KR101469900B1 - DO3A-diaminobiphenyl compounds and Gadolinium complex comprising the same compounds as a ligand - Google Patents

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Abstract

본 발명은 DO3A-디아미노바이페닐 화합물 및 이를 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 DO3A-디아미노바이페닐 화합물, 이 화합물을 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물, 이 가돌리늄 착물을 포함하는 MRI 조영제, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, DO3A의 구조와 바이페닐(biphenyl)의 구조가 결합되어 있는 본 발명의 화합물은 가돌리늄과 착물을 형성하여 향상된 조영증강 효과와 혈액풀 증강 효과를 나타낸다.The present invention relates to a DO3A-diaminobiphenyl compound and a gadolinium complex comprising the same as a ligand. More specifically, the present invention relates to a DO3A-diaminobiphenyl compound, a gadolinium complex containing the compound as a ligand, an MRI A contrast agent, and a method for producing the same. According to the present invention, the compound of the present invention in which the structure of DO3A and the structure of biphenyl are combined forms a complex with gadolinium to exhibit an enhanced contrast enhancement effect and a blood pool enhancement effect.

Description

DO3A-디아미노바이페닐 화합물 및 이를 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물 {DO3A-diaminobiphenyl compounds and Gadolinium complex comprising the same compounds as a ligand}Diamino biphenyl compounds and gadolinium complexes containing them as ligands (DO3A-diaminobiphenyl compounds and Gadolinium complex comprising the same compounds as a ligand)

본 발명은 DO3A-디아미노바이페닐 화합물 및 이를 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 DO3A-디아미노바이페닐 화합물, 이 화합물을 리간드로 포함하는 가돌리늄 착물, 이 가돌리늄 착물을 포함하는 MRI 조영제, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a DO3A-diaminobiphenyl compound and a gadolinium complex comprising the same as a ligand. More specifically, the present invention relates to a DO3A-diaminobiphenyl compound, a gadolinium complex containing the compound as a ligand, an MRI A contrast agent, and a method for producing the same.

자기공명영상(MRI)은 우수한 공간 해상도와 인체의 해부학적 기능적 영상을 제공하는데 유용한 조영에 기초한 인체 해부학, 생리학 및 병리생리학의 비침습적 진단을 위한 강력한 기법이다. 임상 수준에서, MRI 기법은 Gd(III) 킬레이트 (GdL)를 사용하여 시행되고 있고 체내 수중 양성자 이완율을 증가시킴으로써 영상대조(image contrast)를 증강시킨다 (Caravan, P. et al., Chem . Rev. 1999, 99, 22932352). 그러나 임상에서 이들의 폭넓고 성공적인 적용에도 불구하고, 종래 Gd(III)-기반 저분자량 CA들은 대부분 혈관공간(vascular space)에서 빠른 유출(extravasation)을 나타내는 세포외액(extracellular fluid, ECF) 약제이다. 결과적으로, 이미징을 위한 시간창(time window)은 상당히 감소되고, 그 결과 고해상도 영상의 획득에 한계가 있다 (Kobayashi, H. et al., Magn . Reson. Med. 2001, 45, 454460).Magnetic resonance imaging (MRI) is a powerful technique for noninvasive diagnosis of human anatomy, physiology, and pathophysiology based on contrast, which is useful for providing superior spatial resolution and anatomical functional imaging of the human body. At the clinical level, the MRI technique is being performed using Gd (III) chelate (GdL) and enhances image contrast by increasing the body's underwater proton relaxation rate (Caravan, P. et al., Chem . Rev 1999, 99, 22932352). However, despite their widespread and successful application in clinical practice, conventional Gd (III) -based low molecular weight CAs are extracellular fluid (ECF) drugs that exhibit rapid extravasation in the vascular space. As a result, the time window for imaging is significantly reduced, resulting in limitations in acquiring high resolution images (Kobayashi, H. et al., Magn . Reson. Med . 2001, 45, 454460).

