KR101481782B1 - Mutant Strain with improved Amino acid production by inactivating GOGAT - Google Patents

Abstract

본 발명은 불활성화 GOGAT(glutamate synthase)를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시킴으로써 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주보다 생육이 저하되지 않으면서 글루타민(Glutamine) 및 알기닌(Arginine) 생산능이 향상된 변이 균주를 제조하여 고농도 글루타민 및 고농도 알기닌을 생산할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a mutant strain of glutamine or arginine tyrosinase comprising an inactivated GOGAT (glutamate synthase) and a method for producing the same. According to the present invention, by inactivating GOGAT (glutamate synthase), a mutant strain having improved glutamine (glutamine) and arginine production ability is produced without lowering the growth of glutamine or arginine producing ability including wild type or activated GOGAT High concentration of glutamine and high concentration of arginine.

Description

GOGAT의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주{Mutant Strain with improved Amino acid production by inactivating GOGAT}{Mutant Strain with improved amino acid production by inactivating GOGAT}

본 발명은 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시킴으로써 글루타민(Glutamine) 및 알기닌(Arginine) 생산능이 향상된 변이 균주에 관한 것이다.
The present invention relates to a mutant strain in which glutamine (Glutamine) and arginine production ability is improved by inactivating GOGAT (glutamate synthase).

L-글루타민은 L-글루타민산 계열 아미노산의 일종으로, 최근 들어 세포재생 능력에 효과가 있는 것으로 확인되면서 화장품 원료로 수요가 늘고 있으며 노화방지에 대한 연구도 계속되고 있다. 그밖에도 L-글루타민은 영양제, 소화기 궤양 치료제, 알콜중독 치료제 및 뇌기능 향상제 등 의약용으로 꾸준히 이용되어 오고 있다. 한편, L-글루타민은 원래 필수아미노산이 아닌 것으로 분류되어 왔으나, 근래에 들어 필수아미노산의 기능성을 갖게 되는 컨디셔날 필수아미노산(Conditional Essential Amino acid)으로 확인되어 그 중요성이 한층 강조되고 있는 실정이다. L-glutamine is a kind of L-glutamic acid-based amino acid. Recently, it has been confirmed that it has an effect on the cell regeneration ability, and therefore, there is an increasing demand for cosmetic raw materials and studies on anti-aging are continuing. In addition, L-glutamine has been used for medicines such as nutritional supplement, digestive ulcer treatment, alcohol addiction treatment, and brain function improving agent. On the other hand, L-glutamine has been classified as not being an essential amino acid, but recently it has been identified as Conditional Essential Amino acid which has essential amino acid functionality, and its importance is emphasized.

L-아르기닌은 의약품, 식품, 기타 동물 사료 등에 널리 이용되는 천연 아미노산의 일종으로 의약용으로는 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품 용도로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가용, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광을 받고 있는 물질이다. L-arginine is a natural amino acid widely used in pharmaceuticals, foods, and other animal feeds. It is used for medicinal purposes such as liver function promoter, brain function promoter, male infertility treatment, and synthetic amino acid preparation. It is a substance that has recently come into the spotlight for the addition of health drinks and for replacing salty foods in patients with hypertension.

아미노산 생산 균주를 개발하기 위한 방법은 종래 기술로부터 여러 가지가 있었다. 가장 일반적인 아미노산 생산 균주 개발법으로는 돌연변이법을 이용한 중간대사산물 또는 최종산물에 대한 내성주 선별법, 염색체 변이를 통한 목적 산물 생산 조절 유전자의 활성, 결실 또는 강화 등이 있다. 즉, 돌연변이법 이용으로는 아미노산의 유사 구조체에 대한 내성을 가지는 변이주를 선별하는 방법이 적용될 수 있다. 또한 목적산물 이외의 분지점에 해당하는 생합성 경로의 활성을 감소시키거나 차단하는 방법, 또는 목적산물로의 생합성 경로를 강화하는 방법 등 생합성 경로를 조절하는 효소를 활성, 결실 또는 강화하는 방법이 있다. 하지만 이러한 경우 원치 않는 돌연변이가 생겨 생육 저하 및 피드백 억제(feedback inhibition)로 목적 산물 생산이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. Methods for developing an amino acid producing strain have been various from the prior art. The most common methods for the production of amino acid producing strains include resistance to intermediate metabolites or end products using the mutagenesis method, and the activity, deletion or enhancement of the gene for regulating production of the target product through chromosome mutation. That is, a method of selecting a mutant having resistance to a similar structure of amino acid can be applied by using the mutation method. There is also a method of activating, deleting or enhancing an enzyme that regulates a biosynthetic pathway, such as a method of reducing or blocking the activity of a biosynthetic pathway corresponding to a branch point other than a target product, or a method of enhancing a biosynthetic pathway to a target product . However, in such cases, undesirable mutations may occur, resulting in degradation of growth and feedback inhibition, which may result in a decrease in the production of the desired product.

본 발명에서 결실을 시킨 gltB 유전자는 GOGAT(glutamate synthase)를 코딩하는 유전자인 gltBD 중 라지 서브유닛(large subunit)에 해당하는 유전자로 글루탐산을 합성하는 효소를 코딩한다. 글루탐산은 글루타민 생산에 있어 주요 부산물 중 하나이다. 따라서 글루탐산을 합성하는 효소를 불활성화 시킴으로써 글루타민 생산성을 증대시키고자 하였다.The gltB gene deleted in the present invention encodes an enzyme which synthesizes glutamic acid as a gene corresponding to a large subunit of gltBD which is a gene encoding GOGAT (glutamate synthase). Glutamic acid is one of the major by-products of glutamine production. Therefore, we intend to increase the glutamine productivity by inactivating the enzyme that synthesizes glutamic acid.

또한 글루타민으로부터 생성되는 카바모일인산(Carbamoyl phosphate)은 알기닌 합성에 사용되므로, GOGAT 불활성화 균주를 이용하여 알기닌 생산성을 증대시키고자 하였다(도 1a 및 도 1b 참조).
Carbamoyl phosphate, which is produced from glutamine, is also used for the synthesis of arginine. Therefore, it is intended to increase the productivity of arginine by using a GOGAT inactivating strain (see FIGS. 1A and 1B).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 글루타민 및 알기닌의 생산성을 높이기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 유전자 재조합 기술을 이용하여 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시키는 경우 글루타민 생산에 있어 주요 부산물 중 하나인 글루탐산의 합성을 감소시켜 글루타민의 생산성을 증가시킬 뿐만 아니라, 글루타민으로부터 생성되는 카바모일인산(Carbamoyl phosphate)은 알기닌 합성에 사용되므로 알기닌의 생산성 또한 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made extensive efforts to develop a method for increasing the productivity of glutamine and arginine. As a result, inactivation of GOGAT (glutamate synthase) using gene recombination technology not only increases the productivity of glutamine by decreasing the synthesis of glutamic acid, which is one of the main by-products of glutamine production, (Carbamoyl phosphate) is used for the synthesis of arginine, so that the productivity of arginine can be improved. Thus, the present invention has been completed.

따라서 본 발명의 목적은 불활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주를 제공하는 데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a glutamine or arginine hypertrophic mutant strain containing an inactivated GOGAT.

본 발명의 다른 목적은 GOGAT를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a mutant strain of glutamine or arginine hyperproliferation comprising a step of inactivating GOGAT.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 고농도 글루타민 또는 고농도 알기닌을 생산하는 방법을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a method for producing high-concentration glutamine or high-concentration arginine comprising culturing a mutant strain of the present invention.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 불활성화 GOGAT(glutamate synthase)를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주를 제공한다.
According to one aspect of the present invention, there is provided a mutant strain of glutamine or arginine hyperpolarity comprising an inactivated GOGAT (glutamate synthase).

본 발명자들은 글루타민 및 알기닌의 생산성을 높이기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시킨 변이 균주의 글루타민 및 알기닌의 생산성이 향상된 사실을 확인하였다.The present inventors have made extensive efforts to develop a method for increasing the productivity of glutamine and arginine. As a result, it was confirmed that the productivity of glutamine and arginine of the mutant strain inactivated GOGAT (glutamate synthase) was improved.

본 발명자들은 유전자 재조합 기술을 이용하여 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시키는 경우 글루타민 생산에 있어 주요 부산물 중 하나인 글루탐산의 합성을 감소시켜 글루타민의 생산성을 증가시킬 뿐만 아니라, 글루타민으로부터 생성되는 카바모일인산(Carbamoyl phosphate)은 알기닌 합성에 사용되므로 알기닌의 생산성 또한 향상시킬 수 있음을 확인하였다. The present inventors have found that when GOGAT (glutamate synthase) is inactivated using a gene recombination technique, it not only increases the productivity of glutamine by reducing the synthesis of glutamic acid, which is one of the main by-products of glutamine production, (Carbamoyl phosphate) was used for the synthesis of arginine, so that the productivity of arginine was also improved.

본 발명에서 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주를 표현하면서 사용하는 용어 "불활성화"는 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드를 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 단백질의 발현을 억제시키는 것을 의미한다.In the present invention, the term "inactivated " used in expressing the mutant strain of glutamine or arginine is a means of inhibiting the expression of the protein by substitution, insertion, deletion, or a combination of nucleotides encoding the gene.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 GOGAT가 불활성화된 변이 균주를 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실에 의하여 GOGAT가 불활성화된 변이 균주를 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실에 의하여 GOGAT가 불활성화된 변이 균주를 의미한다.According to one embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine or arginine hyperproliferative activity of the present invention refers to a mutant strain in which GOGAT is inactivated by substitution, insertion, deletion, or a combination of nucleotide sequences encoding the gltB gene. According to another embodiment of the present invention, the glutamine or arginine hyperproliferation strain of the present invention means a mutant strain in which GOGAT is inactivated by complete or partial deletion of a nucleotide sequence encoding a gltB gene. According to a specific embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine or arginine hyperpolarity of the present invention means a mutant strain in which GOGAT is inactivated by partial deletion of a nucleotide sequence encoding a gltB gene.

