ID NO: 13) containing the sequence of adapter RNA (SEQ ID NO: 14, ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc) through in vitro transcription reaction (Fig. An oligonucleotide (SEQ ID NO: 16, gaattctaat (SEQ ID NO: 16) containing a sequence of T7 promoter (T7 promoter) and a part of the end of BC200 5 'as a forward primer, using human genomic DNA (Roche, Germany) (SEQ ID NO: 17, cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg gggggg) containing a partial sequence of the BC200 3 'end as the reverse primer, a sequence of the adapter RNA and a sequence of the StuI site PCR was performed with 2X TOPSimple PreMix-Forte (Enzynomics, Korea). The PCR reaction was carried out at 95 ° C. for 3 minutes, followed by reaction at 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 1 minute, and finally reaction at 72 ° C. for 5 minutes.

합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 T-blunt vector(Solgent사, 대한민국)와 반응시키고, 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열 분석을 의뢰하였다(Solgent사, 대한민국). 그 결과, T7 프로모터, BC200 RNA, 어댑터 RNA, 그리고 StuI 부위의 서열들과 일치됨을 확인하였다.
The synthesized DNA was confirmed by electrophoresis on 1.5% agarose gel, and the DNA was purified with MEGAquick-spin PCR & agarose gel DNA extraction kit (Intron, Korea). The purified DNA was reacted with a T-blunt vector (Solgent, Korea), transformed into Escherichia coli DH5α by heat shock and plated on solid medium of LB ampicillin (100 μg / ml, ampicillin, Amp) For 16 hours, and the single colonies shown were inoculated in 3 ml of LB ampicillin (100 [mu] g / ml) liquid medium and cultured at 37 [deg.] C for 16 hours. DNA was extracted from the culture solution using DNA-spin Plasmid DNA Purification kit (Intron, Korea) and subjected to sequencing (Solgent Co., Ltd., Korea). As a result, it was confirmed that the sequences corresponded to the T7 promoter, BC200 RNA, adapter RNA, and StuI site.

1.2 시험관 내 전사반응을 통한 1.2 Through in vitro transcription reaction RNARNA 제작 making

상기 실시예 1.1에서 준비된 DNA는 제한효소 StuI을 사용하여 절단하였고, 상기 제한효소로 절단한 절편을 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동으로 확인하고, DNA를 MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit로 정제하였다. 정제된 DNA를 RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems for T7 kit(Promega사, 미국)로 반응시켜 7M 요소가 포함된 5% PAGE를 이용하여 RNA 밴드를 분리하고, RNA 용출 용액(Tris-Cl, pH7.5, 0.3M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% SDS)에 넣어 4℃에서 16시간 동안 용출하였다. The DNA prepared in Example 1.1 was digested with restriction enzyme StuI, and the fragment digested with the restriction enzyme was confirmed by electrophoresis on a 1.5% agarose gel. DNA was digested with MEGAquick-spin PCR & agarose gel DNA extraction kit Lt; / RTI &gt; The purified DNA was reacted with RiboMAX ™ Large Scale RNA Production Systems for T7 kit (Promega, USA), and the RNA bands were separated using 5% PAGE containing 7 M urea and RNA elution solution (Tris-Cl, 5, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% SDS) at 4 ° C for 16 hours.

상기 용출액을 15,000 xg으로 1분 동안 원심분리하고, 상층액만 0.4μm 필터로 걸러주고, 페놀을 동일양으로 넣고 15,000 xg으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮겼다. 여기에 클로로포름을 동일 양으로 넣고 15,000 xg으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액만 새 튜브에 옮기고, 상층액 양의 2.5배에 해당하는 에탄올을 넣고, -70℃에서 보관하였다. 상기 용액을 2 내지 8℃에서 15,000 xg으로 5분 동안 원심분리하여 에탄올을 제거하였고, 70% 에탄올과 100% 에탄올을 차례로 넣고 동일한 방식으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, RNA 펠렛을 진공펌프를 이용하여 상온에서 3분 동안 건조시켰다.
The eluate was centrifuged at 15,000 xg for 1 minute, the supernatant was filtered with a 0.4 mu m filter, the phenol was added in the same amount, centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes, and only the supernatant was transferred to a new tube. The same amount of chloroform was added thereto, and the mixture was centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes. Only the supernatant was transferred to a new tube, ethanol equivalent to 2.5 times the supernatant was added, and stored at -70 ° C. The solution was centrifuged at 15,000 × g for 5 minutes at 2 to 8 ° C. to remove ethanol. 70% ethanol and 100% ethanol were added in this order, centrifuged in the same manner, and the supernatant was removed. The RNA pellet was then vacuum- And dried at room temperature for 3 minutes.

1.3 1.3 RNARNA 바이오틴화Biotinization

상기 실시예 1.2에서 준비된 RNA와 어댑터 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 바이오틴화 올리고뉴클레오티드(서열번호 15, aggatccgac cgtggtgccc t)를 1:2.5의 비율로 혼합하고 85℃에서 5분간 반응한 뒤, 상온까지 서서히 온도를 내림으로써 바이오틴화 RNA를 얻었다.
The biotinylated oligonucleotide (SEQ ID NO: 15, aggatccgac cgtggtgccc t) capable of complementarily binding to the RNA prepared in Example 1.2 and the adapter RNA was mixed at a ratio of 1: 2.5, reacted at 85 ° C for 5 minutes, Lt; RTI ID = 0.0 &gt; RT &lt; / RTI &gt; to obtain biotinylated RNA.

실시예Example 2.  2. FabFab 형태의 인간 항체 라이브러리를  A human antibody library in the form of 파아지에On the phage 디스플레이된 형태로 전환 Switch to displayed form

Fab 형태의 대형 인간 항체 라이브러리로, kappa 경쇄와 lambda 경쇄가 인간 생체에 존재하는 비율과 동일한 6:4로 존재하는 라이브러리 세포 1.5 X 10¹¹을 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지(2.1L)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. A large human antibody library in the form of Fab was prepared by culturing 1.5 x 10 ¹¹ library cells (6: 4) in the same ratio as that of kappa light chain and lambda light chain in human organism, with medium (2.1 L) containing 2YT and ampicillin 100 μg / (OD ₆₀₀ = 0.7-0.8), the helper phage VCSM13 was infected at an MOI value of 1:20, allowed to stand at 37 DEG C for 30 minutes, and then incubated at 37 DEG C for 2 to 3 hours For 30 minutes. Kanamycin (70 μg / ml, kanamycin, Kan) was added thereto and cultured at 30 ° C. for 16 hours.

