KR101478253B1 - A Piperazium compound for anticancer from Arum palaestinun Boiss - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun Boiss) 유래 신규 피레라지움 화합물 (3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온), 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물은 체외 배양된 종양 세포주에 대하여 큰 세포독성을 나타내므로 항암 활성이 매우 우수한 선택적인 항암제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to the use of Arum palustinum (3α, 5α-diisobutyl-6α-isopropyl-pyrazin-2-one) derived from palaestinun Boiss, a process for producing the same and an anticancer pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient. Since the Piperazinium compound having the anticancer activity of the present invention exhibits a large cytotoxicity against an in vitro cultured tumor cell line, it can be usefully used for the development of a selective anticancer drug having excellent anticancer activity.
아룸 팔래스티눔, 피페라진, 항암제 Arum palastinum, Piperazine, Anticancer drug
Description
본 발명은 아룸 팔래스티눔(Arum palaestinun Boiss) 유래 세스퀴테르펜(sesquiterpen) 알칼로이드계 신규 피레라지움 화합물(3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온), 그의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암용 약학적 조성물에 관한 것이다The present invention relates to the use of Arum palustinum palaestinun Boiss) derived sesqui terpenes (sesquiterpen) new alkaloids based Pierre La wipe compound (3α, 5 α-diisobutyl -6α- isopropyl-Pierre piperazine-2-one), a method of manufacturing the same, and containing the same as an active ingredient To a pharmaceutical composition for anticancer therapy
배양된 암세포주에 대한 시험관내 (in vitro) 세포증식 저해효과를 지표로 하여 식물 및 미생물의 추출물로부터 우수한 세포증식 저해물질을 추출분리하고 나아가 이를 유용한 항암제로 발전 개발시켜 나가고자 하는 연구방식은 오랫동안 많은 학자들이 추구해왔던 가장 보편적인 연구개발 형식으로서 오늘날 가장 널리 통용되고 있는 택솔(taxol), 빈블라스틴(vinblastin), 캠토테신(camptothecin) 등의 항암제들은 모두 이러한 연구방식에 따라 식물의 추출물로부터 분리된 약제들이다.The research method for extracting and separating excellent cell growth inhibitors from plant and microbial extracts and further developing it as a useful anticancer drug has been conducted for a long time by using the inhibitory effect of in vitro cell proliferation on cultured cancer cell lines as an index The most prevalent forms of research and development that many scholars have pursued are today's most widely used anticancer agents such as taxol, vinblastin, and camptothecin, all of which are isolated from plant extracts .
아룸(Arum)은 유럽, 북아프리카 및 서아시아 지역에 고유한 천남성과 중 지 중해 연안 지역에서 높은 종 다양성을 지니고 있는 개화식물체(flowering plant) 약 26종의 속(genus)을 의미한다. 이 식물 종에 대해서 파이토케미컬(phytochemical) 연구는 거의 알려지지 않았고, 플라보노이드-C-글리코사이드(flavonoid C- glycosides)의 발생을 보여주는 연구 또한 마찬가지다(F.U. Afifi et al., Ethnopharmacol 65, 173-177, 1999).Arum is a genus of about 26 species of flowering plants with high biodiversity in the coastal areas of Asia and the Middle East that are unique to Europe, North Africa and Western Asia. Phytochemical studies of this plant species are scarcely known, as is the study of the occurrence of flavonoid C-glycosides (FU Afifi et al ., Ethnopharmacol 65, 173-177, 1999 ).
한편, 피페라진 및 치환된 피페라진은, Merck HIV 프로테아제 저해제, 크리시반(Crixivan) 및 개발하에 있는 다양한 약물에서처럼 많은 시판 약제에서 발견할 수 있는 중요한 약리작용단에 해당한다. On the other hand, piperazine and substituted piperazines are important pharmacological agents that can be found in many commercial drugs, such as the Merck HIV protease inhibitor, Crixivan, and various drugs under development.
그러나, 본 발명의 아룸 팔래스티눔 유래 세스퀴테르펜 알카로이드계의 피페라지움 화합물이 인간 암세포주들에 대하여 강력한 세포증식 저해효과를 나타내어 항암제로서 유용하다는 사실은 아직 보고된 바 없다.However, it has not been reported that the pemetrexime-based piperazinium compound derived from Arum palastinum of the present invention has a strong cell proliferation inhibitory effect on human cancer cell lines and is useful as an anticancer agent.
본 발명의 목적은 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a novel piperazine compound having anticancer activity.
또한, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물을 아룸 팔래스티눔으로부터 추출하는 제조방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a process for producing a novel piperazyl compound having anticancer activity from alum palastinum.
아울러, 본 발명의 목적은 상기 항암활성을 갖는 신규 피페라지움 화합물을유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.In addition, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing a novel piperazine compound having an anticancer activity as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 하기 화학식 1로 표시되는 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래의 세스퀴테르펜 알카로이드계 신규 화합물A 및 그들의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.In order to attain the above object, the present inventors provide novel herbicidal compounds of the present invention and their pharmaceutically acceptable salts derived from Arum palastinum having the anticancer activity represented by the following formula (1).
