KR101474855B1 - 조직공학용 다공성 스캐폴드의 제조방법 - Google Patents

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디디에 르뚜르너르
프레데릭 쇼베
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유니베르시떼 파리스 7- 데니스 디데롯
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Abstract

본 발명은 조직공학용 다공성 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 다공성 스캐폴드, 및 그의 조직공학, 세포 배양 및 세포 운반의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 방법은 a) 소정량의 하나 이상의 폴리사카라이드 및 하나 이상의 가교결합제를 포함하는 염기성 수용액을 제조하는 단계, b) 상기 a) 단계의 수용액을 동결하는 단계, 및 c) 상기 b) 단계의 동결된 용액을 승화시키는 단계로 이루어진 단계를 포함하며, 상기 a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생하기 전에 상기 b) 단계가 수행되는 것을 특징으로 한다.

Description

조직공학용 다공성 스캐폴드의 제조방법{METHOD FOR PREPARING POROUS SCAFFOLD FOR TISSUE ENGINEERING}
본 발명은 조직공학용 다공성 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 다공성 스캐폴드, 및 그의 조직공학, 세포 배양 및 세포 운반의 용도를 제공하는 것이다.
조직공학은 일반적으로 이식에 적합한 스캐폴드 상에 또는 내에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것으로서 정의된다. 스캐폴드는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 스캐폴드 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 스캐폴드는 시험관내 또는 생체내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있다.
이상적인 생체적합성 스캐폴드의 속성에는 시험관내 또는 생체내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력, 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력이 포함될 것이다.
다수의 상이한 스캐폴드 물질들이 유도된 조직 재생을 위하여 및/또는 생체적합성 표면으로서 이용되어 왔다. 스캐폴드는 시간이 경과함에 따라 분해되고 결국 세포-스캐폴드 구조는 세포에 의해 전적으로 대체되기 때문에, 생분해성 중합체 물질이 다수의 경우에 바람직하다. 조직 성장 또는 재생을 지지하기 위하여 요구되는 유용한 스캐폴드로서 제공될 수 있는 많은 후보물들 중에는 겔, 폼(foam), 시트, 및 상이한 형태 및 모양의 다수의 다공성 입자 구조가 포함된다.
조직공학 또는 배양에 유용한 것으로 개시된 매니폴드 천연 중합체 중에서, 피브로넥틴, 다양한 유형의 콜라겐 및 라미닌 뿐만 아니라, 케라틴, 피브린 및 피브리노겐, 히알루론산, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 등을 포함하는 세포외 매트릭스의 다양한 구성이 열거될 수 있다.
일반적으로 사용되는 다른 중합체에는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG)가 포함된다. PLG는 FDA에 의해 체내 사용이 승인되고 기계적으로 강인성이 있는 가수분해성 중합체이다 (Thomson RC, Yaszemski MJ, Powers JM, Mikos AG. Fabrication of biodegradable polymer scaffolds to engineer trabecular bone. J Biomater Sci Polym Ed. 1995;7(1):23-38; Wong WH. Mooney DJ. Synthesis and properties of biodegradable polymers used as synthetic matrices for tissue engineering. In: Atala A, Mooney DJ, editors; Langer R, Vacanti JP, associate editors. Synthetic biodegradable polymer scaffolds. Boston: Birkhauser: 1997. p. 51-82). 그러나, 이들은 소수성이며, 상대적으로 엄격한 조건 하에서 처리되는 것이 통상적이며, 이는 인자 결합 및 생존 세포의 포획을 잠재적으로 어렵게 한다.
선택적으로는, 다양한 히드로겔, 일종의 고 수화된 중합체 물질(함수량이 30 중량% 초과임)이 스캐폴드 물질로서 사용되어 왔다. 이는 기원이 합성 또는 천연인 친수성 중합체쇄로 구성된다. 히드로겔의 구조적 완전성은 다양한 화학결합 및 물리적 상호작용을 통해 중합체쇄 사이에 형성된 가교결합에 의존한다. 상기 적용에서 사용된 히드로겔은 통상적으로 분해가능하며, 상대적으로 온화한 조건 하에서 처리될 수 있으며, 다수의 조직 및 세포외 매트릭스와 유사한 기계적 및 구조적 특징을 가지며, 최소의 침습 방식으로 운반될 수 있다 (Lee KY, Mooney DJ. Hydrogels for tissue engineering. Chem Rev. 2001 Jul; 101(7): 1869-79.). 따라서, 다양한 중합체가 히드로겔을 처리하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 중합체에는 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산(HA) 및 키토산이 포함된다.
또한, 천연 폴리사카라이드는 비항원성 및 비면역성이며, 이들의 일부가 혈관성장인자와 상호작용 및 항혈전 효과를 나타내기 때문에, 천연 폴리사카라이드의 용도는 히드로겔에 기초하여 스캐폴드를 제조하기 위한 유력한 대안을 나타낸다. 또한, 이들의 가소성 특징에 기인하여, 상기 폴리사카라이드 기재 히드로겔은 다양한 형태로 형상화되어 치료상 임플란트 또는 이식 생체재료의 설계를 가능하게 할 수 있다.
예를 들어, Chaouat 등(Chaouat M, Le Visage C, Autissier A, Chaubet F, Letourneur D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 2006 Nov;27(32):5546-53. Epub 2006 Jul 20.)은 풀루란 및 덱스트란의 혼합물을 사용하여 제조된 신규의 폴리사카라이드 기재 스캐폴드를 설계하였다. 폴리사카라이드의 화학적 가교결합은 가교결합제 트리소듐 트리메타포스페이트(STMP)를 사용하여 수행하였다. 그 후에, 상기 스캐폴드로 제조된 동맥 재료의 유효성이 생체내에서 입증되었다.
그러나, Chaouat 등(2006)에 기재된 스캐폴드를 제조하기 위해 폴리사카라이드를 사용하는 이점에도 불구하고, 상기 생성된 스캐폴드의 공극율의 결함은 치료적 목적을 위한 유효한 사용을 고려하는데 문제점을 갖는다. 실제로, 공극율은 스캐폴드 내부에서 세포의 증식, 통합 및 분화를 가능하게 하는 본질적인 특징이므로, 상기 물질은 생체내에서 조직 또는 기관을 복구하는 세포 저장소로서 사용될 수 있다.
따라서, 치료적 목적을 위해 사용될 수 있는 다공성 스캐폴드 매트릭스의 제조방법을 개발하는 것이 당업계에서 여전히 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기로 이루어진 단계를 포함하는 다공성 스캐폴드의 제조방법으로서, 하기 a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생하기 전에 하기 b) 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공하는 것이다:
a) 소정량의 하나 이상의 폴리사카라이드 및 하나 이상의 가교결합제를 포함하는 염기성 수용액을 제조하는 단계,
b) a) 단계의 수용액을 동결하는 단계, 및
c) b) 단계의 동결된 용액을 승화시키는 단계.