ECF CAs에 내재한 이러한 한계를 극복하기 위해, 혈액풀 조영제(blood-pool contrast agents, BPCAs)의 개발에 대한 필요성은 그들이 장기간 동안 혈관에 존재할 것이라는 기대를 높이고 있고 따라서 순환(the circulation)에서 그들의 ECF 카운터파트(counterparts) 보다 훨씬 더 느리게 제거된다. BPCAs는 강력하고 장기간의 혈관 증강(vascular enhancement)을 제공한다. 지금까지 개발된 BPCAs는 그들의 작용 메커니즘에 따라 3개의 클래스로 나눌 수 있다: (i) 세포간 공간(interstitial space)에서 즉시 누출(immediate leakage)을 방지하기 위한 저분자 GdL과 HSA의 비공유결합 (Preda, A. et al., J. Magn . Reson . Imaging 2004, 20, 865873), (ii) 내피의 포어(endothelial pores)를 통해 누출 속도를 줄이는, CAs의 크기의 증가에 기초하여 폴리머 또는 리포솜을 도입한 시스템 (Lokling, K. E. et al., Magn . Reson . Imaging 2001, 19, 731738), 및 (iii) 제거 경로에서의 변화를 포함하는 나노입자에 기초한 시스템 (Mornet, S. et al., J. Mater . Chem.2004, 14, 21612175). 지금까지 가장 성공적인 접근법은 콜산 모이어티(cholic acid moiety)를 포함하는 GdDTPA 유도체인, MS-325로 대표되는 클래스 (i)이다. 이들 착물은 HSA와 강력하게 가역적으로 결합하는데, 임상의 전계강도(field strength)에서 높은 R1 이완성 뿐만 아니라 ECF 약제와 비교할 때 혈액에서 훨씬 더 긴 잔류시간을 갖는다. 킬레이트에서 방향족 모이어티로 대표되는 친유성 요소(lipophilic component)는 상응하는 GdL과 HSA 사이의 비공유 결합의 생성을 초래한다 (Henrotte, V. et al., J. Biol . Inorg . Chem. 2007, 12, 929937). 또한 MS-325에서 음이온성 포스포디에스테르 모이어티(anionic phosphodiester moiety)는 HSA와 비공유결합하는데 상승적인 방식에 기여하는 것으로 알려져 있다.To overcome these limitations inherent in ECF CAs, the need for the development of blood-pool contrast agents (BPCAs) increases the expectation that they will be present in blood vessels over a long period of time, It is removed much slower than counterparts. BPCAs provide a powerful and long-term vascular enhancement. The previously developed BPCAs can be divided into three classes according to their mechanism of action: (i) nonspecific binding of low molecular weight GdL and HSA to prevent immediate leakage in the interstitial space (Preda, A. et al., J. Magn. Reson. Imaging 2004, 20, 865873), (ii) the pore (introducing a polymer or liposomes on the basis of the increase in the size of the CAs, to reduce the leakage rate through the endothelial pores) of the endothelium a system (Lokling, KE et al., Magn. Reson. Imaging 2001, 19, 731738), and (iii) a system based on nanoparticles comprising a change in the removal path (Mornet, S. et al., J. Mater . Chem. 2004, 14, 21612175). The most successful approach to date has been the class (i) represented by MS-325, a GdDTPA derivative containing a cholic acid moiety. These complexes bind strongly and reversibly with HSA, which has a much longer residence time in the blood as compared to the ECF agent, as well as a high R 1 relaxation in clinical field strength. The lipophilic component, represented by an aromatic moiety in the chelate, results in the formation of a non-covalent bond between the corresponding GdL and HSA (Henrotte, V. et al., J. Biol . Inorg . Chem . 2007, 12 , 929937). In addition, anionic phosphodiester moieties at MS-325 are known to contribute to a synergistic way to non-covalently bond with HSA.

본 발명자들은 한동안 새로운 Gd-기반 MRI BPCAs의 디자인과 합성을 연구한 바 있다 (Kim, H.-K. et al., Chem . Commun. 2010, 46, 84428444; Lee, K.-H. et al., Eur . J. Inorg . Chem. 2012, 19421933). 최근 연구는 macrocyclic DTPA-(biphenyl-2,2'-bisamides) (화합물 3)의 합성에 관한 것이다 (도 12 참조).We have studied the design and synthesis of new Gd-based MRI BPCAs over time (Kim, H.-K. et al., Chem . Commun . 2010, 46, 84428444; Lee, K.-H. et al Eur . J. Inorg . Chem ., 2012, 19421933). A recent study relates to the synthesis of macrocyclic DTPA- (biphenyl-2,2'-bisamides) (Compound 3 ) (see FIG. 12).

