KR101476781B1 - Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 결핵 진단용 바이오마커로 사용될 수 있는 마이크로 RNA(micro RNA, 이하 'miRNA'라 한다) 및 이의 발현량을 측정할 수 있는 결핵 진단 키트에 관한 것이다.
The present invention relates to microRNA (hereinafter referred to as 'miRNA') which can be used as a biomarker for tuberculosis diagnosis and a tuberculosis diagnostic kit capable of measuring the expression level thereof.
결핵(tuberculosis)은 미코박테륨, 특히 결핵균의 감염에 의해 발생하는 전염성 질환이다. 세계적으로 전체 인구의 1/3이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되며 매년 약 800백만 명의 새로운 환자가 발생한다. 대부분의 감염자들은 증상이 없고 그 중 1/10 정도가 발병하며, 발병 시 적절한 치료를 하지 않으면 그 중 절반 이상이 사망에 이르게 된다. 전형적인 증상은 피가 섞인 가래를 동반한 기침, 오한, 식은땀, 체중 감소로 몸의 어느 기관에나 감염될 수 있기 때문에 감염된 기관에 따라 다양한 증상을 초래한다.Tuberculosis is a contagious disease caused by infection with Mycobacterium, especially Mycobacterium tuberculosis. Globally, one third of the total population is estimated to be infected with tuberculosis, and about 800 million new cases occur each year. Most infected people have no symptoms, about one-tenth of them develop, and if not properly treated at the onset, more than half of them will die. Typical symptoms include coughing, chills, cold sweats, and weight loss accompanied by sputum mixed with blood, which can cause infection in any organ of the body, resulting in a variety of symptoms depending on the affected organ.
결핵의 초기 진단은 결핵의 확산을 방지하고 적절한 치료를 위하여 필수적이나 결핵은 진단이 어려운 질병중의 하나다. 결핵 진단의 가장 표준적인 방법(gold standard)은 선택된 배지에서 결핵균의 성장을 확인하는 것이다. 그러나 미코박테륨은 성장 속도가 느리기 때문에 검체내에서 이러한 배양에는 3~12주의 오랜 시간이 소요된다. 객담 도말(sputum smear)은 빠른 결말을 얻을 수 있어 임상 실험실에서 널리 이용되고 있지만, 민감도가 낮다. PCR 기반의 핵산 증폭 방법과 면역학적 방법은 결핵의 초기 진단 및 빠른 진단에 커다란 진전을 가져왔다. 그러나 위양성 또는 위음성의 결과를 초래하는 결핵균의 내생성 증폭 저해 인자(endogenous amplification inhibition factor)나 신뢰도 낮은 품질관리(quality control) 등은 PCR 방법의 임상적 사용에 방해요소로 작용한다. 이에 결핵의 진단을 위한 새로운 바이오마커나 새로운 진단방법이 요구되고 있다.
Early diagnosis of tuberculosis is one of the diseases that prevent the spread of tuberculosis and is essential for proper treatment, but tuberculosis is difficult to diagnose. The gold standard for diagnosis of tuberculosis is to confirm the growth of Mycobacterium tuberculosis in selected media. However, since mycobacterium has a slow growth rate, it takes 3 to 12 weeks for this kind of incubation in a sample. Sputum smear is widely used in clinical laboratories because of its quick ending, but is less sensitive. PCR-based nucleic acid amplification and immunological methods have made great progress in the early diagnosis and rapid diagnosis of tuberculosis. However, endogenous amplification inhibition factors and unreliable quality control of Mycobacterium tuberculosis, which result in false positive or false negative results, interfere with the clinical use of PCR methods. Therefore, new biomarkers and new diagnostic methods for diagnosis of tuberculosis are required.
miRNA는 18~24개의 핵산으로 이루어진 소형의 비암호화(noncoding) RNA로 숙주세포에서 면역반응을 포함한 다양한 생리활성의 조절에 중요한 역할을 담당한다. 최근들어, miRNA는 암, 심장질환, 임신, 당뇨, 정신질환 등 다양한 분야의 진단에서 새로운 형태의 바이오마커로서 심도깊게 연구되어 지고 있다. miRNA-17-5p(GeneID : 406952)는 23개의 핵산으로 이루어진 miRNA로 면역질환인 다발적 경화증에서 발현이 감소되며, 유방암 등 여러 암세포의 증식을 억제하는 것이 알려져 있다. miRNA is a small, noncoding RNA consisting of 18 to 24 nucleotides and plays an important role in the regulation of various physiological activities, including immune responses, in host cells. In recent years, miRNA has been extensively studied as a new form of biomarker in the diagnosis of cancer, heart disease, pregnancy, diabetes, and mental illness. miRNA-17-5p (GeneID: 406952) is a miRNA consisting of 23 nucleotides. It is known that miRNA-17-5p (GeneID: 406952) decreases expression in multiple sclerosis, which is an immune disease, and inhibits the proliferation of various cancer cells such as breast cancer.