배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, A500s-8 Rotor No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 xg, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.
The cultured cells were centrifuged for 15 minutes at 5,000 rpm (Supra 22K, A500s-6 No.11, Hanil Scientific Co., Korea) at 4 ° C and then 5 mM PEG (polyethylene glycol) 8000 and 500 mM NaCl Were added and reacted on ice for 2 hours. After centrifugation at 10,000 rpm (Supra 22K, A500s-8 Rotor No. 7, Hanil Scientific Co., Ltd.) at 4 ° C for 1 hour, the supernatant was completely removed and 10 ml of PBS was added to the pellet The solution containing the library phage was centrifuged (13,000 xg, 10 min) and stored at -70 ° C in a new tube.

실시예Example 3.  3. RNARNA 에 대한 For 패닝과정Panning process

3.1 3.1 스트렙트아비딘Streptavidin 코팅 coating

이뮤노튜브에 스트렙트아비딘 100ng을 1 ml 코팅 완충용액(15 mM Na₂CO₃, 34.84 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 녹여서 넣고 4℃에서 16시간 동안 코팅하였고, 0.05% PBST(Tween20 를 0.05% 함유한 PBS)로 1회 세척하였다. 여기에 3% BSA 2 ml를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 차단(blocking)하고, 0.05% PBST로 2회 세척하였다.
100 ng of streptavidin was dissolved in 1 ml of a coating buffer solution (15 mM Na ₂ CO ₃ , 34.84 mM NaHCO ₃ , pH 9.6) and then coated at 4 ° C for 16 hours. 0.05% PBST 1 &lt; / RTI &gt; PBS). 2 ml of 3% BSA was added thereto, followed by blocking at room temperature for 1 hour, followed by washing twice with 0.05% PBST.

3.2 3.2 바이오틴화Biotinization 올리고뉴클레오티드 및  Oligonucleotides and 스트렙트아비딘과Streptavidin and 반응하는 음성군 항체를 제거 Eliminate reactive group of negative antibodies

상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 상기 실시예 2에서 제조한 파아지에 디스플레이된 라이브러리 항체 1 ml(1.2 X 10¹³/ml)와 바이오틴화 올리고뉴클레오티드 100 pmol을 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시키고, 항원에 결합하지 않은 파아지(음성군)를 상기 실시예 3.1에서 제작한 이뮤노튜브에 넣고 실온에서 30분동안 반응시켰으며, 이 과정을 2회 반복하여 음성군에 결합하는 파아지를 제거하였다.
1 ml (1.2 X 10 ¹³ / ml) of the library antibody displayed in the phage prepared in Example 2 and 100 pmol of a biotinylated oligonucleotide were added to the immu- nootypes prepared in Example 3.1 and reacted at room temperature for 30 minutes , And the phage that did not bind to the antigen (negative group) was added to the emyunotube prepared in Example 3.1 and reacted at room temperature for 30 minutes. This procedure was repeated twice to remove the phage binding to the negative group.

3.3 3.3 RNARNA 와 결합하는 항체 선별&Lt; / RTI &gt;

상기 실시예 3.2의 음성군에 결합하는 항체를 제거한 라이브러리 파아지 항체를 실시예 1.3에서 제작한 바이오틴화 RNA 10 pmol과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 상기 실시예 3.1의 이뮤노튜브에 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다.
The library phage antibody from which the antibody binding to the negative group of Example 3.2 was removed was reacted with 10 pmol of the biotinylated RNA prepared in Example 1.3 for 1 hour at room temperature and then placed in the immunotube of Example 3.1 for 30 minutes at room temperature Lt; / RTI &gt;

3.4 3.4 RNARNA 와 결합력이 약한 항체를 세척하여 제거And antibodies that are weakly bound

상기 실시예 3.3의 이뮤노튜브를 0.05% PBST로 10회 세척하였다. 이 때, 패닝 회차가 증가할수록 세척 횟수를 10회씩 늘렸다. 즉, 2차 패닝에서는 20회, 3차 패닝에서는 30회, 4차 패닝에서는 40회를 세척하였다.
The immunotube of Example 3.3 was washed 10 times with 0.05% PBST. At this time, the number of times of washing was increased by 10 times as the panning number increased. That is, 20 times in the second panning, 30 times in the third panning, and 40 times in the fourth panning.

3.5 3.5 RNARNA 와 결합하고 있는 Coupled with 파아지의Phage 용출 Dissolution

상기 실시예 3.4의 이뮤노튜브에 PBS 1 ml에 녹인 효모 전체 RNA(yeast total RNA) (구입처: 라이프 테크놀로지스) 5mg을 넣고 상온에서 10분간 반응시켜, RNA에 결합한 항체만을 떼어내었다.
5 mg of yeast total RNA (purchased from Life Technologies) dissolved in 1 ml of PBS was added to the immature DNA of Example 3.4 and reacted at room temperature for 10 minutes to remove only the antibody bound to the RNA.

3.6 3.6 패닝Panning 결과물을  The result 콜로니Colony 형태로 변환 후 저장 및 다음  Convert to form and save and then 패닝을Panning 위하여  for 파아지에On the phage 디스플레이된 형태로 변환 Convert to displayed form

대장균 TG1(F' [traD36 proAB ⁺ lacI ^q lacZ Δ M15]supE thi -1 Δ( lac - proAB ) Δ( mcrB - hsdSM )5, ( rK ^- mK ^- ))의 단일 콜로니를 2YT배지(10 ml)에서 37℃에서 2 내지 3시간 동안 키운 배양액(OD₆₀₀=0.7~0.8)에 상기 실시예 3.5에서 용출된 파아지를 감염시키고, 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 상기 배양액을 4℃에서 3,500rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 1 ml의 2YT배지에 녹여 SOB, 10mM Mg Cl₂, 100mM glucose 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 고체배지에서 자란 콜로니들은 2YT, 100mM Glucose, 5mM MgCl₂ 및 암피실린 100μg/ml을 포함한 배지 10 ml에 녹이고, 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다. Escherichia coli TG1 (F '[ traD36 proAB ⁺ lacI ^q lacZ ? M15 ] supE thi -1 Δ (lac - proAB) Δ (mcrB - hsdSM) 5, (rK - mK -)) of the culture grown for 2 to 3 hours for single colonies at 37 ℃ in 2YT medium _{(10 ml) (OD 600 =} 0.7 To 0.8) was infected with the phage eluted in the above Example 3.5, allowed to stand at 37 DEG C for 30 minutes, and then shaken at 37 DEG C for 30 minutes. The culture was centrifuged at 3,500 rpm (Supra 22K, Rotor A500s-8 No. 7, Hanil Scientific Co., Ltd.) at 4 ° C for 10 minutes. The supernatant was removed and the pellet was dissolved in 1 ml of 2YT medium SOB, 10 mM MgCl ₂ , 100 mM glucose and 100 μg / ml ampicillin, and then cultured at 37 ° C. for 16 hours. Colonies grown in the solid medium were dissolved in 10 ml of medium containing 2YT, 100 mM Glucose, 5 mM MgCl ₂ and 100 μg / ml of ampicillin, and stored in a new tube at -70 ° C.