그들은 BPCAs의 클래스 (i)에 속하는 중성(neutral) Gd(III) 착물을 형성하고 마크로사이클릭 킬레이트 백본(macrocyclic chelate backbone)에서 높은 친유성 바이페닐(lipophilic biphenyl)의 존재로 인하여 매우 높은 혈액풀 증강을 나타낸다 (Jung, K.-H. et al., J. Med . Chem. 2011, 54, 53855394). 그러나 이들 이미징 프로브의 한 가지 단점은, 열역학 및 동역학적 안정성이 그들의 DTPA 카운터파트들 보다 약간 더 높다고는 하지만, 그들의 DO3A 유사체(analogues)와 비교할 때 열역학 및 동역학적 안정성이 매우 낮다는 것이다 (J. Med . Chem. 2011, 54, 53855394). 이러한 점을 고려하여 열역학 및 동역학적 안정성을 증가시키기 위한 노력으로, 본 발명은 2개의 신규한 DO3A-(바이페닐-2,2′-비스아마이드) 킬레이트(화합물 1a와 1b)와 그들의 Gd 착물(화합물 2a와 2b)을 개발하였다.
They form a neutral Gd (III) complex that belongs to class (i) of the BPCAs and exhibit very high blood pool enhancement due to the presence of high lipophilic biphenyls in the macrocyclic chelate backbone (Jung, K.-H. et al., J. Med . Chem . 2011, 54, 53855394). However, one disadvantage of these imaging probes is that thermodynamics and kinetic stability are very low compared to their DO3A analogues, although thermodynamics and kinetic stability are slightly higher than their DTPA counterparts ( J. Med . Chem ., 2011, 54, 53855394). In view of this, in an effort to increase thermodynamics and dynamic stability, the present invention provides two novel DO3A- (biphenyl-2,2'-bisamide) chelates (compounds 1a and 1b) and their Gd complexes Compounds 2a and 2b) were developed.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 신규한 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 제공하는 데 있다.Accordingly, a primary object of the present invention is to provide a novel DO3A-diaminobiphenyl compound.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 리간드로서 포함하는 가돌리늄 착물을 제공하는데 있다.It is another object of the present invention to provide a gadolinium complex comprising the compound as a ligand.

본 발명의 또 다른 목적은 혈액풀 증강 효과를 나타내면서 높은 열역학 및 동역학적 안정성을 갖는 상기 가돌리늄 착물을 포함하는 MRI 조영제를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide an MRI contrast agent comprising the gadolinium complex having high thermodynamic and kinetic stability while exhibiting a blood pool enhancing effect.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물 및 가돌리늄 착물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
It is another object of the present invention to provide a process for preparing the above compound and a gadolinium complex.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, there is provided a DO3A-diaminobiphenyl compound represented by the following general formula (1) or (2).

Figure 112013033720272-pat00001
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Figure 112013033720272-pat00002
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본 발명에서 사용되는 용어 ‘DO3A’는, 금속친화성 킬레이트화합물 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(tetraazacyclododecan)을 의미하는 것으로, 가돌리늄을 결합시킬 수 있는 리간드로 사용된다. 란타나이드 금속인 가돌리늄은 9개의 결합이 가능한데, 가돌리늄 이온의 경우 그 독성이 매우 높아 인체에 투여가 불가능하기 때문에 DO3A와 같은 리간드를 결합시켜 그 독성을 낮추어 주어야 한다. DO3A는 네 개의 N(질소)과 세 개의 COOH(카르복실)기를 가지고 있어 가돌리늄과 결합하기에 적합한 리간드이다. The term " DO3A " used in the present invention means a metal affinity chelate compound 1,4,7,10-tetraazacyclododecane and is used as a ligand capable of binding gadolinium. Gadolinium, which is a lanthanide metal, is capable of 9 bonds. Gadolinium ions are very toxic and can not be administered to human body. Therefore, it is necessary to bind ligands such as DO3A to lower their toxicity. DO3A has four N (nitrogen) and three COOH (carboxyl) groups and is a ligand suitable for bonding with gadolinium.

상기 화학식 1 또는 2의 화합물은, DO3A의 구조와 바이페닐(biphenyl)의 구조가 결합되어 있는 특징이 있다. 그 구조적 특징에 의하여, 가돌리늄과 착물을 형성하면, 종래 조영제의 리간드 또는 백본으로 사용되었던 화합물과 달리, 높은 조영증강 효과와 동역학 및 열역학적 안정성을 가질 수 있다.
The compound of Formula 1 or 2 is characterized in that the structure of DO3A is combined with the structure of biphenyl. By virtue of its structural features, formation of a complex with gadolinium can have a high contrast enhancement effect, kinetics and thermodynamic stability, unlike compounds which have been used as ligands or backbones of conventional contrast agents.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 상기 DO3A-디아미노바이페닐 화합물의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a process for preparing said DO3A-diaminobiphenyl compound comprising the steps of:

a) 2,2’-[비스(N-브로모메틸카보닐)아미노]바이페닐 또는 [2-(N-브로모메틸카보닐아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노)]바이페닐에 DO3A( t Bu)3 을 첨가하고 교반하여 혼합물을 얻는 단계;a) 2,2 '- [bis (N- bromomethyl-carbonyl) amino] biphenyl, or [2- (N- bromomethyl-carbonyl-amino -2' - (N- tert-butoxycarbonylamino) ] Biphenyl with DO3A ( t Bu) 3 and stirring to obtain a mixture;