본 발명은 결핵의 조기 진단 및 빠른 진단에 유용한 결핵 진단용 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. It is an object of the present invention to provide a biomarker for tuberculosis diagnosis useful for early diagnosis and rapid diagnosis of tuberculosis.
또한 본 발명은 상기 바이오마커의 발현수준을 측정할 수 있는 결핵 진단용 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
It is another object of the present invention to provide a diagnostic kit for diagnosing tuberculosis capable of measuring the expression level of the biomarker.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 miRNA-17-5p(서열번호 1)로 이루어지며 결핵 감염에 의해 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 바이오마커에 관한 것이다. In order to accomplish the above object, the present invention relates to a biomarker for diagnosis of tuberculosis characterized by miRNA-17-5p (SEQ ID NO: 1), wherein the expression is increased by tuberculosis infection.
서열번호 1 : CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
SEQ ID NO: 1: CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
"바이오마커"는 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정이 가능한 표지자를 말한다. miRNA-17-5p는 결핵균 감염에 의해 급속한 발현 변화를 나타내며 정상 세포에 비하여 2배 이상 발현량이 증가하여, 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료에서 발현량을 측정함으로써 결핵균의 감염 여부를 유의적으로 확인할 수 있다. 여기서 정상 세포라 함은 결핵균이 감염되지 않은 세포를 의미한다. A "biomarker" is a marker that can distinguish between normal or pathological conditions, or that can be predicted and objectively measured. miRNA-17-5p expresses a rapid expression change by infection with Mycobacterium tuberculosis. The expression level of miRNA-17-5p is more than twice that of normal cells, and the expression level of miRNA-17-5p is measured in a biological sample to be diagnosed, have. Here, normal cells means cells that are not infected with Mycobacterium tuberculosis.
miRNA-17-5p는 자가포식조절 단백질인 자가포식관련유전자(ATG7)의 3'UTR 영역과 특이적으로 결합하는 것에 의해 자가포식 기작을 조절하는 역할에 관여하는 것으로 판단된다.
miRNA-17-5p is an autophagy regulatory protein (ATG7), which is involved in the regulation of autophagic mechanisms by specific binding to the 3 'UTR region of the autogeograph related gene (ATG7).
본 발명은 또한 miRNA-17-5p의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브를 포함하는 결핵 진단용 진단 키트에 관한 것이다. The present invention also relates to a diagnostic kit for diagnosis of tuberculosis comprising a primer or a probe for measuring the level of expression of miRNA-17-5p.
본 발명의 진단 키트를 이용한 바이오마커의 동정 또는 검출에는 당업계의 모든 방법이 포함될 수 있다. 즉, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 마이크로어레이를 활용하여 상기 바이오마커의 발현량을 측정할 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 이에 본 발명의 진단 키트는 상기 분석 방법에 따라 적절한 형태로 구성되며, 각 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR용 키트는 테스트 튜브, 완층액, 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs), 각종 효소, 사용 매뉴얼 등을 포함할 수 있다.Identification or detection of a biomarker using the diagnostic kit of the present invention may include all methods in the art. That is, the expression level of the biomarker can be measured using RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay, northern blotting or DNA microarray. Accordingly, the diagnostic kit of the present invention may be formed in a proper form according to the above-described analysis method, and may further include one or more other configurations suitable for each analysis method. For example, the kit for RT-PCR may include test tubes, complete solutions, deoxynucleotides (dNTPs), various enzymes, manuals and the like.
상기 프라이머는 공지되어 있는 miRNA-17-5p의 서열로부터 종래기술을 이용하여 이들 유전자 혹은 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있도록 디자인하는 것은 당업자라면 용이할 것이다. 하기 실시예에서는 miRNA-17-5p와 동일한 서열의 프라이머을 사용하였으나, 물론 이에 한정되는 것은 아니다. It will be readily apparent to those skilled in the art to design such primers to specifically amplify specific regions of these genes or genes from known sequences of miRNA-17-5p using conventional techniques. In the following examples, primers having the same sequence as miRNA-17-5p were used, but the present invention is not limited thereto.
