KR101471273B1

KR101471273B1 - Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising superoxide dismutase 2 and diagnostic kit using the same

Info

Publication number: KR101471273B1
Application number: KR1020130009865A
Authority: KR
Inventors: 송인성; 김형규; 정승훈; 이성률; 김나리; 한진
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-12-11
Also published as: KR20140097712A

Abstract

본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하며, 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 다발성 골수종 환자 시료로부터 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공한다. The present invention relates to a bortezomib resistant biomarker composition for use in the treatment of multiple myeloma comprising SOD2 (superoxide dismutase 2), and a diagnostic kit using the same. The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis of bortezomib resistance and a diagnostic kit using the SOD2 (superoxide dismutase 2) And a bortezomib resistant diagnostic biomarker composition comprising the protein or a specific antibody thereof, wherein the bortezomib resistant diagnostic kit comprising the composition is provided. Also, the present invention provides a method for diagnosing bortezomib resistance, comprising measuring the mRNA expression level of SOD2 (superoxide dismutase 2) gene or the expression level of the protein encoded by the gene from a sample of multiple myeloma patients and comparing with a normal control sample do.

Description

ＳＯＤ２를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트{Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising superoxide dismutase 2 and diagnostic kit using the same}[0001] The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing bortezomib resistance, comprising SOD2 and a diagnostic kit using the same, and a diagnostic kit using the biomarker composition for diagnosis of bortezomib,

본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉(bortezomib; 상품명 벨케이드(velcade)) 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker composition for the diagnosis of resistance to bortezomib (velcade) used as a therapeutic agent for multiple myeloma including superoxide dismutase 2 (SOD2) and a diagnostic kit using the same.

다발성 골수종은 백혈병, 림프종과 함께 대표적인 혈액종양으로 B림프구의 성숙형태인 형질세포가 증식하는 혈액암이다. 평균 65세 이상의 고령에서 발병하며, 비교적 동양인에서는 낮은 발병율을 보이며, 1980년대 우리나라 발병율은 연간 100명 이내로 매우 낮았다. 하지만, 급속한 산업화에 따른 공해, 환경호르몬에 노출증가, 고령화로 인해 다발성 골수종 환자는 지속적으로 증가하고 있다. 지난 20년간 다른 암종의 발생률은 5배의 증가에 머물렀으나, 다발성 골수종의 경우, 약 30배 이상의 발생증가를 보이고 있다.Multiple myeloma is a typical hematologic tumor with leukemia and lymphoma. It is a hematologic malignancy in which plasma cells, a mature form of B lymphocyte, proliferate. The average incidence is 65 years or older, relatively low in Asians, and the incidence rate in Korea is very low in the 1980s. However, due to rapid industrialization, increased exposure to environmental hormones, and aging, the number of patients with multiple myeloma continues to increase. Over the past two decades, the incidence of other carcinomas has increased fivefold, but the incidence of multiple myeloma has increased by more than 30-fold.

이러한 다발성 골수종의 치료는 멜팔란과 프레드니존을 이용한 표준화학요법 (MP요법), 65세 이하의 환자에 적용되는 고용량 화학요법 및 조혈모세포 이식요법, 기존치료에 반응하지 않는 불응암이나 재발된 골수종에 대한 표적치료가 있다. 그러나 현재 사용되는 약물들에 내성암 및 불응암이 발생하여 다발성 골수종으로 인한 사망률이 매우 높다. 특히 최근 2차 약제로 FDA 승인을 얻은 표적치료제인 보르테조밉(bortezomib; 상품명 벨케이드(velcade))가 치료불응암 및 재발암에 효과가 높은 것으로 보고되었으나, 전체 반응율은 35%, 완전 관해율은 10%로 미미한 실정이며 이미 이 약물의 내성암이 보고되고 있다. 따라서 이러한 다발성 골수종의 치료불응이나 재발암을 효과적으로 치료하여 다발성 골수종환자의 생존율을 획기적으로 증가시킬 수 있는 치료요법의 개발이 시급하다. 한편, 미토콘드리아는 세포사멸에 중요한 인자로 작용하는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 보르테조밉 내성과 관련된 연구는 거의 없는 실정이다.
The treatment of multiple myeloma is based on the standardization method (MP therapy) using melphalan and prednisone, high-dose chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation therapy for patients under 65 years of age, uncomplicated or recurrent myeloma There is a target treatment for. However, currently used drugs are endometritis and non-mucosal tumors, and mortality from multiple myeloma is very high. In particular, bortezomib (velcade), a targeted drug that has recently received FDA approval as a second-line drug, has been reported to be highly effective in treating untreated and recurrent cancer, but the overall response rate is 35% and the complete remission rate is 10% And it is already reported that metastatic cancer of this drug has been reported. Therefore, it is urgent to develop therapies that can effectively treat the multiple myeloma and to increase the survival rate of patients with multiple myeloma. On the other hand, although mitochondria are known to act as important factors for apoptosis, there are few studies related to bortezomib resistance.

한편, 한국특허출원 제10-2007-7008837호(출원일 2007.04.18)는 보르테조밉 및 표피 성장 인자 수용체 키나아제 억제제로의 병용 치료에 관한 것으로서, 다른 항암 약물 또는 방사선요법과 같은 추가 제제 또는 치료법과 함께 또는 없이, 치료적 유효량의 EGFR 키나아제 억제제 및 보르테조밉이 사용되는 것을 특징으로 하는 환자의 종양 또는 종양 전이 치료를 위해 의도된 약제의 제조방법을 제공한다고 개시하고 있으나, 본 발명의 SOD2를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물에 대한 언급은 없다.
Korean Patent Application No. 10-2007-7008837 (filed on Apr. 18, 2007) discloses a combination therapy with bortezomib and epidermal growth factor receptor kinase inhibitor, together with other anti-cancer drugs or additional agents or therapies such as radiotherapy Wherein the therapeutically effective amount of EGFR kinase inhibitor and bortezomib is used to treat a tumor or a metastatic tumor of a patient, wherein the Bordeta containing the SOD2 of the present invention There is no mention of a biomarker composition for the detection of a prepubertic resistance.

따라서, 본 발명자들은 보르테조밉의 내성세포주와 민감성 세포주를 구분하여 미토콘드리아 유전자의 발현을 확인하고, 동정된 유전자들의 발현과 보르테조밉에 의한 세포사멸과의 상관관계 증명을 통해 보르테조밉 약효 예측 인자로 정하였으며, 다발성 골수종 세포주들의 보르테조밉 민감성을 조사하여 이중 KMS20세포주는 내성을, KMS28BM 세포주는 민감한 반응을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors have identified mitochondrial gene expression by distinguishing between bortezomib-resistant and sensitive cell lines, and by correlating the expression of the identified genes with the cell death by bortezomib, The bortezomib sensitivity of multiple myeloma cell lines was investigated, confirming that the KMS20 cell line was resistant to KMS20 cell line and KMS28BM cell line was sensitive. Thus, the present invention was completed.

본 발명의 목적은 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a bortezomib resistant diagnostic biomarker composition comprising a superoxide dismutase 2 (SOD2) gene, or a protein expressed from the gene, or an antibody specific thereto.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공하는데 있다. It is another object of the present invention to provide a bortezomib resistant diagnostic kit comprising the composition.