b) 상기 혼합물을 여과한 후 감압 하에서 증발시켜 조화합물(crude compound)을 얻는 단계; 및b) filtering the mixture and evaporating under reduced pressure to obtain a crude compound; And

c) 상기 조화합물을 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 용매를 제거한 후 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 얻는 단계.
c) purifying the crude compound through flash chromatography to remove the solvent and then obtaining the DO3A-diaminobiphenyl compound.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 2,2’-[비스(N-브로모메틸카보닐)아미노]바이페닐은 CHCl3을 용매로 하여 2,2’-디아미노바이페닐과 브로모아세틸 브로마이드를 반응시켜 제조될 수 있다.In the present invention, wherein a) in step 2, 2 '- [bis (N- bromomethyl-carbonyl) amino] biphenyl by the CHCl 3 as a solvent, 2,2'-diamino biphenyl and bromoacetyl And then reacting the bromide.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 [2-(N-브로모메틸카보닐아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노)]바이페닐은 CHCl3을 용매로 하여 [2-아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노]바이페닐과 브로모아세틸 브로마이드를 반응시켜 제조될 수 있다. 이 때, 상기 [2-아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노]바이페닐은 2,2’-디아미노바이페닐과 디-터트-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate)를 반응시킨 후 유기용매로 추출한 다음 유기용매를 제거하고 정제하여 얻을 수 있다.In the present invention, a) [2- (N- bromomethyl-carbonyl-amino -2 '- (N- tert-butoxycarbonylamino) of the step-biphenyl by the CHCl 3 as a solvent [2- amino -2 '- (N- tert-butoxycarbonylamino] can be produced by reacting biphenyl with bromoacetyl bromide in this instance, the [2-amino -2' - (N- tert-butoxycarbonyl carbonyl amino] biphenyl is 2,2'-diamino-biphenyl-di-tert-butyl-di after reaction the carbonate (di- tert -butyl dicarbonate), and then extracted with an organic solvent can be obtained by removing the organic solvent and purification have.

본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 조화합물은 노락색을 띄는 백색 고형물로 얻어지는데, 이를 상기 c) 단계의 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH)를 통해 정제하면 백색 고형물인 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 얻을 수 있다.
In the present invention, the crude compound in step b) is obtained as a white solid having a yellowish color, which is purified by flash chromatography (c) in CH 2 Cl 2 / MeOH to give a white solid, DO3A-dia A minobiphenyl compound can be obtained.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 포함하는 가돌리늄 착물 리간드(L)용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a composition for a gadolinium complex ligand (L) comprising the DO3A-diaminobiphenyl compound.

또한 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 리간드(L)로 포함하고, 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 가돌리늄(Gd) 착물을 제공한다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a gadolinium (Gd) complex represented by the following formula (3) or (4), wherein the DO3A-diaminobiphenyl compound is contained as a ligand (L).

Figure 112013033720272-pat00003
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Figure 112013033720272-pat00004
Figure 112013033720272-pat00004

본 발명에서 사용되는 용어 ‘착물(complex)’은 1개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자, 이온, 분자 또는 원자단 등이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것을 말한다. 여기서 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자이온분자 또는 원자단을 리간드(ligand)라고 부른다. 다시 말해서, 상기 화학식 3 또는 4는, 상기 화학식 1 또는 2의 화합물과 가돌리늄이 착물을 형성하고 있음을 의미한다.
As used herein, the term " complex " means that several different atoms, ions, molecules or atomic groups centering on one or more atoms or ions are oriented and coordinately coordinated to form a single atom It is a group of people. The atomic ion molecule or atom group coordinated to the central atom or ion here is called a ligand. In other words, the above formula (3) or (4) means that the compound of formula (1) or (2) forms gadolinium complex.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 하기 단계들을 포함하는 상기 가돌리늄(Gd) 착물의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention there is provided a process for preparing the gadolinium (Gd) complex, comprising the steps of:

a) TFA와 CH2Cl2의 혼합물에 제 1항의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 녹인 후 교반하여 터트-부틸(tert-butyl) 기를 탈보호(deprotection)시키는 단계;a) dissolving the compound of formula (1) or (2) of claim 1 in a mixture of TFA and CH 2 Cl 2 and stirring to deprotect the tert-butyl group;

b) 상기 a) 단계의 결과물에 가돌리늄(III) 클로라이드 헥사하이드레이트를 첨가하고 교반하는 단계;b) adding gadolinium (III) chloride hexahydrate to the result of step a) and stirring;

c) 상기 b) 단계의 결과물에서 물과 불순물을 제거하는 단계; 및c) removing water and impurities from the result of step b); And