상기 프로브는 miRNA-17-5p와 특이적 결합을 이룰 수 있는 표지된 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편으로, 표지의 검출에 의해 miRNA-17-5p의 발현량을 측정할 수 있다. 프로브 역시 공지된 miRNA-17-5p의 서열로부터 종래기술을 이용하여 miRNA-17-5p와 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인하는 것은 당업자라면 용이할 것이다.The probe is a nucleic acid fragment such as labeled RNA or DNA capable of specifically binding to miRNA-17-5p, and the amount of expression of miRNA-17-5p can be measured by detecting the label. It will be readily apparent to those skilled in the art to design probes to specifically bind miRNA-17-5p using known techniques from the sequence of known miRNA-17-5p.
본 발명에서의 검체는 miRNA-17-5p의 조직, 세포, 혈액 등 그 종류에 한정되는 것은 아니나, 채취의 용이성을 고려하면 혈액을 시료로 사용하는 것이 바람직하다.
The sample in the present invention is not limited to the tissue, cell, and blood of miRNA-17-5p, but it is preferable to use blood as a sample in consideration of ease of harvesting.
이상과 같이 본 발명에 의하면 miRNA-17-5p를 바이오마커로 발현량을 측정하는 것에 의해 결핵을 조기에 빠르게 효율적으로 진단할 수 있다.
As described above, according to the present invention, by measuring the expression level of miRNA-17-5p with a biomarker, the tuberculosis can be diagnosed quickly, efficiently and quickly.
도 1은 결핵균 감염에 따른 세포 내 miRNA-17-5p의 발현량 변화를 나타내는 그래프.
도 2는 ATG7 및 LC3-II, LC3-I의 웨스턴블럿 결과를 보여주는 전기영동 사진.
도 3는 miRNA-17-5p와 ATG7의 상호작용이 있을 것으로 예상되는 서열.
도 4는 루시페라제 활성 분석법 결과를 보여주는 그래프.FIG. 1 is a graph showing changes in expression levels of miRNA-17-5p in cells due to Mycobacterium tuberculosis infection.
Figure 2 is an electrophoresis image showing Western blot results of ATG7 and LC3-II, LC3-I.
Figure 3 is a sequence expected to have an interaction of miRNA-17-5p with ATG7.
Figure 4 is a graph showing the results of luciferase activity assay.
이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the drawings and the embodiments are only illustrative of the contents and scope of the technical idea of the present invention, and the technical scope of the present invention is not limited or changed. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention based on these examples.
실시예Example
마우스의 대식세포에 결핵균을 감염시킨 후에 miRAN-17-5p의 발현량에 대한 영향 및 그 기작을 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
The influence of miRAN-17-5p on the expression level and mechanism of miRAN-17-5p was confirmed after infecting the macrophage of mouse with Mycobacterium tuberculosis. Specific experimental methods are as follows.
실시예 1 : 결핵균 감염 대식세포에서의 miRNA 발현 분석 Example 1: miRNA expression analysis in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis
1) 대식세포의 배양1) Culture of macrophages
Abelson Ieukemia 바이러스가 형질도입된 BALB/c mice(Nramp 1D169/D169)로부터 분리한 쥐의 불사화(immortalized) 대식세포주인 RAW264.7를 American Type Culture Collection(Rockvile, MD)에서 분주받았다. 이들 세포주는 5%의 이산화탄소와 95%의 공기가 혼합된 37℃ 수분 공급형 인큐베이터 환경에서 유지·배양하였다. 배양액으로는 10% Fetal Bovine Serum, penicillin 100U/ml, streptomycin 100㎍/ml을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(Gibco, Grand Island, NY)을 사용하였다.
RAW264.7, a rat immortalized macrophage cell line isolated from BALB / c mice (Nramp 1 D169 / D169 ) transduced with Abelson Ieukemia virus, was subcultured in the American Type Culture Collection (Rockville, MD). These cell lines were maintained and cultured in a 37 ° C water-containing incubator environment in which 5% of carbon dioxide and 95% of air were mixed. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco, Grand Island, NY) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum, penicillin 100 U / ml and streptomycin 100 μg / ml was used as the culture medium.