이를 파아지로 다시 전환하기 위하여 상기 세포를 녹여 2YT 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 OD₆₀₀=0.1~0.15가 되도록 넣은 후 37℃에서 2 내지 3시간 동안 배양한 후(OD₆₀₀=0.7~0.8), 헬퍼 파아지(helper phage) VCSM13을 MOI값이 1:20이 되도록 감염시켜 37℃에서 30분 동안 정치한 후 37℃에서 30분 동안 흔들어 키웠다. 여기에 카나마이신(70μg/ml, kanamycin, Kan)을 넣고 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4℃에서 5,000 rpm(Supra 22K, A500s-6 Rotor No.11, 한일과학사업사, 대한민국)으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액에 5mM PEG(polyethylene glycol) 8000과 500mM NaCl을 첨가하여 얼음에서 2시간 동안 반응하였다. 다시 4℃에서 10,000 rpm(Supra 22K, Rotor A500s-8 No.7, 한일과학사업사, 대한민국)으로 1시간 동안 원심분리한 후, 상층액을 완벽히 제거하고 펠렛에 10 ml PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(13,000 xg, 10분)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 용액을 새 튜브에 넣어 -70℃에서 보관하였다.After this insert such that the medium containing 2YT and ampicillin 100μg / ml by dissolving the cells in order to switch back to the phage OD ₆₀₀ = 0.1 ~ 0.15 and incubated for 2 to 3 hours at _{37 ℃ (OD 600 = 0.7 ~} 0.8 ) And helper phage VCSM13 were infected at an MOI value of 1:20, allowed to stand at 37 DEG C for 30 minutes, and then shaken at 37 DEG C for 30 minutes. Kanamycin (70 μg / ml, kanamycin, Kan) was added thereto and cultured at 30 ° C. for 16 hours. The cultured cells were centrifuged for 15 minutes at 5,000 rpm (Supra 22K, A500s-6 Rotor No.11, Hanil Scientific Co., Korea) at 4 ° C, and then 5 mM PEG (polyethylene glycol) 8000 and 500 mM NaCl Was added and reacted on ice for 2 hours. After centrifugation at 10,000 rpm (Supra 22K, Rotor A500s-8 No. 7, Hanil Scientific Co., Ltd.) at 4 ° C for 1 hour, the supernatant was completely removed and 10 ml PBS was added to the pellet The solution containing the library phage was centrifuged (13,000 xg, 10 min) and stored at -70 ° C in a new tube.

상기 실시예 3.1 내지 3.6의 과정을 총 4번 반복하였으며, 항체 선별 과정의 모식도를 도 2에 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.The procedures of Examples 3.1 to 3.6 were repeated four times in total. A schematic diagram of the antibody screening process is shown in FIG. 2, and the results are shown in Table 1 below.

패닝 횟수Number of panning 초기 파아지수Initial phage count 결합한 파아지수Combined phage number 1차Primary 1.2 X 10¹³ 1.2 X 10 ¹³ 6.1 X 10⁶ 6.1 X 10 ⁶ 2차Secondary 3.0 X 10¹³ 3.0 X 10 ¹³ 9.9 X 10⁶ 9.9 X 10 ⁶ 3차Third 1.8 X 10¹³ 1.8 X 10 ¹³ 9.7 X 10⁷ 9.7 X 10 ⁷ 4차Fourth 1.2 X 10¹³ 1.2 X 10 ¹³ 2.2 X 10⁸ 2.2 X 10 ⁸

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 3차 패닝부터 BC200 RNA를 인식하는 항체를 가지고 있는 콜로니 역가가 10배 정도 증폭됨을 확인하였다.
As shown in Table 1, it was confirmed that the colony titer having the antibody recognizing BC200 RNA was amplified about 10 times from the third panning.

실시예Example 4.  4. RNARNA ELISAELISA 및 닷  And dot 블랏(dot blot)을The dot blot 통한  through 패닝Panning 결과 확인 Check the result

4.1 4.1 RNARNA ELISAELISA 를 통한 Through 패닝Panning 결과 확인 Check the result

상기 실시예 3에 따라 1차부터 4차까지 패닝하여, 얼려두었던 세포 스톡(stock)을 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 96 웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 스트렙트아비딘을 웰 당 100 ng씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, 0.05% PBST 200 μl로 1번 세척하고, 0.05% PBST에 녹인 3% BSA를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 동시에 새 튜브에서 1차 내지 4차 패닝 결과 BC200 RNA를 인식하는 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100 μl와 바이오틴화 BC200 RNA 4pmol을 상온에서 반응시켰다. 차단된 각 웰을 0.05% PBST 200 μl로 2번 세척한 다음 상기 항체를 디스플레이하고 있는 파아지와 바이오틴화 BC200 RNA 반응물을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 0.05% PBST 200 μl로 3번 세척한 후 이차 항체인 항-인간IgGF(ab)₂’-HRP(Pierce사, 미국)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-트윈20(0.05%) 0.05% PBST 200 μl로 4번 세척한 후에 BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set(BD사, 미국)로 기질 용액을 만들어, 웰 당 100 μl씩 넣어 5분 동안 발색시키고, 2.5M 황산수용액 50 μl를 넣어 반응을 종료시킨 뒤 분광광도계(Spectrophotometer)(MolecularDevice사, 미국)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.The cells were panned from first to fourth according to Example 3 and frozen stocks were transformed into phage forms in the same manner as in Example 3.6. Streptavidin was added to 96-well immuno plates (NUNC 439454) by coating 100 ng / well of each well with coating buffer solution at 4 ° C for 16 hours. The plate was washed once with 200 μl of 0.05% PBST and dissolved in 0.05% Each well was blocked using 3% BSA. At the same time, 100 μl of phage displaying antibodies recognizing BC200 RNA and 4 pmol of biotinylated BC200 RNA were reacted at room temperature. Each blocked well was washed twice with 200 μl of 0.05% PBST, and the biotinylated BC200 RNA reaction was added to the phage displaying the antibody, followed by reaction at room temperature for 1 hour. After washing three times with 200 μl of 0.05% PBST per well, anti-human IgGF (ab) ₂ '-HRP (Pierce, USA) as a secondary antibody was diluted 1: 2000 and reacted at room temperature for 1 hour. After washing 4 times with 200 μl of PBS-Tween 20 (0.05%) 0.05% PBST, a substrate solution was prepared with BD OptEIA TMB Substrate Reagent Set (BD, USA) and added with 100 μl / M sulfuric acid aqueous solution was added to terminate the reaction, and the absorbance was measured at 450 nm using a spectrophotometer (Molecular Device, USA). The results are shown in FIG.