본 발명에 따르면, 용어 "a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생하기 전에 b) 단계가 수행되는 것"은 폴리사카라이드의 가교결합이 승화 단계((c) 단계) 동안 발생하는 것을 의미한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 기재된 방법에 의해 수득될 수 있는 다공성 스캐폴드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 조직공학을 위한 본 발명의 다공성 스캐폴드의 용도를 제공하는 것이다.
정의:
본원에서 사용된 용어 "폴리사카라이드"는 2개 이상의 모노사카라이드 단위를 포함하는 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "염기성 용액"은 pH가 7보다 높은 용액을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "수용액"은 용매가 물인 용액을 의미한다.
용어 "가교결합"은 하나의 중합체쇄가 다른 중합체쇄에 공유결합으로 연결된 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "스캐폴드"는 1개 종 이상의 폴리사카라이드쇄의 삼차원 네트워크를 포함하는 반고형체로서 정의된다. 상기 네트워크의 성질 및 밀도 뿐만 아니라 사용된 폴리사카라이드(들)의 특징에 따라, 평형 상태의 상기 구조는 다양한 양의 물을 포함할 수 있다.
용어 "가교결합제"는 본 발명의 폴리사카라이드쇄 사이에 가교결합을 도입할 수 있는 임의의 제제를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "생분해성"은 분비될 수 있거나 추가 대사작용될 수 있는, 체내에서 무독성 화합물로 분해하는 물질을 의미한다.
용어 "승화"는 고체 상태로부터 직접 기체 상태로의 물리적 상 변화를 의미한다. 더 구체적으로는, 승화는 액체 상태를 통하지 않고 고체에서 기체로 물질이 진행되는 과정이다. 용액의 승화는 동결-건조 방법을 통해 수득될 수 있다.
용어 "동결-건조"는 용매(즉, 물)을 동결시킴으로써 고 진공 하에서 급속동결된 물질을 건조시킨 후, 동결된 상태에서 상기 물질을 증발시키는 것에 대한 용어이다.
다공성 스캐폴드 및 그의 제조방법:
본 발명의 첫번째 목적은 하기로 이루어진 단계를 포함하는 다공성 스캐폴드의 제조방법으로서, 하기 a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생하기 전에 하기 b) 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다:
a) 소정량의 하나 이상의 폴리사카라이드 및 하나 이상의 가교결합제를 포함하는 염기성 수용액을 제조하는 단계,
b) a) 단계의 수용액을 동결하는 단계, 및
c) b) 단계의 동결된 용액을 승화시키는 단계.
본 발명에 따르면, 용어 "a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생하기 전에 b) 단계가 수행되는 것"은 폴리사카라이드의 가교결합이 승화 단계((c) 단계) 동안 발생하는 것을 의미한다.
본 발명에서, 임의 유형의 폴리사카라이드가 사용될 수 있다. 합성 또는 천연 폴리사카라이드가 본 발명의 목적을 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 천연 폴리사카라이드에는 덱스트란, 한천, 알긴산, 히알루론산, 이눌린, 풀루란, 헤파린, 푸코이단, 키토산, 스클레로글루칸, 커들란, 전분, 셀룰로스 및 그의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어 산기(카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트), 아미노기(에틸렌 아민, 디에틸아미노에틸아민, 프로필아민), 소수성기(알킬, 벤질)을 갖는 화학적으로 변형된 폴리사카라이드가 포함될 수 있다. 목적하는 폴리사카라이드를 제조하기 위해 사용될 수 있는 모노사카라이드에는 리보스, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스, 소르보스, 소르비톨, 만니톨, 이디톨, 둘시톨 및 그의 혼합물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 다수의 상기 화합물들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, Michigan, US)와 같은 회사에서 시판된다.
폴리사카라이드의 바람직한 평균분자량은 약 10,000 돌턴 내지 약 2,000,000 돌턴, 더 바람직하게는 약 10,000 돌턴 내지 약 500,000 돌턴, 가장 바람직하게는 약 10,000 돌턴 내지 약 200,000 돌턴이다.
본 발명의 일구현예에서, 본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해 사용되는 폴리사카라이드(들)은 중성 폴리사카라이드, 예컨대 덱스트란, 한천, 풀루란, 이눌린, 스클레로글루칸, 커들란, 전분, 셀룰로스 또는 그의 혼합물이다. 바람직한 구현예에서, 풀루란 및 덱스트란의 혼합물이 본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 혼합물은 25%의 덱스트란 및 75%의 풀루란을 함유한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해 사용되는 폴리사카라이드(들)은 양전하성 폴리사카라이드, 예컨대 키토산, DEAE-덱스트란 및 그의 혼합물이다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해 사용되는 폴리사카라이드(들)은 음전하성 폴리사카라이드, 예컨대 알긴산, 히알루론산, 헤파린, 푸코이단 및 그의 혼합물이다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드를 제조하기 위해 사용되는 폴리사카라이드(들)은 중성 및 음전하성 폴리사카라이드의 혼합물이며, 상기 음전하성 폴리사카라이드는 상기 혼합물의 1 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 10%를 나타낸다.
특정 구현예에서, 상기 가교결합제는 트리소듐 트리메타포스페이트(STMP), 포스포러스 옥시클로리드(POCl3), 에피클로로히드린, 포름알데히드, 수용성 카르보디이미드, 글루타르알데히드 또는 폴리사카라이드를 가교결합하는데 적합한 임의의 다른 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 상기 가교결합제는 STMP이다. 수용액 내 공유 가교결합제의 농도(w/v)는 약 1 % 내지 약 6%, 더 바람직하게는 약 2% 내지 약 6%, 가장 바람직하게는 약 2% 내지 약 3%이다. 폴리사카라이드 대 가교결합제의 중량비가 20:1 내지 1:1, 바람직하게는 15:1 내지 1:1, 더 바람직하게는 10:1 내지 1:1의 범위에 있는 양으로 가교결합제를 사용하는 것이 바람직하다. 다수의 상기 화합물들은 Sigma-Aldrich(St. Louis, Michigan, US)와 같은 회사에서 시판된다.