2) 결핵균 감염2) Mycobacterial infection
1)에서 준비한 대식세포주의 배지 내에 병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis)를 배양 세포 1개당 감염된 균의 개체 평균수(multiplicity of infection, MOI)가 1:10이 되도록 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 감염시켰다. 결핵균 감염 대식세포는 세포외 결핵균을 제거하기 위하여 PBS 완충액을 사용하여 세척한 후 추가적으로 37℃에서 배양하였다.
Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis ), a pathogenic Mycobacterium tuberculosis , was added to the medium of the macrophage cell prepared in 1) so that the multiplicity of infection (MOI) of the infected bacteria per 1 culture cell was 1:10 and incubated at 37 ° C for 2 hours Infected. Mycobacterium infected macrophages were washed with PBS buffer to remove extracellular Mycobacterium tuberculosis and then cultured at 37 ° C.
3) 결핵균 감염 대식세포에서의 miRNA 발현 분석3) Analysis of miRNA expression in macrophages infected with M. tuberculosis
2)에서 6시간동안 배양한 결핵균 감염 세포로부터 TRIzol 시약(Qiagen, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 전체 RNA를 분리하였다. 이후, Sybergreen microRNA kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 miRNA-17-5p와 동일한 서열의 프라이머(Qiagen, USA)로 real-time RT-PCR에 의해 miRNA-17-5p의 발현량을 정량하였다(normalization : small nuclear RNA(Rnu 6)).
2) for 6 hours. Total RNA was isolated according to the manufacturer's method using TRIzol reagent (Qiagen, USA). The expression level of miRNA-17-5p was then measured by real-time RT-PCR using a Sybergreen microRNA kit (Applied Biosystems) and primers (Qiagen, USA) having the same sequence as miRNA-17-5p according to the manufacturer's method (Normalization: small nuclear RNA (Rnu 6)).
도 1은 결핵균 감염에 따른 세포 내 miRNA-17-5p의 상대적 발현량 변화를 나타내는 그래프로, 결핵균 감염 후 발현량이 크게 증가하는 것을 관측할 수 있었다.
FIG. 1 is a graph showing the relative expression amount of miRNA-17-5p in cells due to Mycobacterium tuberculosis infection, and it was observed that the expression level after infection with M. tuberculosis was greatly increased.
실시예 2 : miRNA-17-5p의 자가포식에 대한 영향 분석 Example 2: Analysis of the effect of miRNA-17-5p on self-feeding
1) miRNA-17-5p의 형질감염 및 결핵균의 감염1) Transfection of miRNA-17-5p and infection of Mycobacterium tuberculosis
1)에서 준비한 대식세포주에 lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 방법에 의해 25nM miRNA-17-5p mimic(Genolution Pharmaceuticals, Inc., Korea, 서열번호 1)를 24시간 처리하여 일시적 형질감염하였다.1) was transiently transfected by treatment with 25 nM miRNA-17-5p mimic (Genolution Pharmaceuticals, Inc., Korea, SEQ ID NO: 1) by lipofectamine 2000 (Invitrogen) for 24 hours by the manufacturer's method.
형질감염된 세포의 배지 내에 병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis)를 배양 세포 1개당 감염된 균의 개체 평균수(multiplicity of infection, MOI)가 1:10이 되도록 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 감염시켰다. Mycobacterium tuberculosis ( M. tuberculosis ), a pathogenic Mycobacterium tuberculosis , was added to the medium of transfected cells at a multiplicity of infection (MOI) of 1:10 per infected cell and infected at 37 ° C for 2 hours.
대조군으로는 miRNA-17-5p를 처리하지 않은 대식세포주를 사용하였다.
As a control group, macrophage cells without miRNA-17-5p treatment were used.