도 3에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 3차 패닝 단계부터 역가가 증가하는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 3, it was confirmed that the titer increased from the third panning step in the BC200 antigen.

4.2 닷 4.2 dot 블랏을Blat 통한 단일 클론 항체의 결합력 확인 Of monoclonal antibodies

상기 실시예 3에 따라 얻은 4차 패닝 세포 스톡을 녹인 후, 2YT 암피실린(100μg/ml) 고체배지에 단일 콜로니로 분별될 수 있도록 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니 항체를 파아지로 다시 전환하기 위하여 녹여 2YT, 100mM Glucose 및 암피실린 100μg/ml를 포함하는 배지에 접종하여 상기 실시예 3.6과 동일한 방법으로 파아지 형태로 전환하였다. 이때, 인간 항체 라이브러리에서 무작위로 뽑아 제작한 단일 클론 항체를 대조군으로 이용하였다. Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 제작한 항체를 디스플레이하고 있는 파아지 100 μl를 넣고 상온에서 1시간 동안 Hybond-ECL막(GE사, 미국)에 결합시켰다. 상기 막은 PBS에 녹인 2% 탈지유(skim milk)로 상온에서 1시간동안 차단하고, 85℃오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 교차 결합된 막은 탐침(probe)으로써 α-³²p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC200 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다. 이 때 BC200 RNA는 2차 구조를 이루도록 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 것을 사용하였다. 마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.The 4th panning cell stock obtained in the above Example 3 was dissolved and plated on a solid medium of 2YT ampicillin (100 μg / ml) so as to be fractionated into a single colony, followed by culturing at 37 ° C for 16 hours. The single-colony antibody was dissolved to convert it into a phage, and inoculated into a medium containing 2YT, 100 mM glucose and 100 μg / ml of ampicillin, and converted into a phage form in the same manner as in Example 3.6. At this time, a monoclonal antibody prepared by randomly pulling out from a human antibody library was used as a control. 100 μl of the phage displayed on the Dot blot kit (Schleicher and Schuell, Germany) was added to Hybond-ECL membrane (GE, USA) for 1 hour at room temperature. The membrane was blocked with 2% skim milk dissolved in PBS for 1 hour at room temperature and cross-linked for 1 hour in an 85 ° C oven. The cross-linked membrane was reacted with a Rapid-hyb buffer (GE Corp., USA) containing internal labeled BC200 RNA for 16 hours using a- ³² p [CTP] as a probe. At this time, BC200 RNA was reacted at 65 ° C for 5 minutes and reacted at 4 ° C for 10 minutes to form a secondary structure. After washing with Washing Solution I (2X SSC, 0.1% SDS) and Washing Solution II (0.2X SSC and 0.1% SDS), the plate was exposed to imaging plate (Fujifilm, Japan) and the signal was transferred to BAS7000 , Japan). The results are shown in Fig.

도 4에 나타난 바와 같이, BC200 항원에 있어서 강력하게 결합하는 단일 클론 파아지 항체 들을 확인할 수 있었으며 이를 FabBC200-A와 FabBC200-B로 명명하였다.
As shown in Fig. 4, monoclonal phage antibodies strongly binding to the BC200 antigen were identified and named FabBC200-A and FabBC200-B.

실시예Example 5. 단일 클론  5. Single clone FabFab 항체 분석 Antibody analysis

상기 실시예 4에서 확인된, BC200 RNA을 특이적으로 인식하는 단일 클론 항체들을 2YT 암피실린(100μg/ml)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 프라이머H(서열번호 18, gcgaagtcac ccatcagg)와 프라이머L(서열번호 19, tagctcactc attaggca)을 이용하여 중쇄와 경쇄의 염기서열을 ABI-3730xl 자동서열분석기 (automatic sequencer) (Solgent사, 대한민국) 로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2 및 표 3에 나타내었다.Monoclonal antibodies specifically recognizing BC200 RNA identified in Example 4 above were incubated in 2YT ampicillin (100 [mu] g / ml) for 16 hours at 37 [deg.] C. DNA was obtained from the cultured monoclon using a DNA-spin Plasmid DNA Purification kit (Intron, Korea), and then primer H (SEQ ID NO: 18, gcgaagtcac ccatcagg) and primer L (SEQ ID NO: 19, tagctcactc attaggca) The base sequences of the heavy and light chains were analyzed with an ABI-3730xl automatic sequencer (Solgent, Korea), and the results are shown in Tables 2 and 3 below.

클론이름Clone name 구분division 유사 대립형질(allele)Alleles 상동성Homology FabBC200-AFabBC200-A 중쇄 가변 영역Heavy chain variable region IGHV1-46*01 F, 혹은 IGHV1-46*02 F, 혹은 IGHV1-46*03 FIGHV1-46 * 01 F, or IGHV1-46 * 02 F, or IGHV1-46 * 03 F 92,01% (265/288 nt)92.01% (265/288 nt) 경쇄 가변 영역Light chain variable region Homsap IGKV1-39*01 F, 혹은 Homsap_IGKV1D-39*01 FHomsap IGKV1-39 * 01 F, or Homsap_IGKV1D-39 * 01 F 92,83% (259/279 nt)92.83% (259/279 nt) FabBC200-BFabBC200-B 중쇄 가변 영역Heavy chain variable region IGHV1-46*01 F, 혹은 IGHV1-46*02 F, 혹은 IGHV1-46*03 FIGHV1-46 * 01 F, or IGHV1-46 * 02 F, or IGHV1-46 * 03 F 91,32% (263/288 nt)91,32% (263/288 nt) 경쇄 가변 영역Light chain variable region Homsap IGLV1-44*01 FHomsap IGLV1-44 * 01 F 95,79% (273/285 nt)95,79% (273/285 nt)