본 발명의 또 다른 목적은 다발성 골수종 환자 시료로부터 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공하는데 있다. It is still another object of the present invention to provide a method for diagnosing bortezomib resistant disease comprising the step of measuring mRNA expression level of superoxide dismutase 2 (SOD2) gene or expression level of protein encoded by said gene from a sample of multiple myeloma patients and comparing with a normal control sample Method.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a bortezomib resistant biomarker composition comprising a superoxide dismutase 2 (SOD2) gene or a protein expressed from the gene or an antibody specific thereto.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공한다. 상세하게는 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 한다.
The present invention also provides a bortezomib resistant diagnostic kit comprising the composition. Specifically, the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit, or a protein chip kit.

본 발명에서 "보르테조밉(bortezomib)"은 다발성 골수종 치료제로 사용되고 있으며, 상품명은 벨케이드(velcade)이다.
In the present invention, "bortezomib" is used as a therapeutic agent for multiple myeloma, and the trade name is velcade.

본 발명에서 용어, "진단" 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 다발성 골수종 치료제인 보르테조밉에 대한 내성 여부를 확인하는 것이다.
As used herein, the term "diagnosis" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm resistance to bortezomib, a multiple myeloma treatment.

본 발명에서 용어, "진단 마커, 진단용 마커 또는 진단용 바이오 마커" 란 보르테조밉 내성 세포를 정상세포(감수성 세포)와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포(감수성 세포)에 비하여 내성 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커는 정상 세포에 비하여, 내성 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자이다.
In the present invention, the term "diagnostic marker, diagnostic marker or diagnostic biomarker" refers to a substance capable of distinguishing bortezomib resistant cells from normal cells (susceptible cells) (Such as mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins, or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) that exhibit reduced or decreased activity. For the purpose of the present invention, the bortezomib resistant diagnostic biomarker of the present invention is a superoxide dismutase 2 (SOD2) gene which is specifically expressed in resistant cells in comparison with normal cells.

SOD2는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 2(superoxide dismutase 2)를 인코딩하는 유전자로서, 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔 주는 불균등화 반응을 촉매하는 효소이며 미토콘드리아에 존재한다. 산소에 노출되는 거의 모든 세포에서 항산화방어기작을 하는 것으로 알려져 있다. SOD2 유전자 및 단백질 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있다 (GeneID: 6782304, NM_000636.2). 본 발명에서는 SOD2의 유전자 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 1과 서열번호 2에 나타내었다.
SOD2 is a gene that encodes superoxide dismutase 2, an enzyme that catalyzes disproportionation reactions that convert excess oxidized ions into oxygen and hydrogen peroxide, and is present in mitochondria. It is known that almost all cells exposed to oxygen are antioxidant defense mechanisms. SOD2 gene and protein information is registered in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (GeneID: 6782304, NM_000636.2). In the present invention, the gene and amino acid sequence of SOD2 are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.

또한, 본 발명은 다발성 골수종 환자 시료로부터 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및 상기 환자 시료의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료보다 높을 경우 보르테조밉에 내성이 있다고 판단하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공한다.Also, the present invention provides a method for detecting a superoxide dismutase (SOD2) gene, comprising: measuring mRNA expression level of a superoxide dismutase 2 (SOD2) gene or expression level of a protein encoded by the gene from a multiple myeloma patient sample; Comparing the mRNA expression level of the gene or the expression level of the protein encoded by the gene with a normal control sample; And determining that bortezomib is resistant if the mRNA expression level or the protein expression level of the patient sample is higher than that of the normal control sample.

상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In detail, the method for measuring the mRNA expression level may be RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA) ), Northern blotting, and DNA chips, but are not limited thereto. Also, as a method for measuring the protein expression level, an amount of protein is determined using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Analysis methods include Western blotting, enzyme linked immunosorbent as (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis Immunoprecipitation assays, complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like, but the present invention is not limited thereto.

본 발명에서 용어 “환자 시료”란 보르테조밉 내성 바이오 마커 유전자인 SOD2의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
The term " patient sample " in the present invention includes, but is not limited to, tissues, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid or urine which have different expression levels of the bortezomib resistant biomarker gene SOD2 It does not.

본 발명은 SOD2(superoxide dismutase 2)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, 다발성 골수종 환자에 대한 보르테조밉 사용의 적합성을 미토콘드리아 유전자의 발현을 통해 환자에게 투약 전 예측하여 보르테조밉 내성과 불응성의 가능성을 극복할 수 있는 약제 등을 동시에 처리함으로써 치료효과를 높이고 환자의 부담을 줄여 다발성 골수종 환자의 생존률을 높이고자 하였다.The present invention relates to a biomarker composition for diagnosing bortezomib resistance and to a diagnostic kit using the composition for the treatment of multiple myeloma including SOD2 (superoxide dismutase 2). The present invention relates to the use of bortezomib for the treatment of multiple myeloma, The aim of this study was to improve the survival rate of patients with multiple myeloma by increasing the therapeutic effect and reducing the burden of patients by simultaneously treating the patients with Bortezomib resistance and the possibility of refractory disease.

도 1은 다발성 골수종 세포에 따른 보르테조밉의 세포사멸 효과를 확인한 결과이다. a, 보르테조밉을 농도별로 처리한 후의 FACS 결과 및 정량 그래프; b, 50nM 보르테조밉 처리 후 시간별로 FACS 분석한 결과; c, 농도별로 보르테조밉 처리 48시간 후 자가세포사멸된 세포의 수 측정 결과.
도 2는 다발성 골수종의 보르테조밉에 의한 세포 사멸 감수성 차이를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 마이크로어레이를 통해 얻어진 결과로부터 후보 유전자를 확보하고, 이들 유전자에 대한 발현 양상을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다(A). 특히 내성 세포주와 감수성 세포주 간의 발현 차이를 보이는 SOD2(superoxide dismutase 2)를 선별하여 발현 변화를 비교한 결과이다(B).
도 5는 SOD2 발현 억제(knockdown)에 따른 보르테조밉 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 SOD2 억제 항암제 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol)과 보르테조밉의 병용처리에 따른 효과를 나타낸 결과이다.FIG. 1 shows the results of examining the cell killing effect of bortezomib according to multiple myeloma cells. a, FACS results and quantification graphs after treatment of bortezomib by concentration; b, and 50 nM of bortezomib treatment; c, the number of self-apoptotic cells after 48 hours of treatment with bortezomib by concentration.
FIG. 2 shows the results of western blot analysis for the difference in cell death susceptibility of bortezomib of multiple myeloma.
FIG. 3 shows the result of confirming the difference in mitochondrial function according to multiple myeloma cells.
Fig. 4 shows the result obtained by securing a candidate gene from the results obtained through microarray and confirming the expression pattern of these genes through real-time RT-PCR (A). In particular, SOD2 (superoxide dismutase 2), which shows a difference in expression between the resistant and susceptible cell lines, was selected and compared with the expression changes (B).
FIG. 5 shows the results of confirming the bortezomib effect upon knockdown of SOD2 expression.
FIG. 6 shows the effect of the combination treatment of SOD2 inhibiting anticancer agent 2-methoxyestradiol with bortezomib.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the present invention is not limited by these examples.

