KR101477899B1 - Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent. - Google Patents
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Abstract
본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 균주를 분리하였다. 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 두 Bacillus 균주 CBW4와 EBW4는 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나고 염분에 내성을 갖고 있으므로 유기물로 오염된 양식장 폐수 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있을 것이다.The present invention is based on the finding that 31 colonies selected according to the color and shape of a colony emerging from the MA medium, which are endogenous to Perinereis aibuhitensis , which is known to have excellent organic decomposability in coastal tidal flats, After culturing, the strains contained in the genus Bacillus were isolated based on the 16S rRNA base sequence. Two Bacillus strains, CBW4 and EBW4, isolated from the nematode, are excellent in protein, carbohydrate and lipid - degrading properties and salinity tolerant. Therefore, they can be useful for the purification of organic wastewater contaminated with organic matter.
Description
본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 염분 내성 및 에스테라아제 활성을 갖는 바실러스(Bacillus ) 신규 균주 EBW4를 동정하는 한편, 동정된 신규 균주 EBW4를 이용한 천연 미생물제재를 제조하여 양식장 폐수와 반응시켜 양식장에서 배수되는 사육폐수에 포함되는 유기물을 분해하는데 적합한 양식장 폐수 처리용 미생물제재 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention is a natural microorganism using Bacillus (Bacillus) On the other hand, the identification of new isolates EBW4 to identify new strains EBW4 having known lug salinity tolerance and esterase activity that is endogenous to (Perinereis aibuhitensis) to be a very good organic resolution in coastal tidal The present invention relates to a microbial agent for the treatment of wastewater in a farm wastewater suitable for decomposing an organic matter contained in a wastewater discharged from a farm and reacting with a wastewater produced by the farm.
갯지렁이는 해양 무척추동물로 조간대 갯벌과 강 하구에 넓게 분포되어 있는 저서생물 중의 하나로, 스트레스를 받은 환경 조건에 대한 적응능력 때문에 연구자들은 이들 갯지렁이들을 환경 파수꾼으로서 뿐만 아니라 모니터링 프로그램을 위해 잠재적으로 중요한 생태종으로서 간주한다.Because of its ability to adapt to stressful environmental conditions, researchers are encouraged to use these worms as an environment watcher, as well as a potentially important ecological species for monitoring programs .
여과 섭식을 하는 많은 저서생물들은 흔히 가정이나 수서생태계에서 물의 유기물을 제거하고 정화하는데 흔히 사용되며, 특히 Perinereis sp.를 비롯한 여러 종의 갯지렁이들이 새우 양식장 환경에서 비통제 방식으로 사용되는 것으로 알려져 있다. Many benthic organisms that are fed with filtration are commonly used to remove and purify organics from water in homes and ecosystems, and several species of lupins , including Perinereis sp., Are known to be used uncontrolled in shrimp farm environments.
조간대에서 세균 군집에 미치는 대형무척추동물의 영향에 대한 연구에서 굴, 대합, 그리고 연체동물들은 비브리오균의 주요 저장소로 알려져 있다. 부유성 세균의 영양학적 기능과 관련하여 갯지렁이를 비롯한 여과 섭식자(suspension feeders)를 대상으로 폭 넓게 연구되어 왔으며 (Gili and Coma, 1998; Orejas et al ., 2000; Prieur et al ., 1990), 갯지렁이 Sabella spallanzanii는 주위 환경으로부터 매우 효과적으로 박테리아를 축적하고 농축할 수 있는 능력이 있음을 보고한 바 있다 (Stabili et al ., 2006b). In the study of the effects of large invertebrates on bacterial communities in the intertidal zone, oysters, clams, and mollusks are known to be the main repository of Vibrio spp. (Gili and Coma, 1998; Orejas et < RTI ID = 0.0 > et al ., 1998). ≪ / RTI > al ., 2000; Prieur et al ., 1990), lugworm Sabella spallanzanii has been reported to have the ability to accumulate and concentrate bacteria very effectively from the surrounding environment (Stabili et al ., 2006b).
특히 동물의 장내 미생물상은 영양분의 소화 및 흡수 능력을 향상시키거나 감염성 질병에 대한 체 저항성을 증가시킬 수 있는 수백 개의 다른 세균으로 구성되어 있다(Tannock, 1998; Walker and Duffy, 1998).In particular, intestinal microbes in animals are composed of hundreds of different bacteria that can enhance digestion and absorption of nutrients or increase body resistance to infectious diseases (Tannock, 1998; Walker and Duffy, 1998).
일반적으로, 배양된 세균으로부터 얻어진 자료는 특정 환경에 존재하는 전체 세균을 대표하지는 않아서 미생물 다양성에 대한 해석이 매우 제한적이기 때문에, 이를 극복하기 위해 최근에는 환경으로부터 genomic DNA를 직접 분리하여 metagenomic library를 조립한 후 16S rRNA 유전자 서열 결정을 통하여 미생물다양성을 분석하는 연구가 활발히 수행되어 왔다.In general, data obtained from cultured bacteria do not represent whole bacteria present in a specific environment, so that interpretation of microbial diversity is very limited. In order to overcome this, recently, genomic DNA was isolated directly from the environment to construct a metagenomic library After 16S rRNA sequencing, microbial diversity has been actively studied.
이러한 배양법에 의한 세균의 연구는 잠재적인 대사활성은 물론 생지화학적 순환에서 종속영양세균의 역할에 대한 의미있는 정보를 제공해줄 뿐만 아니라, 특히 Bacillus에 속하는 수많은 종들은 배양이 가능하다는 점에서 배양세균에 대한 연구로도 충분히 의미있는 가치를 도출할 수 있을 것이다. 이를 바탕으로 본 발명은 연안 갯벌 지렁이에 서식하는 바실러스(Bacillus ) 균 다양성 분석에 초점을 맞추어 MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 바실러스(Bacillus ) 균주를 동정하였다. Studies of bacteria by these methods not only provide meaningful information on the role of heterotrophic bacteria in biogeochemical cycling as well as potential metabolic activity, but in particular that many species belonging to Bacillus can be cultured, A study on Korea will also provide meaningful value. Invention this end, based on the Bacillus (Bacillus) bacteria focussed on the diversity analyzed by separate screening of the selected 31 colonies depending on the color and shape of colonies (colony) indicated by growth in MA medium pure culture inhabiting the coast tidal earthworm after the basis of 16S rRNA sequences were identified Bacillus (Bacillus) strain.
한편, 전 세계적으로 식량 위기에 대응하여 양식업에 대한 관심이 집중되고 있으며, 양식업은 수산 식량 공급의 주요 원천으로 그 역할이 높아지고 있다. 최근 양식장은 어류의 대량 생산 기반을 갖추고 있고, 양식장 내의 사육수의 순환 및 배수에 관한 방식 및 장치와 관련한 기술 개발이 이루어지고 있다. On the other hand, interest in the aquaculture industry has been focused around the world in response to the food crisis, and aquaculture is playing a major role as a major source of aquatic food supply. Recently, farms have a mass production basis for fish, and technologies for the circulation and drainage of the breeding water in the farm are being developed.