본 발명은 야생형(wild type) 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주를 모균주로 하여 GOGAT를 불활성화 시킨 균주이며, GOGAT를 발현하거나 GOGAT의 효소 활성을 포함하고 있는 균주라면 모균주로 제한 없이 이용이 가능하다.The present invention is a strain in which GOGAT has been inactivated using a wild-type or activated GOGAT-containing glutamine or arginine producing ability strain as a parent strain, and a strain expressing GOGAT or containing an enzyme activity of GOGAT is a parent strain It is available without limit.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 마이크로코커스(Micrococcus) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속, 페닐실리움 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아쓰로박터(Arthrobacter) 속, 세라티아(Serratia) 속, 캔디다(Candida) 속, 에어로박터 에어로겐스(Aerobacter aerogenes), 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 에르위니아(Erwinia) 속 및 판토에아(Pantoea) 속으로 이루어진 군으로부터 선택된 균주이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속 또는 마이크로박테리움 속이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium), 코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 임마리오필럼(Brevibacterium immariophilum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum), 브레비박테리움 사카로리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum), 브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album), 브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum), 마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum)이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 아세토액시도필럼, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰, 코리네박테리움 알카노리티쿰, 코리네박테리움 칼루내, 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 릴리움, 코리네박테리움 멜라쎄콜라, 코리네박테리움 써모아미노게네스, 코리네박테리움 에피시엔스, 코리네박테리움 헤르쿨리스이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이다.According to one embodiment, the glutamine suffering sanneung mutant strain of the present invention is Corynebacterium (Corynebacterium) genus Brevibacterium (Brevibacterium), A micro Rhodococcus (Micrococcus), A micro tumefaciens (Microbacterium) genus Pseudomonas spp., Arthrobacter spp., Serratia spp., Candida spp., Aerobacter aerogenes spp., Klebsiella spp., Bacillus spp., Streptomyces spp., Phenylsilium spp., Pseudomonas spp. Klebsiella spp., Erwinia spp., And Pantoea spp. According to another embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine hyperproliferation of the present invention is a genus of Corynebacterium, Brevibacterium or Microbacterium. According to a specific embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine hyperproliferative activity of the present invention is selected from the group consisting of Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Priority Qom (Corynebacterium alkanolyticum), Corynebacterium Kaluga I (Corynebacterium callunae), Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum), Corynebacterium lilium (Corynebacterium lilium), Corynebacterium Melaka Ste-cola (Corynebacterium melissecola, Corynebacterium thermoaminogenes , Corynebacterium efficiens, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium divaricatum, ), Brevibacterium flavum , Brevibacterium immar iophilum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium roseum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium album, Brevibacterium cerinum, Microbacterium ammoniaphilum, and the like . According to any embodiment of the invention, glutamine suffering sanneung mutant strain of the present invention is Corynebacterium acetonitrile solution attempts pilreom, Corynebacterium acetonitrile glutamicum, Corynebacterium alkanoyl utility glutamicum, Corynebacterium Kalou it, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium Lilium, Corynebacterium melanoma theta coke, Corynebacterium thermo amino to Ness, Corynebacterium epi when Enschede, Corynebacterium Herr cool is less . According to another embodiment of the present invention, the glutamine hyperproliferation strain of the present invention is Corynebacterium glutamicum .

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum), 코리네박테리움 써모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenaes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)이다.According to one embodiment of the present invention, the arginine hyperproliferation strain of the present invention is a genus of Corynebacterium or Brevibacterium . According to another embodiment of the present invention, the arginine hyperproliferation strain of the present invention is a strain of Corynebacterium glutamicum , Corynebacterium acetoglutamicum , Corynebacterium acetoacidosum, pilreom (Corynebacterium acetoacidophilum), Corynebacterium Thermo amino jeneseu (Corynebacterium thermoaminogenaes), Brevibacterium Playa boom (Brevibacterium flavum), Brevibacterium lactofermentum (Brevibacterium lactofermentum), Brevibacterium Diva Rica Tomb (Brevibacterium divaricatum ).

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032이다.According to a specific embodiment of the present invention, the arginine hyperproliferation strain of the present invention is Corynebacterium glutamicum. According to another embodiment of the present invention, the Corynebacterium glutamicum is Corynebacterium glutamicum ATCC13032.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필럼 ATCC13870, 코리네박테리움 써모아미노제네스FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 ATCC13869, 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC14020이다. According to a specific embodiment of the present invention, the arginine hyperproliferation strain of the present invention is selected from the group consisting of Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogens FERM BP-1539, Brevibacterium flavumum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium divaricatum ATCC14020.

본 명세서의 용어 "고생산능"은 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주로부터 생산되는 글루타민 또는 알기닌의 생산량보다 증가된 양의 글루타민 또는 알기닌을 생산할 수 있는 능력을 의미한다.As used herein, the term " hypertrophic ability "refers to the ability to produce an increased amount of glutamine or arginine from the production of glutamine or arginine produced from a glutamine or arginine producing ability strain containing wild type or activated GOGAT.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 생산능 균주와 비교하여 글루타민의 생산능이 10-70%, 10-65%, 10-60% 또는 10-55% 증가된 균주이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 생산능 균주와 비교하여 글루타민의 생산능이 15-70%, 20-70%, 23-70%, 23-65%, 23-60% 또는 23-55% 증가된 균주이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 생산능 균주와 비교하여 글루타민의 생산능이 15-65%, 20-65%, 20-60% 또는 20-55% 증가된 균주이다.According to one embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine hyperproliferative activity of the present invention has 10-70%, 10-65%, 10-60% of glutamine production ability in comparison with the glutamine production ability strain including wild type or activated GOGAT, Or 10-55% increased strains. According to another embodiment of the present invention, the glutamine antagonistic activity mutant strain of the present invention has the ability to produce glutamine in an amount of 15-70%, 20-70%, 23-70% , 23-65%, 23-60%, or 23-55%. According to a specific embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine hyperproliferative activity of the present invention is characterized in that the production ability of glutamine is 15-65%, 20-65%, 20-60% Or 20-55% increased strains.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 알기닌 생산능 균주와 비교하여 알기닌의 생산능이 1-15%, 1-10%, 1-8% 또는 1-7% 증가된 균주이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 알기닌 생산능 균주와 비교하여 알기닌의 생산능이 1.5-15%, 2-15%, 2.5-15%, 2.5-10%, 2.5-8% 또는 2.5-7% 증가된 균주이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 고생산능 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 생산능 균주와 비교하여 글루타민의 생산능이 1.5-10%, 1.5-8%, 2-8% 또는 2-7% 증가된 균주이다.
According to one embodiment of the present invention, the arginine-producing mutant strain of the present invention has an ability to produce arginine in an amount of 1-15%, 1-10%, 1-8% Or 1-7% increased strains. According to another embodiment of the present invention, the arginine-producing strain of the present invention has an ability to produce arginine in an amount of 1.5-15%, 2-15%, 2.5-15% , 2.5-10%, 2.5-8%, or 2.5-7%. According to a specific embodiment of the present invention, the mutant strain of glutamine hyperproliferative activity of the present invention has a production capacity of glutamine of 1.5-10%, 1.5-8%, 2-8% or higher, in comparison with a wild-type or activated GOGAT- Or 2-7% increased strains.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 GOGAT를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주의 제조방법을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for producing a mutant strain of glutamine or arginine hyperproliferation comprising the step of inactivating GOGAT.

본 발명은 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주를 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 GOGAT를 불활성화 시키는 것이 가능하다.It is possible to inactivate GOGAT by a known recombinant method using glutamine or arginine producing ability including wild type or activated GOGAT.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 GOGAT를 억제시키는 것을 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 불활성화는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 완전 또는 부분 결실에 의하여 GOGAT를 억제시키는 것을 의미한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주는 gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 부분 결실에 의하여 GOGAT를 억제시키는 것을 의미한다.According to one embodiment of the present invention, the inactivation of the present invention means that GOGAT is inhibited by substitution, insertion, deletion, or a combination of nucleotide sequences encoding the gltB gene. According to another embodiment of the present invention, the inactivation of the present invention means that GOGAT is inhibited by complete or partial deletion of the nucleotide sequence encoding the gltB gene. According to a specific embodiment of the present invention, the glutamine or arginine hyperpolarity mutant strain of the present invention means to inhibit GOGAT by partial deletion of the nucleotide sequence encoding the gltB gene.

글루타민 또는 알기닌 생합성에 관련된 GOGAT를 암호화 하는 유전자 gltB를 염색체상에서 결실시키기 위하여 재조합 플라스미드 pK19mobsacB::ΔgltB를 이용한다(도 2a 및 도 2b).The recombinant plasmid pK19mobsacB :: ΔgltB is used to delete the gene gltB coding for glutamine or arginine biosynthesis on the chromosome (FIGS. 2A and 2B).

본 발명에서 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주에 형질전환 시키는 단계는 공지된 방법을 통하여 실시될 수 있다. 예컨대, 전기 천공 방법(van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999) 등에 의해 실시될 수 있다.In the present invention, the step of transforming a strain capable of producing glutamine or arginine including wild type or activated GOGAT can be carried out by a known method. For example, it can be carried out by an electroporation method (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999).

또한, 본 발명은 형질전환이 되지 않은 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주로부터 형질 전환된 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 포함한다.In addition, the present invention includes a step of isolating and obtaining a mutant strain transformed from a glutamine or arginine-producing ability strain containing wild-type or activated GOGAT that has not been transformed.

상기 본 발명에서 형질전환이 되지 않은 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주 균주로부터 형질전환된 변이 균주를 분리 및 수득하는 단계를 실시하는데 있어서 선택 표지된 벡터를 이용할 수 있다. In the present invention, a selectably-labeled vector may be used in carrying out the step of isolating and obtaining a mutant strain transformed from a strain of glutamine or arginine-producing ability that has not been transformed.

또한, 본 발명에서 이용하는 벡터는 플라스미드 또는 파지(phage)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the vector used in the present invention includes, but is not limited to, a plasmid or a phage.