상기 화학식1에서, In Formula 1,
R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 탄소수 1~6의 알킬기, 탄소수 1~6의 알콕시기, 탄소수 2~7의 알카노일기, 탄소수 2~7의 알콕시카르보닐기이다. 바람직하게는 탄소수 1~6의 알킬기이다.Each of R 1, R 2 and R 3 independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, an alkanoyl group having 2 to 7 carbon atoms, or an alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms. Preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
상기 탄소수 1~6의 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 제1급 내지 제3급의 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로프로필메틸기, 시클로펜틸메틸기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 및, n-, s- 및 t-부틸기이다.Examples of the alkyl group having 1 to 6 carbon atoms include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a primary to tertiary butyl group, a pentyl group, a hexyl group, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, An acyl group, a cyclopropylmethyl group, and a cyclopentylmethyl group. Preferred are a methyl group, an ethyl group, an n -propyl group, an isopropyl group, and an n- , s- and t- butyl group.
상기 탄소수 1~6의 알콕시기로서는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 이소부톡시기, 펜톡시기, 시클로펜틸옥시기 등을 들 수 있다.Examples of the alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms include methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, pentoxy and cyclopentyloxy groups.
상기 탄소수 2~7의 알카노일기로서는 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기,이소부티릴기, 부타노일기, 펜타노일기 등을 들 수 있다Examples of the alkanoyl group having 2 to 7 carbon atoms include an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a butanoyl group, and a pentanoyl group
상기 탄소수 2~7의 알콕시카르보닐기로서는 메톡시카르보닐기, 에톡시카르보닐기, 프로폭시카르보닐기, 부톡시카르보닐기 등을 들 수 있다. Examples of the alkoxycarbonyl group having 2 to 7 carbon atoms include a methoxycarbonyl group, an ethoxycarbonyl group, a propoxycarbonyl group, and a butoxycarbonyl group.
또한, 본 발명에 개시된 화합물A의 순수한 형태의 입체이성체, 광학대장체(optical antipode) 또는 부분입체 이성질체의 임의의 혼합물 등은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. Also included within the scope of the present invention are pure stereoisomers, optical antipodes, or any mixture of diastereomers of Compound A disclosed in the present invention.
본 발명의 일 태양으로, 상기 화학식 1에서,In one aspect of the present invention, in the above formula (1)
바람직하게는 R1, R2 및 R3이 각각 독립적으로 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 및, n-, s- 및 t-부틸기이다. 더더욱 바람직하게는 각각 독립적으로 이소프로필기 및 이소부틸기이고, 가장 바람직하게는 R1 및 R2은 이소부틸기이고, R3은 이소프로필기인, 하기 화학식2로 표시되는 화합물B (3α,5α-디이소부틸-6α-이소프로필-피레라진-2-온)이다.Preferably, each of R1, R2 and R3 is independently a methyl group, an ethyl group, an n -propyl group, an isopropyl group, and an n- , s- , and t- butyl group. Still more preferably each independently is an isopropyl group and an isobutyl group, most preferably R 1 and R 2 are isobutyl groups, and R 3 is an isopropyl group. The compound B (3α, 5α-diis Butyl-6? -Isopropyl-pyrazin-2-one).
본 발명의 항암활성을 갖는 신규한 피페라지움 화합물A는 아룸 팔래스티눔을 수추출(water extract)한 후 여러 종류의 유기용매로 분획하여 얻은 유기용매 추출분획을 실리카 겔 칼럼 크로마토그라피로 분리하여 고속액체 크로마토그라피법으로 정제하여 제조되었다. The novel piperazinium compound A having anticancer activity of the present invention is obtained by extracting water from alum palastinum and fractionating it with various kinds of organic solvents and separating the organic solvent fraction obtained by silica gel column chromatography, And purified by liquid chromatography.
본 발명의 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물의 물리ㆍ화학적 특성을 성상, 용해도, 적외선 분광분석법, 질량 분석법 및 핵자기 공명 분광분석 등을 통해 분석하였다.Physicochemical properties of Arum palastinum-derived piperacillin compounds having anticancer activity of the present invention were analyzed by properties, solubility, infrared spectroscopy, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy.
DEPT 측정을 포함하여 1H 및 13C NMR 스펙트럼 분석으로부터 화합물A의 구조 및 상대 입체화학적 특성을 파악하였고, 스펙트럼의 나열은 600 MHz에서 수행된 탄소-양성자 (HSQC, HMBC) 화학적 이동 상관관계 방법을 통하여 이루어진 반면 분자의 상대적 배열은 NOESY 스펙트럼을 통해 추론하였다.The structure and relative stereochemistry of Compound A were determined from 1 H and 13 C NMR spectral analyzes, including DEPT measurements, and the spectral lines were determined using the carbon-proton (HSQC, HMBC) chemical shift correlation method performed at 600 MHz Whereas the relative arrangement of molecules was deduced through the NOESY spectrum.