특히, 육상에서 해산어를 양식하는 경우, 사육수로서 해수를 사용하여야하며, 양식생물의 사육에 사용된 사육수는 사육생물이 배설한 유기물, 사료찌꺼기 등이 혼합되어 있어 이를 재사용하기 어렵다. 따라서 양식어류를 사육한 사육수 내에 존재하는 유기물을 분해할 수 있는 미생물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있고, 이는 어류들의 분비물 및 사료 찌꺼기 등이 존재하는 사육수를 배수하지 않고 오염된 사육수 안에 존재하는 단백질, 탄수화물, 지질 등과 같은 유기물을 미생물을 접종하여 배양함으로서 미생물에 의해 자연적으로 분해하여 다시 사용할 수 있는 양식장 폐수를 정화하여 처리할 수 있는 연구들이 진행되고 있다.In particular, when sea fish are cultured on land, seawater should be used as breeding water, and it is difficult to reuse the breeding water used for breeding of aquaculture because it is mixed with organic matter, animal waste, and the like. Therefore, studies on microorganisms capable of decomposing organic matter present in the breeding stocks of cultured fish have been actively conducted, and it is considered that the microorganisms which do not drain the water containing the secretions of fishes and feed residue, Studies have been carried out to purify and treat cultured wastewater which can be decomposed and reused by microorganisms by inoculating and culturing microorganisms such as existing proteins, carbohydrates and lipids.
본 발명에서는 연안 갯벌 지렁이에 서식하는 염분 내성이 강한 바실러스(Bacillus ) 균주를 동정하여 동정된 바실러스(Bacillus ) 균주의 고분자 분해효소 활성시험을 통해 단백질, 탄수화물, 지질 분해능을 확인함으로서 유기물로 오염된 양식장 사육수의 환경을 정화할 수 있는 미생물 제재를 제공하고자한다.
The present invention, contaminated with organic material by using a polymer decomposition enzyme activity test of Bacillus (Bacillus) strains identified by salinity tolerance is identified in a strong Bacillus (Bacillus) strains that inhabit coastal tidal worm determine the protein, carbohydrate, lipid resolution farms And to provide a microbial agent capable of purifying the environment of the breeding water.
본 발명은 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 새로운 바실러스(Bacillus )균주를 동정함과 동시에 상기 균주들을 이용하여 단백질, 탄수화물, 지질 분해능을 검증함으로서 양식생물에 의한 유기물로 오염된 양식장 사육수의 오폐수처리에 적합한 미생물제제를 제공하고자 하는 것이다.
The invention at the same time as identification of new Bacillus (Bacillus) strain is known to be associated closely with the digestion and biological immune nutrient Microbe that endogenous to the lug (Perinereis aibuhitensis) known to be very excellent organic resolution in coastal tidal The present invention is to provide a microorganism preparation suitable for treating wastewater from aquaculture farms contaminated with organic matter by aquaculture by verifying the protein, carbohydrate and lipid resolution using strains.
본 발명에서는 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 분석하였다. In the present invention, a lignite ( Perinereis aibuhitensis ) were analyzed based on the culture method. Bacillus sp. Bacillus sp. Bacillus sp .
MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 11 균주를 분리하였다. Bacills 속(genus)에 포함되는 11 균주의 다양성을 분석한 결과, 바실러스 알지콜라(Bacillus algicola), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthrasis), 바실러스 아퀴마리스( Bacillus aquimaris), 바실러스 바바리쿠스(Bacillus barbaricus), 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis), 바실러스 난히엔시스(Bacillus nanhiensis), 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis) 등 모두 7 종 (species)의 Bacillus spp.가 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하는 것으로 조사되었다. 31 colonies were selected and sorted according to the color and shape of colonies grown on MA medium. Then, 11 strains contained in Bacillus were isolated from 16S rRNA sequences. Bacills As a result of analysis of the diversity of 11 strains contained in the genus, Bacillus alcicola algicola), Bacillus anthraquinone system (Baci llus anthrasis), Aquitania Maris Bacillus (Bacillus aquimaris , Bacillus barbaricus), N-Sys Hwajinpo Bacillus (Bacillus hwajinpoensis), N-Sys nanhi Bacillus (Bacillus nanhiensis), Viet Nam N-Sys Bacillus (Bacillus of Bacillus spp vietnamensis) including all seven kinds (species). The lug (Perinereis aibuhitensis ).
본 발명에서 밝혀진 11개의 Bacillus 균주의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 Bacillus 균주 바실러스 안트레시스(이하 "CBW4" 라 한다)와 바실러스 화진포엔시스(이하 "EBW4" 라 한다) 의 특성을 분석하였다. The systematic analysis of the 16S rRNA sequences of the 11 Bacillus strains revealed in the present invention was broadly classified into five groups. Among them, Bacillus strain Bacillus anthracis (hereinafter referred to as "CBW4") and Bacillus virginaceus strain (Hereinafter referred to as "EBW4").
고분자 분해효소 활성 시험을 통하여 균주 CBW4와 EBW4 모두가 DNAse 활성과 함께, 카제인을 분해하여 단백질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 또한 CBW4는 starch를 분해하는 효소 활성을 가지고 있었으나 EBW4는 starch 분해능이 없는 것으로 나타났고, CBW4와 EBW4 모두 대부분의 Tween을 분해하는 것으로 나타나 지질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다.
Both the CBW4 and EBW4 showed DNAse activity and protease activity by degrading casein. In addition, CBW4 had enzymatic activity to degrade starch, but EBW4 showed no starch degradation, and both CBW4 and EBW4 showed lipase activity.
본 발명에서 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물 중 영양물질의 소화 및 생물면역과 밀접하게 연관된 것으로 알려져 있는 Bacillus균의 다양성을 배양법에 기초하여 EBW4 균주를 동정하였고 동정된 미생물의 활성 분석결과로부터 유기물로 오염된 양식장 폐수를 정화하는데 필요한 미생물제제로서 유용하게 사용가능하여 육상양식에서 사육수 재활용이 가능하여 양식장 주변의 환경보호에 효과가 있다..
In the present invention, the lignite ( Perinereis The EBW4 strain was identified on the basis of the cultivation method of Bacillus bacterium, which is known to be closely related to the digestion and bio-immunity of the nutrients in the aibuhitensis. From the results of the activity analysis of the identified microorganisms, Can be usefully used as a microbial agent to purify water. Therefore, it is possible to recycle water for breeding in the aquaculture form, which is effective in protecting the environment around the farm.
도 1은 갯지렁이의 사진을 나타낸다.
도 2은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 다양성을 나타내는 모식도이다.
도 3은 갯지렁이로부터 분리 동정한 바실러스 속 균주의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 4는 갯지렁이 유래 Bacillus sp. 균주의 계통관계를 나타내는 모식도이다.
도 5는 분리한 바실러스 속(기탁번호:KACC91749P)의 특허미생물 수탁증을 나타낸다.
도 6은 갯지렁이 유래 Bacillus sp. 균주로부터 미생물제제를 제조하기 위한 방법을 나타내는 모식도이다.
도 7은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주를 이용하여 제조된 미생물제제가 사용되는 양식장 폐수처리시설의 예를 나타낸다.Figure 1 shows a photograph of a snakehead.
2 is a schematic diagram showing the diversity of the Bacillus strain derived from the nematode .
Fig. 3 shows the nucleotide sequence of the 16S rDNA gene of Bacillus subtilis isolated and isolated from the worms.
Figure 4 is derived from Bacillus lug sp. Is a schematic diagram showing the systematic relationship of the strain.
Figure 5 shows the patented microorganism deposit of the genus Bacillus (Accession No .: KACC91749P) isolated.
FIG. 6 is a schematic view of a Bacillus sp. Is a schematic view showing a method for producing a microorganism preparation from a strain.
Fig. 7 is a schematic view of a bacillus-derived Bacillus Shows an example of a farm wastewater treatment facility in which a microorganism produced using a strain is used.