본 발명에서 이용하는 선택 표지는 당업계에서 통상적으로 이용되는 카나마이신, 클로람페니콜 같은 항생제 내성 유전자와 고초균 유래 SacB 유전자의 산물인 레반슈크라제(levansucrase)를 포함한다.Selection markers used in the present invention include levansucrase, which is an antibiotic resistance gene such as kanamycin, chloramphenicol and the product of Sacb gene derived from Bacillus subtilis, which is commonly used in the art.

본 발명의 제조방법은 상술한 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주와 동일한 균주를 제조하는 방법이며, 불활성화의 대상이 되는 단백질(GOGAT) 및 관련 유전자(gltB)를 공통으로 하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
The production method of the present invention is a method for producing the same strain as the glutamine or arginine-spontaneous mutant strain described above. Since the protein (GOGAT) to be inactivated and the related gene ( gltB) are common, The common description is omitted in order to avoid the excessive complexity of the present specification.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 고농도 글루타민 또는 고농도 알기닌 생산방법을 제공한다.According to still another aspect of the present invention, there is provided a method for producing high-concentration glutamine or high-concentration arginine comprising culturing a mutant strain of the present invention.

본 발명은 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주 및 변이 균주의 전배양 또는 종배양 하는데 있어서 공지된 배양 방법을 통해 배양할 수 있다.The present invention can be cultured through a known culture method for pre-culturing or seeding a glutamine or arginine-producing ability strain and a mutant strain.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 25-35℃에서 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 28-32℃에서 실시한다. According to one embodiment of the present invention, the cultivation of the present invention is carried out at 25-35 占 폚. According to another embodiment of the invention, the incubation of the invention is carried out at 28-32 < 0 > C.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 교반속도 100-600 rpm에서 실시한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 교반속도 100-200 rpm 또는 400-600 rpm에서 실시한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 본 발명의 글루타민 고생산능 변이균주를 배양하는 경우 교반속도 400-600 rpm 또는 알기닌 고생산능 변이균주를 배양하는 경우 교반속도 100-200 rpm에서 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 배양은 본 발명의 글루타민 고생산능 변이균주를 배양하는 경우 교반속도 450-550 rpm 또는 알기닌 고생산능 변이균주를 배양하는 경우 교반속도 140-180 rpm에서 실시한다. According to one embodiment of the present invention, the culture of the present invention is carried out at a stirring speed of 100-600 rpm. According to another embodiment of the present invention, the culture of the present invention is carried out at a stirring speed of 100-200 rpm or 400-600 rpm. According to a specific embodiment of the present invention, the culture of the present invention is carried out at a stirring speed of 400-600 rpm when culturing the mutant strain of glutamine hyperpolarizing activity of the present invention, or at a stirring speed of 100-200 rpm when cultivating an arginine tyrosinic acid mutant strain do. According to some embodiments of the present invention, the culture of the present invention is carried out at a stirring speed of 450-550 rpm when culturing the mutant strain of glutamine hyperpolarizing activity of the present invention, or at a stirring speed of 140-180 rpm when cultivating the arginine tyrosinic acid mutant strain do.

본 발명에 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있으며, 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. As the carbon source of the culture medium, for example, glucose, sucrose, dextrin, glycerol, starch and the like can be used. As the nitrogen source, peptone, meat extract, yeast extract, dried Yeast, soybean cake, urea, thiourea, ammonium salt, nitrate and other organic or inorganic nitrogen-containing compounds may be used, but are not limited to these components.

배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. Examples of inorganic salts contained in the medium include, but are not limited to, phosphates such as magnesium, manganese, potassium, calcium and iron, nitrates, carbonates, chlorides and the like.

상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.Amino acids, vitamins, nucleic acids and related compounds may be added to the medium in addition to the carbon source, the nitrogen source and the components of the inorganic salt.

본 명세서의 용어 "생산수율"은 탄소원 및 에너지원으로 사용된 포도당에 대한 글루타민 또는 알기닌의 생산량(중량/중량) 비율을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민은 생산수율이 20-70%, 20-65%, 20-60% 또는 20-55%이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민은 생산수율이 25-70%, 30-70%, 35-70% 또는 40-70%이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민은 생산수율이 25-65%, 30-60%, 35-55% 또는 40-55%이다.The term "production yield" as used herein means the ratio (weight / weight) of production of glutamine or arginine to glucose used as carbon source and energy source. According to one embodiment of the present invention, the production yield of glutamine of the present invention is 20-70%, 20-65%, 20-60% or 20-55%. According to another embodiment of the present invention, the production yield of glutamine of the present invention is 25-70%, 30-70%, 35-70% or 40-70%. According to certain embodiments of the present invention, the production yield of glutamine of the present invention is 25-65%, 30-60%, 35-55%, or 40-55%.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 알기닌은 생산수율이 10-30%, 10-25% 또는 10-20%이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 글루타민은 생산수율이 15-30%, 15-25% 또는 18-22%이다.According to one embodiment of the present invention, the arginine of the present invention has a production yield of 10-30%, 10-25%, or 10-20%. According to another embodiment of the present invention, the production yield of glutamine of the present invention is 15-30%, 15-25%, or 18-22%.

본 발명은 상기 GOGAT 불활성화 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주와 동일한 균주 및 균주제조 방법을 이용하여 고농도 글루타민 또는 고농도 알기닌을 생산하는 방법이므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
Since the present invention is a method for producing high-concentration glutamine or high-concentration arginine using the same strain and method for producing strain GOGAT-inactivated glutamine or arginine hyperproliferation mutant, common content between them is used in order to avoid the excessive complexity of the present invention , The description thereof is omitted.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 생산한 글루타민 또는 알기닌을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides glutamine or arginine produced using the method of the present invention.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 불활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 고생산능 변이 균주 및 이의 제조방법을 제공한다.(a) The present invention provides a mutant strain of glutamine or arginine-bearing ability containing inactivated GOGAT and a method for producing the same.

(b) 본 발명은 본 발명의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 고농도 글루타민 또는 고농도 알기닌을 생산하는 방법을 제공한다.(b) The present invention provides a method for producing high-concentration glutamine or high-concentration arginine comprising culturing a mutant strain of the present invention.

(c) 본 발명은 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시킴으로써 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 균주보다 생육이 저하되지 않으면서 글루타민 및 알기닌 생산능이 향상된 변이 균주를 제조하여 고농도 글루타민 및 고농도 알기닌을 생산할 수 있는 효과가 있다.(c) Inactivating glutamate synthase (GOGAT) to produce glutamine and arginine-producing mutant strains without lowering the growth of glutamine or arginine-producing strains containing wild-type or activated GOGAT, It has an effect of producing arginine.

(d) 본 발명은 본 발명의 변이 균주를 이용하여 고농도의 글루타민 또는 알기닌 생산이 가능한바, 글루타민 또는 알기닌이 원료로 사용되는 경우에 있어 원가 절감의 이점이 있다.
(d) The present invention can produce a high concentration of glutamine or arginine using the mutant strains of the present invention, and advantageous in cost reduction when glutamine or arginine is used as a raw material.

도 1a 및 1b는 글루타민(도 1a) 또는 알기닌(도 1b)의 생합성 경로를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 gltB 유전자 결실벡터 제조과정(도 2a) 및 gltB 유전자 결실벡터(도 2b)를 나타낸다. 글루타민 생산균주의 경우 GMgltB-F(HindⅢ), GMgltB-R(Fu), GMgltB-F(Fu), GMgltB-R(HindⅢ), GMgltB-cf 및 GMgltB-cr를 프라이머를 사용하였고, 알기닌 생산균주의 경우 ARGgltB-F(HindⅢ), ARGgltB-R(Fu), ARGgltB-F(Fu), ARGgltB-R(HindⅢ), ARGgltB-cf 및 ARGgltB-cr 프라이머를 사용하였다.Figures 1a and 1b show biosynthetic pathways for glutamine (Figure la) or arginine (Figure lb).
Figures 2a and 2b show the gltB gene deletion vector preparation process (Figure 2a) and the gltB gene deletion vector (Figure 2b). For the glutamine production strains, primers were used for GMgltB- F (HindIII), GMgltB- R (Fu), GMgltB- F (Fu), GMgltB- R (HindIII), GMgltB -cf and GMgltB- ARGgltB-F (HindIII), ARGgltB-R (Fu), ARGgltB-F (Fu), ARGgltB-R (HindIII), ARGgltB-cf and ARGgltB-cr primers were used.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
Throughout this specification, "%" used to denote the concentration of a particular substance is intended to include solids / solids (wt / wt), solid / liquid (wt / The liquid / liquid is (vol / vol)%.

실시예 1: Example 1: gltBgltB 유전자가 결실된 변이주 제조 Production of a mutant strain in which a gene is deleted

gltB 유전자를 상동성 재조합 방법(homologous recombination)으로 결실시켰다. 결실하고자 하는 gltB 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(코리네박테리움 글루타미쿰 365) 및 서열번호 2(코리네박테리움 글루타미쿰 ARP)와 같다. The gltB gene was deleted by homologous recombination. The nucleotide sequence of the gltB gene to be deleted is the same as SEQ ID NO: 1 (Corynebacterium glutamicum 365) and SEQ ID NO: 2 (Corynebacterium glutamicum ARP).