본 발명의 구체적인 일례인 상기 화학식2의 화합물 B는 1H NMR 스펙트럼 (DMSO-d6)상에서, 3.4-3.6 ppm 범위 및, D2O로 서로 바꿀 수 있는 δ8.45 및 δ9.75의 2개의 넓은 시그널에서 나타나는 3개의 양성자 시그널을 제외한 '높은장 화학적 이동 영역(upfield chemical shifts region)'인 0.8-2.1 ppm 범위에 대부분의 양성자 시그널이 나타났다. 상기 2개의 넓은 시그널은 HSQC 상관관계(correlation)가 없기 때문에 2개의 NH기임을 알 수 있다. Specific examples of compound B of formula (II) of the present invention is one of the two H NMR spectrum δ8.45 and δ9.75, which can replace one another as (DMSO-d 6), 3.4-3.6 ppm range, and, on D 2 O Most proton signals appeared in the range of 0.8-2.1 ppm, the 'upfield chemical shifts region' except for the three proton signals present in the broad signal. It can be seen that the two broad signals are two NH groups since there is no HSQC correlation.
게다가 화합물 A의 13C NMR 스펙트럼은 15 탄소 공명의 존재를 보여주었다. 화학적 이동(chemical shifts) 및 결합상수(coupling constants)와 함께 상기의 모든 스펙트럼 자료들은 화합물 A가 세스퀴터펜익 알카로이드임을 시사한다.In addition, the 13 C NMR spectrum of Compound A showed the presence of 15 carbon resonance. All of the above spectral data, along with chemical shifts and coupling constants, suggest that Compound A is a scepter penny alkaloid.
이하 분석 결과를 구체적으로 설명한다.The analysis result will be described in detail below.
(1) 성상 (1) Appearance
본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는 백색의 비결정성 분말이다.The piperazinium compound A having the anticancer activity of the present invention is a white amorphous powder.
(2) 용해도(2) Solubility
본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는 메탄올, 에탄올, 에틸아세 테이트, 디클로로메탄포 및, 디메틸설폭사이드(DMSO) 등에는 매우 잘 용해된다.Piperazinium compound A having anticancer activity of the present invention is very well dissolved in methanol, ethanol, ethyl acetate, dichloromethane, and dimethylsulfoxide (DMSO).
(3) 적외선(IR) 분광분석법(3) Infrared (IR) spectroscopy
본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A의 적외선 흡수 스펙트럼을 조사한 결과, 3250-3170 cm-1, 1680 cm-1 및 1578 cm-1에서 흡수대를 나타낸다.Infrared absorption spectra of the piperazinium compound A having the anticancer activity of the present invention were examined. As a result, absorption bands at 3250-3170 cm -1 , 1680 cm -1 and 1578 cm -1 are shown.
3250-3170 cm-1의 흡수대는 넓게 뻗은 아미노기(broad NH-stretching)에 의한 것이고, 1680 cm- 1 의 흡수대는 C=O에 의한 것이다. 또한, 1578 cm- 1흡수대는 NH기의 굽힘(bending)에 의한 것이다.Will according to the absorption band of 3250-3170 cm -1 is widely extending amino group (NH-stretching broad), 1680 cm - 1 absorption band is due to C = O. In addition, 1578 cm - 1 absorption band is due to the bending (bending) of the NH group.
(4) 질량 분석법(4) Mass spectrometry
본 발명의 항암활성을 갖는 피페라지움 화합물A는HRESIMS 질량 분석법에 의해서 분자식 C15H30N2O, 분자량 253.2280인 것으로 나타난다.Piperazinium compound A having the anticancer activity of the present invention is represented by molecular formula C 15 H 30 N 2 O and molecular weight 253.2280 by HRESIMS mass spectrometry.
(5) 핵자기 공명 분광분석(5) Nuclear magnetic resonance spectroscopy
본 발명의 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A의 대표적인 화합물B(화학식2의 화합물)를 자기 공명 분광분석법으로 조사하여 1H-NMR 및 13C-NMR 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 1 H-NMR and 13 C-NMR results are shown in Table 1 below by irradiating a representative compound B (compound of formula 2) of Arum palastinum-derived piperazinium compound A having the anticancer activity of the present invention with magnetic resonance spectroscopy .