본 발명은 갯지렁이로부터 동정된 기탁번호: KFCC91749P의 바실러스(Bacillus sp.) 속 균주로부터 배양되는 염분 내성을 갖고 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 중에 선택되는 어느 하나 이상의 유기물 분해능과 에스테라아제 활성을 갖는 새로운 균주 바실러스를 이용한 천연 미생물제재를 제조하여 양식장 폐수와 반응시켜 양식장에서 배수되는 사육폐수에 포함되는 유기물을 분해하는데 적합한 양식장 폐수 처리용 미생물제제 및 이의 제조방법을 제공한다.The present invention relates to a novel strain having salinity tolerance cultured from a strain of Bacillus sp. Of KFCC91749P, which has been identified from a nematode, and which has at least one organic compound selected from proteins, carbohydrates, lipids and surfactants and has an esterase activity Provided is a microorganism preparation for treating a wastewater for cultivation and a method for producing the microorganism preparation, which is suitable for decomposing organic matter contained in reared wastewater discharged from a farm, by producing a natural microorganism agent using Bacillus, and reacting with the wastewater.
또한 본 발명은 상기 균주 배양물을 유효성분으로 함유하는 갯벌 정화용 미생물 제제 및 상기 균주를 사용하여 갯벌에 고정된 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 중에 선택되는 어느 하나 이상의 유기물을 분해시키는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a microorganism preparation for purification of tidal flats containing the culture of the strain as an active ingredient and a method for decomposing any one or more organic substances selected from protein, carbohydrate, lipid and surfactant immobilized on the tidal flat by using the strain .
본 발명의 신균주인 상기 바실러스 속 균주는 본 발명자들에 의해 최초로 분리 동정된 것으로서, 연안 갯벌에서 유기물 분해능이 매우 우수한 것으로 알려진 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하고 있는 미생물을 배양법에 기초하여 처음으로 분석하였다. The strain of the genus Bacillus, which is a new strain of the present invention, was first isolated and identified by the inventors of the present invention, and was identified as Perinereis aibuhitensis ) was first analyzed based on the culture method.
MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 선별한 31개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, Bacillus 속에 포함되는 11 균주를 분리하였다. 31 colonies were selected and sorted according to the color and shape of colonies grown on MA medium. Then, 11 strains contained in Bacillus were isolated from 16S rRNA sequences.
Bacills 속(genus)에 포함되는 11 균주의 다양성을 분석한 결과, 바실러스 알지콜라(Bacills algicola), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthrasis), 바실러그 아퀴마리스( Bacills aquimaris),바실러스 바바리쿠스(Bacills barbaricus), 바실러스 화진포엔시스(Bacills hwajinpoensis), 바실러스 난히엔시스(Bacills nanhiensis), 바실러스 비엔트남엔시스(Bacills vietnamensis) 등 모두 7 종 (species)의 Bacillus spp.가 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)에 내생하는 것으로 조사되었다. Bacills As a result of analysis of the diversity of the 11 strains contained in the genus, Bacillus alcicola algicola), Bacillus anthraquinone system (Baci llus anthrasis), Basil lug Aquitania Maris (Bacills aquimaris , Bacills barbaricus , Bacills hwajinpoensis), Bacillus nanhi N-Sys (Bacills nanhiensis), Bacillus Bien teunam N-Sys (Bacills of Bacillus spp vietnamensis) including all seven kinds (species). The lug (Perinereis aibuhitensis ).
분리한 균주의 16S rDNA 서열 검색에 의한 분자 유전학적인 방법에 의해 분석하여 동정한 결과, 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 CBW2와 CBW4는 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis 15-1T) 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis ATCC 14578T)와 각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보였으며, EBW4는 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis SW-72T)와 96.8%의 상동성을 보여 신종(new species) 균주임을 알 수 있었다. The 16S rDNA sequences of the isolated strains were analyzed by molecular genetic analysis. As a result, the systematic analysis of the 16S rRNA sequences of eleven Bacillus strains revealed that they were divided into five groups, The middle strains CBW2 and CBW4 were obtained from Bacillus < RTI ID = 0.0 > Bacillus & vietnamensis 15-1 T ) And Bacillus anthracis ATCC 14578 T ) and Bacillus anthracis (90.7%) and 94.2%, respectively, and EBW4 was homologous to Bacillus hwajinpoensis SW-72 T ) and 96.8% homology, indicating that it was a new species.
이에 본 발명자들은 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis SW-72T)와 96.8%의 상동성을 보인 상기 분리 및 동정된 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. EBW4"라고 명명하였으며, 2012년 10월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91749P를 부여받았다.
Thus, the present inventors have found that Bacillus sp. hwajinpoensis SW-72 T ) and The isolated and identified novel strain of the present invention, which showed 96.8% homology, was designated " Bacillus & sp. EBW4 "and deposited with KACC, National Institute of Agricultural Science and Technology, on October 26, 2012, and received the deposit number KACC91749P.
이하 갯지렁이에서 신규주를 동정하기 위한 방법 및 균주의 유기물 분해능에 대하여 실시예를 중심으로 설명한다.
Hereinafter, the method for identifying a new strain in the barnacles and the organic matter decomposition ability of the strain will be described with reference to examples.
1 갯지렁이로부터의 균주 분리 동정 1 Identification and isolation of strains from the marshes
1.1 균주 분리 및 배양 조건1.1 Strain isolation and culture conditions
본 발명에서 균주 분리원으로 사용한 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)는 순천만 갯벌 양식장에서 채취하였다. 도 1은 채집된 갯지렁이의 사진을 나타내며, 도 2는 갯지렁이 유래 바실러스(Bacillus) 균주의 동정방법을 나타내는 모식도이다.In the present invention, the lupine ( Perinereis aibuhitensis ) were collected from the Suncheon Bay tidal flat farm. Fig. 1 is a photograph of the collected lugworm, and Fig. 2 is a schematic diagram showing a method of identifying a Bacillus strain derived from a winged worm.
갯지렁이 내부에 존재하는 미생물을 분리하기 위해 살아있는 갯지렁이를 BM buffer (Mikesell et al ., 1993) 50 mL가 포함된 conical tube에 넣은 후 vortex에서 세 번 세척한 후, 70% ethanol에서 짧게 다시 한 번 세척하였다. 세척한 갯지렁이를 멸균된 면도날로 갯지렁이의 복부를 가르고 다시 여러 개의 매우 짧은 마디로 절단한 후, BM buffer 50 mL가 포함된 conical tube에 넣어 격렬하게 vortexing 하여 갯지렁이 내생 미생물이 buffer안으로 빠져나오게 하였다. In order to isolate the microorganisms present inside the barnacle, living rats were placed in BM buffer (Mikesell et al ., 1993) . The cells were washed three times in vortex and then briefly washed once in 70% ethanol. The washed ridge was cut with a sterilized razor blade and then cut into several very short segments. The ridge was vortexed in a conical tube containing 50 mL of BM buffer, and the endogenous microorganism of the rug was allowed to escape into the buffer.
이어서, 갯지렁이를 제거한 후 12000 rpm으로 원심분리하여 pellet을 모은 후 2mL의 BM buffer를 첨가하여 잘 섞은 후, 100㎕씩 고체 Bacto marine agar 2216(MA)배지에 접종하여 미생물을 배양하였다. MA배지는 1:10과 1:2로 희석한 배지 및 희석하지 않은 배지를 동시에 사용하여 배양법에 의하여 분석할 수 있는 미생물 다양성을 높이고자 하였다. 기타 환경조건별 균주의 생장 여부를 파악할 때는 분리한 모든 균주가 LB에서 생장할 수 있었기 때문에, LB 또는 LB agar 배지를 기본배지로 사용하였으며, 구체적인 균주 배양조건은 환경 조건별 생장시험에 자세히 나타내었다.