위자드 지노믹 DNA 정제 키트(Wizard Genomic DNA Purification Kit, 프로메가, 미국)를 이용하여 글루타민 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 365(기탁번호 KFCC-10694) 및 알기닌 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 균주(기탁번호 ATCC 21831)를 변이 처리(예컨대, 자외선 조사 또는 MNNG(N-methyl-N'-nitrosoguanidine)처리)하여 알기닌 하이드록사메이트(L-Arginie hydroxamate hydrochloride, 시그마, 미국)에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ARP의 염색체 DNA(지노믹 DNA)를 분리하였다. 상기 알기닌 생산 균주를 변이 처리하여 알기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 균주를 분리하는 방법은 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제 10-0052645호 및 대한민국 등록특허 제 10-0055145호에 상세하게 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Corynebacterium glutamicum 365 (Accession No. KFCC-10694), which is a glutamine producing strain, and Corynebacterium glue, which is an arginine producing strain, were cultured using a Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) (Resistant to L-Arginie hydroxamate hydrochloride (Sigma, USA)) by mutagenizing (for example, UV irradiation or MNNG (N-methyl-N'- nitrosoguanidine) treatment) a Staphylococcus aureus strain (Accession No. ATCC 21831) The chromosomal DNA (genomic DNA) of Corynebacterium glutamicum ARP was isolated. Methods for isolating strains resistant to arginine hydroxamate by mutating the arginine producing strains have been described in detail in Korean Patent Registration No. 10-0052645 and Korean Patent Registration No. 10-0055145 of the present inventors, Incorporated herein by reference.

상기 염색체 DNA를 주형(template)으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 결실된 형태의 gltB DNA 절편 1173bp(주형: 코리네박테리움 글루타미쿰 365) 및 999bp(주형: 코리네박테리움 글루타미쿰 ARP)를 증폭하였다.Using the chromosomal DNA as a template, the deleted gltB DNA fragment of 1173 bp (template: Corynebacterium glutamicum 365) and 999 bp (template: Corynebacterium glutamicum) were obtained by polymerase chain reaction (PCR) KUM ARP).

gltB 결실 균주를 제작하기 위해서 하기 표 1에서의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응(총 반응 부피는 50 ㎕, 94℃에서 5분 1 사이클 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분 총 30 사이클 및 그 후 72℃에서 5분)을 수행하였다. 1 차 PCR 산물을 획득 후 오버랩 PCR(overlap PCR)을 수행하여 최종 PCR 산물인 1173bp(GMgltB-cf 및 GMgltB-cr 이용) 및 999bp(ARGgltB-cf 및 ARGgltB-cr 이용) 각각을 우선적으로 pGEMT-이지 벡터(T-벡터, 프로메가, 미국)에 클로닝 하였다. To prepare gltB- deficient strain, PCR reaction (total reaction volume: 50 ,, 5 min, 1 cycle at 94 째 C, 30 sec at 94 째 C, 30 sec at 55 째 C, 72 째 C For a total of 30 cycles for 2 minutes and then 5 minutes at 72 < 0 > C). After obtaining the first PCR products, overlap PCR was performed to obtain final PCR products of 1173 bp (using GMgltB -cf and GMgltB -cr) and 999 bp (using ARGgltB-cf and ARGgltB-cr ) Vector (T-vector, Promega, USA).

T-벡터에 포함된 형태의 gltB를 제한효소 HindⅢ로 처리하였으며, 최종 벡터 제조를 위하여 pK19mobsacB 벡터 역시 같은 제한효소를 처리하고 난 후 이를 연결(ligation)하였다. 연결 반응은 연결 키트 버전 2.1(Ligation kit Ver 2.1, 다카라, 일본)을 사용하였다. GltB in the form of T-vector was treated with restriction enzyme HindIII, and pK19mobsacB vector was treated with the same restriction enzyme for ligation. The coupling reaction was performed using a link kit version 2.1 (Ligation kit Ver. 2.1, Takara, Japan).

완성된 벡터는 전기충격요법(electroporation)으로 글루타민 및 알기닌 생산균주에 도입하였다. 최종 후보주는 표 1의 프라이머쌍(글루타민 생산균주의 경우 GMgltB-cf 및 GMgltB-cr, 알기닌 생산균주의 경우 ARGgltB-cf 및 ARGgltB-cr)을 이용하여 gltB 유전자가 결실되었는지 확인하였다.The completed vector was introduced into the glutamine and arginine producing strains by electroporation. In the final candidate strain, the gltB gene was deleted by using the primer pair shown in Table 1 ( GMgltB -cf and GMgltB -cr for the glutamine producing strain, and ARGgltB-cf and ARGgltB-cr for the arginine producing strain).

글루타민 및 알기닌을 분석하기 위하여 배양액을 증류수로 100배 희석하고 0.45 μm 여과막으로 여과한 다음 컬럼(Universal Cation HR 3u, 100 mm, Part No. 23100)과 자외선 검출기(195 nm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하였다. For the analysis of glutamine and arginine, the culture was diluted 100 times with distilled water, filtered through a 0.45 μm filter membrane, and then subjected to high performance liquid chromatography with a column (Universal Cation HR 3u, 100 mm, Part No. 23100) and ultraviolet detector (195 nm) (HPLC) was used.

프라이머primer 염기서열 (5'→ 3')The base sequence (5 '- > 3') GMgltB-F(HindⅢ) GMgltB- F (HindIII) CCC AAG CTT GGG TGG CGT AGA TAA CTGCCC AAG CTT GGG TGG CGT AGA TAA CTG GMgltB-R(Fu) GMgltB- R (Fu) CCA CAA GTC CAG AAT CAG GCG ATT CCT GTT GCG TACCCA CAA GTC CAT AAT CAG GCG ATT CCT GTT GCG TAC GMgltB-F(Fu) GMgltB- F (Fu) GTA CGC AAC AGG AAT CGC CTG ATT CTG GAC TTG TGGGTA CGC AAC AGG AAT CGC CTG ATT CTG GAC TTG TGG GMgltB-R(HindⅢ) GMgltB- R (HindIII) CCC AAG CTT CAG GAT TGC CAG CTC ATGCCC AAG CTT CAG GAT TGC CAG CTC ATG GMgltB-cf GMgltB -cf GGC TGG CAC ATT CAA AGGGGC TGG CAC ATT CAA AGG GMgltB-cr GMgltB -cr CTG ATT CCA CCA CCA ACGCTG ATT CCA CCA CCA ACG ARGgltB-F(HindⅢ) ARGgltB-F (HindIII) CCC AAG CTT GGG TGG CGT AGA TGA TTGCCC AAG CTT GGG TGG CGT AGA TGA TTG ARGgltB-R(Fu)ARGgltB-R (Fu) CGC GAA TCC ACT CAC CAT GCA ATA CCA GTG GCA TACCGC GAA TCC ACT CAC CAT GCA ATA CCA GTG GCA TAC ARGgltB-F(Fu)ARGgltB-F (Fu) GTA TGC CAC TGG TAT TGC ATG GTG AGT GGA TTC GCGGTA TGC CAC TGG TAT TGC ATG GTG AGT GGA TTC GCG ARGgltB-R(HindⅢ) ARGgltB-R (HindIII) CCC AAG CTT CAG CAG CAC CAA AGG AATCCC AAG CTT CAG CAG CAC CAA AGG AAT ARGgltB-cfARGgltB-cf TCC CGG AAC ATT GAG GGGTCC CGG AAC ATT GAG GGG ARGgltB-crARGgltB-cr CCC TGG TGG TGG AAT CTGCCC TGG TGG TGG AAT CTG

실시예 2: 글루타민 생산균주 365와 Example 2: Production of glutamine-producing strains 365 and gltBgltB 유전자 결실균주의 글루타민 생산량 평가(플라스크) Evaluation of Glutamine Production of Gene-Deficient Strain (Flask)

상기 실시예 1에서 얻어진 gltB 유전자 결실 균주의 글루타민 생산량을 확인하기 위하여 모균주인 글루타민 생산균주 365와 gltB 유전자가 결실된 균주인 365 Δg l tB의 글루타민 생산량을 비교하였다. 상기 두 균주를 표 2의 조성으로 구성된 배지에서 플라스크 역가 실험으로 글루타민 생산량을 비교하였다.Example 1 The parent strain of glutamine-producing strain 365 and gltB glutamine production of the gene is a deletion strain 365 Δ l g tB were compared to confirm that the obtained gltB glutamine production of gene deletion strains. Glutamine production was compared by flask titration experiments in the medium consisting of the two strains with the composition of Table 2.

성분ingredient 플라스크 배지 농도 Flask concentration 글루코오스Glucose 10%10% HVPHVP 1%One% 비프 추출물Beef extract 0.05%0.05% 요소Element 0.15%0.15% NH₄ClNH ₄ Cl 3.5%3.5% 비오틴Biotin 1.5 μg/L1.5 μg / L 티아민-HClThiamine-HCl 2000 μg/L2000 μg / L 시스테인-HClCysteine-HCl 200 mg/L200 mg / L M-100M-100 200 mg/L200 mg / L CaCl₂ CaCl ₂ 0.25%0.25% MgSO₄ MgSO ₄ 0.05%0.05% FeSO₄ FeSO ₄ 10 ppm10 ppm MnSO₄ MnSO ₄ 10 ppm10 ppm ZnSO₄ ZnSO ₄ 20 ppm20 ppm KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0.05%0.05% K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 0.05%0.05%

상기 배지 조건으로 플라스크 역가 실험을 수행하였고, 물리적인 배양 조건은 온도 30℃, 교반속도 140 rpm으로 배양하였다. 하기 표 3은 모균주 및 gltB 결실 균주의 글루타민 생성량 비교(플라스크 역가 실험)에 관한 것이다.
Flask titration experiments were carried out under the conditions described above, and the physical culture conditions were incubated at a temperature of 30 ° C and a stirring speed of 140 rpm. Table 3 below shows the comparison of the amount of glutamine production (flask titration experiment) of parent strain and gltB deletion strain.

균주명Strain name 글루타민(%)Glutamine (%) 수율(Yp/s)Yield (Yp / s) 365 ΔgltB #3365 ΔgltB # 3 3.383.38 46.646.6 365 ΔgltB #4 365 ΔgltB # 4 3.42 3.42 49.2 49.2 365 ΔgltB #6 365 Δ gltB # 6 3.21 3.21 46.8 46.8 365 ΔgltB #9 365 Δ gltB # 9 3.45 3.45 46.9 46.9 365 365 2.25 2.25 38.5 38.5

표 3의 결과와 같이 365 ΔgltB #4 균주는 모균주에 비해 글루타민 생산이 증가하여 수율이 높아진 것으로 나타났다. 365와 365 ΔgltB #4 배양 결과의 글루타민 생산량을 비교하면 모균주 대비 365 ΔgltB #4의 생산량이 2.25%에서 3.42%로, 글루타민 생산량 2.25% 기준 시 본 발명에 의해 글루타민 생산량이 53.3% 증가한 것을 확인할 수 있었다.As shown in Table 3, the 365 Δ gltB # 4 strain showed an increase in the yield of glutamine compared with the parent strain. 365 and 365 Δ gltB # 4, the yield of 365 Δ gltB # 4 was 2.25% to 3.42%, and the amount of glutamine production increased by 53.3% according to the present invention when the glutamine yield was 2.25% I could confirm.