화학식2로 표시되는 화합물B대한 1H, and 13C NMR s스펙트럼의 상세한 분석은 6개의 메틸기(methyl group), 6개의 메틴기(methine group), 2개의 메틸렌기(methylene group) 및 1개의 4차 카보닐기(이미드 또는 아미드)의 존재를 가리키고 있다. 고리의 2번 위치에서 카르보닐기의 존재는 HMBC스펙트럼에서, H-3 (δ 3.59), H-1`a (δ 1.54), 및 H-6 (δ 3.47)와의 상관관계를 보여주는 긴 거리 상관관계로부터 도출해낼 수 있었다(도 1). EIMS 스펙트럼에서 관찰된 m / z 43 [C3H7]+ 및 m / z 57 [C4H9]+ 에서의 단편 이온 피크들이, 이소프로필 및 이소부틸 측면 사슬 각각이 존재한다는 가정을 뒷받침하고 있다. 또한, m / z 85 [C5H11N]+ 및 m / z 72 [C4H10N]+ 에서의 단편 피크는 이들 잔기 각각이 하나의 메틴기를 통하여 질소 원자에 부착됨을 확인하였다. 나아가 13C NMR 스펙트럼에서 각각 C-3, C-5 및 C-6에 대하여, 53.6, 59.7 및 60.6 δC에 질소원자를 가지는 3개의 메틴 카본 시그널에 의하여 확인되었다. 피페라진 고리에 5-이소부틸 및 6-이소프로필 잔기의 부착 위치는 HMBC 상관관계를 통해 추론하였는데, H-6 (δ 3.47)/C-1``(δ 24.6) 및 H-1```(δ 2.14)/C-5 (δ 59.7) 사이의 상관관계는 양 알킬 잔기의 5,6-위치에서 확인되었다. 이와 유사하게, 두번째 이소부틸 잔기의 위치는 H-1`a (δ1.55)/ C-2 (δ 175.7)의 HMBC 상관관계로부터 C-3임을 확인하였다. Detailed analysis of the 1 H, and 13 C NMR s spectra for compound B, represented by formula 2, showed that 6 methyl groups, 6 methine groups, 2 methylene groups, and 1 4 Refers to the presence of a carbanyl group (imide or amide). The presence of the carbonyl group at position 2 of the ring was determined from the long distance correlation showing the correlation with H-3 (δ 3.59), H-1'a (δ 1.54), and H-6 (δ 3.47) in the HMBC spectrum (Fig. 1). The fragment ion peaks at m / z 43 [C 3 H 7 ] + and m / z 57 [C 4 H 9 ] + observed in the EIMS spectrum support the assumption that isopropyl and isobutyl side chains are present, respectively have. Also, the short peaks at m / z 85 [C 5 H 11 N] + and m / z 72 [C 4 H 10 N] + confirmed that each of these residues was attached to the nitrogen atom through one methine group. Further, it was confirmed by three methine carbon signals having nitrogen atoms at 53.6, 59.7 and 60.6 delta C for C-3, C-5 and C-6 in the 13 C NMR spectrum, respectively. The position of attachment of 5-isobutyl and 6-isopropyl moiety to the piperazine ring was inferred through HMBC correlation, and H-6 (δ 3.47) / C-1 (δ 24.6) and H-1 (delta 2.14) / C-5 (delta 59.7) was found at the 5,6-position of both alkyl residues. Similarly, the position of the second isobutyl residue was found to be C-3 from the HMBC correlation of H-1'a (delta 1.55) / C-2 (delta 175.7).
그리고, 화학식2로 표시되는 화합물B의 상대성 입체 화학적 특성은 NOESY 실험에 의해 결정되었다. H-3 및 H-5 사이, 그리고 H-5 및 H-6 사이에서 관찰된 중요한 NOE 크로스-피크(cross-peak)가 H-3, H-5 및 H-6이 피페라진 고리의 동일한 β-페이스(face)에 존재하는 것과, 그 고리의C-3, C-5 및 C-6에서의 치환체가 α-오리엔테이션(orientation)을 가지는 것을 입증하였다. 또한 H-1``a 및 H3-2```사이의 상관관계와 H3-2``` 및 H3-3`` 사이의 상관관계는 상기 화합물의 상대적인 구조를 제공한다 (도 2).The relative stereochemical properties of the compound B represented by the formula (2) were determined by NOESY experiments. H-3 and H-5, and between H-5 and a significant NOE cross observed between H-6 - peak (cross-peak) is H-3, H-5 and H-6 same β of the piperazine ring -Face in the ring and that the substituents at C-3, C-5 and C-6 of the ring have an orientation of ? -Independence. In addition, correlation between the H-H 3 -2``` 1``a and correlated with the H 3 and H 3 -2``` -3`` between provides a relative configuration of the compound (2 ).
또한, 본 발명의 화학식 1의 화합물 A는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물A는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.Compound (A) of the present invention can be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt. As the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful. Compound (I) of formula (I) may form acid addition salts which are pharmaceutically acceptable according to methods conventional in the art. Examples of the free acid include free acid and inorganic acid. Examples of the inorganic acid include hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid. Examples of the organic acid include citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid or aspartic acid Can be used.
또한, 본 발명은 피페라지움 화합물A를 추출하는 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a production method for extracting piperazinium compound A.
상기 제조방법은The above-
ⅰ) 아룸 팔래스티눔를 물 또는 알코올에 침지시켜 반복 추출하는 단계;I) repeatedly extracting Arum palastinum by immersing it in water or alcohol;
ⅱ) 상기 알코올 추출물에 유기용매를 가하여 추출하는 단계 ;Ii) extracting the alcoholic extract with an organic solvent;
ⅲ) 상기유기용매 추출 분획을 크로마토그라피(Chromatography)로 분리하여 항암활성물질을 얻는 단계 ; 및Iii) separating the organic solvent-extracted fraction by chromatography to obtain an anticancer active substance; And
ⅳ) 상기 분리된 각각의 항암활성물질을 정제하는 단계를 포함한다.Iv) purifying each of the separated anticancer active substances.