2) Western Blot2) Western Blot
1)에서 준비한 대조군 및 miRNA-17-5p로 형질감염된 세포 또는 이들의 결핵균 감염 세포 각각을 PBS 완충액을 사용하여 3회 세척한 후 lysis 완충액으로 용균하였다. 일정량의 용균액을 SDS-PAGE에 용해시킨 후 PVDF 멤브레인으로 옮겨 Western-blot에 의해 자가포식 관련 유전자7(ATG7) 단백질과 자가포식 지표인 LC3I 및 LC3II 단백질을 정량하였다. 자가포식 과정에서 LC3-I 단백질은 LC3-II 단백질로 변환되는 것으로 알려져 있으며, 이 때문에 LC3-II/LC3-I은 자가포식의 정도를 나타내는 지표로 활용되고 있다.The control cells prepared in 1) and miRNA-17-5p-transfected cells or their M. tuberculosis-infected cells were washed three times with PBS buffer and lysed with lysis buffer. After a certain amount of the bacterial suspension was dissolved in SDS-PAGE, it was transferred to PVDF membrane, and Western blot analysis was performed to quantify autopatch-related gene 7 (ATG7) protein and self-expression markers LC3I and LC3II proteins. The LC3-I protein is known to be converted to the LC3-II protein during the self-predation process, and LC3-II / LC3-I is therefore used as an indicator of the degree of self-predation.
도 2의 (a)와 (b)는 각각 ATG7 및 LC3-II, LC3-I의 웨스턴블럿 결과를 보여주는 전기영동 사진이다. 도 2에 의하면 miRNA-17-5p은 정상 또는 결핵균 감염세포에서 ATG7의 발현을 감소시키며, 자가포식의 정도를 나타내는 LC3-II/LC3-I 역시 miRNA-17-5p의 형질감염에 의해 크게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 miRNA-17-5p이 세포의 자가포식을 조절하는데 관여하는 것을 시사한다.
2 (a) and 2 (b) are electrophoresis images showing Western blot results of ATG7, LC3-II and LC3-I, respectively. 2 shows that miRNA-17-5p decreases ATG7 expression in normal or Mycobacterium tuberculosis-infected cells and LC3-II / LC3-I, which indicates the degree of autophagy, is also greatly reduced by transfection of miRNA-17-5p Respectively. This suggests that miRNA-17-5p is involved in regulating cellular self-feeding.
3) miRNA-17-5p의 자가포식 조절 기작 분석3) Analysis of autopoiesis control mechanism of miRNA-17-5p
ATG7 cDNA(Origene Technologies, USA)으로 부터 하기 ATG7FOR(서열번호 2) 및 ATG7REV(서열번호 3) 프라이머쌍을 사용하여 ATG7 3'UTR 서열 중 118bp를 30 cycles at 94℃ X 20sec; 58℃ X 20 sec; 72℃ X 20sec의 조건에서 증폭하였다. 증폭된 서열은 서열번호 4와 같다.From ATG7 cDNA (Origene Technologies, USA) 118bp of the ATG7 3'UTR sequence was amplified using the ATG7FOR (SEQ ID NO: 2) and ATG7REV (SEQ ID NO: 3) primer pairs at 30 cycles at 94 DEG C for 20 sec; 58 [deg.] C X 20 sec; 72 ° C for 20 sec. The amplified sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
서열번호 2 : GAGCTCTACCATCTGTGCAAGGCTSEQ ID NO: 2: GAGCTCTACCATCTGTGCAAGGCT
서열번호 3 : TCTAGAATAAAGTGCTCTTAAACCGSEQ ID NO: 3: TCTAGAATAAAGTGCTCTTAAACCG
서열번호 4 : TACCATCTGTGCAAGGCTCCCCACAAGTAGCCAGGCCTACCTGGGCACAGGGCCCCA CAGCCCACATGCCACCCTAGGAGTCAAGAGCCACACAGCCTCGGTTTAAGAGCACTTTATTSEQ ID NO: 4: TACCATCTGTGCAAGGCTCCCCACAAGTAGCCAGGCCTACCTGGGCACAGGGCCCCA CAGCCCACATGCCACCCTAGGAGTCAAGAGCCACACAGCCTCGGTTTAAGAGCACTTTATT
증폭된 서열을 Xba I 및 Sac I 위치를 통해 pMIR-REPORT vector(Ambion, Austin, TX)에 도입하여 pMIRATG7wt 플라스미드를 제작하였다.The amplified sequence was introduced into the pMIR-REPORT vector (Ambion, Austin, TX) through the Xba I and Sac I sites to construct the pMIRATG7wt plasmid.