<< 실시예Example 1> 다발성 골수종 세포에 따른 1> According to multiple myeloma cells 보르테조밉의Bortezomib 세포사멸 효과 확인 Confirmation of cell killing effect

1. 세포 배양1. Cell culture

다발성 골수종 세포주 KMS20과 KMS28BM 세포주는 보르테조밉에 대한 반응 및 미토콘드리아 기능 관련 유전자, CypD의 특이적 발현을 확인하고, 상기 유전자의 기능을 확인하기 위해 배양하였다. KMS20과 KMS28BM 세포주는 일본 Kawasaki medical school에서 다발성 골수종 환자로부터 확립된 세포주로 이들로부터 분양받아 본 실험을 위해 사용하였다. KMS20과 KMS28BM 세포들은 RPMI1640 (Lonza, USA)에서 배양되었으며, 상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/ml 엠피실린이 포함된 배지에서 배양되었다.
The multiple myeloma cell lines KMS20 and KMS28BM cell lines were cultured in order to confirm the function of bortezomib and the specific expression of CypD gene related to mitochondrial function. KMS20 and KMS28BM cell lines were established from multiple myeloma patients in Kawasaki medical school in Japan and were used for this experiment. KMS20 and KMS28BM cells were cultured in RPMI1640 (Lonza, USA) and cultured in media containing 10% fetal bovine serum, 100 mg / ml streptomycin, and 100 IU / ml ampicillin.

2. 2. FACSFACS 분석 analysis

다발성 골수종 세포주 KMS20과 KMS28BM에서 보르테조밉 처리에 의한 세포사멸을 분석하기 위하여 Annexin V-FITC/PI 염색법을 이용하여 사멸세포를 염색한 후 이를 FACScanto (BD)를 이용하여 분석하였다. Annexin V-FITC는 자가세포사멸시 일어나는 현상으로 세포막에 존재하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)이 세포사멸시 방향이 세포 바깥쪽으로 역전되는 것을 인식하여 세포를 염색시키며, 프로피디움 이오디드(propidium iodide; PI)는 그 자체로는 세포 안으로 들어가지 못하나 세포사멸시 세포막이 붕괴되면 세포 내로 들어가 염색체를 염색시킨다. 따라서 자가세포사멸 (apoptosis)은 Annexin V-FITC에 의해 세포괴사 (necrosis)는 PI에 의해 검출된다. 각 세포들을 처리 시간에 따라 혹은 보르테조밉 농도에 따라 배양한 후 원심분리기를 통해 세포를 모은 후, Annexin V-FITC/PI 시약을 사용하여 염색하여 FACS 분석기를 이용하여 세포사멸을 측정하였다.
In order to analyze the cell death by bortezomib treatment in multiple myeloma cell lines KMS20 and KMS28BM, apoptotic cells were stained with Annexin V-FITC / PI staining method and analyzed using FACScanto (BD). Annexin V-FITC is a phenomenon that occurs during autologous cell death, when phosphatidylserine present in the cell membrane recognizes that the direction of cell death is reversed to the outside of the cell and stains the cell, and propidium iodide (PI) Can not enter the cell itself, but when the cell membrane collapses during cell death, it enters the cell and stains the chromosome. Therefore, apoptosis is detected by Annexin V-FITC and necrosis is detected by PI. Each cell was cultured according to treatment time or according to bortezomib concentration, cells were collected through a centrifuge, stained with Annexin V-FITC / PI reagent, and cell death was measured using a FACS analyzer.

3. 결과3. Results

보르테조밉에 대한 내성과 미토콘드리아와의 상관관계분석을 위해 먼저 보르테조밉에 내성을 갖는 세포주와 감수성이 높은 세포주로 구분하여 실험을 수행하기 위해서 보르테조밉을 시간과 농도별로 처리하였다. 보르테조밉을 농도별로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 세포사멸 정도를 Annexin V-FITC/PI 염색시약으로 염색하고 이를 FACScanto (BD)를 사용하여 분석하였다(도 1a). FACS분석결과, KMS28BM 세포주는 처리 농도에 따라 세포사멸이 증가한 반면, KMS20세포주는 50nmole/l에서도 거의 세포사멸이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 50nmole/l 농도의 보르테조밉을 시간별로 처리한 후 Annexin V-FITC/PI 염색시약으로 염색하고 이를 FACScanto (BD)를 사용하여 분석한 결과, KMS28BM 세포주는 처리 시간에 따라 세포사멸이 증가한 반면, KMS20세포주는 72시간 후에도 거의 세포사멸이 일어나지 않았다(도 1b). In order to analyze the correlation between bortezomib resistance and mitochondria, bortezomib was treated with time - and concentration - dependent cell lines and bortezomib with high sensitivity. After treatment with bortezomib by concentration and incubation for 48 hours, the degree of apoptosis was stained with Annexin V-FITC / PI staining reagent and analyzed using FACScanto (BD) (Fig. 1a). As a result of FACS analysis, KMS28BM cell line increased cell death according to treatment concentration, whereas KMS20 cell line showed almost no cell death even at 50nmole / l. Bortezomib of 50 nmole / l was treated with time, stained with Annexin V-FITC / PI staining reagent and analyzed with FACScanto (BD). As a result, KMS28BM cell line increased cell death with treatment time, whereas KMS20 The cell line showed almost no apoptosis even after 72 hours (Fig. 1B).

한편, 보르테조밉을 농도별로 48시간 처리한 후 세포사멸을 PI 염색 후 DNA 농도를 측정하여 자가세포사멸된 세포의 수를 측정한 결과, 세포사멸이 KMS28BM에서만 증가되었으며, KMS20세포주는 내성을 나타내었다(도 1c).
Meanwhile, bortezomib was treated by concentration for 48 hours, and the number of self-apoptotic cells was measured by measuring DNA concentration after PI staining. As a result, apoptosis was increased only in KMS28BM, and KMS20 cell line was resistant (Fig. 1C).

<< 실시예Example 2> 다발성 골수종의 2> Multiple myeloma 보르테조밉에Bortezomib 의한 세포사멸 감수성 차이 확인 Confirmed differences in cell death susceptibility

1. One. 웨스턴Western 블랏Blat 분석 analysis

보르테조밉에 의한 세포사멸이 자가세포사멸임을 확인하기 위하여 자가세포사멸의 특징인 카스파아제 절단 여부를 웨스턴 블랏법을 사용하여 확인하였다. 보르테조밉을 처리하여 배양된 세포들을 모아 세포에 용해 완충용액 A(lysis buffer A)[20mM HEPES(pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2mM EGTA, 1% 트립톤(Triton) X-100, 10% 글리세롤(glycerol), 프로테아제 칵테일(protease cocktail) I, II(Sigma, USA)]를 첨가한 후 4℃에서 20분간 방치하였다. 세포 용해물(cell lysate)을 새 튜브(tube)에 옮긴 후, 4℃, 15000 rpm, 10분간 원심분리하여 단백질을 얻는다. 상기 세포 용해물을 5X 시료 완충용액(sample buffer)을 첨가하여 95℃에서 10분간 끊여 겔 적재 시료(gel loading sample)로 만들어 SDS PAGE 겔(gel)에 전기영동하였다. 상기 전기영동으로 분자량에 따라 분리된 단백질 밴드(band)들은 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 transfer kit(biorad, USA)을 사용하여 이동(transfer)시킨 후, 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 블라킹(blocking)시켰다. 그리고 도 2에 표시된 항체를 처리하여 각각의 단백질을 검출하였다. In order to confirm that apoptosis by bortezomib is autologous apoptosis, we confirmed the cleavage of caspase, which is characteristic of autologous apoptosis, by Western blotting. Bortezomib was treated to collect the cultured cells and lysis buffer A (20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, protease cocktail I, II (Sigma, USA)] was added and left at 4 ° C for 20 minutes. The cell lysate is transferred to a new tube and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to obtain the protein. The cell lysate was suspended in a 5X sample buffer at 95 ° C for 10 minutes to prepare a gel loading sample and electrophoresed on an SDS PAGE gel. The protein bands separated according to the molecular weight by the electrophoresis were transferred to a nitrocellulose membrane using a transfer kit (biorad, USA), and the protein bands were washed with 5% skim milk for 1 hour Lt; / RTI > Then, each of the proteins was detected by treating the antibody shown in Fig.