폴리사카라이드를 포함하는 수용액은 목적하는 적용에 따라 다양한 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 첨가제는 폴리사카라이드와 양립될 수 있으며, 폴리사카라이드(들)의 유효한 가교결합을 저해하지 않는다. 사용되는 첨가제의 양은 특정 적용에 의존하며, 통상적인 실험을 행하는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
폴리사카라이드를 포함하는 수용액은 하나 이상의 항미생물제를 임의로 포함할 수 있다. 적합한 항미생물 보존제는 당업계에 잘 알려져 있다. 적합한 항미생물제의 예에는 알킬 파라벤, 예컨대 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤 및 부틸파라벤, 크레졸, 클로로크레졸, 히드로퀴논, 소듐 벤조에이트, 포타슘 벤조에이트, 트리클로산 및 클로르헥시딘이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 항균제 및 항감염제의 다른 예에는 리팜피신, 미노시클린, 클로르헥시딘, 은이온 제제 및 은-기재 조성물이 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 폴리사카라이드를 포함하는 수용액은 상기 용액의 가시성을 증가시키는 하나 이상의 염색제를 임의로 포함할 수 있다. 적합한 염색제에는 염료, 안료 및 천연 색소제가 포함된다. 적합한 염색제의 예에는 알시안 블루, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 FITC-덱스트란이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
또한, 폴리사카라이드를 포함하는 수용액은 하나 이상의 계면활성제를 임의로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 계면활성제는 물의 표면장력을 낮추는 화합물을 의미한다. 상기 계면활성제는 이온성 계면활성제, 예컨대 소듐 라우릴 술페이트, 또는 중성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄일 수 있다.
본 발명의 본질적인 특징은, b) 단계가 a) 단계의 용액에서 폴리사카라이드의 가교결합이 발생되기 전에 수행되는 것이다 (실시예 1 참조). 온도 및 시간은 수용액의 가교결합을 조절하는 주요 인자이다. 폴리사카라이드의 가교결합을 방지하거나 매우 제한하기 위하여, 상기 수용액은 37℃ 미만, 더 바람직하게는 4℃ 내지 25℃의 온도에서 제조될 수 있다. 또한, b) 단계는 상기 폴리사카라이드의 가교결합을 방지하기 위하여 가능한한 신속하게 수행될 수 있다.
상기 수용액이 제조되면, 이는 동결된다. 수용액의 동결은 다른 속도(예컨대, ℃/분)로 수행될 수 있다. 예를 들어, 동결은 약 1℃/분 내지 약 200℃/분, 바람직하게는 약 1℃/분 내지 약 20℃/분, 가장 바람직하게는 약 5℃/분 내지 약 10℃/분의 속도로 수행될 수 있다. 상기 용액은 액체 질소 또는 드라이아이스에서 동결될 수 있다.
상기 수용액이 동결될 때, 승화가 발생할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 다공성 스캐폴드의 제조방법에는 동결-건조 단계가 포함된다.
따라서, 본 발명에 따르면, 수용액에서 가교결합 과정이 발생하기 전에 동결-건조 과정이 발생해야 한다.
동결-건조는 당업계에 공지된 임의의 기구로 수행될 수 있다. 동결건조기에는 기본적으로 회전식 증발기, 매니폴드(manifold) 동결건조기 및 트레이(tray) 동결건조기의 3개의 카테고리가 있다. 상기 기구는 당업계에 잘 알려져 있으며, 동결건조기 리오박(Lyovac)(GT2, STERIS Rotary vane pump, BOC EDWARDS)처럼 시판된다.
기본적으로, 급속동결된 수용액은 챔버 내에 위치한다. 이어서, 상기 챔버 온도는 액화된 증기의 비점보다 더 높은 수준까지 증가되며, 이에 의해 상기 증기는 증발되고 제거된다. 예를 들어, 챔버의 온도는 -70℃ 내지 -1℃, 바람직하게는 -70℃ 내지 -40℃, 더 바람직하게는 약 -50℃ 내지 -40℃일 수 있다. 챔버의 가열은 챔버의 압력을 감소시키는 진공 플로우(vacuum flow)가 수반된다. 통상적으로, 상기 챔버의 진공은 0.1mBar 내지 약 6.5mBar이다.
동결-건조는 물의 98.5% 이상, 바람직하게는 물의 99% 이상, 더 바람직하게는 99.5% 이상을 제거하기 위하여 충분한 시간 동안 수행된다.
수용액의 동결은 물로부터 얼음 입자의 형성을 야기한다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않고, 상기 기재된 온도 및 압력 조건 하에서, 동결된 용액에 포함된 물은 승화되며, 이로 인해 얼음 입자에 의해 이미 점유된 공간에서 상기 물질 내에 틈을 남기며, 이에 따라 형성된 다공성 스캐폴드가 제조된다. 놀랍게도, 가교결합 과정이 상기 동결-건조 과정 동안 발생한다.
따라서, 상기 생성된 스캐폴드의 물질 밀도 및 공극 크기는 동결된 수용액의 동결-건조 속도를 조절함으로써 변화될 수 있다. 동결-건조 과정에서 중요한 매개변수는 진공율이다. 본 실시예에서, 본 발명자는 상이한 진공율이 스캐폴드 내 공극의 상이한 크기 및 밀도를 야기한다는 것을 실제로 입증하였다.
스캐폴드의 평균 공극 크기는 약 1μm 내지 약 500μm, 바람직하게는 약 150μm 내지 약 350μm, 더 바람직하게는 약 175μm 내지 약 300μm이다. 상기 공극의 밀도는 약 4% 내지 75%, 바람직하게는 약 4% 내지 약 50%이다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 본 발명에 따라 제조된 스캐폴드를 수화시키는 것으로 이루어진 추가 단계를 포함한다. 상기 수화는 원하는 함수량을 갖는 스캐폴드를 제조하기 위하여 충분한 소정량의 시간 동안 스캐폴드를 수용액(예컨대, 탈염수, 역삼투를 통해 여과된 물, 식염수 또는 적합한 유효성분을 포함하는 수용액)에 침지시켜 수행할 수 있다. 예를 들어, 최대의 함수량을 포함하는 스캐폴드가 요구될 때, 스캐폴드가 그의 최대 크기 또는 부피까지 팽창되도록 충분한 소정량의 시간 동안 스캐폴드를 수용액에 침지한다. 통상적으로, 스캐폴드는 약 1 시간 이상, 바람직하게는 약 2 시간 이상, 더 바람직하게는 약 4 시간 내지 약 24 시간 동안 수용액에 침지된다. 스캐폴드를 원하는 수준까지 수화하는데 필요한 시간의 양은 수개의 인자, 예컨대 사용된 폴리사카라이드의 조성물, 스캐폴드의 크기(예컨대, 두께) 및 수용액의 온도 및 점도 뿐만 아니라 다른 인자에 의존될 것으로 여겨진다.
특정 구현예에서, 수화된 스캐폴드는 80%의 물, 바람직하게는 90%의 물, 가장 바람직하게는 95%의 물을 포함한다.