한편, miRNA-17-5p/ATG7의 상호작용이 있을 것으로 예상되는 위치를 의 database를 이용하여 확인하고(도 3) DpnI mediated site-directed mutagenesis protocol에 의하여 이 위치에 8개의 점돌연변이를 갖도록 하기 MIRMUTFOR(서열번호 5) 및 MIRMUTREV(서열번호 6) 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 마찬가지로 증폭된 서열을 pMIR-REPORT vector에 도입하여 pMIRATG7MUT 플라스미드를 제작하였다. On the other hand, the position expected to have the interaction of miRNA-17-5p / ATG7 was confirmed using a database (Fig. 3) Were amplified using the MIRMUTFOR (SEQ ID NO: 5) and MIRMUTREV (SEQ ID NO: 6) primers to have eight point mutations at this position by the DpnI mediated site-directed mutagenesis protocol. Similarly, the amplified sequence pMIR-REPORT vector to construct pMIRATG7MUT plasmid.
서열번호 5 : CAGCCTCGGTTTAAGCTTCTGGCATTCTAGAACTAGTGSEQ ID NO: 5: CAGCCTCGGTTTAAGCTTCTGGCATTCTAGAACTAGTG
서열번호 6 : CACTAGTTCTAGAATGCCAGAAGCTTAAACCGAGGCTGSEQ ID NO: 6: CACTAGTTCTAGAATGCCAGAAGCTTAAACCGAGGCTG
RAW264.7 대식세포주에 lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 제조사의 방법에 의해 1㎍의 상기 플라스미드를 형질감염하고 24시간 후 Dual-Luciferase Assay System(Promega)를 사용하여 제조자의 방법에 따라 루시페라제 활성을 측정하고 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에 ARG7과 miRNA-17의 상호작용이 있을 것으로 예상되는 위치에서의 ATG7과 miRNA-17-5p의 서열도 함께 나타내었다. 도 3에서 WT의 루시페라제 활성만이 크게 감소하는 것으로부터 ATG7이 miRNA-17/ATG7의 타겟이 됨을 확인할 수 있었다.
RAW264.7 was transfected with 1 쨉 g of the plasmid using lipofectamine 2000 (Invitrogen) by the manufacturer, and after 24 hours, luciferase (Promega) was used according to the manufacturer's method using Dual-Luciferase Assay System Activity was measured and the results are shown in Fig. Figure 4 also shows the sequences of ATG7 and miRNA-17-5p at positions where interaction of ARG7 with miRNA-17 is expected. In FIG. 3, only the luciferase activity of WT is greatly reduced, confirming that ATG7 is a target of miRNA-17 / ATG7.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Biomarker MicroRNA for Diagnnosis of Tuberculosis <130> P0514-214 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagctctacc atctgtgcaa ggct 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tctagaataa agtgctctta aaccg 25 <210> 4 <211> 118 <212> DNA <213> mouse <400> 4 taccatctgt gcaaggctcc ccacaagtag ccaggcctac ctgggcacag ggccccacag 60 cccacatgcc accctaggag tcaagagcca cacagcctcg gtttaagagc actttatt 118 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagcctcggt ttaagcttct ggcattctag aactagtg 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactagttct agaatgccag aagcttaaac cgaggctg 38 <110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Biomarker MicroRNA for Diagnosis of Tuberculosis <130> P0514-214 <160> 6 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagctctacc atctgtgcaa ggct 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tctagaataa agtgctctta aaccg 25 <210> 4 <211> 118 <212> DNA <213> mouse <400> 4 taccatctgt gcaaggctcc ccacaagtag ccaggcctac ctgggcacag ggccccacag 60 cccacatgcc accctaggag tcaagagcca cacagcctcg gtttaagagc actttatt 118 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagcctcggt ttaagcttct ggcattctag aactagtg 38 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactagttct agaatgccag aagcttaaac cgaggctg 38
Claims (5)
Wherein the miRNA-17-5p of SEQ ID NO: 1 is increased in expression by tuberculosis infection.
A diagnostic kit for the diagnosis of tuberculosis comprising a primer or a probe for measuring an expression level of miRNA-17-5p.
상기 키트는 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 노던 블랏팅, RNA 보호분석법 또는 마이크로어레이 칩용인 결핵 진단용 키트.
3. The method of claim 2,
The kit can be used for RT-PCR, real-time RT-PCR, Northern blotting, RNA protection assay or microarray chip.
상기 프라이머는 miRNA-17-5p와 동일한 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 키트.
3. The method of claim 2,
Wherein the primer has the same sequence as miRNA-17-5p.
상기 진단 키트의 검체는 혈액인 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 키트.3. The method of claim 2,
Wherein the specimen of the diagnostic kit is blood.
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