실시예 3: 글루타민 생산균주 365와 Example 3: Glutamine production strains 365 and gltBgltB 유전자 결실균주의 글루타민 생산량 평가(발효조) Evaluation of Glutamine Production of Gene-Deficient Strains (Fermentation Tank)

상기 두 균주를 표 4의 배지 조성으로 구성된 50L 발효조에서 글루타민 생산량을 비교하였다.The two strains were compared in terms of glutamine production in a 50 L fermenter comprising the medium composition of Table 4.

성분ingredient 사입 배지 농도Feed medium concentration 글루코오스Glucose 18%18% HVPHVP 2.5%2.5% CSPCSP 0.208%0.208% NH₄ClNH ₄ Cl 0.738%0.738% 비오틴Biotin 1 μg/L1 μg / L 티아민-HClThiamine-HCl 2000 μg/L2000 μg / L 시스테인-HClCysteine-HCl 700 mg/L700 mg / L M-100M-100 360 mg/L360 mg / L CaCl₂ CaCl ₂ 0.1%0.1% MgSO₄ MgSO ₄ 0.088%0.088% FeSO₄ FeSO ₄ 20 ppm20 ppm MnSO₄ MnSO ₄ 24 ppm24 ppm ZnSO₄ ZnSO ₄ 60 ppm60 ppm KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0.162%0.162% K₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 0.107%0.107%

상기 배지 조건으로 사입 액량 1.8 L로 수행하였고, 물리적인 배양 조건은 온도 30℃, 교반속도 500 rpm 및 통기량 1.0 vvm의 조건으로 배양하였다. 본 발명에서 얻어진 365 ΔgltB는 모균주와 같은 조건으로 배양하였다. 하기 표 5는 모균주 및 gltB 결실 균주의 글루타민 생성량 비교(50L J/F)에 관한 것이다.The culture conditions were as follows: the culture volume was 1.8 L, and the physical culture conditions were 30 ° C, 500 rpm, and aeration rate of 1.0 vvm. The 365 Δ gltB obtained in the present invention was cultured under the same conditions as the parent strain. Table 5 below shows a comparison of the amount of glutamine produced (50 L J / F) of parent strain and gltB deletion strain.

균주명Strain name 배양시간(hr)Culture time (hr) O.DO.D. 글루타민(%)Glutamine (%) 수율(Yp/s)Yield (Yp / s) 365 ΔgltB #4-41365? GltB # 4-41 8484 58.958.9 11.2311.23 50.950.9 365 ΔgltB #4-46 365? GltB # 4-46 8484 55.355.3 10.8310.83 51.651.6 365365 8484 58.258.2 8.618.61 38.338.3

표 5의 결과와 같이 365 ΔgltB #4-41 균주는 모균주에 비해 생육이 저하되지 않으면서 글루타민 생산이 증가하여 수율이 높아진 것으로 나타났다. 모균주와 동일한 시간(84 hr)으로 365 ΔgltB #4-41를 배양한 결과, 58.9의 O.D 값을 보여 모균주와 유사한 생육 정도를 나타냈다. 또한, 365 ΔgltB #4-41의 글루타민 생산량은 11.23%로, 본 발명에 의해 모균주의 글루타민 생산량 8.61%을 기준으로 하여 365 ΔgltB #4-41의 글루타민 생산량이 30.4% 증가한 것을 확인 할 수 있었다.As shown in Table 5, the 365 Δ gltB # 4-41 strain showed an increase in the yield of glutamine without increasing the growth of the parent strain. When 365 Δ gltB # 4-41 was cultured at the same time (84 hr) as that of the parent strain, OD value of 58.9 was shown, showing similar growth to parent strain. In addition, the glutamine production amount of 365? GltB # 4-41 was 11.23%, and it was confirmed by the present invention that the glutamine production amount of 365? GltB # 4-41 was increased by 30.4% based on 8.61% of the glutamine production amount of the parent strain there was.

실시예 4: 알기닌 생산균주 ARP와 Example 4: Arginine production strain ARP and gltBgltB 유전자 결실균주의 알기닌 생산량 평가 Evaluation of arginine production of genetic deletion strain

상기 실시예 1에서 얻어진 gltB 유전자 결실 균주의 알기닌 생산량을 확인하기 위하여 모균주인 알기닌 생산균주 ARP와 gltB 유전자가 결실된 균주인 ARP ΔgltB의 알기닌 생산량을 비교하였다. 상기 두 균주를 표 6의 조성으로 구성된 배지에서 플라스크 역가 실험으로 알기닌 생산량을 비교하였다.In order to confirm the production of arginine gltB gene deletion strains obtained in Example 1 it was compared to the parental strain of arginine-producing strain ARP and ARP arginine production gltB Δ gltB genes of the deletion strains. The two strains were compared with the yields known from flask titration experiments in the medium consisting of the composition of Table 6.

성분ingredient 플라스크 배지 농도 Flask concentration 글루코오스Glucose 10 %10% 효모 펩톤 Yeast peptone 1 %One % 요소Element 0.2 %0.2% (NH₄)₂SO₄ (NH _{4) 2} SO ₄ 4.5 %4.5% 비오틴Biotin 100 ug/L100 ug / L 티아민-HClThiamine-HCl 100 ug/L100 ug / L MgSO₄ MgSO ₄ 0.1 %0.1% FeSO₄ FeSO ₄ 20 ppm20 ppm MnSO₄ MnSO ₄ 20 ppm20 ppm KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0.2 %0.2% 알기닌Arginine 2 %2 %

상기 배지 조건으로 플라스크 역가 실험을 수행하였고, 물리적인 배양 조건은 온도 30℃, 교반속도 160 rpm으로 배양하였다. 하기 표 7은 모균주 및 gltB 결실 균주의 알기닌 생성량 비교(플라스크 역가 실험)에 관한 것이다.Flask titration experiments were carried out under the above conditions, and physical culture conditions were incubated at a temperature of 30 ° C and a stirring speed of 160 rpm. Table 7 below shows the comparison of arginine production (flask titration experiments) of parent strain and gltB- deficient strains.

균주명Strain name 알기닌 (%)Arginine (%) 수율 (Yp/s)Yield (Yp / s) ARP ΔgltB #1ARP ΔgltB # 1 1.521.52 19.519.5 ARP ΔgltB #6 ARP ΔgltB # 6 1.49 1.49 19.6 19.6 ARP ΔgltB #8 ARP ΔgltB # 8 1.54 1.54 19.8 19.8 ARP ARP 1.45 1.45 18.2 18.2