또한, 미토콘드리아의 세포사멸 관련성을 확인하기 위하여 세포질분획법을 이용하여 세포질 단백질과 미토콘드리아 단백질을 분획한 후 미토콘드리아 단백질인 사이토크롬 c(cytochrome c)의 세포질내로의 방출 여부를 확인하였다. 이는 미토콘드리아가 세포사멸에 관여함을 의미하는 것이다.
In order to confirm the cytotoxicity of mitochondria, cytoplasmic protein and mitochondrial protein were fractionated using cytoplasmic fractionation method, and the mitochondrial protein cytochrome c was released into the cytoplasm. This means that mitochondria are involved in apoptosis.

2. 결과2. Results

보르테조밉에 의한 세포사멸이 자가세포사멸에 의한 것이고, 미토콘드리아를 경유한 세포사멸이라는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(도 2). 도 2A는 자가세포사멸임을 나타내는 카스파아제 절단(caspase cleavage)를 웨스턴 블랏으로 확인한 것으로 KMS28BM 세포주는 50nM에서 절단되는 반면 KMS20 세포주는 75nM에서 일부분이 절단되는 것을 확인하였다. 이는 KMS20이 KMS28BM에 비해 보르테조밉에 대해 내성을 갖는다는 것을 나타내는 결과이다. 또한, 이러한 보르테조밉에 의한 자가세포사멸이 미토콘드리아 분획을 통해 미토콘드리아 단백질인 사이토크롬 c(cytochrome c)가 세포질로 방출되는 미토콘드리아 매개 세포사멸임을 도 2B를 통해 확인하였다.
The cell death by bortezomib was due to autologous cell death, and cell death via mitochondria was confirmed by Western blot (Fig. 2). FIG. 2A shows Western blot analysis of caspase cleavage showing autologous cell death. It was confirmed that the KMS28BM cell line was cut at 50 nM while the KMS20 cell line was partially cut at 75 nM. This is a result indicating that KMS20 is resistant to bortezomib compared to KMS28BM. In addition, FIG. 2B shows that autologous cell death by bortezomib is mitochondria-mediated cell death, which is mitochondrial protein cytochrome c released into the cytoplasm through the mitochondrial fraction.

<< 실시예Example 3> 다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이 검증 3> Verification of mitochondrial function differences according to multiple myeloma cells

1. One. 유세포Flow cell 분석 analysis

다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이를 검증하기 위하여, 유세포분석기를 이용하여 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 중요 인자를 확인하였다. 이러한 인자로는 세포질 활성산소종, 미토콘드리아 산소종, 미토콘드리아 칼슘, 그리고 미토콘드리아 막전압 등이 있다. 유세포분석은 이러한 인자를 확인하기 위하여 사용되는 염색시약에 염색된 세포들을 염색정도에 따라 세포를 구분하여 세포내 인자들의 양을 검출하는 방법이다. 보르테조밉등과 함께 배양된 세포들은 각각의 염색시약으로 염색된 후 유세포분석기 사용법에 따라 분석되었다.
In order to examine the difference in mitochondrial function according to multiple myeloma cells, a flow cytometry analyzer was used to identify important factors affecting mitochondrial function. These factors include cytoplasmic reactive oxygen species, mitochondrial oxygen species, mitochondrial calcium, and mitochondrial membrane voltage. Flow cytometry is a method of detecting the amount of intracellular factors by dividing cells according to the degree of staining of stained cells in a staining reagent used to identify these factors. Cells cultured with bortezomib and the like were stained with each staining reagent and analyzed by flow cytometry.

2. 2. 공초점Confocal 형광현미경( Fluorescence microscope confocalconfocal microscopymicroscopy ) 분석) analysis

공초점 형광현미경은 각각의 인자를 검출할 수 있는 염색시약에 염색된 세포를 현미경으로 염색 정도를 확인하는 것으로 평면적인 세포 모양 뿐만 아니라 세포를 Z-section (일정한 두께로 이미지를 절단) 하여 3차원적 이미지와 염색된 인자의 정확한 위치를 구분할 수 있는 실험 기법이다. 배양된 세포를 염색시약으로 염색한 후 공초점 형광현미경을 사용하여 이미지를 분석하였다. 도3b에서는 미토콘드리아 칼슘 특이적 염색시약인 Rhod-2AM과 미토콘드리아 마커인 Mito-tracker를 사용하여 염색한 후 공초점 형광현미경으로 이미지를 분석한 것으로 미토콘드리아 특이적 칼슘임을 검증한 실험이었다.
Confocal fluorescence microscopy confirms the degree of staining of cells stained with a staining reagent capable of detecting each factor using a microscope. The microscope can be used to detect not only a planar cell shape but also a Z-section (cut image at a constant thickness) It is an experimental technique that can distinguish the exact position of the dyed image and the red image. The cultured cells were stained with a staining reagent and images were analyzed using a confocal fluorescence microscope. In FIG. 3B, Rhod-2AM, a mitochondrial calcium-specific staining reagent, and a mitochondrion marker, Mito-tracker, were used for staining, and images were analyzed by confocal fluorescence microscopy to confirm mitochondrial specific calcium.

3. 미토콘드리아 내막 전압 및 칼슘 수치 분석3. Mitochondrial inner membrane voltage and calcium level analysis

미토콘드리아 내막전압은 특이적인 형광염색시약인 TMRE (tetramethylrhodamine, ethyl ester, percholrate)를 사용하여 세포를 염색한 후 유세포분석기 또는 공초점 현광현미경을 사용하여 측정하였다. 다발성 골수종 세포는 200nM TMRE에 20분간 37℃에서 염색된 후 유세포분석기 또는 공초점현광현미경을 사용하여 측정되었다. 또한 미토콘드리아 칼슘 수치는 미토콘드리아 칼슘 특이적 염색시약인 Rhod-2AM을 사용하여 측정되었다. 다발성 골수종 세포는 5uM Rhod-2AM을 4℃에서 120분간 처리한 후 37℃에서 30분간 더 방치한 후 공초점 형광현미경 또는 유세포분석기를 사용하여 측정되었다.
The mitochondrial inner membrane voltage was measured using a flow cytometry analyzer or confocal microscope after cells were stained with a specific fluorescent dye, TMRE (tetramethylrhodamine, ethyl ester, percholrate). Multiple myeloma cells were stained with 200 nM TMRE for 20 min at 37 ° C and then measured using flow cytometry or confocal microscopy. Also, mitochondrial calcium levels were measured using Rhod-2AM, a mitochondrial calcium-specific staining reagent. The multiple myeloma cells were treated with 5 uM Rhod-2AM for 120 min at 4 ° C, followed by incubation at 37 ° C for 30 min, followed by confocal fluorescence microscopy or flow cytometry.