또다른 특정 구현예에서, 수성 폴리사카라이드 용액은 동결 및 승화 이전에 주형에 주입될 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 방법으로 수득된 다공성 스캐폴드는 원하는 형태를 가질 수 있다. 임의의 기하학적 주형이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 상이한 크기가 예상될 수 있다. 예를 들어, 통상적으로 수용액은 중심축을 갖는 튜브형 주형에 주입될 수 있으며, 다공성 스캐폴드는 원하는 외부 및 내부 직경을 갖는 튜브형이 될 수 있다 (실시예 6 참조). 상기 주형은 임의의 물질로 구성될 수 있지만, 바람직한 물질은 테플론(Teflon)과 같은 비접착성 표면을 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 스캐폴드는 원하는 크기 및 형태를 갖기 위하여 절단되고 형상화될 수 있다.
본 발명의 방법은 임의의 적합한 방법을 이용하여 스캐폴드를 멸균하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 스캐폴드는 임의의 적합한 시점에서 멸균될 수 있지만, 바람직하게는 스캐폴드가 수화되기 전에 멸균된다. 적합한 비-방사선 멸균법에는 당업계에 공지된 UV-노출, 가스 플라즈마 또는 에틸렌옥시드 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 스캐폴드는 상표 PlazLyte로 Abtox, Inc of Mundelein, Illinois에서 시판되는 멸균 시스템을 사용하거나, 또는 US-5413760 및 US-5603895에 개시된 가스 플라즈마 멸균 공정에 따라 멸균될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 스캐폴드는 임의의 적합한 포장 물질로 포장될 수 있다. 바람직하게는, 포장 물질은 포장 물질이 제거되기 전까지 스캐폴드의 멸균성을 유지한다.
또다른 구현예에서, 하나 이상의 생체분자가 다공성 스캐폴드에 포함될 수 있다. 또다른 구현예에서, 생체분자에는 약물, 호르몬, 항생제, 항미생물 물질, 염료, 방사성 물질, 형광 물질, 항균성 물질, 화학제 또는 제제, 이의 임의의 조합물이 포함될 수 있다. 상기 물질들은 치료효과의 증대, 가시화의 증대, 적절한 방향의 표지, 감염의 내성, 치료의 촉진, 유연도의 증가 또는 임의의 다른 원하는 효과를 위해 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 본원에 기재된 하나 이상의 생체분자를 포함하는 본 발명의 스캐폴드는 활성제의 서방성 시스템으로서 사용될 수 있다.
일구현예에서, 생체분자에는 주화성 제제, 항생제, 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 진통제, 항염증제, 면역억제제, 항암 약물, 다양한 단백질 (예컨대, 단쇄 펩티드, 골형성 단백질, 당단백질 및 지질단백질); 세포 부착 매개체; 생물학적 활성 리간드; 인테그린 결합 시퀀스; 리간드; 다양한 성장 및/또는 분화 제제 (예컨대, 상피세포 성장인자, IGF-I, IGF-II, TGF-[베타], 성장 및 분화 인자, 기질 유래 인자 SDF-1; 혈관내피 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유래 성장인자 및 변형성 성장인자, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드, bFGF; TGF[베타] 슈퍼패밀리 인자; BMP-2; BMP-4; BMP-6; BMP-12; 소닉 헤지호그; GDF5; GDF6; GDF8; PDGF); 특정 성장인자의 상향조절에 영향을 미치는 소분자; 테나신-C; 히알루론산; 콘드로이틴 술페이트; 피브로넥틴; 데코린; 트롬보플라스틴; 트롬빈 유래 펩티드; 헤파린-결합 도메인; 헤파린; 헤파란 술페이트; DNA 절편, DNA 플라스미드, Si-RNA, 형질감염제 또는 이의 임의의 혼합물이 포함될 수 있다.
일구현예에서, 성장인자에는 헤파린 결합 성장인자(HBGF), 변형성 성장인자 알파 또는 베타(TGF), 알파 섬유아세포성 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF) 및 SDF-1, 또한 일부의 혈관형성 인자가 포함된다. 또다른 구현예에서, 인자에는 호르몬, 예컨대 인슐린, 글루카곤 및 에스트로겐이 포함된다. 일부 구현예에서, 신경 성장인자(NGF) 또는 근육 형성인자(MMF)와 같은 인자를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일구현예에서, TNF 알파/베타 또는 매트릭스 메탈로프로테나아제(MMP)가 포함된다.
또한, 본 발명의 스캐폴드는 항염증제, 예컨대 인도메타신, 살리실산 아세테이트, 이부프로펜, 설린닥, 피록시캄 및 나프록센; 혈전형성제, 예컨대 트롬빈, 피브리노겐, 호모시스테인 및 에스트라무스틴; 및 방사선비투과성 화합물, 예컨대 바륨 술페이트, 금 입자 및 산화철 나노입자(USPIO)를 임의로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 스캐폴드는 항혈전제, 예컨대 항비타민 K 또는 아스피린, (아데노신 디포스페이트(ADP)-유도 혈소판 응집을 선택적이고 비가역적으로 억제하는) 항혈소판제, 예컨대 아스피린, 티에노피리딘, 디피리다몰 또는 클로피도그렐, 또는 항응고제, 예컨대 헤파린을 임의로 포함할 수 있다. 혈전증 및 혈전색전증 모두를 감소시키는데 유효하다는 것이 입증된 헤파린(항응고제) 및 티로피반(항혈소판제)의 혼합물이 포함될 수 있다. 또한, 용량-의존성 항혈소판 및 항증식성 특징을 가지며, 일차 혈전증을 유발하는 콜라겐-유도 혈소판 응집을 억제하는, 잠재적 이소플라본인 제니스테인이 포함될 수 있다.
본 발명의 스캐폴드의 사용방법:
본 발명의 스캐폴드는 조직공학, 수복 또는 재생에 특히 적합하다. 공극율의 차이는 스캐폴드의 적절한 부위로 상이한 세포 유형의 이동을 가능하게 할 수 있다. 또다른 구현예에서, 공극율의 차이는 발달/수복/재생 조직의 적절한 구조화에 요구되는, 스캐폴드를 포함하는 세포 유형 중에서 적절한 세포와 세포의 연결의 발달을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 세포 처리의 확장은 스캐폴드성 물질의 다양한 공극율을 통해 더욱 적절하게 조절될 수 있다. 따라서, 스캐폴드는 임의의 조직 세포를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 상기 스캐폴드 상에 파종된다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 스캐폴드 전체에 세포의 침투가 가능하도록 충분한 소정량의 시간 동안 원하는 세포를 포함하는 배양액 내에 침지된다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 분화를 유도하지 않고 장기간 동안에 걸쳐 배양물 내 파종된 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 (성장 자극제에 의한 활성화 없이) 자극되지 않은 세포 성장을 위한 환경을 제공한다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 생리학적 및 병리학적 과정, 예컨대 조직 성장, 골 개조, 상처 치유, (전이 및 침범을 포함하는) 종양 형성 및 혈관형성을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 스캐폴드는 내인성 인자가 없는 제어된 방식으로 특정 과정이 조절되고 연구될 수 있는 제한 및 조절된 환경을 생성할 수 있다.