표 7의 결과와 같이 ARP ΔgltB #8 균주는 모균주에 비해 알기닌 생산이 증가하여 수율이 높아진 것으로 나타났다. ARP와 ARP ΔgltB #8 배양 결과의 알기닌 생산량을 비교하면 모균주 대비 ARP ΔgltB #8 의 생산량이 1.45%에서 1.54%로, 본 발명에 의해 알기닌 생산량 1.45% 기준 시 알기닌 생산량이 6.2% 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
As shown in Table 7, the ARP ΔgltB # 8 strain showed higher yields of arginine production than the parent strain. Comparison of arginine production of ARP ΔgltB # 8 with ARP ΔgltB # 8 showed that ARP ΔgltB # 8 production increased from 1.45% to 1.54%, and arginine production increased 6.2% based on arginine production of 1.45% I could confirm.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant Strain with improved Amino acid production by inactivating GOGAT <130> PN120573 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4533 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum 365 gltB <400> 1 atgaataaac aagggcttta taacccagtg catgaacacg atgcctgtgg cgtggcattc 60 atcgcggata tccacggacg tcctagccga agcattgtgg accgtgccct agaagcactg 120 cgcaatattg atcaccgtgg tgcagcaggt gcagaaaaga acaccggcga tggtgcgggc 180 attctcatgc agatccctga cagtttttat cgtgaagtgt caggcattga acttcctgaa 240 gcaggggagt acgcaacagg aatcgccttc ctgccacgag cacggatggc catgttggat 300 gcacaaaaag aaatcgaacg catcgccatc caagaaggtg cagaggttct tggttggcgc 360 atggttcctt ttgattcccg cgagttgggt tccatggctg ttgaatccat gccaagtttt 420 gcgcagatct tccttcacgt acctggaaaa acaggcgagg atctagaccg cgttatgttt 480 tttatccgca agcgctgtga acgtgagctg ggtactacag gtggccggga taccgtgtac 540 tttccatcgc tgtcttctcg cacggtgatt tacaaaggca tgctcaccac cctgcagctt 600 gagggatttt tcgatgatct gggtgatccc cgcatggaga ctgcaatcgc gattgtgcac 660 tcacgctttt ccaccaatac tttccccagc tggcctttgg cacacccata tcgtttcgtc 720 gcccacaatg gtgaaatcaa taccgtgcgc ggcaatgaga attggatgcg ggcgcgcgaa 780 gcgctcatta agagcaataa gctgggagat ctcggcagcg tgctgcctat ctgcaccccg 840 gagggctccg acaccgcgcg tttcgacgag gctttggagc ttttgcacct gggcggatac 900 tccctgcccc atgctgttgc catgatgatt ccgcaggcct gggaacacaa taaaacactg 960 agtccgaagc ttcgtgattt ctacgaatat cactcctgcc tcatggaacc atgggatggt 1020 ccggctgcgc tggcctttac tgatagtcgt tttgtgggtg ctgttctaga ccgtaatggc 1080 ctgcgaccag gacgtatttc cattactgat tctggacttg tggtgatggc ttctgaatcg 1140 ggtgtactgg acttgaggga ggaaagcgtc gtaaagcgaa ctcgcgtcca gcctggacgc 1200 atgttccttg ttgacacggc cgagggccgc attgttgaag acgaagaaat caagcagaaa 1260 ttgagcgaag cgaagcctta tggtgagtgg attcgcgata attttgtgca tcttgatcgc 1320 ttgccgcaga ctcggtacag ctacatggca cactcgcgcg cggtgctgcg ccagcgcgtt 1380 tttggcatta ctgaagaaga cgtggatctg ctcatcctgc cgatggcacg ccagggtgct 1440 gaggctatcg gttccatggg ctcagatacg ccgatcgctg ctctctccca acgtccgcgt 1500 atgctttatg atttcttcgc gcagcgtttt gctcaggtga ccaacccgcc tttggattcc 1560 attagagaaa agcctgtgac cagtatgtac acccttttgg gggcacaatc tgatgtgctc 1620 aatccggggc ctgatgctgc gcgccgtatt cgcctggaat cgccgatcat tgataaccat 1680 gagctggcaa tcctgatcaa tgccaatgtg catggggaat gggattcctt cggtgctgct 1740 gtaatttccg gtttgtaccc tgtggctcac cacggtgccg gcatgaaggc tgcgattgcg 1800 cgtgtgcgcc gtgaggtttc tgaggcaatc cgcaacggca agaccatcat tgtgttgtcg 1860 gatagagatt ccgatgagcg catggcaccg attccagctt tgttgcttac ctctgctgtg 1920 caccagtatc tcgtacagca acgtacccgc acccaatgtt cgttggtggt ggaatcaggc 1980 gatgctcgcg aggtgcacca cctcgccatg ctcattggtt ttggtgcaga tgcgatcaac 2040 ccatatatgg cttttgaaac catcgatgag ctgcgtatga agggccagct cggcgatctc 2100 agcctggatg aagcatcccg caattacatc aaggctgcta ccaccggtgt gctcaaggtg 2160 atgtccaaga tgggtatcgc tactgtgtcg tcctaccgtg gcgcgcagct ggctgatgtc 2220 actggtctgc atcaggatct cctagataat tacttcggcg gcattgcttc accgatttct 2280 ggcattggtt tggatgaggt tgcagccgac gttgaagctc gtcaccgcag tgcatttttg 2340 ccacgcccgg aagaaaatgc acaccgtgaa ttggatttgg gcggtgaata caagtggcgc 2400 cgcgaaggtg aataccacct gttcaactcg gaaaccatct tcaagctgca gcatgccact 2460 cgctcgggaa gttacaagat ttttaaggat tacacccgca aggtggatga tcaatccact 2520 cgtctgggta ccattcgtgg gctttttgaa ttcagtgcgg atcgcacccc catccccgta 2580 tcagaggtgg agccggtcag tgagattgtc aagcgatttt ccaccggtgc gatgtcctat 2640 ggctcgatct ctgcggaagc acatgaggta ttggccattg ccatgaatcg tctgggcagc 2700 atgtccaatt ccggcgaagg tggcgaggac gcccgccgct tcgatgtgga acccaatggc 2760 gattggaagc gctctgctat caaacaggtt gcctcaggcc gtttcggcgt gaccagccac 2820 tatctcaaca actgcaccga tattcagatc aagatggctc aaggtgcaaa gccaggtgaa 2880 ggtggccagc tgccaccaaa taaggtctac ccatggatcg cggaagtgcg catcaccacc 2940 ccaggtgttg gtctgatttc tcctccgcca caccacgata tttactccat tgaggatcta 3000 gcccagctga tccacgacct gaaaaatgct aacccccgcg cccgcattca cgtgaaattg 3060 gtagcagaac aaggtgttgg aactgttgct gctggtgtgt ccaaagcaca cgcagatatg 3120 gtgctcattt cgggacacga tgggggaacc ggtgcatcgc ctttgacgtc cctcaagcat 3180 gccggtgggc catgggagct tggattagct gaaactcagc aaaccttgct gctcaacggc 3240 ctgcgcgatc gcattcgtgt gcagtgtgat ggccagctaa aaaccggccg cgatgtagtg 3300 atcgcagcgc tacttggtgc agaagaattt ggctttgcca ccgcaccact ggtggtggaa 3360 ggctgcatca tgatgcgtgt ctgccacctg gatacctgcc cggtgggcat tgctacgcaa 3420 aacccagatc tgcgttccaa gttcaccggc aaagcagaac atgtggttaa tttcttcacc 3480 ttcatcgctg aagaagtccg cgagtatttg gcgcagcttg gtttccgctc cattgatgaa 3540 gccgtgggac aagcgcaggt gctgcgtaag cgttccggaa ttccagctga ttcccgtgca 3600 gcacacctgg atttgagccc tatcttccac cgcccagaaa ccccacactt cccaactcag 3660 gacgtgaggt gcaccaaaac ccaggaacat agcctggaaa aagccctgga caacgcattt 3720 attgataagg cttcggacac gattacccgt gccgccgcag gtgtggacac cagcattgtg 3780 atcgaaagcc agatcagcaa tgttaaccgt tcagtaggca ccatgctggg ttccgcagtc 3840 agccgcgtag ctggtgcgaa cggttttcct gatggcacca tcaccttgaa tctggagggc 3900 tgcgccggta actccttcgg tgcattcatt cccaagggca tcaccatcaa cctcaccggc 3960 gatgccaatg actttgtggg caagggactt tcaggcggac gcattgtcat ccgaccatca 4020 ttaaaggccc cgaagcagtt gaaaaacaat ccaaatatca ttgccggaaa cgtgcttggc 4080 tatggtgcca ccagcggtga attgttcatc cacggccagg tcggcgaacg tttctgcgtc 4140 cgtaactctg gcgccaccgc agtggtggaa ggtatcggaa accatggctg tgaatacatg 4200 actggtggcc gcgtgctcgt gcttggccca gtgggtgaaa actttggtgc cggcatgtcc 4260 ggtggcatcg cttacctgcc tagctctgcg gacctgaccc agaagatcaa tggcgaattg 4320 gtggatgttg ttccactgaa cgctgacgat ctgacctggg cagatgagct cattgcccgc 4380 cactgcaaac taaccggatc cgacaccaag ctgcgtgcac aagatttggt gaaagtcatg 4440 ccccgcgact accaaaaagt actcaacatc atcgaaatgg cccaggcaga gggccaagat 4500 ccagcaatca agatcatgga ggcagtgagc taa 4533 <210> 2 <211> 4534 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ARP gltB <400> 2 atgaaaccac aaggactcta caaccctgcg catgaacatg acgcctgcgg tgtggcgttt 60 attgcggata tccacggtcg acccagccgc agcattgttg atcgtgcact tgaggcgctt 120 cgcaatattg atcaccgagg tgccgccggt gcagagaaga acactggcga tggtgcgggc 180 atcctcatgc agattccgga tagtttctac cgtgaagtat ctggcattga gcttcctgag 240 gcaggggagt atgccactgg tattgcgttc ttgcctcgcg gtcgcatggc gatgatggat 300 gctcagaagg aaattgagcg catcgcgaag caagaaggtg ccgatgtgct tggttggcgc 360 atggttcctt ttgattcccg tgagctgggt tccatggctg aggaggcgat gcctagtttc 420 gcgcagattt tccttactgt gcctggaaaa tctggtgaag atcttgaccg tgtgatgttc 480 tttatccgta agcgttgtga gcgtgagctg ggcaccacca atggtcgcga tacggtgtat 540 ttcccgtcgc tatcttcacg caccatcatt tacaaaggca tgttgaccac tctgcagctt 600 gagggcttct ttgaggatct gggtgatgct cgcctggagt cggccattgc tattgtgcac 660 tcgcgtttct ccacgaacac tttcccaagc tggccgctgg cgcacccgta ccgtttcgtt 720 gcccacaacg gtgagatcaa cactgtgcgt ggcaatgaaa actggatgcg tgcccgcgag 780 gcgcttatca aaaacgacaa gctgggcaat ttgagcagcg tgctgcctat ctgcaccccg 840 gagggctcgg ataccgcgcg tttcgacgag gctttggagc ttttgcacct gggcggatac 900 tcacttccgc atgctgttgc gatgatgatc cctcaggcgt gggaacacaa caagacgctg 960 agccctgagc tgcgtgattt ctacgaatac cactcttgtc tgatggagcc atgggatggt 1020 cctgcagcgc tggcatttac tgacggtcgt tttgtgggtg ccgtgctgga ccgtaatggc 1080 ctgcgacctg ggcgaatcac cattactgat tcgggtttgg ttgtgatggg cttctgaatc 1140 gggagtgttg gacttgaggg aggagagcgt cgtaaagcgt actcgcgtac agcctggacg 1200 catgttcctt gttgacacgg ccgagggccg catcgttgaa gacgaggaaa tcaagcagaa 1260 attaagcgaa gcgcagccat atggtgagtg gattcgcgat aattttgtgc atctggatcg 1320 tctgcctcag acacgctaca actacatggc gcactctcgt gctgtgttgc gtcagcgtgt 1380 tttcggaatc actgaagaag atgtggattt gttgctgctg ccgatggccc gccagggtgc 1440 tgaggcaatt ggttccatgg gttcggatac gccgattgcg gcgctgtccc agcgaccacg 1500 catgctttat gatttcttcg cgcagcgctt tgctcaggtg acaaacccac ctttggactc 1560 catccgtgaa aagcctgtga ccagcatgtt cactttgttg ggtgcgcagt ctgacgtgct 1620 caatccgggt cctgatgcgg cgcgacgtat ccgtttggaa tcgccgatca ttgataacca 1680 tgagctggcc accttgatca atgccaacgc gcatggtgag tgggattcct ttggtgctgc 1740 tgtaatttct ggtttgtacc cagtggctca ccatggtgcc ggcatgaagg ctgcgattgc 1800 tcgtgtgcgc cgcgaggttt ctgaagcaat tcgcaatggc aagacgttga tcgtgctgtc 1860 ggatcgtgaa tctgatgagc gcatggctcc catccctgcg ttgctgctga cttccgctgt 1920 gcatcagtac ttggtgcagc aacgtacccg tacccagtgc tccctggtgg tggaatctgg 1980 cgatgcccgc gaggttcatc acctggcgat gctcattggt tttggtgccg atgcgatcaa 2040 cccgtacatg gcatttgaaa ccatcgatga gctgcgcatg aagggtcagt tggatgatct 2100 ttctttggat gaggcatccc gaaactacat caaggcagcc accactggtg tgctgaaggt 2160 gatgtccaag atgggcattg cgacggtgtc ttcgtaccgt ggcgcgcagc ttgctgatgt 2220 cactggtttg catcaggatc tcttggacaa ctacttcggt ggtattgctt caccaatttc 2280 tggcatcggt ctggatgaag ttgcagctga cgtagaagct cgtcaccgca gcgcattttt 2340 gccacgccca gaagagcacg ctcaccgcga attggatttg ggtggtgaat acaagtggcg 2400 ccgcgaaggt gaataccacc tgttcaaccc agaaaccatc ttcaagctgc agcatgcaac 2460 tcgttctggc agctacgaga ttttcaagga ttacacccgc aaggttgatg atcaatccac 2520 tcgcttgggt actattcgtg gactgtttga gttcagcacg gaccgcaagc caatttcggt 2580 gtctgaggtg gagccggtca gtgagatcgt gaagcgtttc tccactggtg cgatgtctta 2640 tggctcgatt tctgctgagg cacacgaggt cttggccatc gccatgaacc gactgggcgg 2700 tatgtccaac tccggcgaag gtggcgagga cgcccgccga ttcgatgtgg aacccaacgg 2760 tgactggaag cgctctgcca ttaagcaggt ggcctcggga cgtttcggcg tgaccagcca 2820 ttacttgaac aactgcaccg atattcagat caagatggca cagggcgcaa agcccggtga 2880 aggtggtcag ctgccaccaa acaaggtgta cccatgggtt gcagaagtcc gcatcaccac 2940 cccaggtgtt ggtctgattt ctcctccacc acaccacgat atttactcca ttgaggattt 3000 ggctcagctg atccacgact tgaagaacgc taacccacgc gcacgaatcc acgtgaagct 3060 agtggcagaa