4. 결과4. Results

다발성 골수종세포의 미토콘드리아 기능을 확인하기 위해서 미토콘드리아 내막 전압과 칼슘수치를 염색시약을 이용하여 측정하였다. 미토콘드리아 내막전압은 미토콘드리아의 ATP 생성을 위해 적절히 유지되어야 하고, 탈분극에 의해 내막전압이 감소하는 현상은 세포사멸의 특징 중 하나이다. 또한 미토콘드리아 내 칼슘의 증가는 막 투과 전이(membrane permeabilization transition; MPT)를 일으키는 원인중 하나인데, 세포 사멸은 MPT를 통해 일어나는 것으로 알려져 있다. To confirm the mitochondrial function of multiple myeloma cells, mitochondrial inner membrane voltage and calcium level were measured using a staining reagent. The mitochondrial inner membrane voltage should be properly maintained for ATP production of mitochondria, and the decrease of inner membrane voltage by depolarization is one of the characteristics of apoptosis. In addition, the increase of calcium in mitochondria is one of the causes of membrane permeabilization transition (MPT), which is known to occur through MPT.

미토콘드리아 칼슘 수치를 Rhod2AM 염색시약을 사용하여 염색한 후, 유세포분석 장비를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 자극이 없는 상태의 미토콘드리아 칼슘 수치는 내성세포주인 KMS20 세포가 현저히 높았으며, 보르테조밉 자극에 의한 칼슘 수치는 KMS28BM이 2배 정도 높게 증가하였다(도 3a). The mitochondrial calcium levels were stained with Rhod2AM staining reagent and analyzed by flow cytometry. As a result, the mitochondrial calcium level without stimulation was significantly higher in KMS20 cell line, which is a resistant cell line, and the calcium level by bortezomib stimulation was increased about twice as high as KMS28BM (FIG. 3A).

도 3a에서 측정된 칼슘이 미토콘드리아 내에 칼슘인지를 확인하기 위하여 미토콘드리아 마커인 MitoTracker와 Rhod2AM 칼슘 염색 시약을 동시에 염색한 후, 공초점 형광현미경(confocal microscopy)을 사용하여 확인하였다. Merge 결과에서 보이듯이 미토콘드리아 마커와 칼슘이 같은 위치에서 염색되어 주황색으로 나타냄으로써 측정된 칼슘이 미토콘드리아 칼슘이라는 것이 확인되었다(도 3b).In order to confirm whether the calcium measured in FIG. 3A is calcium in the mitochondria, mitochondrial markers such as MitoTracker and Rhod2AM calcium staining reagent were simultaneously stained and confirmed by confocal microscopy. As shown in the Merge results, the mitochondrial markers and calcium were stained at the same position and appeared orange, confirming that the measured calcium was mitochondrial calcium (Fig. 3B).

보르테조밉 내성 세포주인 KMS20과 세포사멸 효과가 높은 KMS28BM 세포의 미토콘드리아 내막 전압을 TMRE 염색시약을 사용하여 염색한 후, FACS 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 자극 전 KMS20 내성 세포주의 내막전압이 현저히 높았으며, 보르테조밉 자극에 의한 탈분극화는 KMS28BM 세포주에서 현저히 증가 되는 것을 확인하였다(도 3c). The mitochondrial inner membrane voltage of KMS20, a bortezomib resistant cell line, and KMS28BM, a highly apoptotic cell line, was stained using a TMRE staining reagent and then confirmed by FACS analysis. As a result, the intimal voltage of the KMS20-resistant cell line before stimulation was remarkably high, and the depolarization by bortezomib stimulation was significantly increased in the KMS28BM cell line (FIG. 3C).

이를 통해 다발성 골수종 세포에 따라 미토콘드리아 칼슘 및 내막전압 등이 세포사멸과 관련되어 있다는 것을 확인하였다. 또한 다발성 골수종 세포에 따라 자극에 관계없이 기본적인 미토콘드리아 기능이 차이가 있고, 특히, 내막전압이 증가 되어 있어 세포사멸 자극에 의한 탈분극에 대한 수용능력(capacity)이 높아 세포가 살아남을 수 있는 여지를 제공하는 것으로 사료된다. 이는 많은 연구에서 제기한 것으로서, 즉 암의 악성화가 진행될수록 내막전압이 높게 유지되는 것과 동일한 현상으로 보르테조밉 내성 역시 이러한 관점으로 풀이될 수 있다.
It was confirmed that mitochondrial calcium and endothelial voltage were related to apoptosis in multiple myeloma cells. In addition, the basic mitochondrial functions differ depending on the multiple myeloma cells irrespective of the stimulus. In particular, since the intimal voltage is increased, the capacity for depolarization by the cell death stimulus is high, Respectively. This is the result of many studies, that is, the same phenomenon that the inner membrane voltage is kept higher as the malignancy of the cancer progresses, and the bortezomib resistance can also be resolved in this view.

<< 실시예Example 4> 다발성 골수종 환자의 미토콘드리아 관련 유전자 발현 조사 4> Expression of Mitochondrial Gene Expression in Patients with Multiple Myeloma

1. One. 마이크로어레이Microarray (( microarraymicroarray ) 분석) analysis

다발성 골수종환자의 미토콘드리아 기능 분석을 위하여 다발성 골수종 환자로부터 다발성 골수종 세포를 분리하였으며, 이를 이용하여 RNA를 추출하여 이를 이용하여 마이크로 어레이 실험을 수행하였다. 다발성 골수종 환자 4명으로부터 세포를 각각 분리하였으며, 마이크로어레이 역시 4 그룹으로 나뉘어 실시하였다. 얻어진 결과는 미토콘드리아 특이적인 유전자군으로 구분하여 분석하여 정리하였다.
To analyze the mitochondrial function of patients with multiple myeloma, multiple myeloma cells were isolated from multiple myeloma patients, and RNA extraction and microarray experiments were performed. Cells were isolated from 4 patients with multiple myeloma and microarrays were divided into 4 groups. The results obtained were classified into mitochondrial - specific genes and analyzed.

2. 결과2. Results

미토콘드리아 기능 변화의 원인 유전자를 동정하고, 이의 조절이 세포사멸에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해서 먼저 다발성 골수종 환자로부터 획득된 다발성 골수종세포의 마이크로어레이를 통해 미토콘드리아 관련 유전자 발현을 확인하였다. In order to identify the gene responsible for mitochondrial function changes and to determine whether its regulation affects cell death, mitochondrial gene expression was first confirmed by microarray of multiple myeloma cells obtained from multiple myeloma patients.

그 결과, 표 1에서 나타낸 바와 같이 환자에 따라 상이한 발현 패턴을 보이는 것을 알 수 있었다. 세포 생존과 관련된 유전자들 역시 다른 패턴으로 나타났다. SOD2(superoxide dismutase 2) 발현은 3번 환자가 매우 낮게 발현되고, 2번 환자가 매우 높게 발현되었다.
As a result, it was found that different expression patterns were shown depending on the patient as shown in Table 1. The genes involved in cell survival also have different patterns. The expression of SOD2 (superoxide dismutase 2) was very low in patient No. 3 and very high in patient No. 2.