The pellet was collected by centrifugation at 12,000 rpm, and 2 mL of BM buffer was added thereto. The microbial cells were inoculated into 100 μl of the solid Bacto marine agar 2216 (MA) medium. MA medium was used to increase the microbial diversity that can be analyzed by the culture method using both the 1:10 and 1: 2 diluted medium and the undiluted medium at the same time. LB or LB agar medium was used as the primary culture medium, and detailed culture conditions were detailed in the growth test according to the environmental condition, because all strains isolated were able to grow in LB .
1.2. 1.2. TotalTotal genomicgenomic DNADNA 분리와 정제 Separation and purification
각 균주를 50 mL의 LB 배지에 접종하고 30℃에서 180 rpm으로 24시간 동안 배양한 후 원심분리 (6,300×g, 10 min, 4℃)하여 세포를 수확하였다. 회수된 배양세포를 5 mL TES buffer [0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.01 M EDTA, 1 M NaCl]로 재현탁하고, lysozyme (10 mg/mL)을 200㎕ 첨가하여 37℃에서 15분간 반응시켰다.Each strain was inoculated into 50 mL of LB medium, cultured at 30 ° C. at 180 rpm for 24 hours, and harvested by centrifugation (6,300 × g, 10 min, 4 ° C.). The recovered cultured cells were resuspended in 5 mL of TES buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0.01 M EDTA, 1 M NaCl), 200 μl of lysozyme (10 mg / mL) Lt; / RTI >
10% SDS를 100㎕ 첨가하고, 물리적인 DNA 절단을 방지하기 위하여 천천히 섞어준 후 50㎕ proteinase K (20㎎/㎖)와 5㎕ RNase를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 5㎖ TES buffer를 더 첨가형 10㎖의 phenol을 첨가하여 잘 섞어주었다. 100 μl of 10% SDS was added and mixed slowly to prevent physical DNA cleavage. Then, 50 μl proteinase K (20 mg / ml) and 5 μl RNase were added and reacted at 37 ° C for 30 minutes. Add 5 ml of TES buffer, add 10 ml of phenol, and mix well.
원심분리를 통하여 얻어진 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 동량의 phenol/chloroform/isoamyl alcohol로 2회, chloroform으로 1회 처리하였다. 상징액을 취하여 새로운 tube로 옮긴 후 1/10 volume의 3M sodium acetate(pH. 5.4)와 2-3 volume의 100% ethanol을 첨가하여 30분간 실온에서 방치하였다. 원심분리 후 상징액을 버리고, 70% ethanol을 처리하여 염류를 씻어낸 후, 다시한번 원심분리하였다. 상징액을 버리고 공기 중에서 ethanol을 제거한 후, 침전물 500㎕의 멸균수에 녹여 다음 실험에 사용하였다. The supernatant obtained by centrifugation was transferred to a new tube and treated with the same amount of phenol / chloroform / isoamyl alcohol twice and once with chloroform. The supernatant was transferred to a new tube, and 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.4) and 2-3 volumes of 100% ethanol were added and left at room temperature for 30 minutes. After the centrifugation, the supernatant was discarded, the salts were washed with 70% ethanol, and centrifuged again. The supernatant was discarded, ethanol was removed from the air, and the precipitate was dissolved in sterilized water to be used in the next experiment.
0.8% agarose gel에 전기영동을 실시하여 DNA band를 확인한 후 UV-spectrophotometer (여 800, Beckman Coulter, Fullerton, USA)를 이용하여 정량하였다. Total DNA의 정제를 위해 crude DNA를 10㎖ cesium chloride용액에서 녹인 후 ethidium bromide를 첨가하여 102,200um membrane filter를 이용하여 30분간 투석하여 DNA 용액을 회수하여 농축한 후 특정 유전자의 증폭 또는 클로닝을 위한 시료를 사용하였다.
After electrophoresis on 0.8% agarose gel, the DNA band was identified and quantified using a UV-spectrophotometer (F 800, Beckman Coulter, Fullerton, USA). For purification of total DNA, crude DNA was dissolved in 10 ml of cesium chloride solution, ethidium bromide was added, dialyzed against 102,200um membrane filter for 30 minutes, and the DNA solution was recovered and concentrated. Then, a sample for amplification or cloning of a specific gene Were used.
1.3. 16S 1.3. 16S rRNArRNA 유전자 염기서열 및 계통관계 분석 Analysis of gene sequence and systematic relationship
세균의 16S rDNA 염기서열 분석은 분리 균주들을 액체 배지에서 30℃에서 2일-3일 동안 배양한 후 이로부터 추출된 chromosomal DNA를 PCR 반응의 주형으로, 프라이머는 Eub27F : 5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG- 3'와 Eub1522R : 5' -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA- 3'로 이루어진 한 세트가 사용하였다.Bacterial 16S rDNA sequencing was performed by culturing the isolates in liquid medium at 30 ° C for 2 days to 3 days. The chromosomal DNA extracted from the chromosomal DNA was used as a template for PCR reaction and the primers were Eub27F: 5 '-AGA GTT TGA TCC A set of TGG CTC AG- 3 'and Eub 1522R: 5' -AAG GAG GTG ATC CAR CCG CA- 3 'was used.
PCR 반응은 GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT)를 사용하여 수행하였고, 반응 조건은 95℃에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 30번 반복하여 마지막에는 72℃에서 1분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. 증폭된 DNA는 1.0% agarose gel에서 전기영동한 후 gel extraction kit(SolGent사)에 의해 회수되었다. The PCR reaction was performed using GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CT). The reaction conditions were 95 ° C for 5 minutes, 1 minute at 95 ° C, 1 minute at 55 ° C, 1 minute at 72 ° C 30 times and finally at 72 ° C for 1 minute and then stored at 4 ° C. The amplified DNA was recovered by gel extraction kit (SolGent) after electrophoresis on 1.0% agarose gel.
회수된 DNA는 pGEM-T easy vector(Promega, Madison, Wisconsin)에 ligation한 후 E. coli JM109에 형질전환하였다. 형질전환된 클론의 플라스미드 DNA를 분리한 후 promoter primer나 SP6 promoter primer를 이용하여 ABI 377 자동염기서열 분석기(Applied Biosystem, Foster, USA)에서 양방향으로 DNA sequencing을 수행하였다.The recovered DNA is then ligation in pGEM-T easy vector (Promega, Madison, Wisconsin) E. coli JM109. The plasmid DNA of the transformed clones was isolated and DNA sequencing was performed bidirectionally using an ABI 377 automated sequencer (Applied Biosystem, Foster, USA) using a promoter primer or SP6 promoter primer.
결정된 염기서열은 Ribosomal Database Project-Ⅱ(http://rdp.cme.msu.edu) GenBank http://ncbi.nlm.nih.gov의 database를 이용하여 분석하였다. 염기서열이 결정된 미생물의 계통관계는 EZtaxon을 이용하여 type 균주들의 16S rNA 염기서열과의 관계를 나타내었다.
The determined nucleotide sequence was analyzed using the database of Ribosomal Database Project-II (http://rdp.cme.msu.edu) GenBank http://ncbi.nlm.nih.gov. The systematic relationship of the microorganisms determined by the nucleotide sequence was shown to be related to the 16S rNA nucleotide sequence of the type strain using EZtaxon.
1.4 배양의존성 갯지렁이 내생 미생물 분리 결과1.4 Culture-Dependent Endosperm Segregation Results
희석법에 의해 3 종류의 영양분의 농도로 조정하여 제조된 MA 배지에 갯지렁이 추출물이 포함된 BM buffer 0.1 mL를 접종하여 분리 배양한 세균들을 분석하였다. MA 배지에서 생장하여 나타난 집락(colony)의 색깔과 모양에 따라 30개의 집락을 별도로 선별하여 순수배양한 후 16S rRNA 염기서열에 기초하여 동정한 결과, 11 균주가 Bacillus 속(genus), 1 균주가 Micrococcus 속, 1 균주가 Pantoea 속, 7 균주가 Shewanella 속, 10 균주가 Vibrio 속에 포함되는 것으로 밝혀졌다 (표 1).