Fab BC200 RNA에 결합하는 항체의 CDR 아미노산 서열The CDR amino acid sequence of an antibody that binds to Fab BC200 RNA CDR1CDR1 CDR2CDR2 CDR3CDR3 FabBC200-AFabBC200-A 중쇄 가변 영역Heavy chain variable region GYTLSAYY
(서열번호 1)GYTLSAYY
(SEQ ID NO: 1) INPRGGRT
(서열번호 2)INPRGGRT
(SEQ ID NO: 2) CAARGSPRSRFYYGMGVW
(서열번호 3)CAARGSPRSRFYYGMGVW
(SEQ ID NO: 3) 경쇄 가변 영역Light chain variable region QSINNY
(서열번호 4)QSINNY
(SEQ ID NO: 4) ATS
(서열번호 5)ATS
(SEQ ID NO: 5) CQQSYSFPWTF
(서열번호 6)CQQSYSFPWTF
(SEQ ID NO: 6) FabBC200-BFabBC200-B 중쇄 가변 영역Heavy chain variable region GYTLSTYY
(서열번호 7)GYTLSTYY
(SEQ ID NO: 7) INSRGGRT
(서열번호 8)INSRGGRT
(SEQ ID NO: 8) CARGSPRLRRDPRRAFDIW
(서열번호 9)CARGSPRLRRDPRRAFDIW
(SEQ ID NO: 9) 경쇄 가변 영역Light chain variable region SSNIGSNT
(서열번호 10)SSNIGSNT
(SEQ ID NO: 10) RNN
(서열번호 11)RNN
(SEQ ID NO: 11) CATWDDSRNG
(서열번호 12)CATWDDSRNG
(SEQ ID NO: 12)

상기 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이 선별된 항체의 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 CDR영역을 확인하였다. 상기 항체와 생식세포계열의 대립형질(germline allele) 항체군의 유사성을 IMGT(www.imgt.org) 의 Internet software IMGT/V-QUEST(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret=0&Option=humanIg) 프로그램을 이용하여 확인한 결과, 항체 FabBC200-A의 중쇄의 경우 인간 생식세포계열 서열과 대략 92%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 대략 92%의 상동성을 보여주었다. 항체 FabBC200-B의 중쇄의 경우 인간 생식세포계열 서열과 대략 91%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 대략 95%의 상동성을 보여주었다. 또한, 각각의 인간 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR1,2 및 3에서 사용되고 있는 아미노산 잔기(residue)를 분석하였으며, 서로 서열이 다른 것을 확인하였다. 이 때 항체의 서열번호는 IMGT 에서 정한 인간 항체의 염기서열 번호 명명법에 따랐고, 항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3와 LCDR1, LCDR2, LCDR3 영역 결정은 IMGT의 CDR표시 방법에 따랐다.
CDR regions of the heavy chain (V _H ) and light chain (V _L ) of the selected antibodies were identified as shown in Tables 2 and 3 above. The similarity of the germline allele antibody group to the germline allele was determined using the Internet software IMGT / V-QUEST (http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest?livret) of IMGT (www.imgt.org) = 0 & Option = humanIg), the heavy chain of the antibody FabBC200-A showed homology of about 92% with the human germline sequence and about 92% homology with the light chain. The heavy chain of the antibody FabBC200-B showed up to 91% homology with the human germline sequence and 95% homology with the light chain. In addition, the amino acid residues used in CDR1, 2 and 3 of the heavy and light chain of each human antibody were analyzed and the sequences were confirmed to be different from each other. HCDR1, HCDR2, HCDR3, and LCDR1, LCDR2, and LCDR3 regions of the antibodies were determined according to the CDR labeling method of IMGT.

실시예Example 6. 동물세포 전체  6. Whole animal cells IgGIgG 발현벡터 제조 Expression vector production

6.1 전체 6.1 All IgG1IgG1 변환 분석 Conversion analysis

BC200 RNA에 결합하는 인간 단일 클론 항체를 Fab 형태에서 IgG1 전체 형태의 항체로 전환하기 위해, 단일 클론 DNA 1fmol과 15pmole의 중쇄 또는 경쇄 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 20 내지 서열번호 31), 2X TOPSimple PreMix-Forte(Enzynomics사, 대한민국)를 혼합하여 SOEing PCR법을 사용하여 반응을 실시하였다. 합성된 DNA를 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 예상되는 사이즈의 DNA 밴드를 자른 후, MEGAquick-spin PCR & Agarose Gel DNA Extraction kit(Intron사, 대한민국)로 정제하였다. 정제된 DNA를 제한효소로 처리한 pdCMV-dhfrC-chimeric 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012) 1 μl(10ng), 중쇄(100~200 ng) 15 μl, 10X 완충용액 2 μl, 리가아제(Ligase, Promega사, 미국) 1 U 및 증류수를 혼합하여 17℃에서 16시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균 DH5α에 열충격(Heat shock)으로 형질전환시켜 LB 암피실린(100μg/ml, ampicillin, Amp) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하고, 나타난 단일 콜로니를 LB 암피실린(100μg/ml) 액체배지 3㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-spin Plasmid DNA Purification kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 DNA를 추출하여, 염기서열을 ABI-3730xl automatic sequencer 로 분석하였다(Solgent사, 대한민국). To transform the human monoclonal antibody binding to BC200 RNA from the Fab form to an IgG1 whole form of antibody, 1 fmol of monoclonal DNA and 15 pmole of heavy or light chain forward primer and reverse primer (SEQ ID NO: 20 to SEQ ID NO: 31), 2X TOPSimple PreMix-Forte (Enzynomics, Korea) were mixed and subjected to the reaction using the SOEing PCR method. The synthesized DNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and the DNA bands of the expected size were cut and purified with MEGAquick-spin PCR & agarose gel DNA extraction kit (Intron, Korea). (10 ng), heavy chain (100 to 200 ng), 15 ng (15 ng) of the pdCMV-dhfrC-chimeric vector (Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012) , 2 μl of 10 × buffer solution, 1 U of ligase (Promega, USA) and distilled water were mixed and allowed to stand at 17 ° C. for 16 hours and ligated to the vector. The vector was transformed into Escherichia coli DH5α by heat shock and plated on solid medium of LB ampicillin (100 μg / ml, ampicillin, Amp), followed by incubation at 37 ° C. for 16 hours. The single colonies shown were transformed with LB ampicillin / ml) liquid medium and incubated at 37 DEG C for 16 hours. DNA was extracted from the culture solution using a DNA-spin plasmid DNA purification kit (Intron, Korea), and the base sequence was analyzed with an ABI-3730xl automatic sequencer (Solgent, Inc., Korea).

그 결과, 전체 IgG1으로 전환한 BC200 RNA에 결합하는 항체의 중쇄 및 경쇄 서열이 Fab 형태로 얻은 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the heavy and light chain sequences of antibodies binding to BC200 RNA converted to whole IgG1 were consistent with the sequences of antibodies obtained in Fab form.