caaggcgtgg gcaccgttgc cgcaggtgtg tccaaagcac acgctgatgt 3120 ggtgcttatt tccggccacg acggcggaac tggcgcatct cctttgacct ccctgaagca 3180 tgccggtggt ccatgggagt tgggcttggc tgaaactcag caaacgttgc tgctcaacgg 3240 cctgcgtgat cgtattcgcg tgcagtgcga tggtcagctg aaaactggcc gagacgtggt 3300 tatcgcagct ctgctcggtg ccgaagaatt cggttttgcc accgcaccgc tggtggttga 3360 aggctgcatc atgatgcgcg tctgccacct ggacacctgc ccggtgggta tcgctaccca 3420 gaacccggat ttgcgttcca agttcaccgg caaggctgaa cacgtggtca acttcttcac 3480 cttcatcgcc caggaagtcc gtgagtactt ggcacagctt ggtttccgct ctattgatga 3540 agccgtagga caagcccagg tgctgcgtaa gcgttccgga atcccagctg attcccgcgc 3600 aacacacctg gatttgagcc caattttcca tcgcccagaa actccacact tcccaactca 3660 ggatgtgcgt tgcaccaaga cccaggaaca cagcctagaa aaagccctgg acaacgcatt 3720 tattgataag gcttcggaca cgatcacccg tgccgcagcg ggtgtggaaa ccagcattgt 3780 tattgatagc tccatcagca acgtcaaccg ttcagttggc acgatgctgg gttctgcagt 3840 cagccgcgtg gctggtgccc aaggtttgcc agacggcacc atcaccttga atcttcaagg 3900 ctgcgccggt aactcctttg gcgcgttcat cccacgaggc atcaccatca acctcaccgg 3960 cgatgccaat gactttgtgg gcaagggatt atctggcgga aagattgtga tcaagccttc 4020 cgctcaggct ccgaagcagc tgaagaacaa tccaaatatc attgccggaa acgtgcttgg 4080 atacggcgca accagtggtg aattgttcat tcgtggccag gtcggcgaac gtttctgcgt 4140 ccgtaactct ggcgccaccg cagtggttga aggtatagga aaccacggtt gtgagtacat 4200 gactggcggc cgagtcctgg ttttgggccc ggttggtgag aactttggtg ccggcatgtc 4260 tggtggcatt gcatacctgg ctaattcccc ggacctaaac cagaagatca atggcgaatt 4320 ggtggatgtt gttccactga gcgctgacga tctgacatgg gctgatgagc tcattgctcg 4380 ccaccgcgaa ctcaccggat ccgagaccaa gctgcgtgca caagatttgg tgaaaatcat 4440 gccacgcgat ttccaaaaag tactcaacat catcgaaacg gcccacgctg agggccaaga 4500 cccagcaatc aagatcatgg aggcagtgag ctaa 4534 <110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant Strain with improved Amino acid production by inactivating          GOGAT <130> PN120573 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 4533 <212> DNA &Lt; 213 > Corynebacterium glutamicum 365 gltB <400> 1 atgaataaac aagggcttta taacccagtg catgaacacg atgcctgtgg cgtggcattc 60 atcgcggata tccacggacg tcctagccga agcattgtgg accgtgccct agaagcactg 120 cgcaatattg atcaccgtgg tgcagcaggt gcagaaaaga acaccggcga tggtgcgggc 180 attctcatgc agatccctga cagtttttat cgtgaagtgt caggcattga acttcctgaa 240 gcaggggagt acgcaacagg aatcgccttc ctgccacgag cacggatggc catgttggat 300 gcacaaaaag aaatcgaacg catcgccatc caagaaggtg cagaggttct tggttggcgc 360 atggttcctt ttgattcccg cgagttgggt tccatggctg ttgaatccat gccaagtttt 420 gcgcagatct tccttcacgt acctggaaaa acaggcgagg atctagaccg cgttatgttt 480 tttatccgca agcgctgtga acgtgagctg ggtactacag gtggccggga taccgtgtac 540 tttccatcgc tgtcttctcg cacggtgatt tacaaaggca tgctcaccac cctgcagctt 600 gagggatttt tcgatgatct gggtgatccc cgcatggaga ctgcaatcgc gattgtgcac 660 tcacgctttt ccaccaatac tttccccagc tggcctttgg cacacccata tcgtttcgtc 720 gcccacaatg gtgaaatcaa taccgtgcgc ggcaatgaga attggatgcg ggcgcgcgaa 780 gcgctcatta agagcaataa gctgggagat ctcggcagcg tgctgcctat ctgcaccccg 840 gagggctccg acaccgcgcg tttcgacgag gctttggagc ttttgcacct gggcggatac 900 tccctgcccc atgctgttgc catgatgatt ccgcaggcct gggaacacaa taaaacactg 960 agtccgaagc ttcgtgattt ctacgaatat cactcctgcc tcatggaacc atgggatggt 1020 ccggctgcgc tggcctttac tgatagtcgt tttgtgggtg ctgttctaga ccgtaatggc 1080 ctgcgaccag gacgtatttc cattactgat tctggacttg tggtgatggc ttctgaatcg 1140 ggtgtactgg acttgaggga ggaaagcgtc gtaaagcgaa ctcgcgtcca gcctggacgc 1200 atgttccttg ttgacacggc cgagggccgc attgttgaag acgaagaaat caagcagaaa 1260 ttgagcgaag cgaagcctta tggtgagtgg attcgcgata attttgtgca tcttgatcgc 1320 ttgccgcaga ctcggtacag ctacatggca cactcgcgcg cggtgctgcg ccagcgcgtt 1380 tttggcatta ctgaagaaga cgtggatctg ctcatcctgc cgatggcacg ccagggtgct 1440 gaggctatcg gttccatggg ctcagatacg ccgatcgctg ctctctccca acgtccgcgt 1500 atgctttatg atttcttcgc gcagcgtttt gctcaggtga ccaacccgcc tttggattcc 1560 attagagaaa agcctgtgac cagtatgtac acccttttgg gggcacaatc tgatgtgctc 1620 aatccggggc ctgatgctgc gcgccgtatt cgcctggaat cgccgatcat tgataaccat 1680 gagctggcaa tcctgatcaa tgccaatgtg catggggaat gggattcctt cggtgctgct 1740 gtaatttccg gtttgtaccc tgtggctcac cacggtgccg gcatgaaggc tgcgattgcg 1800 cgtgtgcgcc gtgaggtttc tgaggcaatc cgcaacggca agaccatcat tgtgttgtcg 1860 gatagagatt ccgatgagcg catggcaccg attccagctt tgttgcttac ctctgctgtg 1920 caccagtatc tcgtacagca acgtacccgc acccaatgtt cgttggtggt ggaatcaggc 1980 gatgctcgcg aggtgcacca cctcgccatg ctcattggtt ttggtgcaga tgcgatcaac 2040 ccatatatgg cttttgaaac catcgatgag ctgcgtatga agggccagct cggcgatctc 2100 agcctggatg aagcatcccg caattacatc aaggctgcta ccaccggtgt gctcaaggtg 2160 atgtccaaga tgggtatcgc tactgtgtcg tcctaccgtg gcgcgcagct ggctgatgtc 2220 actggtctgc atcaggatct cctagataat tacttcggcg gcattgcttc accgatttct 2280 ggcattggtt tggatgaggt tgcagccgac gttgaagctc gtcaccgcag tgcatttttg 2340 ccacgcccgg aagaaaatgc acaccgtgaa ttggatttgg gcggtgaata caagtggcgc 2400 cgcgaaggtg aataccacct gttcaactcg gaaaccatct tcaagctgca gcatgccact 2460 cgctcgggaa gttacaagat ttttaaggat tacacccgca aggtggatga tcaatccact 2520 cgtctgggta ccattcgtgg gctttttgaa ttcagtgcgg atcgcacccc catccccgta 2580 tcagaggtgg agccggtcag tgagattgtc aagcgatttt ccaccggtgc gatgtcctat 2640 ggctcgatct ctgcggaagc acatgaggta ttggccattg ccatgaatcg tctgggcagc 2700 atgtccaatt ccggcgaagg tggcgaggac gcccgccgct tcgatgtgga acccaatggc 2760 gattggaagc gctctgctat caaacaggtt gcctcaggcc gtttcggcgt gaccagccac 2820 tatctcaaca actgcaccga tattcagatc aagatggctc aaggtgcaaa gccaggtgaa 2880 ggtggccagc tgccaccaaa taaggtctac ccatggatcg cggaagtgcg catcaccacc 2940 ccaggtgttg gtctgatttc tcctccgcca caccacgata tttactccat tgaggatcta 3000 gcccagctga tccacgacct gaaaaatgct aacccccgcg cccgcattca cgtgaaattg 3060 gtagcagaac aaggtgttgg aactgttgct gctggtgtgt ccaaagcaca cgcagatatg 3120 gtgctcattt cgggacacga tgggggaacc ggtgcatcgc ctttgacgtc cctcaagcat 3180 gccggtgggc catgggagct tggattagct gaaactcagc aaaccttgct gctcaacggc 3240 ctgcgcgatc gcattcgtgt gcagtgtgat ggccagctaa aaaccggccg cgatgtagtg 3300 atcgcagcgc tacttggtgc agaagaattt ggctttgcca ccgcaccact ggtggtggaa 3360 ggctgcatca tgatgcgtgt ctgccacctg gatacctgcc cggtgggcat tgctacgcaa 3420 aacccagatc tgcgttccaa gttcaccggc aaagcagaac atgtggttaa tttcttcacc 3480 ttcatcgctg aagaagtccg cgagtatttg gcgcagcttg gtttccgctc cattgatgaa 3540 gccgtgggac aagcgcaggt gctgcgtaag cgttccggaa ttccagctga ttcccgtgca 3600 gcacacctgg atttgagccc tatcttccac cgcccagaaa ccccacactt cccaactcag 3660 gacgtgaggt gcaccaaaac ccaggaacat agcctggaaa aagccctgga caacgcattt 3720 attgataagg cttcggacac gattacccgt gccgccgcag gtgtggacac cagcattgtg 3780 atcgaaagcc agatcagcaa tgttaaccgt tcagtaggca ccatgctggg ttccgcagtc 3840 agccgcgtag ctggtgcgaa cggttttcct gatggcacca tcaccttgaa tctggagggc 3900 tgcgccggta actccttcgg tgcattcatt cccaagggca tcaccatcaa cctcaccggc 3960 gatgccaatg 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cgtgaagtat ctggcattga gcttcctgag 240 gcaggggagt atgccactgg tattgcgttc ttgcctcgcg gtcgcatggc gatgatggat 300 gctcagaagg aaattgagcg catcgcgaag caagaaggtg ccgatgtgct tggttggcgc 360 atggttcctt ttgattcccg tgagctgggt tccatggctg aggaggcgat gcctagtttc 420 gcgcagattt tccttactgt gcctggaaaa tctggtgaag atcttgaccg tgtgatgttc 480 tttatccgta agcgttgtga gcgtgagctg ggcaccacca atggtcgcga tacggtgtat 540 ttcccgtcgc tatcttcacg caccatcatt tacaaaggca tgttgaccac tctgcagctt 600 gagggcttct ttgaggatct gggtgatgct cgcctggagt cggccattgc tattgtgcac 660 tcgcgtttct ccacgaacac tttcccaagc tggccgctgg cgcacccgta ccgtttcgtt 720 gcccacaacg gtgagatcaa cactgtgcgt ggcaatgaaa actggatgcg tgcccgcgag 780 gcgcttatca aaaacgacaa gctgggcaat ttgagcagcg tgctgcctat ctgcaccccg 840 gagggctcgg ataccgcgcg tttcgacgag gctttggagc ttttgcacct gggcggatac 900 tcacttccgc atgctgttgc gatgatgatc cctcaggcgt gggaacacaa caagacgctg 960 agccctgagc tgcgtgattt ctacgaatac cactcttgtc tgatggagcc atgggatggt 1020 cctgcagcgc tggcatttac tgacggtcgt tttgtgggtg ccgtgctgga ccgtaatggc 1080 ctgcgacctg ggcgaatcac cattactgat tcgggtttgg ttgtgatggg cttctgaatc 1140 gggagtgttg gacttgaggg aggagagcgt cgtaaagcgt actcgcgtac agcctggacg 1200 catgttcctt gttgacacgg ccgagggccg catcgttgaa gacgaggaaa tcaagcagaa 1260 attaagcgaa gcgcagccat atggtgagtg gattcgcgat aattttgtgc atctggatcg 1320 tctgcctcag acacgctaca actacatggc gcactctcgt gctgtgttgc gtcagcgtgt 1380 tttcggaatc actgaagaag atgtggattt gttgctgctg ccgatggccc gccagggtgc 1440 tgaggcaatt ggttccatgg gttcggatac gccgattgcg gcgctgtccc agcgaccacg 1500 catgctttat gatttcttcg cgcagcgctt tgctcaggtg acaaacccac ctttggactc 1560 catccgtgaa aagcctgtga ccagcatgtt cactttgttg ggtgcgcagt ctgacgtgct 1620 caatccgggt cctgatgcgg cgcgacgtat ccgtttggaa tcgccgatca ttgataacca 1680 tgagctggcc accttgatca atgccaacgc gcatggtgag tgggattcct ttggtgctgc 1740 tgtaatttct ggtttgtacc cagtggctc ccatggtgcc ggcatgaagg ctgcgattgc 1800 tcgtgtgcgc cgcgaggttt ctgaagcaat tcgcaatggc aagacgttga tcgtgctgtc 1860 ggatcgtgaa tctgatgagc gcatggctcc catccctgcg ttgctgctga cttccgctgt 1920 gcatcagtac ttggtgcagc aacgtacccg tacccagtgc tccctggtgg tggaatctgg 1980 cgatgcccgc gaggttcatc acctggcgat gctcattggt tttggtgccg atgcgatcaa 2040 cccgtacatg gcatttgaaa ccatcgatga gctgcgcatg aagggtcagt tggatgatct 2100 ttctttggat gaggcatccc gaaactacat caaggcagcc accactggtg tgctgaaggt 2160 gatgtccaag atgggcattg cgacggtgtc ttcgtaccgt ggcgcgcagc ttgctgatgt 2220 cactggtttg catcaggatc tcttggacaa ctacttcggt ggtattgctt caccaatttc 2280 tggcatcggt ctggatgaag ttgcagctga cgtagaagct cgtcaccgca gcgcattttt 2340 gccacgccca gaagagcacg ctcaccgcga attggatttg ggtggtgaat acaagtggcg 2400 ccgcgaaggt gaataccacc tgttcaaccc agaaaccatc ttcaagctgc agcatgcaac 2460 tcgttctggc agctacgaga ttttcaagga ttacacccgc aaggttgatg atcaatccac 2520 tcgcttgggt actattcgtg gactgtttga gttcagcacg gaccgcaagc caatttcggt 2580 gtctgaggtg gagccggtca gtgagatcgt gaagcgtttc tccactggtg cgatgtctta 2640 tggctcgatt tctgctgagg cacacgaggt cttggccatc gccatgaacc gactgggcgg 2700 tatgtccaac tccggcgaag gtggcgagga cgcccgccga 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caagatttgg tgaaaatcat 4440 gccacgcgat ttccaaaaag tactcaacat catcgaaacg gcccacgctg agggccaaga 4500 cccagcaatc aagatcatgg aggcagtgag ctaa 4534