Bacterial isolates were obtained by inoculating 0.1 mL of BM buffer containing the extract of Rubus coreus into MA medium prepared by adjusting the concentration of three kinds of nutrients by dilution method. Thirty colonies were screened and cultured according to the color and shape of the colonies grown on the MA medium. 11 colonies were identified on the basis of the 16S rRNA nucleotide sequence. As a result, 11 strains were identified as Bacillus 1 genus, 1 strain of Micrococcus , 1 strain of Pantoea , 7 strains of Shewanella genus, and 10 strains of genus Vibrio (Table 1).
1.5 갯지렁이 유래 1.5 Origin of lug BacillusBacillus 균주의 다양성 및 계통관계 분석 Analysis of strain diversity and phylogenetic relationships
본 발명에서 바실러스 알지콜라(Bacillus algicola), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthrasis), 바실러스 아퀴마리스(Bacillus aquimaris), 바실러스 바바리쿠스(Bacillus barbaricus), 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis), 바실러스 난히엔시스(Bacillus nanhiensis), 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis) 등 다양한 종의 Bacillus가 갯지렁이 내에 서식하는 것으로 나타났다. Bacillus in the present invention know coke (Bacillus algicola), Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthrasis), Aquitania Maris Bacillus (Bacillus aquimaris ) , Bacillus bavaricus (Ba cillus barbaricus , Bacillus hwajinpoensis , Bacillus nanhiensis , Bacillus vietnamensis , Bacillus species were found to be inhabited in the barnacles.
분리한 균주의 16S rRNA 서열 검색에 의한 분자 유전학적인 방법에 의해 분석하여 동정한 결과, 밝혀진 11개의 Bacillus 균의 16S rRNA 염기서열을 기초로 계통관계를 분석하였을 때 크게 5개 그룹으로 구분되었으며, 그 중 균주 CBW2와 CBW4는 Bacillus vietnamensis 15-1T 및 Bacillus anthracis ATCC 14578T와 각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보여 신종(new species)일 가능성이 매우 높은 것으로 사료된다. The 16S rRNA sequences of the isolated strains were analyzed by molecular genetic analysis. As a result, the systematic analysis of the 16S rRNA sequences of the 11 Bacillus strains revealed that there were five groups, Among the middle strains CBW2 and CBW4, Bacillus vietnamensis 15-1 T and Bacillus anthracis ATCC 14578 T and (90.7%) and 94.2% (94.2%), respectively.
도 3은 본 발명에서 분리한 바실러스 안트레시스 ATCC 14578 균주와 상동성이 높은 Bacillus sp. CBW4의 16S rDNA 유전자의 염기서열을 나타내며, 도 4는 갯지렁이 유래 Bacillus 균주의 계통관계를 나타내는 모식도를 나타낸다. 갯지렁이에내생하는 미생물에 대한 발명은 본 발명에서 처음 밝혀진 것으로 이들 미생물 군의 기능과 관련해서는 추후 심층적인 연구가 이루어질 필요가 있다. 본 발명에서 갯지렁이(Perinereis aibuhitensis)로부터 분리한 세균 중 우점종으로 나타난 다양한 Bacillus에 대한 정보는 본 발명에서 처음으로 보고하는 것으로 파악되었다. FIG. 3 is a graph showing the results of the measurement of the homology with the Bacillus anthracis ATCC 14578 strain isolated in the present invention Bacillus sp. 4 shows the nucleotide sequence of the 16S rDNA gene of CBW4, and FIG. 4 shows a schematic diagram showing the systematic relationship of the Bacillus strain derived from the nematode. The inventions of microbes endogenous to the nematodes have been discovered for the first time in the present invention, and further research on the function of these microbial groups needs to be carried out in depth. In the present invention, information on various Bacillus species, which are dominant species among the bacteria isolated from the lupine ( Perinereis aibuhitensis ), was found to be reported for the first time in the present invention.
이에 본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 바실러스 비에트남엔시스(Bacillus vietnamensis) 15-1T 및 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis ) ATCC 14578T와 각각 90.7%와 94.2%의 상동성을 보인 본 발명의 신규주를 "Bacillus sp. CBW4"라고 명명하였으며, 2012년 6월 8일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91722P를 부여받았다. The present inventors have found that the isolated and identified Bacillus Viet Nam N-Sys (Bacillus vietnamensis) 15-1 T and Bacillus anthraquinone system (Bacillus anthracis ) ATCC 14578 T and Bacillus sp. CBW4 ", which showed 90.7% and 94.2% homology, respectively, was deposited with the National Institute of Agricultural Science and Technology (KACC), National Academy of Agricultural Science, on June 8, 2012 and deposited with the deposit number KACC91722P .
또한 바실러스 화진포엔시스(Bacillus hwajinpoensis SW-72T)와 96.8%의 상동성을 보인 본 발명의 신균주를 "Bacillus sp. EBW4"라고 명명하여, 2012년 10월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 기탁하여 기탁번호 KACC91749P를 부여받았고. 도 5는 본 발명에서 분리 동정한 Bacillus sp. EBW4의 특허미생물 수탁증을 나타낸다.In addition, Bacillus hwajinpoensis SW-72 T ) and The new strain of the present invention, which showed 96.8% homology, was named " Bacillus sp. EBW4 ", deposited with the National Institute of Agricultural Science and Technology (KACC) on October 26, 2012 and assigned the deposit number KACC91749P. FIG. 5 is a graph showing the activity of Bacillus sp. EBW4 patented microorganism deposit.
특히 분리된 Bacillus는 수질 정화 능력을 통하여 배양 생물의 생존을 향상시키고 성장을 촉진하는데 긍정적 효과를 미칠 수 있고, 또한 지질이 많이 포함되어 있는 유지물의 제거에도 lipase를 다량생산하는 Bacillus 종들이 활용될 수 있으므로, 본 발명에서 얻어진 다양한 Bacillus 균주들에 대한 심층적인 연구의 가치가 크다고 할 수 있으며, 본 발명에서는 유기물 분해능이 뛰어나 선별한 Bacillus 균주 EBW4에 대한 특성을 CBW4와 비교 조사하였다.
In particular, the isolated Bacillus has a positive effect on the survival of cultured organisms and promotes growth through its ability to purify water. In addition, Bacillus, which produces lipase in a large amount even in the removal of lipid- As species can be utilized, the various Bacillus < RTI ID = 0.0 > In the present invention, the properties of the selected Bacillus strain EBW4 were compared with those of CBW4.
2. 2. 갯지렁이에서From the lobster 동정한 Sympathetic 신규주의New caution 환경조건별 생장 특성 Growth Characteristics by Environmental Conditions
가. 환경 조건별 균주 생장 시험end. Strain Growth Test by Environmental Condition
본 발명에서는 온도, pH, 염도 등 세 가지 환경 조건을 달리하여 균주의 생장 여부를 조사하였다. 균 생장의 적정 온도 범위를 정하기 위해 균주를 LB 배지에 접종한 후 4℃, 15℃, 25℃, 30℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃으로 조건을 달리하여 각각 배양하였으며, 30℃이하는 LB 고체 배지에, 40℃부터는 LB 액체 배지에 균주를 접종한 후 수조(water bath)에서 배양하면서 생장 여부를 관찰하였다.In the present invention, the growth of the strain was investigated under different environmental conditions such as temperature, pH, and salinity. The strains were inoculated into LB medium and incubated at 4 ℃, 15 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 45 ℃, 50 ℃ and 55 ℃, respectively. The growth was monitored by inoculating the LB liquid medium with LB liquid medium at 40 ° C or less and then culturing in a water bath at 40 ° C or less.