6.2 전체 6.2 All IgGIgG 의 검증Verification of

293T 세포에 Noble enhancer 36 μl, Noble factor 40 μl(Noble Bioscience사, 대한민국)와 전체 형태(whole form) 항체 DNA 10 μg을 넣어 형질감염하여 얻은 상등액을 recombinant protein G agarose(Invitrogen사, 미국)로 정제한 후 용출액을 SDS-PAGE와 ELISA로 확인하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.The supernatant obtained by transfecting 293T cells with 36 μl of Noble enhancer, 40 μl of Noble factor (Noble Bioscience, Korea) and 10 μg of whole-form antibody DNA was purified with recombinant protein G agarose (Invitrogen, USA) After elution, the eluate was confirmed by SDS-PAGE and ELISA, and the results are shown in FIG. 5 and FIG.

도 5 및 도 6에서 나타난 바와 같이, 성공적으로 전체 IgG1 형태로 전환되었음을 확인하였다.
As shown in FIG. 5 and FIG. 6, it was confirmed that the whole IgG1 form was successfully converted.

실시예Example 7. 전체  7. All IgG1IgG1 형태 단일 클론 항체의 결합력 확인 Type monoclonal antibody

7.1 필터 7.1 Filter 결합법(filter binding assay)를The binding binding assay 통한 단일 클론 항체의 결합력 확인 Of monoclonal antibodies

상기 실시예 6에 따라 얻은 단일 클론 항체를 희석하여 농도별로 65℃에서 5분 반응시키고, 4℃에서 10분 반응시킨 BC200 RNA 동일양과 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이때, pdCMV-dhfrC-chimeric-A10A3 벡터(Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012)에서 만들어지는 항체를 항체 대조군으로, 대장균 유래 6S RNA를 RNA 대조군으로 이용하였다. The monoclonal antibody obtained in Example 6 was diluted, reacted at 65 ° C for 5 minutes, and reacted at the same temperature for 30 minutes with the same amount of BC200 RNA reacted at 4 ° C for 10 minutes. At this time, the antibody produced in the pdCMV-dhfrC-chimeric-A10A3 vector (Eung Suk, L., et al., Exp. And Mol. Med., 2012) was used as an antibody control and E. coli-derived 6S RNA was used as an RNA control .

Dot blot kit(schleicher and schuell사, 독일)에 상기 반응물을 넣고 Hybond-ECL막(GE사, 미국)과 Hybond-XL막(GE사, 미국)에 차례로 통과시켰다. 이때 결합하지 않은 BC200 RNA양을 분석하기 위해 BC200 RNA만을 통과시키는 실험도 동시에 수행하였다. 필터 결합법의 실험 모식도는 도 7에 나타내었다. 상기 Hybond-XL막은 85℃의 오븐에서 1시간 동안 교차 결합(cross linking)시켰다. 여기에 탐침(probe)으로써 α-³²p[CTP]를 사용하여 내부 표지된 BC20 RNA를 포함하는 Rapid-hyb buffer(GE사, 미국)와 회전기(rotator)에서 16시간 동안 반응시켰다. The reaction mixture was passed through a Hybond-ECL membrane (GE, USA) and a Hybond-XL membrane (GE, USA) in a Dot blot kit (Schleicher and Schuell, Germany). At this time, only BC200 RNA was allowed to pass through in order to analyze the amount of unbound BC200 RNA. An experimental schematic diagram of the filter bonding method is shown in FIG. The Hybond-XL membrane was cross-linked in an oven at 85 캜 for 1 hour. Here, α- ³² p [CTP] was used as a probe to react with a Rapid-hyb buffer (GE Corp., USA) containing internally-labeled BC20 RNA for 16 hours in a rotator.

마지막으로 세척 용액 I(2X SSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II(0.2X SSC와 0.1% SDS)로 세척한 뒤에, imaging plate(Fujifilm사, 일본)에 감광시키고, 그 신호를 BAS7000(Fujifilm사, 일본)로 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.After washing with Washing Solution I (2X SSC, 0.1% SDS) and Washing Solution II (0.2X SSC and 0.1% SDS), the plate was exposed to imaging plate (Fujifilm, Japan) and the signal was transferred to BAS7000 , Japan). The results are shown in Fig.

도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명진이 선벌한 FabBC200-A 및 B가 BC200 RNA에만 특이적으로 결합함을 확인하였다.
As shown in Fig. 8, it was confirmed that FabBC200-A and B purified by the present invention specifically bind to BC200 RNA only.

7.2 7.2 BC200BC200 RNARNA 와 전체 And whole IgGIgG 형태 단일 클론 항체의 결합 친화도 분석 Binding affinity analysis of monoclonal antibodies

상기 실시예 7.1에서 얻은 결과를 하기 수학식 1을 바탕으로 분석하여 해리상수 K_d값을 산출하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.The dissociation constant K _d was calculated by analyzing the results obtained in Example 7.1 based on the following Equation 1, and the results are shown in Table 4 below.

하기 표 4에 나타난 바와 같이, FabBC200-A와 FabBC200-B의 해리상수 Kd값이 각각 9.4 X 10^-9 M과, 44.4 X 10^-9 M인 것으로 산출되었다.As shown in Table 4 below, the dissociation constants Kd values of FabBC200-A and FabBC200-B were calculated to be 9.4 X 10 ^-9 M and 44.4 X 10 ^-9 M, respectively.

FabBC200-AFabBC200-A FabBC200-BFabBC200-B 해리상수 값 (K_d) (M)Dissociation constant value (K _d ) (M) 9.4 X 10^-9 9.4 X 10 ^-9 4.4 X 10^-8 4.4 X 10 ^-8

실시예Example 8.  8. FACSFACS 및 실시간( And real time ( realreal timetime ) ) PCRPCR 을 통한 각 세포주에서의 In each cell line BC200BC200 RNA 정량 분석 RNA quantitative analysis

8.1 8.1 FACSFACS 분석 analysis

HeLa, MCF7 및 HaCaT 세포를 3 X 10⁶/ml이 되도록 10% FBS/PBS에 희석하였다. 희석한 세포에 각각 FabBC200-A 및 음성 항체 1ug을 별도로 처리하였고, 처리한 각 세포를 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, PBS로 두 번 세척하였다. 각각 FabBC200-A 및 음성 항체를 처리한 세포에 항-인간IgGF(ab)₂’-DyLight488(Bethyl사, 미국)를 1:50으로 희석하여 실온에서 30분 동안 반응시키고 다시 PBS로 두 번 세척하였다. 상기 세포는 BD LSRII(BD사, 미국)를 통해 FACS 측정하여 형광값(평균값)을 분석하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.HeLa, MCF7 and HaCaT cells were diluted in 10% FBS / PBS to 3 × 10 ⁶ / ml. The diluted cells were separately treated with FabBC200-A and negative antibody, and the treated cells were reacted at room temperature for 30 minutes and then washed twice with PBS. Anti-human IgGF (ab) ₂ '-DyLight 488 (Bethyl, USA) was diluted 1:50 in each of the FabBC200-A and negative antibody-treated cells, reacted at room temperature for 30 minutes, and then washed twice with PBS . The cells were analyzed by FACS through BD LSRII (BD, USA) and the fluorescence values (mean values) were analyzed. The results are shown in Table 5 below.