< 표 1 ><Table 1>

<< 실시예Example 5> 미토콘드리아 유전자 동정 5> Identification of mitochondrial genes

1. 실시간 1. Real time RTRT -- PCRPCR 분석 analysis

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy total RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 다발성 골수종세포로부터 total RNA를 추출하였다. 다발성 골수종 특이적 발현 미토콘드리아 유전자를 확인하기 위하여 실시간 RT-PCR 방법을 사용하였다. 총 RNA 1ug을 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다. 이어서 생성된 cDNA를 1/50 으로 희석한 후 희석된 cDNA를 2ul를 첨가한 후 CypD 를 비롯한 각각의 유전자 프라이머를 가지고 PCR반응을 수행하였다. 반응액의 조성은 다음과 같았다. 2X SYBR premix EX Taq (Takara, 일본) 5ul, 프라이머 각 0.2uM, 주형 cDNA 2ul. 실시간 RT-PCR 반응의 조건은 95℃에서 2분간 초기 변성 시행 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 증폭반응은 CFX96 real time system (Bio-rad)을 이용하여 시행하였으며, 증폭신호의 검출을 위해서 측정파장 530 nm, 분석파장 530/705 nm로 설정 하여 결합반응에서의 형광신호를 단발적으로 측정하였다 (single fluorescence measurement).
Total RNA was extracted from multiple myeloma cells using a commercially available system, the RNeasy total RNA kit (Qiagen Inc., Germany). Real-time RT-PCR was used to identify multiple myeloma-specific expressed mitochondrial genes. Reverse transcription was performed using 1 ug of total RNA as a template and oligo dT as a primer. Then, the generated cDNA was diluted to 1/50, 2 ul of the diluted cDNA was added, and the PCR reaction was carried out with each gene primer including CypD. The composition of the reaction solution was as follows. 2X SYBR premix EX Taq (Takara, Japan) 5ul, 0.2uM of each primer, 2ul of template cDNA. The real-time RT-PCR conditions were 95 ° C for 30 sec, 95 ° C for 30 sec, 60 ° C for 30 sec, and 72 ° C for 30 sec. The amplification reaction was performed with CFX96 real time system (Bio-rad) In order to detect the amplified signal, the fluorescence signal in the binding reaction was measured once (single fluorescence measurement) by setting the measurement wavelength to 530 nm and the analysis wavelength to 530/705 nm.

2. 결과2. Results

마이크로어레이를 통해 확인된 유전자 발현이 실제 보르테조밉 세포사멸 내성과 관련되어 있는지를 검증하기 위해서, 내성세포주와 민감성 세포주를 실시간 유전자 분석법(real time RT-PCR)을 사용하여 비교 분석하였다. In order to verify whether the gene expression confirmed by the microarray is related to the actual Bortezomib cell apoptosis resistance, resistant and sensitive cell lines were compared and analyzed using real-time RT-PCR.

마이크로어레이를 통해 얻어진 결과로부터 후보 유전자들을 확보하였고, 이들을 포함하여 미토콘드리아 기능과 관련한 여러 유전자들의 발현 양상을 내성 세포주(KMS20)와 감수성 세포주(KMS28BM)에서 실시간 유전자 증폭기법(real time RT-PCR)을 사용하여 확인하였다. 미토콘드리아 대사 관련 유전자의 발현이 내성세포주인 KMS20에서 상대적으로 높게 유지되며, CypD의 경우 감수성 세포주에 비해 내성세포주에서 현저히 감소하였고, SOD2와 MCU의 경우 반대로 내성 세포주에서 증가하였다.From the results obtained through the microarray, candidate genes were obtained and the expression patterns of various genes related to mitochondrial function including real-time RT-PCR were analyzed in the resistant cell line (KMS20) and the susceptible cell line (KMS28BM) Respectively. The expression of mitochondrial metabolism related genes was relatively high in KMS20, which is a resistant cell line. In CypD, SOD2 and MCU were significantly decreased in resistant cell line compared to susceptible cell line.

내성 세포주와 감수성 세포주간의 차이가 있는 유전자 중 SOD2를 선별하여 보르테조밉 자극에 대한 발현변화를 비교하였다(도 4B). SOD2의 경우, 감수성 세포주에 비해 내성세포주 KMS20 세포에서 현저히 발현이 증가 되어 있는 것을 확인하였다. 이는 보르테조밉 처리에 의해 증가 되는 활성 산소종을 효과적으로 제거함으로써, 활성산소종에 의해 유도되는 미토콘드리아 내막 전압 저하를 억제하여 세포사멸로부터 세포를 보호하는 것으로 판단된다.
SOD2 was selected among the genes having the difference between the resistant cell line and the susceptible cell line to compare the expression changes to bortezomib stimulation (Fig. 4B). In the case of SOD2, it was confirmed that the expression was significantly increased in the resistant cell line KMS20 cell compared to the susceptible cell line. It is considered that this effectively prevents active oxygen species which is increased by bortezomib treatment and protects cells from apoptosis by suppressing the voltage decrease of mitochondrial inner membrane induced by reactive oxygen species.

<< 실시예Example 6> 미토콘드리아 기능 조절 유전자 6> Mitochondrial function regulatory genes SOD2SOD2 발현 억제( Expression Suppression ( knockdownknockdown )에 따른 )In accordance 보르테조밉Bortezomib 효과 확인 Check the effect

1. One. SOD2SOD2 유전자의 발현 억제( Suppression of gene expression ( knockdownknockdown ) )

SOD2 유전자의 small interfering RNA (siRNA)를 세포에 형질감염(transfection) 방법에 따라 주입하여 이 유전자의 발현을 억제하였다. SOD2의 염기서열 중에서 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 siRNA를 제작하였다. siSOD2 서열은 5′-gtggtcatatcaatca tag-3′이다. 다발성 골수종 세포에서 SOD2 유전자 발현을 억제하기 위해서 lipofectamine RNAiMax reagent를 사용하여 SOD2 세포 내로 도입하였다.
Small interfering RNA (siRNA) of the SOD2 gene was injected into the cells by transfection to inhibit the expression of this gene. SiRNA consisting of 19 nucleotides in the nucleotide sequence of SOD2 was prepared. The siSOD2 sequence is 5'-gtggtcatatcaatca tag-3 '. To inhibit SOD2 gene expression in multiple myeloma cells, lipofectamine RNAiMax reagent was used to introduce them into SOD2 cells.

2. 결과2. Results

동정된 SOD2 유전자에 의한 미토콘드리아 기능 변화가 보르테조밉 내성과 관련되어있는지 확인하기 위해서, SOD2 유전자의 발현을 siRNA를 사용하여 억제하고 보르테조밉를 처리하여 감수성 변화가 생기는지 여부를 알아보았다. In order to confirm whether the altered mitochondrial function of the identified SOD2 gene is related to bortezomib resistance, we examined whether the expression of SOD2 gene was inhibited by siRNA and treated with bortezomib to change the sensitivity.

SOD2 siRNA의 녹다운(knockdown) 효과를 웨스턴 블랏 분석법을 사용하여 확인하였는데, 그 결과 siRNA 도입에 의해 효과적으로 SOD2가 녹다운(knockdown) 되었으며 KMS20에서의 발현양이 KMS28BM 세포주에 비해 현저히 높게 발현됨을 확인하였다(도 5A). The knockdown effect of SOD2 siRNA was confirmed by Western blot analysis. As a result, it was confirmed that SOD2 knockdown was effectively induced by the introduction of siRNA, and the expression level in KMS20 was significantly higher than that of KMS28BM cell line 5A).

한편, KMS20 세포주에서 SOD2 siRNA를 이용하여 녹다운(knockdown) 후 보르테조밉을 농도별로 처리하여 세포사멸 효과를 확인한 결과, KMS20 내성 세포주의 경우 SOD2 녹다운(knockdown)에 의해 발현이 억제된 후 보르테조밉 75nM 처리에 의해 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났다(도 5B). On the other hand, in the KMS20 cell line, after knockdown using SOD2 siRNA, bortezomib was treated at various concentrations to examine the cell death effect. In the case of KMS20 resistant cell line, the expression was suppressed by SOD2 knockdown and treated with 75 nM bortezomib (Fig. 5B).