즉, 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A의 분리에 따른 각각의 추출물 및 분리물질을 제공하기 위하여, 아룸 팔래스티눔을 알코올 또는 물로 추출하여 얻은 추출물을, 에틸아세테이트 및 부탄올 등의 유기용매로 다시 추출하고, 이를 통하여 얻은 아룸 팔래스티눔 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피(Column Chromatography)로 분리하여 피페라지움 화합물A을 얻는다. 상기 수득한 분리물질이 항암활성을 나타냄을 확인하였다(표 2).That is, in order to provide each of the extracts and the separation material according to the separation of Arum palastinum-derived piperazinium compound A having anticancer activity, the extract obtained by extracting Arum palastinum with alcohol or water is dissolved in an organic solvent such as ethyl acetate and butanol Extracted with a solvent, and the obtained extract fraction of Arum palastinum organic solvent is separated by column chromatography packed with silica gel to obtain Piperazinium compound A. It was confirmed that the obtained separation material exhibited anticancer activity (Table 2).
이하 상기 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
먼저, 아룸 팔래스티눔으로부터 항암활성을 갖는 아룸 팔래스티눔 추출물을 분리한다. 이를 위하여, 본 발명자들은 아룸 팔래스티눔을 물 또는 알코올에 침지시켜 반복 추출함으로써 항암활성을 나타내는 아룸 팔래스티눔의 알코올 분획을 얻었다. 이 때, 아룸 팔래스티눔으로는 특히 잎 부분을 사용하고, 알코올로는 n-부탄올을 사용하는 것이 바람직하다.First, Arum palastinum extract having anticancer activity is isolated from Arum palastinum. For this purpose, the present inventors obtained alcohol fraction of Arum palastinum which shows anticancer activity by repeatedly extracting Arum palastinum by immersing it in water or alcohol. At this time, it is particularly preferable to use a leaf portion as the alum palustinum, and to use n-butanol as the alcohol.
상기한 바와 같이 아룸 팔래스티눔 잎을 n-부탄올을 이용하여 추출한 후 다시 유기용매를 사용하여 추출한 항암활성을 갖는 물질을 분리한다.As described above, the leaves of Arum palastinum are extracted using n-butanol, and then substances having anticancer activity extracted using an organic solvent are separated.
이 때, 유기용매를 이용한 추출은 비극성용매로부터 극성용매의 차례로 실시하며 유기용매는 알코올을 포함하여 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 부탄올 등이 사용될 수 있다. 바람직한 실시예로서, 본 발명은 에틸아세테이트 및 부탄올 등을 차례로 사용하여 각각의 용매 추출분획 및 물 분획을 제조하였다. 상기와 같은 용매를 사용한 용매 추출시, 아룸 팔래스티눔를 추출하는 온도는 4 내지 100℃ 범위인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 실온 또는 4 내지 30℃ 범위인 것이다. At this time, the extraction using an organic solvent is carried out in the order of a nonpolar solvent and a polar solvent, and the organic solvent may include alcohol, and ethyl acetate, chloroform, or butanol may be used. As a preferred embodiment, the present invention uses ethylacetate and butanol in sequence to prepare respective solvent-extracted fractions and water fractions. When the solvent is extracted using the above-mentioned solvent, the temperature for extracting Arum palastinum is preferably 4 to 100 ° C, more preferably room temperature or 4 to 30 ° C.
상기의 아룸 팔래스티눔으로부터 분리한 유기용매 추출분획을 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피를 이용하여 항암 활성을 가지는 물질을 분리하기 위하여, 상기 추출분획을 농축한 후 이를 메탄올이나 에틸아세테이트에 용해시켜 실리카젤이 충진된 칼럼 크로마토그라피에 점적하고 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 메탄올을 여러 가지 조성 비율로 혼합한 유기용매를 사용하여 용출·농축시킨 후 박막 크로마토 그라피로 분리하여 항암 활성을 나타내는 분리물질을 제조하였다.The organic solvent-extracted fraction separated from the above-mentioned Arum palastinum was subjected to column chromatography packed with silica gel to separate the substance having anticancer activity. The extracted fraction was concentrated and dissolved in methanol or ethyl acetate to obtain silica The eluate was eluted and concentrated using an organic solvent prepared by dissolving dichloromethane, ethyl acetate and methanol in various composition ratios by dropping on gel column chromatography, and then separated by thin layer chromatography to prepare a separation material exhibiting anticancer activity .
크로마토그래피 분석 결과, 항암활성을 갖는 분리물질의 이동율(run of flow :Rf)은 0.01 내지 0.5 사이에 위치하고 있으며, 이 이동율 부근의 분획을 모아 반복적으로 농축하여 항암활성을 갖는 물질을 분리하였다.As a result of the chromatographic analysis, the run-of-flow (Rf) of the separating material having anticancer activity was located between 0.01 and 0.5, and the fractions around the moving rate were collected and repeatedly concentrated to separate the substance having anticancer activity.
이와 같이 분리한 항암활성을 갖는 화합물을 더욱 정제하기 위하여, 진공 액체 크로마토그라피법(vacuum Pressure Liquid Chromatography)을 사용하여 비결정질의 흰색 분말 가루로서 수득하였다.In order to further purify the compound having the thus-isolated anticancer activity, it was obtained as an amorphous white powdery powder using vacuum pressure liquid chromatography.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해, 화학식 1로 표시되는 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물A 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물을 제공한다. In addition, the present invention provides a pharmaceutical composition for an anticancer drug comprising the piperazine compound A derived from Arum palastinum or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by the formula (1) as an active ingredient.