세포주Cell line FabBC200-AFabBC200-A 음성 항체Negative antibody FabBC200-A/음성항체FabBC200-A / negative antibody 상대적 비율 값Relative rate value MCF7MCF7 2777.822777.82 254.68254.68 10.9110.91 4.994.99 HeLaHeLa 470.16470.16 114.57114.57 4.104.10 1.881.88 HaCaTHaCaT 350.03350.03 160.02160.02 2.192.19 1One

8.2 8.2 realreal -- timetime PCRPCR 분석 analysis

HeLa, MCF7 및 HaCaT 세포주의 전체 RNA(total RNA)는 easy-BLUE Total RNA Extraction Kit(Intron사, 대한민국)를 이용하여 추출하였다. 추출된 전체 RNA는 6개의 임의의 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머(random hexamer)와 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 역전사 반응을 시켜 cDNA를 제작하였다. 제작된 cDNA는 BC200 RNA와 GAPDH mRNA를 선택적으로 증폭할 수 있는 프라미어를 사용하여 real-time PCR반응을 수행하여, 각 RNA의 Ct(threshold cycle)를 얻어 각 세포주에 따른 BC200 RNA의 상대적인 양을 분석하였으며 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.Total RNAs of HeLa, MCF7 and HaCaT cell lines were extracted using easy-BLUE Total RNA Extraction Kit (Intron, Korea). The extracted total RNA was subjected to a reverse transcription reaction using a random hexamer and a reverse transcriptase consisting of six arbitrary nucleotides to prepare cDNA. The prepared cDNA was subjected to real-time PCR using a primer capable of selectively amplifying BC200 RNA and GAPDH mRNA, and the Ct (threshold cycle) of each RNA was obtained. The relative amount of BC200 RNA The results are shown in Table 6 below.

세포주Cell line RNARNA CtCt BC200 RNA 상대적 비율 값(2^{(-Δ△ Ct )})BC200 RNA relative ratio value ^{(2 (-Δ △ Ct))} MCF7MCF7 BC200 RNABC200 RNA 12.0412.04 4.724.72 GAPDH mRNAGAPDH mRNA 12.7212.72 HeLaHeLa BC200 RNABC200 RNA 13.1613.16 2.632.63 GAPDH mRNAGAPDH mRNA 12.9912.99 HaCaTHaCaT BC200 RNABC200 RNA 14.1814.18 1One GAPDH mRNAGAPDH mRNA 12.6212.62

표 5 및 표 6에 나타난 바와 같이, 유방암 세포주인 MCF7 세포에서 BC200 RNA의 상대적 비율 값이 높은 것으로 확인하였다. 이러한 결과는 FabBC200-A가 BC200 RNA의 탐지용으로 사용될 수 있음을 의미한다.
As shown in Table 5 and Table 6, it was confirmed that the relative ratio of BC200 RNA was high in MCF7 cells, a breast cancer cell line. These results indicate that FabBC200-A can be used for detection of BC200 RNA.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.It will be understood by those skilled in the art that the foregoing description of the present invention is for illustrative purposes only and that those of ordinary skill in the art can readily understand that various changes and modifications may be made without departing from the spirit or essential characteristics of the present invention. will be. It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive.