d) 상기 c) 단계의 결과물을 디에틸에테르로 침전시켜 고형물을 얻는 단계.d) precipitating the product of step c) with diethyl ether to obtain a solid.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계는 화학식 1 또는 2의 화합물에 TFA를 첨가하여 deprotection 시키는 단계로서, tert-butyl을 deprotection하면 carboxylic acid가 되는데 carboxylic acid의 경우 분리/정제에 어려움이 있어 분리/정제가 용이한 tert-butyl로 protection하여 합성을 한다. 이후 tert-butyl을 deprotection하여 carboxyl기를 만들어 가돌리늄과 결합할 수 있도록 한다. tert-butyl기가 있으면 가돌리늄과 결합시킬 수 없다.
In the present invention, step a) is a step of deprotecting the compound of formula (1) or (2) by adding TFA to deprotection of tert-butyl. When carboxylic acid is difficult to be separated / purified, The synthesis is carried out by protecting with tert-butyl which is easy. Subsequently, tert-butyl is deprotected to form a carboxyl group to bond with gadolinium. If there is a tert-butyl group, it can not bond with gadolinium.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 가돌리늄(Gd) 착물을 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제를 제공한다.According to another aspect of the present invention, there is provided a magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent comprising the gadolinium (Gd) complex.

본 발명의 조영제는, 생체 내에서 강력하고 장기간의 혈관 증강(vascular enhancement)을 나타낼 수 있으며, 특히 심장, 복부대동맥, 소혈관 등에서 모두 강력한 조영 신호를 나타내므로 혈액풀 조영제(blood-pool contrast agent, BPCA)로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 뇌종양 영상에 대해서는, 종래 Dotarem과 같은 다른 조영제들에서는 기대할 수 없었던 것으로, 1시간 이상 조영 효과를 증강시키는 장점을 가지고 있다.The contrast agent of the present invention can exhibit strong and prolonged vascular enhancement in vivo and exhibits a strong contrast signal particularly in the heart, abdominal aorta, small blood vessels, etc. Therefore, a blood-pool contrast agent, BPCA). In addition, brain tumor imaging has the advantage of enhancing contrast enhancement over 1 hour, which was not expected in other contrast agents such as Dotarem.

본 발명의 실시예에서는, 본 발명에 화학식 3의 화합물(화합물 2a)을 이용하여 마우스 모델로부터 생채 내 조영효과를 확인하였다. 그 결과 심장과 복부대동맥에서 분명하게 혈액풀 증강이 나타났으며, 영상은 최후에는 신장을 통해 배출되는 1시간까지 길게 유지되었다 (도 4 참조). 이는 생체 내에서 높은 안정성과 함께 이러한 느린 신장청소율(renal clearance)을 나타내는 것을 의미한다. 또한 뇌종양 동물 모델에서 처리한 결과, 1시간 정도 길게 뇌종양을 증강시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (도 7 참조). 이는 Dotarem과 같은 통상의 ECF 약제로는 잘 관찰되지 않는 것이다.
In the examples of the present invention, the contrast effect in the living body was confirmed from the mouse model using the compound of the formula (3) (compound 2a) in the present invention. As a result, blood pool enhancement was evident in the heart and abdominal aorta, and the image was retained for up to one hour, which is finally excreted through the kidney (see FIG. 4). This means showing such a slow renal clearance with high stability in vivo. In addition, it was confirmed that treatment with a brain tumor animal model can enhance a brain tumor for about 1 hour (see FIG. 7). It is not well observed with conventional ECF drugs such as Dotarem.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 본 발명의 화합물은 DO3A의 구조와 바이페닐(biphenyl)의 구조가 결합되어 있는 특징을 가지고 있고 가돌리늄과 착물을 형성하면 종래 조영제의 리간드 또는 백본으로 사용되었던 화합물과 비교하여 향상된 조영증강 효과와 혈액풀 증강 효과 뿐만 아리나 동역학 및 열역학적 안정성을 가질 수 있다. 또한 뇌종양 영상의 조영 증강 효과도 우수하다. 따라서 본 발명의 가돌리늄 착물은 혈액풀 조영제, 뇌종양 조영제 등 MRI 조영제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
As described above, according to the present invention, the compound of the present invention has a feature that the structure of DO3A is combined with the structure of biphenyl, and when a compound is formed with gadolinium, the compound used as a ligand or backbone of the conventional contrast agent It is possible to obtain not only enhanced contrast enhancement effect and blood pool enhancement effect, but also has kinetic and thermodynamic stability. The contrast enhancement effect of brain tumor images is also excellent. Therefore, the gadolinium complex of the present invention can be very useful as an MRI contrast agent such as a blood pool contrast agent and a brain tumor contrast agent.