균 생장의 적정 염도범위는 sodium chloride를 이용하여 LB 배지의 염도를 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%로 조정하였고, 균 생장의 적정 pH 범위는 NaOH와 HCl을 이용하여 LB 배지의 pH를 pH.3에서 pH.11까지 pH.1 단위로 조정하여 사용하였다. 균주의 생장 여부는 균주 접종 후 각 균주의 적정 생장 온도에서 5일간 배양하면서 생장여부를 확인하였다.
The optimal salinity range of the bacterial growth was adjusted to 1%, 3%, 5%, 7%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% and 15% The optimal pH range of the bacterial growth was adjusted by adjusting the pH of the LB medium to pH 1 to pH 1 using NaOH and HCl. The growth of the strain was confirmed by incubation for 5 days at the optimum growth temperature of each strain after the strain inoculation.
나. 갯지렁이 유래 선별 I. Selection of lobsters BacillusBacillus 균주의 배지 The culture medium of the strain 이용능Usability 시험 결과 Test result
본 발명에서 선별한 두 Bacillus 균주를 MA(marine agar), NA(nutrient agar), TSA (tryptic soy agar), R2A, LB (Luria-Bertani)배지에서 이용한 생장능을 시험한 결과, CBW4와 EBW4는 일부는 육상 혹은 담수에서 유래한 Bacillus 균주와는 다르게 LB, TSA, 또는 NA 배지에서 생장하지 못하는 것으로 나타났고, 시험한 두 균주 모두 다량의 염분을 포함하고 있는 MA배지에서 생장하는 것으로 나타나 염분 요구성이 모두 큰 것으로 나타났다(표 2).
The growth performance of two Bacillus strains selected in the present invention was tested using MA (marine agar), NA (nutrient agar), TSA (tryptic soy agar), R 2 A and LB (Luria-Bertani) EBW4 was not able to grow in LB, TSA, or NA medium, unlike Bacillus strain, which was derived from land or freshwater. Both strains were grown in MA medium containing a large amount of salinity, (Table 2).
CBW4
+
+
-
+
-
-
+
+
3. 3. 갯지렁이에서From the lobster 동정한 Sympathetic 신규주의New caution 생리, 생화학적 특성 Physiological and biochemical characteristics
가. 세균의 형태적, 생리 · 생화학적 특성 분석end. Morphological, physiological and biochemical characterization of bacteria
세균의 형태적·생리적 특성을 보기 위해 균주들을 MA(marine agar) 고체배지에 접종하여 25℃에서 배양하였다. 먼저 5-7일 동안 배양하면서 형성되는 단일 콜로니의 형태, 색깔, 크기를 관찰하였으며, 균주의 형태와 크기는 광학 현미경과 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 전자현미경 관찰 시, 배양된 세균을 4% glutaraldehyde로 2시간 동안 고정시킨 후 50mM phosphate 완충용액 (pH. 7.2)을 이용하여 세척하였다. 그리고 2% osmium tetroxide 용액에 1시간 고정한 후 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 에탄올로 탈수시킨 후 동결건조 시켰다. 이 후 ion sputter를 이용하여 gold coating을 한 후 전자현미경을 이용하여 관찰하였다.The strains were inoculated on MA (marine agar) solid medium and cultured at 25 ℃ to examine morphological and physiological characteristics of bacteria. First, the shape, color, and size of single colonies formed by 5-7 days of culture were observed. The shape and size of the strain were observed using optical microscope and scanning electron microscope. In the electron microscopic observation, the cultured bacteria were fixed with 4% glutaraldehyde for 2 hours and then washed with 50 mM phosphate buffer (pH 7.2). The cells were fixed in 2% osmium tetroxide solution for 1 hour and dehydrated with 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ethanol and lyophilized. After that, gold coating was performed using an ion sputter and observed with an electron microscope.
균주의 운동성은 0.4%의 agar를 포함시킨 semisolid 배지에서 확인하였고, 산소 대사와 관계된 oxidase는 Oxidase Reagent Kit(BioM'rieux)를 이용하여 콜로니 색의 변화로 분석하였다. Catelase는 3% 과산수소를 균체에 떨어뜨려 거품이 발생 유·무로 판단하였다.The motility of the strain was confirmed in semisolid medium containing 0.4% agar. Oxidase - related oxidase was analyzed by colony color change using Oxidase Reagent Kit (BioM'rieux). Catelase was determined to be bubbles by adding 3% and hydrogen peroxide to the cells.
기타 분리 균주의 생리·생화학적 특성은 여러 가지 API kit(BioMerieux)를 사용하였으며, API 20E, APL 20NE, API 50CHB, 그리고 API ZYM kit를 동시에 이용하여 균주의 특성을 조사하였다. 이때 균주는 MA 고체배지를 이용하여 25℃에서 2-3일간 배양하였으며, 성장된 균체는 멸균된 3% sea salt 용액에 현탁하여 제조회사의 지시에 따라 수행하였다. The physiological and biochemical characteristics of other isolates were determined using various API kits (BioMérieux), and the characteristics of the strains were investigated using API 20E, APL 20NE, API 50CHB, and API ZYM kit simultaneously. At this time, the strain was cultured in MA solid medium at 25 ° C for 2-3 days, and the grown cells were suspended in sterilized 3% sea salt solution and performed according to the manufacturer's instructions.
주요 조사 항목으로는 nitrate 환원반응, esterase(C4), esterase lipase(C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin 액화, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β-galactosidase, alkalin phosphatase, lipase(C14) 등이 효소활성 유무, indole 생성 여부 등을 들 수 있다. 또한 탄소원 mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate, phenyl-acetate 등의 동화 여부 등에 대하여 조사하였다.
Nitrate reduction reaction, esterase (C4), esterase lipase (C8), leucine arylamidase, acid phosphatase, naphtol-AS-Bi-phosphohydrolase, glucose acidification, gelatin liquefaction, arginine dihydrolase, urease, β-glucosidase, β -galactosidase, alkaline phosphatase, lipase (C14), etc., and indole production. We also investigated the assimilation of carbon sources such as mannitol, gluconate, malate, citrate, glucose, arabinose, mammose, N-acetyl-glucosamine, maltose, caprate, adipate and phenyl-acetate.
나. 갯지렁이 유래 선별 I. Selection of lobsters BacillusBacillus 균주의 생리생화학적 특성 분석 결과 Analysis of physiological biochemical characteristics of the strain
API 20NE kit를 이용하여 Bacillus 균주의 생리생화학적 특성을 분석하였다. 균주 CBW4와 EBW4 모두가 베타 글루코시다아제(β-glucosidase)와 프로테아제(protease) 효소 활성을 가지고 있었고, 말토오스(maltose)를 이용할 수 있는 것으로 나타났다(표 3). Biochemical and biochemical characteristics of Bacillus strains were analyzed using API 20NE kit. Both strains CBW4 and EBW4 had β-glucosidase and protease enzymatic activity and were able to utilize maltose (Table 3).
API 20E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4는 arginine dihydrolase, lysine decarboxylase, gelatinase 활성이 높은 것으로 나타난 반면, EBW4는 β-glucosidase와 gelatinase 활성을 가지고 있었다(표 4).
As a result of the test using API 20E kit, CBW4 showed high activity of arginine dihydrolase, lysine decarboxylase and gelatinase, while EBW4 had β-glucosidase and gelatinase activity (Table 4).