특히, 본 발명의 스캐폴드는 진단상 또는 독성학적 용량으로 3D 배양에 대해 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 3D 환경에 존재하는 세포 상에서 직접 생성물의 독성의 평가를 가능하게 한다. 상기 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 생성물, 예컨대 간세포, 배아줄기세포, 상피세포, 케라틴 형성 세포, 또는 유도 다능성 줄기세포(iPS 세포)의 독성학적 및/또는 약리학적 평가를 위해 유용한 세포를 배양하는데 사용된다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 시험관내 및 생체내에서 세포 유형의 성장 및 분화를 지지할 수 있다.
또다른 구현예에서, 상기 세포는 줄기 또는 전구세포이다. 또다른 구현예에서, 상기 세포에는 연골세포; 섬유연골세포; 골세포; 골아세포; 파골세포; 윤활막세포; 골수세포; 간엽세포; 상피세포, 간세포, 근육세포; 기질세포; 줄기세포; 배아줄기세포; 지방 조직으로부터 유래된 전구세포; 말초혈액 전구세포; 성체조직으로부터 단리된 줄기세포; 유도 다능성 줄기세포(iPS 세포); 유전적으로 변형된 세포; 연골세포 및 다른 세포의 혼합물; 골세포 및 다른 세포의 혼합물; 윤활막세포 및 다른 세포의 혼합물; 골수세포 및 다른 세포의 혼합물; 간엽세포 및 다른 세포의 혼합물; 기질 세포 및 다른 세포의 혼합물; 줄기세포 및 다른 세포의 혼합물; 배아줄기세포 및 다른 세포의 혼합물; 성체조직으로부터 단리된 전구세포 및 다른 세포의 혼합물; 말초혈액 전구세포 및 다른 세포의 혼합물; 성체조직으로부터 단리된 줄기세포 및 다른 세포의 혼합물; 및 유전적으로 변형된 세포 및 다른 세포의 혼합물이 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또다른 구현예에서, 상기 스캐폴드 및 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 임의의 상기 세포는 예를 들어 헤파린 결합 성장인자(HBGF), 변형성 성장인자 알파 또는 베타(TGF.베타.), 알파 섬유아세포성 성장인자(FGF), 상피세포 성장인자(TGF), 혈관 내피 성장인자(VEGF) 및 SDF-1, 또한 일부 혈관형성 인자와 같은 목적분자를 발현하기 위하여 유전적으로 가공될 수 있다. 또다른 구현예에서, 발현된 인자에는 호르몬, 예컨대 인슐린, 글루카곤 및 에스트로겐이 포함된다. 또다른 구현예에서 신경 성장인자(NGF) 또는 근육 형성인자(MMF)와 같은 인자가 발현되거나, 또다른 구현예에서 TNF 알파/베타와 같은 인자가 발현된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는, 예를 들어 Chaouat 등(Chaouat M, Le Visage C, Autissier A, Chaubet F, Letourneur D. The evaluation of a small-diameter polysaccharide-based arterial graft in rats. Biomaterials. 2006 Nov;27(32):5546-53. Epub 2006 Jul 20.)에 기재된 바와 같이, 면역반응이 발휘되지 못하는 동맥을 대체하기 위한 혈관 대체재를 제조하는데 적합하다. 상기 대체재는 상기 기재된 주형을 사용함으로써 본 발명의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이어서, 상기 대체재는 시험관내 또는 생체내에서 혈관을 복원하는 일군의 세포를 구성할 수 있다. 또다른 구현예에서, 상기 세포에는 간엽 줄기세포(MSC), 내피전구세포(EPC), 내피세포, 섬유아세포성 세포 및 평활근육 세포가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 연골 또는 골 임플란트를 제조하는데 적합하다. 상기 방법으로, 본 발명의 스캐폴드는 연골세포, 골세포; 골아세포; 파골세포; 혈관세포 또는 이의 혼합물을 적재할 수 있으며, 분화 제제의 존재 하에서 배양될 수 있다.
이식 부위는 치료를 요하는 병든/손상된 조직에 의존한다. 예를 들어, 관절 연골, 반월판 및 골의 구조적 결함을 치료하기 위하여, 세포-파종된 합성 스캐폴드는 손상된 조직의 복구를 촉진하기 위하여 결손 부위에 위치할 것이다.
중추신경계(CNS) 손상의 경우에, 합성 스캐폴드에 성체 신경 줄기세포, 배아줄기세포, 교질 세포 및 세르톨리 세포의 혼합물이 파종될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 합성 스캐폴드에 신경 줄기세포와 혼합된 이종 또는 동종 원, 변형 세포주로부터 유래된 세르톨리 세포가 파종될 수 있다. 세르톨리 세포는 손상 부위에 줄기세포의 첨가 및 일련의 이식 이전의 기간 동안 합성 스캐폴드와 함께 배양될 수 있다. 이러한 접근은 CNS 적용을 위한 세포 치료법, 즉 이식이 뒤따르는 줄기세포 생존의 주요 장애물 중 하나를 피할 수 있게 한다. 다수의 세르톨리 세포를 포획한 합성 스캐폴드는 줄기세포의 생존을 위해 더 순응적인 환경을 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 제조된 다공성 중합체 스캐폴드는 인공 조직 또는 기관, 예컨대 인공 혈관, 인공 방광, 인공 식도, 인공 신경, 인공 심장, 전립선 심장판막, 인공 피부, 정형외과 임플란트, 인공 근육, 인공 인대, 인공 호흡 기관 등을 제조하기 위한 원재료로서 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 다공성 중합체 스캐폴드는 조직 또는 기관으로부터 유래된 기능성 세포와 함께 다른 유형의 생체적합물질 상에 또는 내에 포함되거나 혼합됨으로써 혼성 조직의 형태로 제조될 수 있다. 이는 다양한 생물의학적 적용, 예를 들어 세포 기능의 유지, 조직 재생 등을 가질 수 있다.