도 1은 본 발명에 따른 화합물 1과 2의 합성과정에 대한 개략도이다.
도 2는 64 MHz에서 교반 시 PBS(pH 7.4)에서 HSA(w/v:0-16.8%)의 함수로서 [HSA]/[화합물 2] ([Gd] = 0.1 mM)에 대한 이완 증강의 크기(ε*)를 나타낸다.
도 3은 64 MHz 및 293 K에서 HSA(0.067 mM)의 PBS (pH 7.4) 용액에서 [Gd]의 함수로서 화합물 2a와 2b의 양성자 종축상자성이완율(proton longitudinal paramagnetic relaxation rate)을 나타낸다.
도 5는 ICR 마우스에서 화합물 2a(0.1 mmol Gd/체중 kg)의 생체 내 분포 데이터이다. 마우스 그룹(n = 5)은 0.5 h, 1 h, 6 h, 12h, 24 h, 48 h 및 72 h에서 희생되었다.
도 6은 신장, 심장, 대동맥 및 간에 대하여 화합물 2에서 얻은 CNR(contrast to noise ratio) 프로파일이다.
도 7은 화합물 2a에서 얻은 뇌종양(C6-glyoma cell)의 생체 내 MR T1 가중된(weighted) SE 관상영상(coronal images)이다.
도 8은 다양한 MRI CAs에 대한 시간의 함수로서 종축이완율 R1 p(t)/R1 p(0)의 전개(evolution)를 나타낸다 {[Gd]0 and [ZnCl2]0 = 2.5 mM in PBS(pH 7.4) at 128 MHz and 293 K}.
도 9는 화합물 2, Dotarem, Multihance, Primovist및 Omniscan에 대한 금속교환 실험데이터 및 식 4를 이용한 데이터 피팅(data fitting)을 나타낸다.
도 10은 서로 다른 pH 조건 하에서 반응시간의 함수로서 PBS에서 화합물 2 ([Gd] = 1.0 mM)에 대한 R1의 전개양상을 나타낸다.
도 11은 다양한 농도에서 화합물 2와 Dotarem에 대한 IMR-90 세포 생존력을 시험한 결과이다.
도 12는 본 발명자들의 이전 연구에서 개발한 DTPA-기반 가돌리늄 착물(화합물 3)의 구조를 나타낸다.
도 13은 뇌종양에 대한 화합물 2a와 Dotarem의 CNR 프로파일이다.
도 14는 합성된 화합물 2a와 2b의 HPLC 스펙트럼이다.1 is a schematic view of the synthesis process of Compounds 1 and 2 according to the present invention.
Figure 2 shows the magnitude of relaxation enhancement for [HSA] / [Compound 2] ([Gd] = 0.1 mM) as a function of HSA (w / v: 0-16.8%) in PBS (? * ).
Figure 3 shows the proton longitudinal paramagnetic relaxation rates of compounds 2a and 2b as a function of [Gd] in a solution of HSA (0.067 mM) in PBS (pH 7.4) at 64 MHz and 293 K.
Figure 5 is in vivo distribution data of Compound 2a (0.1 mmol Gd / kg body weight) in ICR mice. The mouse group (n = 5) was sacrificed at 0.5 h, 1 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h.
Figure 6 is a contrast to noise ratio (CNR) profile obtained from compound 2 for the kidney, heart, aorta and liver.
Figure 7 is an in-vivo MR T 1 weighted SE coronal image of a C6-glyoma cell from compound 2a.
Figure 8 shows the evolution of the longitudinal axis relaxation rate R 1 p (t) / R 1 p (0) as a function of time for various MRI CAs. [Gd] 0 and [ZnCl 2 ] 0 = 2.5 mM in PBS (pH 7.4) at 128 MHz and 293 K}.
9 shows metal exchange experimental data for Compound 2, Dotarem, Multihance, Primovist and Omniscan and data fitting using Equation 4.
Figure 10 shows the evolution of R 1 versus compound 2 ([Gd] = 1.0 mM) in PBS as a function of reaction time under different pH conditions.
Figure 11 shows the results of testing IMR-90 cell viability against Compound 2 and Dotarem at various concentrations.
Figure 12 shows the structure of a DTPA-based gadolinium complex (Compound 3) developed in a previous study of the present inventors.
Figure 13 is the CNR profile of Compound 2a and Dotarem for brain tumors.
14 is a HPLC spectrum of synthesized compounds 2a and 2b.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

전반적인 실험Overall experiment

모든 반응은 표준 Schlenk techniques를 이용하여 이질소(dinitrogen)의 대기 하에서 수행하였다. 용매는 표준 방법으로 정제하고 건조하였다. 2,2’-디아미노바이페닐(2,2’-diaminobiphenyl)(Jung, K.-H. et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 53855394), DO3A( t Bu)3 (= 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris-tert-butyl acetate)은 문헌에 따라 제조되었다 (Gu, S. et al., J. Med. Chem. 2011, 54(1), 143152).
All reactions were carried out under a dinitrogen atmosphere using standard Schlenk techniques. The solvent was purified by standard methods and dried. 2,2'-diaminobiphenyl (Jung, K.-H. et al., J. Med. Chem . 2011, 54, 53855394), DO3A ( t Bu) 3 (= 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris- tert -butylacetate) was prepared according to literature (Gu, S. et al., J. Med. , 143152).