Claims (9)

gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의한 불활성화 GOGAT(glutamate synthase)를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이 균주.
A mutant strain of Corynebacterium glutamicum capable of producing glutamine or arginine comprising an inactivated GOGAT (glutamate synthase) by substitution, insertion, deletion or a combination of nucleotide sequences encoding the gltB gene.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 글루타민 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 글루타민 생산능 균주와 비교하여 글루타민의 생산능이 10-70% 증가된 균주인 것을 특징으로 하는 변이 균주.
[Claim 2] The method according to claim 1, wherein the mutant strain of Corynebacterium glutamicum capable of producing glutamine is a strain having an increased productivity of glutamine by 10-70% as compared with a strain capable of producing glutamine containing wild type or activated GOGAT Mutation strain.
제 1 항에 있어서, 상기 알기닌 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰 변이 균주는 야생형 또는 활성화 GOGAT를 포함하는 알기닌 생산능 균주와 비교하여 알기닌의 생산능이 1-15% 증가된 균주인 것을 특징으로 하는 변이 균주.
[Claim 2] The method according to claim 1, wherein the arginine producing ability Corynebacterium glutamicum mutant strain is a strain having an arginine production capacity increased by 1-15% as compared with an arginine producing ability strain containing wild type or activated GOGAT Mutation strain.
gltB 유전자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합에 의하여 GOGAT(glutamate synthase)를 불활성화 시키는 단계를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산능 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이 균주의 제조방법.
( Corynebacterium glutamicum ) mutant strain capable of producing glutamine or arginine, comprising the step of inactivating GOGAT (glutamate synthase) by substitution, insertion, deletion, or a combination of nucleotide sequences encoding the gltB gene &Lt; / RTI &gt;
제 1 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 하나의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 글루타민 또는 알기닌 생산방법.
A method for producing glutamine or arginine, comprising culturing a mutant strain of any one of claims 1, 5, and 6.
제 8 항에 있어서, 상기 배양은 25-35℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.9. The method according to claim 8, wherein the cultivation is carried out at 25-35 &lt; 0 &gt; C.

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