보르테조밉에 민감한 KMS28BM 세포주에서 SOD2 siRNA를 사용하여 녹다운(knockdown)한 후에 보르테조밉을 농도별로 처리한 결과, 녹다운(knockdown) 효과가 없는 siRNA를 형질감염(transfection) 시킨 것에 비해 세포사멸이 유의성 있는 차이를 보이지 않았다(도 5C). 이는 SOD2의 발현이 siRNA 처리와 상관없이 억제되어 있고 이로 인해 세포사멸이 잘 일어나고 있기 때문인 것으로 판단된다. 이러한 결과로부터 SOD2 유전자의 발현 정도가 보르테조밉의 세포사멸 효과를 결정하는 인자임을 확인할 수 있었다. In the bortezomib-sensitive KMS28BM cell line, knockdown was performed using SOD2 siRNA, and bortezomib was treated at different concentrations. As a result, siRNAs without knockdown effect were transfected, (Fig. 5C). This suggests that SOD2 expression is inhibited regardless of siRNA treatment and cell death is occurring well. From these results, it was confirmed that the expression level of SOD2 gene is a factor determining the cell death effect of bortezomib.

따라서 앞서 언급한 바와 같이 SOD2 유전자의 발현을 조사하여 보르테조밉에 내성이 있는지 여부를 진단하고, 미토콘드리아 내 활성 산소종의 양을 증가시키는 항암제와 보르테조밉과 병용처리한다면 미토콘드리아 매개 세포사멸이 잘 유도될 수 있도록 하여 다발성 골수종 환자의 치료 효율을 높일 수 있을 것으로 판단된다.
Therefore, as described above, when the expression of SOD2 gene is examined to diagnose whether or not bortezomib is resistant, and when an anticancer agent that increases the amount of reactive oxygen species in mitochondria and bortezomib are used, mitochondrial mediated cell death is induced well And to improve the treatment efficiency of patients with multiple myeloma.

<< 실시예Example 7> 7> SOD2SOD2 억제 항암제 2- Inhibition chemotherapeutic agent 2- 메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol)과2-methoxyestradiol and 보르테조밉의 병용처리에 따른 Combined treatment of bortezomib 보르테조밉Bortezomib 내성 극복 확인 Confirm resistance overcome

보르테조밉 내성 세포주인 KMS20 세포에서 SOD 저해제로 알려진 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol; 2ME2)을 보르테조밉과 병용처리하여 KMS20 세포주에서 내성의 원인으로 선별한 SOD2의 기능저해를 통해 보르테조밉 내성을 극복할 수 있는지 여부를 확인하였다.2-methoxyestradiol (2ME2), known as an SOD inhibitor, was treated with bortezomib in a bortezomib resistant cell line KMS20 cell to inhibit the function of SOD2 selected as a cause of resistance in KMS20 cell line, Of the total population.

내성세포주 KMS20에서 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol) 단일처리에 의한 세포사멸 효과를 FACS 분석법을 사용하여 확인하였는데, 이는 보르테조밉과의 병용처리효과를 검증하기 위한 것이다(도 6A). KMS20 세포주에서 보르테조밉과 2-메톡시에스트라디올(2-methoxyestradiol) 사이의 병용처리 효과를 annexin V-FITC/PI 염색 후 FACS 분석법으로 확인한 결과, 단독처리에 비해 2배 이상 세포사멸이 증가하였으며, 이는 SOD2가 항암제 타겟으로써 충분한 가능성을 가지고 있음을 나타낸다(도 6B). The cytotoxic effect of 2-methoxyestradiol single treatment on the resistant cell line KMS20 was confirmed by FACS analysis to confirm the effect of the combination treatment with bortezomib (FIG. 6A). The effect of the combination of bortezomib with 2-methoxyestradiol in the KMS20 cell line was confirmed by FACS analysis after annexin V-FITC / PI staining. As a result, the cell death was more than twice that of the single treatment, Indicating that SOD2 has sufficient potential as an anticancer target (Fig. 6B).