2,2’-디아미노바이페닐의 합성Synthesis of 2,2'-diaminobiphenyl

고압멸균기(autoclave)에서 90 ml의 에틸 아세테이트(ethyl acetate)에 2,2'-dinitrobiphenyl(5.0 g, 20.5 mmol; Aldrich)을 첨가한 후, 상기 용액에 Pd/C(10%, 2.0 g)를 첨가하였다. 반응로(reaction vessel)는 디수소(dihydrogen)로 몇 번 치환한 후, 700 kPa에서 디수소(dihydrogen)로 가압하였다. 상기 반응로를 봉인하고, 혼합물을 상온에서 18시간 동안 교반하였다. 교반 후, 압력을 방출시키고 에틸 아세테이트(3×10 ml)로 여과하여 촉매를 분리하였다. 이후, 감압 하에서 용매를 제거하고, 잔류물을 헥산(hexane)/클로로포름(chloroform)로 재결정하여 엷은 보라색의 크리스탈을 얻었다.
After adding 2,2'-dinitrobiphenyl (5.0 g, 20.5 mmol; Aldrich) to 90 ml of ethyl acetate in a high pressure autoclave, Pd / C (10%, 2.0 g) was added to the solution . The reaction vessel was displaced several times with dihydrogen and pressurized with dihydrogen at 700 kPa. The reactor was sealed and the mixture was stirred at ambient temperature for 18 hours. After stirring, the pressure was released and the catalyst was isolated by filtration with ethyl acetate (3 x 10 ml). Subsequently, the solvent was removed under reduced pressure, and the residue was recrystallized with hexane / chloroform to obtain a pale purple crystal.

DO3A(DO3A ( tt Bu)This) 33 의 합성 Synthesis of

0℃에서 CH3CN 120 ml에 cylen(1,4,7,10-tetraazacyclododecane)(strem, USA)(5.34 g, 30 mmol)과 NaHCO3(8.34 g, 99 mmol)을 넣고 교반하다가, tert-butyl bromoacetate(19.35 g, 99 mmol)를 30분에 걸쳐 천천히 떨어트려 첨가하였다. 이후 상기 반응 혼합물을 상온에서 48시간 동안 교반시켰다. 반응이 완료되면, 상기 혼합물을 필터하여 무기고체(inorganic solid)를 제거하고, 다시 필터하여 용매를 제거하였다. 필터하여 남은 고체상태의 물질을 클로로포름(chloroform)에 넣은 후, 녹지 않고 남아있는 고체 부유물을 필터하여 제거하였다. 이후 여과액(filtrate)을 농축시켜 얻은 고체 물질을 톨루엔(toluene)으로 재결정시켰다.
Cylen (1,4,7,10-tetraazacyclododecane) (strem, USA) (5.34 g, 30 mmol) and NaHCO 3 (8.34 g, 99 mmol) were added to 120 ml of CH 3 CN at 0 ° C, butyl bromoacetate (19.35 g, 99 mmol) was slowly added dropwise over 30 minutes. The reaction mixture was then stirred at ambient temperature for 48 hours. When the reaction was complete, the mixture was filtered to remove the inorganic solid and again filtered to remove the solvent. The solid matter remaining in the filter was put into chloroform, and the remaining solid residue was removed by filtration. Thereafter, the filtrate was concentrated, and the resulting solid substance was recrystallized with toluene.