<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME <130> DPP20126861KR <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR3 <400> 3 Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Gly 1 5 10 15 Val Trp <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR1 <400> 4 Gln Ser Ile Asn Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR2 <400> 5 Ala Thr Ser 1 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR3 <400> 6 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR1 <400> 7 Gly Tyr Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR2 <400> 8 Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr 1 5 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR3 <400> 9 Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe 1 5 10 15 Asp Ile Trp <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR1 <400> 10 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR2 <400> 11 Arg Asn Asn 1 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR3 <400> 12 Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly 1 5 10 <210> 13 <211> 200 <212> RNA <213> Human <400> 13 ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag 60 gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc 120 agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaua agcguaacuu cccucaaagc 180 aacaaccccc cccccccuuu 200 <210> 14 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor RNA <400> 14 ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc 46 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin oligonucleotide <400> 15 aggatccgac cgtggtgccc t 21 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-BC200-Fwd <400> 16 gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg 37 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-StuI-Rev <400> 17 cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg 60 gggggg 66 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerH <400> 18 gcgaagtcac ccatcagg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerL <400> 19 tagctcactc attaggca 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR1-Up <400> 20 ccggaattca ctctaacc 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR1-Dn <400> 21 gaacctggga gaggacacct gtag 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR2-Up <400> 22 cctctcccag gttcagctgg tgc 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR2-Dn <400> 23 cgatgggccc ttggccgtgc 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR1-Dn <400> 24 gcatttggga gaggacacct gtag 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR2-Up <400> 25 cctctcccaa atgcagctgg tgc 23 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-LC_PCR1_Up <400> 26 gaaggagata ttgtgatgac cc 22 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-LC_PCR2_Up <400> 27 cacaatatct ccttc 15 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-LC_PCR2_Dn <400> 28 cccaagcttc ggcacg 16 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR1_Dn <400> 29 agccaccgta cgtaggacgg tcagcttgg 29 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR1_Up <400> 30 gaaggacagt ctgtgctgac gc 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-LC_PCR2_Up <400> 31 gcacagactg tccttcaaca ccagac 26 <110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> RNA-SPECIFIC BINDING ANTIBODY AND SELECTING METHOD FOR THE SAME <130> DPP20126861 <160> 31 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR1 <400> 1 Gly Tyr Thr Leu Ser Ala Tyr Tyr   1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR2 <400> 2 Ile Asn Pro Arg Gly Gly Arg Thr   1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Heavy Chain CDR3 <400> 3 Cys Ala Ala Arg Gly Ser Pro Arg Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Met Gly   1 5 10 15 Val Trp         <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR1 <400> 4 Gln Ser Ile Asn Asn Tyr   1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR2 <400> 5 Ala Thr Ser   One <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-A Light Chain CDR3 <400> 6 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe   1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR1 <400> 7 Gly Tyr Thr Leu Ser Thr Tyr Tyr   1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR2 <400> 8 Ile Asn Ser Arg Gly Gly Arg Thr   1 5 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Heavy Chain CDR3 <400> 9 Cys Ala Arg Gly Ser Pro Arg Leu Arg Arg Asp Pro Arg Arg Ala Phe   1 5 10 15 Asp Ile Trp             <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR1 <400> 10 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr   1 5 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR2 <400> 11 Arg Asn Asn   One <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FabBC200-B Light Chain CDR3 <400> 12 Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Arg Asn Gly   1 5 10 <210> 13 <211> 200 <212> RNA <213> Human <400> 13 ggccgggcgc gguggcucac gccuguaauc ccagcucuca gggaggcuaa gaggcgggag 60 gauagcuuga gcccaggagu ucgagaccug ccugggcaau auagcgagac cccguucucc 120 agaaaaagga aaaaaaaaaa caaaagacaa aaaaaaaaa agcguaacuu cccucaaagc 180 aacaaccccc cccccccuuu 200 <210> 14 <211> 46 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adapter RNA <400> 14 ggaucgcauu uggacuucug cccgcaaggg caccacgguc ggaucc 46 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin oligonucleotide <400> 15 aggatccgac cgtggtgccc t 21 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-BC200-Fwd <400> 16 gaattctaat acgactcact ataggccggg cgcggtg 37 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Biotin-StuI-Rev <400> 17 cttccggatc cgaccgtggt gcccttgcgg gcagaagtcc aaatgcgatc caaagggggg 60 gggggg 66 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerH <400> 18 gcgaagtcac ccatcagg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrimerL <400> 19 tagctcactc attaggca 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR1-Up <400> 20 ccggaattca ctctaacc 18 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR1-Dn <400> 21 gaacctggga gaggacacct gtag 24 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A-HC_PCR2-Up <400> 22 cctctcccag gttcagctgg tgc 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-HC_PCR2-Dn <400> 23 cgatgggccc ttggccgtgc 20 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR1-Dn <400> 24 gcatttggga gaggacacct gtag 24 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-HC_PCR2-Up <400> 25 cctctcccaa atgcagctgg tgc 23 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > A-LC_PCR1_Up <400> 26 gaaggagata ttgtgatgac cc 22 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > A-LC_PCR2_Up <400> 27 cacaatatct ccttc 15 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uni-LC_PCR2_Dn <400> 28 cccaagcttc ggcacg 16 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > B-LC_PCR1_Dn <400> 29 agccaccgta cgtaggacgg tcagcttgg 29 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > B-LC_PCR1_Up <400> 30 gaaggacagt ctgtgctgac gc 22 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> &Lt; 223 > B-LC_PCR2_Up <400> 31 gcacagactg tccttcaaca ccagac 26

Claims (12)

(a) 고정상 지지체에 표적 RNA를 고정하는 단계;
(b) 상기 고정화된 표적 RNA에 파지 디스플레이-인간 항체 라이브러리를 결합시키는 단계;
(c) 상기 표적 RNA에 결합되지 않은 항체를 발현하는 파아지를 제거하는 단계 및
(d) 효모 전체 RNA(yeast total RNA)를 넣어 상기 표적 RNA에 결합한 항체 발현 파아지를 분리하고 항체를 얻는 단계를 포함하고,
상기 (b) 결합단계, (c) 제거단계 및 (d) 항체를 얻는 단계를 반복하는,
RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 선별방법.
(a) immobilizing target RNA on a fixed bed support;
(b) binding the phage display-human antibody library to the immobilized target RNA;
(c) removing the phage expressing the antibody not bound to the target RNA; and
(d) separating the antibody-expressing phage bound to the target RNA by adding yeast total RNA, and obtaining an antibody,
Repeating the steps of (b) combining, (c) removing, and (d) obtaining the antibody.
A method for screening antibodies that specifically bind to RNA.
제1항에 있어서, 상기 (b) 결합단계, (c) 제거단계 및 (d) 항체를 얻는 단계를 1 내지 5회 반복하는 것인 선별방법.The selection method according to claim 1, wherein the step (b), the step (c), and the step (d) are repeated one to five times. 제1항에 있어서, 상기 표적 RNA는 BC200 RNA인 선별방법.The selection method according to claim 1, wherein the target RNA is BC200 RNA. BC200 RNA에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 상보성결정영역 1 (CDR1), 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H) 및,
서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는;
상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 중쇄 가변영역(V_H) 및,
서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 함유하는 경쇄 가변영역(V_L)을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
An antibody or antigen-binding fragment thereof, which specifically binds to BC200 RNA,
The antibody heavy chain variable region (V _H) containing CDR3 having the amino acid sequence of CDR2 and SEQ ID NO: 3 having the amino acid sequence of the complementarity determining region 1 (CDR1) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and,
An antibody or antigen-binding fragment comprising a light chain variable region (V _L ) comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6;
The antibody comprises a heavy chain variable region (V _H ) comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO:
An antibody or antigen-binding fragment comprising a light chain variable region (V _L ) comprising CDR1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, CDR2 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and CDR3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO:
삭제delete 삭제delete 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 및 F(ab')₂로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 항원 결합 단편.5. The antibody or antigen-binding fragment of claim 4, wherein the antibody or antigen-binding fragment is selected from the group consisting of scFv, (scFv) ₂ , Fab, Fab 'and F (ab') ₂ . 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
A nucleotide sequence encoding a heavy chain complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3; And a nucleic acid molecule encoding a heavy chain complementarity determining region (CDR) of an antibody that specifically binds to BC200 RNA, comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence.
서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
A nucleotide sequence encoding a light chain complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6; And a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining region (CDR) of an antibody that specifically binds to BC200 RNA, comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence.
서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
A nucleotide sequence encoding a heavy chain complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; And a nucleic acid molecule encoding a heavy chain complementarity determining region (CDR) of an antibody that specifically binds to BC200 RNA, comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence.
서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성결정영역 (CDR)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 상기 뉴클레오티드 서열의 상보적 서열을 포함하고, BC200 RNA에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 상보성결정영역(CDR)을 코딩하는 핵산분자.
A nucleotide sequence encoding a light chain complementarity determining region (CDR) having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12; And a nucleic acid molecule encoding a light chain complementarity determining region (CDR) of an antibody that specifically binds to BC200 RNA, comprising a complementary sequence of the nucleotide sequence.
제4항 및 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 BC200 RNA 탐지용 조성물.A composition for detecting BC200 RNA comprising the antibody or antigen-binding fragment of any one of claims 4 and 7.

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