선택적으로, 본 발명의 스캐폴드는 치료상 용도를 위한 세포 운반에 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 스캐폴드는 치료 또는 진단 목적을 위한 대상체에 투여될 수 있는 세포 운반 시스템을 제조하기 위한 원재료로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 세포, 특히 자가세포가 적재될 수 있는 패치, 바이오필름 또는 드레싱(dressing)을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 인간 및 동물 세포는 세포 배양 후에 그리고 세포이 동결 저장액으로부터 직접 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 스캐폴드는 피부를 복원하거나 치료하기 위해 피부상에 적용될 수 있는 세포를 포함하는 드레싱을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 드레싱은 국소빈혈(심근경색)을 치료하기 위하여 대상체의 심장에 적용되기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 구현예에서 스캐폴드 내에 포획된 세포는 목표 조직 또는 기관으로 이동할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드는 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 이어서, 세포는 적절한 성장인자의 추가에 의해 분화 또는 다른 생리학적 과정들이 진행되도록 자극될 수 있다. 하나 이상의 시토킨, 성장인자, 호르몬 또는 그의 혼합물을 포함하는 배양배지가, 세포를 미분화 상태로 유지하기 위하여 또는 세포를 특정 경로로 분화시키기 위하여 사용될 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명의 스캐폴드는 목적하는 분자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 실제로, 본 발명의 스캐폴드는 생물반응기 내에 세포의 정착을 위한 생물학적 환경을 제공하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 세포는 원하는 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 스캐폴드는 배양된 세포의 기계적 및 생화학적 보호를 제공한다.
따라서, 스캐폴드는 단백질, 유기 분자 및 뉴클레오티드와 같은 목적하는 분자를 제조하기 위한 세포 저장소로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 단백질에는 성장인자, 호르몬, 신호분자, 세포 성장의 억제제 및 항체가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스캐폴드는 특히 단일클론 항체를 제조하는 것과 관련된다. 또한, 본 발명의 스캐폴드는 향미제, 치료적 분자 등과 같은 유기 분자를 제조하는데 적합할 수 있다.
상기 목적에서, 본 발명의 스캐폴드에 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 임의 유형의 세포가 적재될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 스캐폴드에 박테리아, 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등이 적재될 수 있다. 구체적인 예에는 대장균, 클루이베로마이세스 또는 사카로마이세스 효모, 포유류 세포주(예컨대, 베로 세포, CHO 세포, 3T3 세포, COS 세포 등), 뿐만 아니라 1차 또는 확립된 포유류 세포 배양물(예컨대, 림프아세포, 섬유아세포, 배아세포, 상피세포, 신경세포, 지방세포 등으로부터 생성된 것)이 포함된다. 더 바람직하게는, 본 발명은 하이브리도마와 같은 확립된 세포주의 사용을 고려한다. 선택적으로, 상기 세포는 상기 기재된 바와 같이 원하는 분자를 발현하기 위하여 유전적으로 가공될 수 있다.
추가의 용도, 예컨대 치료 또는 진단 적용 또는 세포 분석을 위해 본 발명의 스캐폴드는 세포를 적재하고, 특정 시간 동안 배양될 수 있으며, 이어서 상기 세포는 스캐폴드로부터 회수/추출/단리될 수 있다. 스캐폴드로부터 세포의 단리는 스캐폴드를 분해할 수 있는 효소, 예컨대 풀루라나아제의 사용 및/또는 세포를 분리할 수 있는 효소, 예컨대 콜라게나아제, 엘라스타아제, 트립신 또는 세포-분리 용액, 예컨대 EDTA의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명은 하기의 도 및 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
도 1: 재수화 후에 원형의 다공성 스캐폴드의 육안적 외관
도 2: 동결-건조 처리 조건(진공 mbar)의 작용으로써 다공성 수화된 스캐폴드의 ESEM에 의한 현미경 관찰. 스케일 바(Scale bar): 200 미크론, 고배율(50 미크론) 제외.
도 3: 0.1 mbar(좌측) 또는 6.5 mbar(우측)에서 제조된 다공성 건조 스캐폴드의 SEM 관찰.
도 4: 0.1 mbar 또는 6.5 mbar에서 제조된 다공성 스캐폴드 절편의 H&E 염색의 관찰 (배율, x40).
도 5: 동결-건조 압력의 함수로서 팽창율
도 6: 포로겐 제제의 부재 하에서 제조된 비-다공성 스캐폴드로부터의 노르플록사신의 방출과 비교된, 다공성 스캐폴드로부터의 노르플록사신의 방출
실시예 1: 폴리사카라이드-기재 스캐폴드 제조
물에서 총 농도가 24.5%(w/v)인 풀루란/덱스트란 75:25의 혼합물(풀루란, MW 200,000, Hayashibara Inc., Okayama, Japan; 덱스트란 MW 500,000, Pharmacia)을 제조하였다. 염기성 조건 하에서 가교결합제 소듐 트리메타포스페이트 STMP(11%(w/v), Sigma)를 사용하여 폴리사카라이드의 화학적 가교결합을 수행하였다. 간략하게는, 9 mL의 폴리사카라이드 용액을 1 mL의 수산화나트륨 10M과 혼합한 후에, 1 mL의 물 내 300 mg의 STMP를 상기 혼합물에 첨가하였다. 상기 용액을 즉시 60 mm 페트리 접시에 부은 후, -80℃에서 저장하였다. 리오박(Lyovac) 동결건조기(GT2, STERIS Rotary vane pump, BOC EDWARDS)에서 동결-건조 과정 동안 동결된 혼합물 상에서 가교결합이 수행되었다. 스캐폴드를 24시간 동안 동결-건조하여 물을 완전히 제거하였다. 동결-건조 과정 동안 가교결합된 스캐폴드는 불투명하고 약간 취약하였다. 이는 원하는 크기 및 형상으로 용이하게 절단될 수 있었고, 재수화될 수 있었다 (도 1).
대조 실험은 50℃에서 실시된 화학적 가교결합 후에 수득된 동결-건조 스캐폴드에 의해 수행하였다. 그러나, 상기 건조된 스캐폴드는 동결-건조 처리 후에 그의 전체 구조가 손상되었기 때문에, 적절하게 재수화할 수 없었다. 상기 과정에서 가교결합제를 생략함으로써 다른 실험을 수행하였다. 이러한 조건에서, 동결-건조 프로토콜은 용액만을 야기하고 스캐폴드를 야기하지 않는다.
실시예 2: 동결-건조 조건의 영향
폴리사카라이드 스캐폴드의 제조를 실시예 1에 따라 실시하였다. 동결-건조 단계 동안, 제어된 누출부(leak)를 이용하여 진공(O.1 mbar, 0.75 mbar, 3 mbar, 1.5 mbar 및 6.5 mbar)을 다르게 조절하였다.