<110> Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising superoxide dismutase 2 and diagnostic kit using the same <130> DP-2012-0762 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1593 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcggtgccct tgcggcgcag ctggggtcgc ggccctgctc cccgcgcttt cttaaggccc 60 gcgggcggcg caggagcggc actcgtggct gtggtggctt cggcagcggc ttcagcagat 120 cggcggcatc agcggtagca ccagcactag cagcatgttg agccgggcag tgtgcggcac 180 cagcaggcag ctggctccgg ttttggggta tctgggctcc aggcagaagc acagcctccc 240 cgacctgccc tacgactacg gcgccctgga acctcacatc aacgcgcaga tcatgcagct 300 gcaccacagc aagcaccacg cggcctacgt gaacaacctg aacgtcaccg aggagaagta 360 ccaggaggcg ttggccaagg gagatgttac agcccagata gctcttcagc ctgcactgaa 420 gttcaatggt ggtggtcata tcaatcatag cattttctgg acaaacctca gccctaacgg 480 tggtggagaa cccaaagggg agttgctgga agccatcaaa cgtgactttg gttcctttga 540 caagtttaag gagaagctga cggctgcatc tgttggtgtc caaggctcag gttggggttg 600 gcttggtttc aataaggaac ggggacactt acaaattgct gcttgtccaa atcaggatcc 660 actgcaagga acaacaggcc ttattccact gctggggatt gatgtgtggg agcacgctta 720 ctaccttcag tataaaaatg tcaggcctga ttatctaaaa gctatttgga atgtaatcaa 780 ctgggagaat gtaactgaaa gatacatggc ttgcaaaaag taaaccacga tcgttatgct 840 gagtatgtta agctctttat gactgttttt gtagtggtat agagtactgc agaatacagt 900 aagctgctct attgtagcat ttcttgatgt tgcttagtca cttatttcat aaacaactta 960 atgttctgaa taatttctta ctaaacattt tgttattggg caagtgattg aaaatagtaa 1020 atgctttgtg tgattgaatc tgattggaca ttttcttcag agagctaaat tacaattgtc 1080 atttataaaa ccatcaaaaa tattccatcc atatactttg gggacttgta gggatgcctt 1140 tctagtccta ttctattgca gttatagaaa atctagtctt ttgccccagt tacttaaaaa 1200 taaaatatta acactttccc aagggaaaca ctcggctttc tatagaaaat tgcacttttt 1260 gtcgagtaat cctctgcagt gatacttctg gtagatgtca cccagtggtt tttgttaggt 1320 caaatgttcc tgtatagttt ttgcaaatag agctgtatac tgtttaaatg tagcaggtga 1380 actgaactgg ggtttgctca cctgcacagt aaaggcaaac ttcaacagca aaactgcaaa 1440 aaggtggttt ttgcagtagg agaaaggagg atgtttattt gcagggcgcc aagcaaggag 1500 aattgggcag ctcatgcttg agacccaatc tccatgatga cctacaagct agagtattta 1560 aaggcagtgg taaatttcag gaaagcagaa gtt 1593 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ser Arg Ala Val Cys Gly Thr Ser Arg Gln Leu Ala Pro Val 1 5 10 15 Leu Gly Tyr Leu Gly Ser Arg Gln Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro 20 25 30 Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu Pro His Ile Asn Ala Gln Ile Met Gln 35 40 45 Leu His His Ser Lys His His Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val 50 55 60 Thr Glu Glu Lys Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Val Thr Ala 65 70 75 80 Gln Ile Ala Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His Ile 85 90 95 Asn His Ser Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu 100 105 110 Pro Lys Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe 115 120 125 Asp Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Gly Val Gln Gly 130 135 140 Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu Gln 145 150 155 160 Ile Ala Ala Cys Pro Asn Gln Asp Pro Leu Gln Gly Thr Thr Gly Leu 165 170 175 Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln 180 185 190 Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile Trp Asn Val Ile 195 200 205 Asn Trp Glu Asn Val Thr Glu Arg Tyr Met Ala Cys Lys Lys 210 215 220 <110> Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising superoxide dismutase 2 and diagnostic kit using the same <130> DP-2012-0762 <160> 2 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 1593 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcggtgccct tgcggcgcag ctggggtcgc ggccctgctc cccgcgcttt cttaaggccc 60 gcgggcggcg caggagcggc actcgtggct gtggtggctt cggcagcggc ttcagcagat 120 cggcggcatc agcggtagca ccagcactag cagcatgttg agccgggcag tgtgcggcac 180 cagcaggcag ctggctccgg ttttggggta tctgggctcc aggcagaagc acagcctccc 240 cgacctgccc tacgactacg gcgccctgga acctcacatc aacgcgcaga tcatgcagct 300 gcaccacagc aagcaccacg cggcctacgt gaacaacctg aacgtcaccg aggagaagta 360 ccaggaggcg ttggccaagg gagatgttac agcccagata gctcttcagc ctgcactgaa 420 gttcaatggt ggtggtcata tcaatcatag cattttctgg acaaacctca gccctaacgg 480 tggtggagaa cccaaagggg agttgctgga agccatcaaa cgtgactttg gttcctttga 540 caagtttaag gagaagctga cggctgcatc tgttggtgtc caaggctcag gttggggttg 600 gcttggtttc aataaggaac ggggacactt acaaattgct gcttgtccaa atcaggatcc 660 actgcaagga acaacaggcc ttattccact gctggggatt gatgtgtggg agcacgctta 720 ctaccttcag tataaaaatg tcaggcctga ttatctaaaa gctatttgga atgtaatcaa 780 ctgggagaat gtaactgaaa gatacatggc ttgcaaaaag taaaccacga tcgttatgct 840 gagtatgtta agctctttat gactgttttt gtagtggtat agagtactgc agaatacagt 900 aagctgctct attgtagcat ttcttgatgt tgcttagtca cttatttcat aaacaactta 960 atgttctgaa taatttctta ctaaacattt tgttattggg caagtgattg aaaatagtaa 1020 atgctttgtg tgattgaatc tgattggaca ttttcttcag agagctaaat tacaattgtc 1080 atttataaaa ccatcaaaaa tattccatcc atatactttg gggacttgta gggatgcctt 1140 tctagtccta ttctattgca gttatagaaa atctagtctt ttgccccagt tacttaaaaa 1200 taaaatatta acactttccc aagggaaaca ctcggctttc tatagaaaat tgcacttttt 1260 gtcgagtaat cctctgcagt gatacttctg gtagatgtca cccagtggtt tttgttaggt 1320 caaatgttcc tgtatagttt ttgcaaatag agctgtatac tgtttaaatg tagcaggtga 1380 actgaactgg ggtttgctca cctgcacagt aaaggcaaac ttcaacagca aaactgcaaa 1440 aaggtggttt ttgcagtagg agaaaggagg atgtttattt gcagggcgcc aagcaaggag 1500 aattgggcag ctcatgcttg agacccaatc tccatgatga cctacaagct agagtattta 1560 aaggcagtgg taaatttcag gaaagcagaa gtt 1593 <210> 2 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ser Arg Ala Val Cys Gly Thr Ser Arg Gln Leu Ala Pro Val 1 5 10 15 Leu Gly Tyr Leu Gly Ser Arg Gln Lys His Ser Leu Pro Asp Leu Pro 20 25 30 Tyr Asp Tyr Gly Ala Leu Glu Pro His Ile Asn Ala Gln Ile Met Gln 35 40 45 Leu His His Ser Lys His His Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Val 50 55 60 Thr Glu Glu Lys Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Lys Gly Asp Val Thr Ala 65 70 75 80 Gln Ile Ala Leu Gln Pro Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly Gly His Ile 85 90 95 Asn His Ser Ile Phe Trp Thr Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Gly Glu 100 105 110 Pro Lys Gly Glu Leu Leu Glu Ala Ile Lys Arg Asp Phe Gly Ser Phe 115 120 125 Asp Lys Phe Lys Glu Lys Leu Thr Ala Ala Ser Val Gly Val Gln Gly 130 135 140 Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Phe Asn Lys Glu Arg Gly His Leu Gln 145 150 155 160 Ile Ala Ala Cys Pro Asn Gln Asp Pro Leu Gln Gly Thr Thr Gly Leu 165 170 175 Ile Pro Leu Leu Gly Ile Asp Val Trp Glu His Ala Tyr Tyr Leu Gln 180 185 190 Tyr Lys Asn Val Arg Pro Asp Tyr Leu Lys Ala Ile Trp Asn Val Ile 195 200 205 Asn Trp Glu Asn Val Thr Glu Arg Tyr Met Ala Cys Lys Lys 210 215 220

Claims

SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물.A biomarker composition for the diagnosis of resistance to bortezomib comprising SOD2 (superoxide dismutase 2) gene.

SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물.A bortezomib resistance diagnostic biomarker composition comprising a protein expressed from a superoxide dismutase 2 (SOD2) gene or an antibody specific thereto.

제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단 키트.A bortezomib resistance diagnostic kit comprising the composition of claim 1 or 2.

제3항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단 키트.4. The bortezomib resistance test kit according to claim 3, wherein the kit is an RT-PCR kit, a DNA chip kit or a protein chip kit.

보르테조밉(bortezomib) 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
다발성 골수종 환자 시료로부터 SOD2(superoxide dismutase 2) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및
상기 환자 시료의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료보다 높을 경우 보르테조밉(bortezomib)에 내성이 있다고 판단하는 단계를 포함하는 SOD2 유전자 발현을 검출하는 방법.In order to provide information necessary for the diagnosis of bortezomib resistance,
Measuring the mRNA expression level of the superoxide dismutase 2 (SOD2) gene or the expression level of the protein encoded by the gene from the multiple myeloma patient sample;
Comparing the mRNA expression level of the gene or the expression level of the protein encoded by the gene with a normal control sample; And
And determining that the mRNA expression level of the patient sample or the expression level of the protein is higher than that of a normal control sample, the method comprising the step of determining that the mRNA expression level of the SOD2 gene is resistant to bortezomib.

제5항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 방법인 것을 특징으로 하는 SOD2 유전자 발현을 검출하는 방법.6. The method according to claim 5, wherein the mRNA expression level is measured by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, protection assay, Northern blotting, and DNA chip. The method of detecting SOD2 gene expression according to claim 1,

제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 SOD2 유전자 발현을 검출하는 방법.[Claim 6] The method according to claim 5, wherein the protein expression level is measured using an antibody specific to the protein.

제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 방법인 것을 특징으로 하는 SOD2 유전자 발현을 검출하는 방법.The method according to claim 5, wherein the protein expression level is measured by Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunization The method is characterized by using any one selected from the group consisting of diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS and protein chip. Lt; RTI ID = 0.0 > SOD2 < / RTI > gene expression.