API 50CHB/E kit를 이용한 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 glycerol, ribose, glucose, fructose, esculin, cellobiose, maltose, trehalose, starch를 이용할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 arbutin, salicin, lactose 등을 이용할 수 있는 능력이 있는 반면, EBW4는 이들을 이용할 수 없었으나, CBW4 균주가 이용하지 못하는 mannose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acethyl-glucosamine, melibiose, sucrose, raffinose, D-turanose 등 다양한 당을 이용하는 것으로 나타나 두 균주가 상당히 다른 특성을 갖고 있었다(표 5).
As a result of the test using the API 50CHB / E kit, both CBW4 and EBW4 showed the ability to utilize glycerol, ribose, glucose, fructose, esculin, cellobiose, maltose, trehalose and starch. In addition, CBW4 was able to utilize arbutin, salicin, and lactose, while EBW4 was not available, but mannose, mannitol, α-methyl-D-glucoside, N-acethyl-glucosamine, melibiose, sucrose, raffinose, and D-turanose (Table 5).
API ZYM kit를 이용한 효소활성 시험 결과, 균주 CBW4와 EBW4 모두 alkaline phosphatase, leucine arylamidase, α-chymotrypsin 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. 이외에 CBW4는 매우 높은 acid phosphatase 활성과 함께 β-glucosidase 활성을 가지고 있는 것으로 조사되었다. EBW4는 CBW4 균주에서는 탐지하지 못한 에스테라아제(esterase) 활성을 갖고 있었다(표 6).
As a result of enzymatic activity test using API ZYM kit, both strains CBW4 and EBW4 showed alkaline phosphatase, leucine arylamidase and α-chymotrypsin activity. In addition, CBW4 has very high acid phosphatase activity and β-glucosidase activity. EBW4 had an undetectable esterase activity in the CBW4 strain (Table 6).
4. 4. 갯지렁이에서From the lobster 동정한 Sympathetic 신규주의New caution 양식장 사육 폐수 정화용 미생물 제제로의 응용 Application of microbial agent for cultivation of aquaculture wastewater
도 6은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주로부터 미생물제제를 제조하기 위한 방법을 나타내는 모식도를 나타낸다.FIG. 6 is a schematic view of a Bacillus 1 shows a schematic diagram showing a method for producing a microorganism preparation from a strain.
갯지렁이로 부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) EBW4(기탁번호:KACC91749P)를 액체 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하였으며, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태의 미생물제제로 제조하였다.A new strain of Bacillus ( Bacillus sp. sp . ) EBW4 (Accession No .: KACC91749P) was inoculated into a liquid culture medium and cultured at 25-30 ° C for 1-2 days. A part of the resultant obtained in the culturing step was aseptically dried as a liquid microbicide, the remaining part was aseptically dried, The resultant was aseptically pulverized to prepare a powdery microbial agent.
액상제조물의 경우는 색상조절을 위한 부형제로서 식용색소 등이 첨가될 수 있고, 저장성 개선을 위한 부형제로서 비타민 C등이 첨가될 수 있으며, 효소능력 활성화를 위한 부형제로서 Tween80등이 첨가될 수 있다. 고체분말용의 경우는 발효용 부형제로서 미강, 탈지강, 당밀 등이 부가적으로 첨가되고, 저장성 개선용 부형제로서 규산염 등이 첨가가능하다.
In the case of a liquid preparation, food coloring may be added as an excipient for color control, vitamin C may be added as an excipient for improving shelf life, and Tween 80 may be added as an excipient for activating the enzyme ability. In the case of a solid powder, rice bran, degreasing steel, molasses and the like are additionally added as an excipient for fermentation, and silicate or the like can be added as an excipient for improving shelf stability.
가. 고분자 물질 분해효소 활성 시험end. Polymerase chain reaction activity test
Bacillus는 다양한 고분자 물질 분해능이 있는 것으로 알려져 있어, 셀룰로오스, 녹말, 카세인, 그리고 계면활성제(Tween80)이 포함된 LB 고체 배지에 본 발명에서 분리한 Bacillus 균주들을 접종한 후, 이들 고분자 물질 분해에 관련된 효소, cellulase, amylase, protease, 그리고 lipase 활성이 있는지에 대해 조사하였다. Bacillus is known to have a variety of polymer decomposing properties. After inoculation of Bacillus strains isolated in the present invention into LB solid medium containing cellulose, starch, casein, and surfactant (Tween 80), enzymes involved in the degradation of these polymers , cellulase, amylase, protease, and lipase.
균주의 셀룰로오스 분해능은 접종 후 30℃에서 3일 배양 후 congo red로 30분간 염색 후 1M NaCl을 이용하여 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로, 녹말 분해는 iodine으로 30분 염색 후 1M NaCl로 5분간 탈색하여 형성된 투명환으로 판단하였다. 카세인과 Tween80은 각각 2일, 3일 배양하여 별다른 염색과정을 거치지 않고 육안으로 관찰된 투명환으로 분해능을 확인하였다. Alkaline protease 활성은 0.5% 농도의 Hammerstan casein (Merck)을 이용하여 100mM Tris-HCl buffer (pH. 10.0)에서 결정하였다. 효소활성의 1 Unit는 표준 분석 조건하에서 50℃에서 분당 1g의 티로신을 방출하는 효소의 양으로 정의 된다.
The cellulolytic activity of the strain was determined after 30 days of incubation at 30 ° C for 3 days, followed by 30 minutes of staining with congo red, followed by discoloration with 1M NaCl for 5 minutes, staining with iodine for 30 minutes and discoloration with 1M NaCl for 5 minutes As shown in Fig. The casein and Tween 80 were cultured for 2 days and 3 days, respectively, and their resolution was confirmed by a transparent ring observed with naked eyes without performing any staining process. Alkaline protease activity was determined in 100 mM Tris-HCl buffer (pH 10.0) using Hammerstan casein (Merck) at a concentration of 0.5%. One Unit of Enzyme Activity is defined as the amount of enzyme that releases 1 g of tyrosine per minute at 50 캜 under standard assay conditions.
나. 갯지렁이 유래 선별 I. Selection of lobsters BacillusBacillus 균주의 고분자 분해 효소 활성 시험 결과 Results of Polymerase Enzyme Activity Test of Strain
고분자 분해효소 활성 시험을 통하여 균주 CBW4와 EBW4 모두가 DNAse 활성과 함께, 카제인을 분해하여 단백질 분해 효소 활성을 가지고 있었다. CBW4는 starch를 분해하는 효소 활성을 가지고 있었으나 EBW4는 starch 분해능이 없는 것으로 나타났다. 또한, CBW4와 EBW4 모두 대부분의 Tween을 분해하는 것으로 나타나 지질 분해 효소 활성을 가지고 있는 것으로 나타났다. Both the CBW4 and EBW4 strains showed DNAse activity and protease activity by degrading casein. CBW4 had enzymatic activity to degrade starch but EBW4 did not have starch resolution. In addition, both CBW4 and EBW4 were shown to degrade most of the tween, indicating lipolytic enzyme activity.
따라서 본 발명에서 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 두 Bacillus 균주들은 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나 유기물로 오염된 양식장 환경을 정화하는데 유용하게 쓰일 수 있는 것으로 판단된다(표 7).
Therefore, in the present invention, two Bacillus strains isolated from the nematodes were found to be useful for purifying organic environments contaminated with the protein, carbohydrate and lipid (Table 7).