생성된 스캐폴드는 환경주사전자현미경(ESEM) 및 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 특징지어졌다. 스캐폴드의 수화된 상태에서 그의 표면을 ESEM-FEG(Philips XL 30, Netherlands, 4 토르의 압력에서 가속전압 15 kV를 가짐)를 사용하여 직접 관찰하였으며, 이는 ESEM 기법이 샘플의 탈수를 요구하지 않기 때문이다. 스캐폴드의 팽창된 상태에서 그의 ESEM 이미지는 상기 스캐폴드가 다공성임을 나타내었다 (도 2). 0.1 mbar(고 진공)에서 동결건조된 스캐폴드는 6.5mbar(저 진공)에서 제조된 스캐폴드보다 더 큰 직경의 공극을 나타내었다. 저 진공 조건에서, 스캐폴드의 네트워크는 스캐폴드의 도처에서 상호연결된 공극으로 균질성 있게, 더 잘 조직화되었다. 건조된 스캐폴드의 SEM 이미지로부터 동결-건조 단계 동안 가교결합된 스캐폴드가 다공성임을 확인하였다 (도 3). 조직학적 염색을 위해, 스캐폴드를 4% 파라포름알데히드/PBS에 고정한 후에, 이를 OCT-포매하고 (Tissue Teck-OCT (EMS, Washington, PA)), 액체 질소 냉각-이소펜탄에서 동결하였다. 상기 동결된 샘플을 저온유지장치(Leica CM 1900)를 사용하여 동결절편시켰다 (10μm 절편). 헤마톡실린/에오신 염색을 스캐폴드 절편에 대해 수행하여, 스캐폴드의 구조를 가시화하였다.
조직학적 절편 상에서 스캐폴드의 외관은 전자 현미경 이미지와 일치하였다 (도 4). 스캐폴드의 내부 공극 구조는 동결-건조 진공을 변화시켜 조절할 수 있었다. 저 진공(6.5mbar)에서 가교결합된 스캐폴드는 작은 공극을 갖는 구조를 나타낸 것에 비해, 고 진공(0.1 mbar)에서 가교결합된 스캐폴드는 느슨한 네트워크를 나타내었다.
실시예 3: 팽창율
폴리사카라이드 스캐폴드의 제조를 실시예 2에 따라 실시하였다. 동결-건조된 스캐폴드를 면도날로 절단하여, 직사각형의 스캐폴드(2.5cm x 2cm, 두께: 3mm)를 수득하였다. 모든 완충염을 제거하기 위하여 스캐폴드를 탈염수에서 세척한 후에, 36시간 동안 50℃에서 탈수시켰다. 24시간 동안 탈염수에서 재수화한 후에, 건조 상태의 샘플 질량(W 건조) 및 팽창 상태의 샘플 질량(W 팽창)을 전자저울(AG 204 Deltarange® mettler Toledo; max 81g/210g; d=0.1mg/1mg)을 사용하여 측정하였다. 칭량 전에, 과량의 물을 제거하기 위하여 팽창된 스캐폴드를 연질 종이 위에 주의깊게 놓았다. 각각의 실험은 3번 실시하였다. 팽창율은 하기 식에 따라 계산하였다: 팽창율=((W 팽창 - W 건조)/W 건조) x 100.
동결-건조 진공의 증가에 따라 다공성 스캐폴드의 팽창율이 증가하였다 (도 5). 가장 낮은 팽창율은 가장 낮은 진공(6.5 mbar)에서 제조된 스캐폴드에서 발견되었다.
실시예 4: 세포의 침투
위스타르 래트(Wistar rat)의 대퇴 골수 간엽줄기세포(MSC)를 실시예 1에서와 같이 제조된 스캐폴드 상에서 배양하였다. 6mm의 직경 및 1mm의 두께의 둥근 형태의 다공성 스캐폴드를 절단하기 위하여 원형 펀치를 사용하였다. 세포 파종 전에, 스캐폴드를 24시간 동안 37℃에서 24-웰 플레이트 내 배양배지에서 평형화하였다. 배양배지는 10% 소 태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma)와 저 글루코스 DMEM(Gibco, Life Technology, New York)으로 이루어져 있다. 세포를 스캐폴드의 상부에 파종하였다 (세포 밀도: 106개 세포/스캐폴드). 아스코르브산(50 μg/ml)이 추가된 배양배지를 2-3일마다 교환하였다. 샘플을 1주까지 동안 배양배지에서 유지하였다. 배양배지에서 배양된 파종되지 않은 다공성 스캐폴드를 대조군으로서 사용하였다. 동물 및 인간을 기원으로 하는 1차 혈관 평활근육 세포 및 내피세포와 같은 다른 세포 유형에 대해 유사한 실험을 성공적으로 실시하였다.
- 초기 부착: MSC가 스캐폴드에 침투되어, 2시간 미만 내에 다공성 스캐폴드 표면상에 부착된 세포.
- 세포 탐지: 파종 단계 이전의 세포를 제조사의 지시에 따라 형광 안료 PKH26(Sigma)으로 표지하여 세포 탐지를 수행하였다. 표지되지 않은 스캐폴드 및 FITC-스캐폴드 모두에 대해 세포를 파종하였다. 이어서, 파종된 스캐폴드를 4% 파라포름알데히드/PBS에 고정한 후, 공초점(confocal) 현미경법(Zeiss LSM 510)으로 분석하였다.
PKH26 표지된 MSC를 스캐폴드의 공극을 통해 탐지하였다. 상기 겔 내에서 세포 분포의 대표 이미지가 1일 및 7일 동안 70 및 190 미크론의 깊이에서 획득되었다. 공초점 이미지의 z-축 투사로부터 상기 겔 내에서 세포의 침투를 확인하였다. 1일째부터 7일째까지 스캐폴드 내에서 세포 밀도의 증가를 관찰하였다.
- 세포 생존율: 생존 세포에 의해 가수분해되는 다음이온성 염료인 칼세인 AM(Calbiochem, San Diego CA)을 사용하여 세포 생존율을 평가하였으며, 이에 따라 강한 단일 녹색 형광(파장 485-535 nm)을 나타내었다. 제조사의 지시에 따라 상기 염료를 다공성의 표지되지 않은 스캐폴드 및 FITC-스캐폴드에 대해 1일째, 5일째 및 7일째에 첨가하였다. 이어서, 상기 파종된 스캐폴드를 4% 파라포름알데히드/PBS에 고정한 후, 상기 스캐폴드 및 FITC-스캐폴드 내의 세포 분포를 가시화하기 위하여 공초점 현미경법(Zeiss LSM 510)으로 분석하였다.
1일째 및 7일째에 대부분의 세포가 다공성 스캐폴드의 표면 및 내부에서 생존해 있음을 상기 분석으로부터 확인하였다.