본 발명의 화학식 1로 표시되는, 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 임상투여시에 근육 또는 정맥 주사제와 같은 형태의 비경구 투여 뿐 아니라 경구로도 투여할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 기존의 항종양 의약품과 병용하여 사용될 수 있다.The piperazine compound derived from Arum palastinum or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by formula 1 of the present invention can be administered orally as well as parenteral administration such as muscle or intravenous injection in clinical administration , Can be used in combination with existing antineoplastic drugs in the form of generic medicinal products.
즉, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 및 그의 약학적으로 허용가능한 염은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. That is, the compound represented by the formula (I) of the present invention and its pharmaceutically acceptable salt may be administered in various formulations of oral and parenteral administration at the time of actual clinical administration. In the case of formulation, the filler, , A wetting agent, a disintegrant, a surfactant, or the like.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화학식 1 내지 3의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate ), Sucrose or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included .
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제 로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used as the non-aqueous solvent and suspension agent. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like can be used.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 활성 화합물의 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위로, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous, or muscular. In the case of humans, the usual daily dose of the active compound may be administered once or several times in the range of 1 to 1,000 mg / kg body weight, preferably 10 to 100 mg / kg body weight.
그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.It should be understood, however, that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of various relevant factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease, Are not intended to limit the scope of the present invention.
본 발명의 화학식 1로 표시되는, 아룸 팔래스티눔 유래 피페라지움 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제용 약학적 조성물은 A549 (인간 폐암 세포주), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주) 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주) 등의 인체 기원 암세포주들에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 각종 암의 예방 및 치료제로서 유용하다.A pharmaceutical composition for an anticancer agent comprising, as an active ingredient, a piperazine compound derived from Arum palastinum or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by the formula (1) of the present invention is A549 (human lung cancer cell line), SK-OV-3 (Human ovarian cancer cell line), SK-MEL-2 (human melanoma cell line), and HCT-15 (human colorectal cancer cell line), the present invention provides a prophylactic and therapeutic agent for various cancers useful.
전술한 바와 같이 아룸 팔래스티눔으로부터 분리된 세스키테르펜 알칼로이드 화합물은 인체기원 암세포주에 대하여 탁월한 세포증식 저해효과를 나타내므로 폐암, 난소암, 흑색종, 결장암 등 각종 악성종양의 예방 및 치료제로 사용될 수 있다.As described above, the sesquiterpene alkaloid compound isolated from Arum palastinum exhibits excellent inhibitory effect on cell proliferation against human cancer cell lines, and thus can be used as a preventive and therapeutic agent for various malignant tumors such as lung cancer, ovarian cancer, melanoma and colon cancer have.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. However, the following examples are merely preferred embodiments of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예1Example 1 : : 아룸Arum 팔래스티눔로으부터From palestinumro 수추출물의Water extract 제조 Produce
공기-건조된 아룸 팔래스티눔 잎 221.4 g 을 분말로 하여 물 1 L에 침지시킨 후 60 ℃ 5시간 동안 추출하였다. 상기 추출물을 여과한 후 잔사는 다시 물로 반복 추출하였으며, 이 과정을 모두 3회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 여과 후의 여액은 60℃에서 농축하여 수추출물 15.6 g을 제조하였다.221.4 g of air-dried arum palustinum leaves were dipped in 1 L of water and extracted at 60 ° C for 5 hours. After the extract was filtered, the residue was repeatedly extracted with water, and this procedure was repeated three times. The filtered solution obtained above was concentrated at 60 캜 to give 15.6 g of a water extract.
실시예2Example 2 : : 아룸Arum 팔래스티눔Palustinum 수추출물로부터From the water extract 다양한 유기용매 추출분획의 제조 Preparation of various organic solvent-extracted fractions
(1) 에틸아세테이트 추출분획의 제조(1) Preparation of an ethyl acetate extract fraction
상기 실시예 1에서 제조한 아룸 팔래스티눔 수추출물(15.6 g)을 에틸아세테이트 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 에틸아세테이트로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 에틸아세테이트층 을 모아 여과한 후 농축하여 에틸아세테이트 추출분획 1.7 g을 제조하였다.The arum palustinum water extract (15.6 g) prepared in Example 1 was shaken by adding 100 ml of ethyl acetate, and the mixture was allowed to stand for 5 hours, and substances transferred to ethyl acetate were collected and repeated four times. The ethyl acetate layer obtained above was collected, filtered, and concentrated to obtain 1.7 g of an ethyl acetate extract fraction.
(2) n-(2) n- 부탄올Butanol 추출분획의 제조 Preparation of the extract fraction
상기 실시예 1에서 제조한 에틸아세트추출분획을 제외한 아룸 팔래스티눔 수추출물 (13.2 g) 을 부탄올 100 ㎖을 넣어 진탕시킨 후 5시간 동안 정치시켜 부탄올로 이행되는 물질을 모았으며, 이를 4회 반복하여 실시하였다. 상기에서 얻은 부탄올층을 모아 여과한 후 농축하여 부탄올 추출분획 3.6 g을 제조하였다.100 ml of butanol was shaken by adding Arum palastinum water extract (13.2 g) except for the ethyl acetate-extracted fraction prepared in Example 1, and the mixture was allowed to stand for 5 hours to collect substances transferred to butanol. Respectively. The butanol layer obtained above was collected, filtered, and concentrated to obtain 3.6 g of butanol-extracted fraction.