Strain
Starch 1%
DNAse
/cellulose
CM
/ cellulose
Casein 1%
[실시 예][Example]
도 7은 갯지렁이 유래 Bacillus 균주를 이용하여 제조된 미생물제제가 사용되는 양식장 사육수 처리시설의 공정도를 나타낸다. 일반 가두리 양식장의 시설은 사용된 사육수를 그대로 하천 또는 바다로 방류하나 도 7에서와 같이 일정 공간에 배출되는 사육수를 모아 미생물 제재를 이용하여 유기물 분해처리를 실시함으로서 하천 또는 바다로 배출함으로서 양식장 사육폐수에 의한 오염방지가 가능하다.Fig. 7 is a schematic view of a bacillus-derived Bacillus This is a process chart of a breeding water treatment facility where a microorganism manufactured using a strain is used. In general, the facilities of the cage farm are discharged to the rivers or the sea as they are. However, as shown in FIG. 7, the water collected in a certain space is collected, and the microorganisms are used to decompose the organic matter. It is possible to prevent contamination by farming wastewater.
양식장에서 배출되는 유기물을 정화하기 위한 미생물 제재는 갯지렁이로 부터 동정된 새로운 균주 바실러스 속(Bacillus sp .) EBW4(기탁번호:KACC91749P), CBW4(기탁번호: KACC91722P)를 액체 배양액에 접종하여 25-30℃에서 1-2일간 배양하여, 배양단계에서 얻은 결과물 일부를 액상 미생물제제로, 남은 일부를 무균적으로 건조시키고, 건조단계 후 얻어진 결과물을 무균적으로 분쇄하는 단계를 거쳐 분말형태로 제조된 미생물제제를 이용하였다. A microbial agent for the purification of organic matter from a farm is a new strain Bacillus ( Bacillus sp. sp . ), EBW4 (Accession No .: KACC91749P), and CBW4 (Accession No .: KACC91722P) were inoculated into a liquid culture broth and cultured at 25-30 ° C for 1-2 days. A part of the resultant obtained in the culturing step was treated with a liquid microbicide, Followed by aseptically pulverizing the resultant product obtained after the drying step, to prepare a powdered microorganism preparation.
상기 갯지렁이로부터 동정된 기탁번호: KACC91749P의 바실러스 속(Bacillus sp.) EBW4의 배양물을 유효성분으로 함유하는 양식장 폐수 정화용 미생물 제제를 양식장 폐수 처리 반응수조에 살포하여 1 내지 3일간 배양 처리한 다음 유입수와 방류수의 성분을 분석한 결과, 사육수 내에 포함되는 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제등의 유기물이 배출수에서는 유입수 대비 배출수가 70-85% 감소한 것으로 나타났다. Microbial preparations for the purification of wastewater containing cultures of Bacillus sp. EBW4 of KACC 91749P identified from the above-mentioned nematodes were sprayed on the aquaculture wastewater treatment reaction tank, cultured for 1 to 3 days, And effluent water showed that organic matter such as proteins, carbohydrates, lipids, and surfactants contained in the breeding water decreased by 70-85% compared to influent water.
즉, 양식장에서 배출되는 사육수 폐수는 양식생물이 배설한 단백질, 탄수화물, 지질 및 계면활성제 등의 유기물을 포함하고 있으므로, 상기에서 제조된 미생물제재를 사육수 저장조에 접종하여 폭기시켜 1-3일간 배양시킴으로서 사육수 저장조에서 배양된 미생물의 활성에 의해 양식수 내에 포함되는 유기물 물질이 분해되어 정화된 양식수를 바다로 흘러보냄으로서 양식장 사육폐수에 의한 오염방지가 가능한 환경보호형 재생산 산업으로의 이용이 가능하다.
That is, since the wastewater discharged from the farm contains organic matter such as proteins, carbohydrates, lipids and surfactants excreted by the aquaculture, the microorganism preparation prepared as described above is inoculated into the breeding water storage tank, By cultivating, the organic matter contained in the aquaculture is decomposed by the activity of the microorganism cultivated in the breeding water reservoir, and the purified water is sent to the sea, so that it can be used in the environment protection type reproduction industry which can prevent pollution by cultivation wastewater. This is possible.
본 발명의 염분 내성을 갖는 바실러스 속 신규 균주를 이용한 양식장 폐수 처리용 미생물 제재는 연안 갯지렁이로부터 분리하여 선별한 Bacillus 균주 EBW4는 단백질, 탄수화물, 지질 분해능이 뛰어나고 염분에 내성을 갖고 있으므로 양식생물의 활동에 따른 유기물로 오염된 양식장 폐수를 정화하는데 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
Bacillus sp . EBW4, isolated from coastal lagoons, has excellent protein, carbohydrate, and lipid degradation ability and is resistant to salinity. Therefore, the microbial agent for the treatment of aquaculture wastewater using salinity tolerant new strain of Bacillus sp . Which can be used to purify wastewater contaminated with organic matter.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacillus spp., identified from lugworm and microbial cleaning agent <130> P201212064 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> RNA <213> Bacillus sp. EBW4 <400> 1 tcgagcgaat ggattgagag cttgctctta tgaagttagc ggcggacggg tgagtaacac 60 gtgggtaacc tgcccataag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggataa 120 tattttgaac tgcatggttc gaaattgaaa ggcggcttcg gctgtcactt atggatggac 180 ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtgctagt tgaataagct 420 ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggtggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggagact 600 tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatatgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt 720 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840 acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaattcgct 960 agagatagct tagtgccttc gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020 gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct tacttgccag 1080 cgggtcatgc cgggaacttt agggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggacg 1140 acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcgagtaca 1200 gagggttgcg aagccgcgag gtggagctaa tctcagaaag ctcgtcgtag tccggattgg 1260 agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggctgca 1378 <110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Bacillus spp., Identified from lugworm and microbial cleaning agent <130> P201212064 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> RNA <213> Bacillus sp. EBW4 <400> 1 tcgagcgaat ggattgagag cttgctctta tgaagttagc ggcggacggg tgagtaacac 60 gtgggtaacc tgcccataag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggataa 120 tattttgaac tgcatggttc gaaattgaaa ggcggcttcg gctgtcactt atggatggac 180 ccgcgtcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggctttcg ggtcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtgctagt tgaataagct 420 ggcaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggtggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtggaggg tcattggaaa ctgggagact 600 tgagtgcaga agaggaaagt ggaattccat gtgtagcggt gaaatgcgta gagatatgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactttctgg tctgtaactg acactgaggc gcgaaagcgt 720 ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagagggtt tccgcccttt agtgctgaag ttaacgcatt aagcactccg cctggggag 840 acggccgcaa ggctgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctactct tgacatccag agaattcgct 960 agagatagct tagtgccttc gggagctctg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 1020 gtgttgtgaa atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct tacttgccag 1080 cgggtcatgc cgggaacttt agggagactg ccggtgataa accggaggaa ggtggggacg 1140 acgtcaagtc atcatggccc ttacgagtag ggctacacac gtgctacaat ggcgagtaca 1200 gagggttgcg aagccgcgag gtggagctaa tctcagaaag ctcgtcgtag tccggattgg 1260 agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgtggatca gaatgccacg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt gggctgca 1378
Claims (7)
상기 배양물은 베타 글루코시다아제, 에스테라아제, 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase) 중에서 선택되는 어느 하나 이상에 대하여 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 양식장 폐수 정화용 미생물 제제.
A culture obtained by inoculating a strain of Bacillus sp. EBW4 (accession number KACC91749P) having salinity tolerance identified from the worms at 25-30 DEG C for 1-2 days and containing as an active ingredient;
Wherein the culture product has activity against at least one selected from beta glucosidase, esterase, and alkaline phosphatase.
A method for purifying a wastewater from a farm wastewater treatment plant by spraying a microorganism preparation for purification of wastewater from a farm wastewater treatment reaction tank according to claim 1.
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|---|
| 장진덕, 경상대학교 대학원, 박사학위논문, p30 ~ 41 (2006.08.) * |
| 장진덕, 경상대학교 대학원, 박사학위논문, p30 ∼ 41 (2006.08.)* |
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