실시예 5: 스캐폴드 내로 단백질의 혼입
젤라틴 및 콜라겐 제1형과 같은 접착성 단백질을 혼입하기 위한 하기의 변경과 함께, 실시예 1에 따라 폴리사카라이드 스캐폴드의 제조를 실시하였다. 젤라틴에 대해, 9 mL의 폴리사카라이드 용액을 1 mL의 수산화나트륨 10M과 혼합한 후에, 500 μg의 젤라틴을 포함하는 1 mL의 물(500 μL의 0.1% 젤라틴 용액) 내 300 mg의 STMP를 상기 혼합물에 첨가하였다. 500 μL의 0.4% 콜라겐 용액(Upstate #08115)을 상기 폴리사카라이드 용액에 첨가한 후 가교결합 시약(500 μL 내 300 mg)을 첨가하여, 콜라겐 제1형의 혼입을 실시하였다. 스캐폴드의 두꺼운 절편에 대한 쿠마시 블루 및 시리우스 레드 염색으로부터 스캐폴드 내의 단백질 분포를 확인하였다. 단백질의 평균 함량은 6 mm 직경 스캐폴드에 대해 약 1 μg의 젤라틴, 그리고 6 mm 직경 스캐폴드에 대해 약 4 μg의 콜라겐이라고 추정되었다.
실시예 6: 혈관 대체재로서 튜브형 스캐폴드
실시예 1에 기재된 바에 따라 제조된 폴리사카라이드-기재 튜브형 스캐폴드는 혈관 대체재로서 사용될 수 있다.
실시예 1에 기재된 바에 따라 제조된 수용액을 2OG 니들 및 니들 캡으로 이루어진 자가제 튜브형 주형에 주입하였다. 상기 내강(2mm 내강 직경)의 매끄러운 표면을 만들기 위하여 니들(20G x 11/2" 또는 0.9 x 40 mm)을 중심축으로서 사용하였다. 상기 폴리사카라이드/STMP 용액을 1 ml 주사기를 사용하여 니들 캡을 통해 니들에 주입하였다. 생성된 튜브형 스캐폴드의 내부 및 외부 직경 모두는 니들 및 니들 캡의 크기에 의존한다 (샘플을 또한 18G 또는 21 G 니들을 사용하여 제조하였다).
실시예 1에 따라, 상기 주형을 -80℃에서 즉시 동결하였다. 두번째로, 상기 혼합물을 상기 기재된 바에 따라 동결-건조하였다. 동결-건조 후에, 상기 스캐폴드는 주형으로부터 용이하게 제거되었다. PBS에서 재수화 후에, 튜브 형상의 스캐폴드를 수득하였다. 평활근육 세포 또는 간엽 줄기세포와 같은 세포를 재수화 단계 동안 튜브형 스캐폴드에 파종할 수 있으며, 이어서 내피 세포 또는 내피 전구세포와 같은 다른 세포를 튜브형 스캐폴드의 내강 내에 적재할 수 있다.
실시예 7: 스캐폴드 내로 약물의 혼입
노르플록사신과 같은 약물을 혼입하기 위한 하기의 변경과 함께, 실시예 1에 따라 폴리사카라이드 스캐폴드의 제조를 실시하였다. 플루오로퀴놀론 카르복실산인 노르플록사신은 광범위하게 사용되는 항미생물제이다. 이는 생물학적 이용가능성이 낮은 화합물 모델로서 현재 여겨지며, 이는 주로 그의 낮은 수용성에 기인한다. 노르플록사신(Sigma)을 상기 폴리사카라이드 용액(10g)에 고체 상태(60 mg)에서 첨가하였으며, 상기 혼합물을 균질해질 때까지 교반하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 1 mL의 수산화나트륨 10M과 혼합한 후에, 1 mL의 물 내 300 mg의 STMP를 상기 혼합물에 첨가하였다. 그 후, 실시예 1에 따라 가교결합 단계를 수행하였다.
24시간까지 동안 37℃에서 PBS에서 다공성 스캐폴드를 배양함으로써 방출 프로파일을 수득하였다. 상청액 내의 노르플록사신의 함량은 274 nm에서 분광광도계에 의해 분석되었다. 도 6은 포로겐 제제의 부재 하에서 제조된 비-다공성 스캐폴드로부터 방출되는 것에 비교하여, 다공성 스캐폴드로부터 노르플록사신의 방출을 나타낸다.

Claims (20)

  1. 하기로 이루어진 단계를 포함하는 다공성 스캐폴드의 제조방법으로서, 폴리사카라이드의 가교결합이 하기 c)의 승화 단계 동안 발생하는 것을 특징으로 하는 제조방법:
    a) 소정량의 하나 이상의 폴리사카라이드 및 하나 이상의 가교결합제를 포함하는 염기성 수용액을 제조하는 단계,
    b) 상기 a) 단계의 수용액을 동결하는 단계, 및
    c) 상기 b) 단계의 동결된 용액을 승화시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리사카라이드가 덱스트란, 한천, 알긴산, 히알루론산, 이눌린, 풀루란, 헤파린, 키토산 및 푸코이단으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교결합제가 트리소듐 트리메타포스페이트(STMP: trisodium trimetaphosphate), 포스포러스 옥시클로리드(POCl3), 에피클로로히드린, 포름알데히드, 수용성 카르보디이미드 및 글루타르알데히드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 가교결합제가 트리소듐 트리메타포스페이트(STMP)인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 0.1 mBar 내지 6.5 mBar의 압력에서 수행되는 것인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계의 수용액이 b) 단계 이전에 주형에 주입되는 것인 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 수득된 스캐폴드를 원하는 크기 및 형태로 절단 및 형상화하는 것으로 이루어진 추가 단계를 포함하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계에서 수득된 스캐폴드를 재수화하는 것으로 이루어진 추가 단계를 포함하는 제조방법.
  9. 제1항에 따른 제조방법으로 수득되는 다공성 스캐폴드.
  10. 제9항에 있어서,
    공극의 크기가 1 μm 내지 500μm인 다공성 스캐폴드.
  11. 제9항에 있어서,
    공극율이 4% 내지 50%인 다공성 스캐폴드.
  12. 제9항에 있어서,
    소정량의 세포를 적재한 것을 특징으로 하는 다공성 스캐폴드.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 세포가 효모 세포, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다공성 스캐폴드.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 포유류 세포가 연골세포, 섬유연골세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 근육세포, 윤활막세포, 골수세포, 간엽세포, 상피세포, 간세포, 기질세포, 줄기세포, 배아줄기세포, 지방 조직으로부터 유래된 전구세포, 말초혈액 전구세포, 성체조직으로부터 단리된 줄기세포 및 유전적으로 변형된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 다공성 스캐폴드.
  15. 제9항에 있어서,
    조직공학, 3D 세포 배양 또는 치료적 사용을 위한 세포 운반용인 다공성 스캐폴드.
  16. 제9항에 따른 다공성 스캐폴드로 구성된 혈관 대체재.
  17. 제9항에 따른 다공성 스캐폴드로 구성된 연골 또는 골 임플란트.
  18. 제9항에 따른 다공성 스캐폴드로 구성된 활성제의 서방성 시스템(controlled release system).
  19. 삭제
  20. 삭제
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