실시예3Example 3 : 수용성 추출분획으로부터 : From the aqueous extract fraction 컬럼column 크로마토그라피에On chromatography 의한 항암 활성물질의 분리 Isolation of anticancer active substance by
상기 실시예 2에서 제조한 여러 유기용매 추출분획 중 n-부탄올 추출분획 1g을 진공 액체 크로마토그래피(vacuum liquid chromatography)에서 용출시켰다. 이때 용출 용매로는 1 : 1 조성의 디클로로메탄:메탄올을 사용하였다. 그 후, 메탄올과 물의 조성비율을 달리하여 Sepadex-LH20이 충진된 칼럼의 상단부에 주입하여 반복하여 정제한 후, 흰색의 비결정질 분말 형태로 화합물B를 수득하였다 (80 mg). 1 g of the n-butanol extract fraction of the various organic solvent-extracted fractions prepared in Example 2 was eluted from the vacuum liquid chromatography. At this time, dichloromethane: methanol having a 1: 1 composition was used as an elution solvent. Thereafter, compound B was obtained (80 mg) in the form of a white amorphous powder after repeatedly injecting into the upper part of the column filled with Sepadex-LH20 with different composition ratios of methanol and water.
참고예1Reference Example 1 : 각종 인체 기원 : Various human origins 암세포주에Cancer cell 대한 세포증식 저해효과 시험 Inhibitory effect on cell proliferation
A549 (인간 폐암 세포주, ATCC CCL 185), SK-OV-3 (인간 난소암 세포주, ATCC HTB 77), SK-MEL-2 (인간 흑색종 세포주, ATCC HTB 68), 및 HCT-15 (인간 결장암 세포주, ATCC CCL 225)의 4종의 인체 기원 암세포주를 미국 NCI (국립암연구 센터)로부터 분양받아 계대배양하여 사용하였으며, 암세포 증식 저해효과는 미국 NCI 및 기타 여러 검정기관에서 약물의 일차적 항암효과의 측정방법으로 가장 널리 사용하는 SRB (sulfrhodamine B) 방법 (Skehan, P.et al., (1990), J. Natl. Cancer. Inst., 82, 1107)에 준하여 다음과 같이 측정하였다.(Human lung cancer cell line, ATCC CCL 185), SK-OV-3 (human ovarian cancer cell line, ATCC HTB 77), SK-MEL-2 (human melanoma cell line, ATCC HTB 68), and HCT- (ATCC CCL 225) were purchased from the National Cancer Research Center (NCI) in the US. The cancer cell proliferation inhibitory effect was evaluated by using the primary anti-cancer effect (1990), J. Natl. Cancer. Inst., 82, 1107), which is the most widely used method for measuring the concentration of the sulfhydryl moiety in a sample.
1) 계대중의 암세포들을 트립신-CDTA 용액으로 처리하여 용기 부착면으로부터 분리시키고, 96-웰 편평 바닥 마이크로플레이트 (Falcon)에 각 웰당 세포수가 각각 5 x 10 3 (A549, HCT-15), 1 x 10 4 (SK-MEL-2, XF498) 및 2 x 104 (SK-OV-3)이 되도록 희석하여 분주하였다. 이들을 CO 2 배양기속에서 24시간 배양하여 세포가 웰의 바닥면에 부착(anchor)되도록 한 후 흡입기로 배지를 제거하고 배지에 녹여둔 검체를 농도별로 각각의 웰속에 넣어주고 48 시간동안 계속 배양하였다.1) Total cancer cells were treated with trypsin-CDTA solution and separated from the adherend surface. Cells were seeded in 96-well flat bottom microplates (Falcon) with 5 x 10 3 (A549, HCT-15) x 10 4 (SK-MEL-2, XF498) and 2 x 104 (SK-OV-3). The cells were incubated in a CO 2 incubator for 24 hours to allow the cells to be anchored to the bottom surface of the wells. The medium was removed with an inhaler, and the sample dissolved in the medium was added to each well at a concentration, followed by further incubation for 48 hours .
2) 48시간동안의 배양을 마친 후 각 웰속의 배지를 흡입 제거하고 10 % 트리클로로아세트산 (TCA) 용액을 각 웰당 10 ㎕씩 가하고 1 시간동안 상온에서 방치하여 세포들을 고정시킨 다음 물로 5-6회 세척하여 과잉의 TCA 용액을 완전제거하고 건조시켰다.2) After culturing for 48 hours, 10 μl of 10% trichloroacetic acid (TCA) solution was added to each well, and the cells were fixed at room temperature for 1 hour. The excess TCA solution was completely removed and dried.
3) 각 웰당 100 ㎕씩의 SRB 염색용액 (1 % 아세트산 중의 0.4 % 설포로다민)을 가하여 30분간 염색하고 과잉의 염색액은 1 % 아세트산으로 5-6회 반복 세척하여 제거한 후 상온에서 건조시켰다.3) 100 μl of SRB staining solution (0.4% sulphorodamine in 1% acetic acid) was added to each well and stained for 30 minutes. The excess staining solution was washed with 1% acetic acid repeatedly 5-6 times and then dried at room temperature .
4) 각 웰당 100 ㎕씩의 10 mM 트리스마 염기(Trisma base (unbuffered)) 용액을 가한 후 타이터 플레이트 진탕기(titer plate shaker)로 10분간 진탕하여 세 포에 염색된 염색액을 용출시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 520 nm에서의 흡광도치(absorbance)를 측정하였다.4) Add 100 μl of 10 mM Trisma base (unbuffered) solution to each well, and shake for 10 minutes with a titer plate shaker to elute the staining solution. The absorbance at 520 nm was measured using a microplate reader.
5) 검체용액을 넣어준 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth, 항암활성 의 역)은 다음수식에 따라 산출하였다. 즉 검체용액 대신 동량의 배지를 넣어준 대조군의 세포수(C)와 0 시간(zero time)의 세포수(Tz) 및 검체군의 세포수(T)를 각각 각군의 흡광도치로부터 환산하였다. 검체군의 암세포 증식율 (% cell growth)은 Tz> T인 경우에는 수학식1로, Tz< T인 경우에는 수학식 2로 계산하였다.5) The cell growth rate (% cell growth, inverse of anticancer activity) of the sample group in which the sample solution was added was calculated according to the following formula. In other words, the number of cells (C), the number of cells (Tz) at zero time (zero) and the number of cells (T) in the test group were calculated from the absorbance values of the respective groups. The cell growth rate (% cell growth) of the test group was calculated by Equation (1) when Tz > T and by Equation (2) when Tz < T.
수학식 1Equation 1
수학식 2Equation 2
6) 각각의 농도에서 측정한 검체군의 암세포 증식율을 바탕으로하여 LOTUS 프로그램의 데이터 회귀(data regression)를 사용하여 검체가 해당 암세포의 증식을 50 % 저해하는 농도 (ED 50 )를 계산하였다.6) Using the data regression of the LOTUS program, the concentration (ED 50) at which the sample inhibited the proliferation of the cancer cells by 50% was calculated based on the cancer cell proliferation rate of the test group measured at each concentration.
실시예4Example 4 : : 화합물2의Compound 2 인체기원Human origin 암세포 증식 저해효과(항암 활성 측정) Inhibitory effect of cancer cell proliferation (measurement of anticancer activity)
참고예의 방법에 따라, 실시예 3에서 얻은 화합물 B의 암세포 증식 저해효과를 A549를 비롯한 4종의 인체기원 암세포주에 대하여 검정하여 각 암세포주에 대한 50 % 증식저해 농도(ED50)를 표 2에 나타내었다.Note the 50% proliferation inhibitory concentration (ED 50) of each cancer cell lines, carried out in black against a cancer-cell proliferation inhibitory effect of the compound B obtained in Example 3, the four kinds of human origin cancer cell lines of including A549 according to the method of Table 2 Respectively.
인체 세포주
Human cell line
A549
A549
SK-OV-3
SK-OV-3
SK-MEL-2
SK-MEL-2
HCT15
HCT15
화합물 B
Compound B
4.26±0.2μＭ
4.26 ± 0.2 μM
1.38±0.1μＭ
1.38 ± 0.1 μM
0.51±0.1μＭ
0.51 ± 0.1 μM
2.47±0.3μＭ
2.47 ± 0.3 μM
각 암세포주에 대한 ED50값은 체외 세포증식을 50% 저해할 때의 값을 의미한다.The ED 50 value for each cancer cell line indicates the value when inhibiting the cell proliferation by 50%.
상기 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 화합물 1은 각종 암세포주에 대하여 우수한 세포 증식 저해효과를 나타낸다.As can be seen from the above Table 2, Compound 1 shows excellent cell proliferation inhibitory effect against various cancer cell lines.
도 1은 본 발명의 피페라지움 A의 HMBC(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)을 나타낸 도식도이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram illustrating Heterogeneous Multiple Quantum Correlation (HMBC) of piperazinium A of the present invention. FIG.
도 2는 본 발명의 피페라지움 A의 NOESY 상관성(Nuclear Overhauser effect spectroscopy Correlation) 및 상대적 입체화학적 특성을 나타낸 도식도이다.FIG. 2 is a schematic diagram showing the NOESY correlation (relative poregularity correlation) and the relative stereochemical characteristics of the piperazinium A of the present invention. FIG.
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| JP2006506384A (en) * | 2002-10-23 | 2006-02-23 | ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー | 2-alkyl- (2-amino-3-aryl-propionyl) -piperazine derivatives and related compounds as melanocortin receptor ligands for the treatment of obesity |
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|---|---|---|---|---|
| WO2019165023A1 (en) * | 2018-02-23 | 2019-08-29 | Ankh Life Sciences Limited | Nutritional supplement for mammals |
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