다른 모든 상업적 시약은 Aldrich사로부터 구입하여 다른 지시가 없는 한 받은 대로 사용하였다. 모든 실험에는 탈이온수를 사용하였다. 1H NMR 실험은 경북대학교 기기분석 센터에서 브루커 분광기(Bruker Advance 400 Spectrometer)를 이용하여 수행하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 내부 표준으로 테트라메틸실란(TMS)에 관한 d 값으로서 제공되었다. 결합상수는 Hz로 표시된다. 원소분석(elemental analyses)은 경북대학교 기기분석 센터에서 수행하였다. FAB-질량 스펙트럼은 한국기초과학지원연구원(KBSI)에서 JMS-700 모델 (Jeol, Japan) 질량 분석기를 이용하여 얻었다. 측정에는 칼럼(Develosil ODS-HG-5 column; 6.0 mm - 250 mm; Nomura Chemical Co., Ltd., Aichi, Japan)이 장착된 HPLC 시스템(KNAUER, Berlin, Germany)을 사용하였다. 분석 조건은 다음과 같다: 1.4 ml/min의 유속에서 30분 선형구배(from 5% to 60%)를 갖는 TFA의 수용성 용액(0.1%, v/v)과 TFA의 아세토나이트릴 용액(0.1%, v/v)의 혼합물은 원소분석을 통해 순도 95% 이상으로 확인하였다.
All other commercial reagents were purchased from Aldrich and used as received unless otherwise indicated. Deionized water was used for all experiments. 1 H NMR experiments were performed using a Bruker Advance 400 Spectrometer at Kyungpook National University Instrumental Analysis Center. The chemical shift was provided as the d value for tetramethylsilane (TMS) as an internal standard. The coupling constant is expressed in Hz. Elemental analysis was performed at Kyungpook National University Instrumental Analysis Center. The FAB-mass spectra were obtained using the JMS-700 model (Jeol, Japan) mass spectrometer at Korea Basic Science Institute (KBSI). HPLC system (KNAUER, Berlin, Germany) equipped with a column (Develosil ODS-HG-5 column; 6.0 mm - 250 mm; Nomura Chemical Co., Ltd., Aichi, Japan) was used. The analytical conditions were as follows: an aqueous solution (0.1%, v / v) of TFA with a 30 min linear gradient (from 5% to 60%) at a flow rate of 1.4 ml / min and an acetonitrile solution , v / v) was confirmed to be 95% or higher in purity by elemental analysis.

제조예Manufacturing example 1. 2,2’-[비스(N- 1. 2,2 '- [Bis (N- 브로모메틸카보닐Bromomethylcarbonyl )아미노]) Amino] 바이페닐Biphenyl (2,2’-[Bis(N- (2,2 ' - [Bis (N- bromomethylcarbonylbromomethylcarbonyl )) aminoamino ]] biphenylbiphenyl )의 합성) Synthesis of

0℃에서 CHCl3(100 mL)에 녹인 2,2’-디아미노바이페닐(2,2’-diaminobiphenyl; 3.0 g, 16.3 mmol)과 K2CO3(18.0 g, 130.3 mmol)의 혼합물에 CHCl3(20 mL)에 녹인 브로모아세틸 브로마이드(bromoacetyl bromide; 9.9 g, 48.9 mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 10시간 교반한 후, 무기염을 여과하여 제거하고 유기상은 감압 하에서 증발시켰다. 수득한 조생성물(crude product)을 칼럼 크로마토그래피(silica, hexane/ethyl acetate, 70:30)를 통해 더 정제하여 백색 고형물을 얻었다. Yield: 5.7 g (83%). 1H NMR (CDCl3): δ = 8.32-8.30 (d, 2H, 3,3’-H ), 8.00 (s, 2H, -NH), 7.51-7.47 (t, 2H, 4,4’-H ), 7.33-7.26 (m, 4H, 5,5’,6,6’-H), 3.83 (s, 4H, -CH2Br). 13C NMR (CDCl3): δ = 163.6 (-CO), 135.1 (2,2’-C), 130.4 (6,6’-C), 129.8 (4,4’-C), 127.8 (5,5’-C), 125.6 (1,1’-C), 121.6 (3,3’-C),29.6 (-CH2Br). Anal. Calcd for C16H14Br2N2O2: C, 45.10; H, 3.31; N, 6.57. Found: C, 45.23; H, 3.30; N, 6.32.
To a mixture of 2,2'-diaminobiphenyl (3.0 g, 16.3 mmol) and K 2 CO 3 (18.0 g, 130.3 mmol) dissolved in CHCl 3 (100 mL) at 0 ° C was added CHCl A solution of bromoacetyl bromide (9.9 g, 48.9 mmol) dissolved in 3 (20 mL) was slowly added over 30 minutes. After stirring for 10 hours, the inorganic salts were removed by filtration and the organic phase was evaporated under reduced pressure. The obtained crude product was further purified through column chromatography (silica, hexane / ethyl acetate, 70:30) to obtain a white solid. Yield: 5.7 g (83%). 1 H NMR (CDCl 3): δ = 8.32-8.30 (d, 2H, 3,3'-H), 8.00 (s, 2H, -NH), 7.51-7.47 (t, 2H, 4,4'-H ), 7.33-7.26 (m, 4H, 5,5 ', 6,6'-H), 3.83 (s, 4H, -CH 2 Br). 13C NMR (CDCl 3): δ = 163.6 (-CO), 135.1 (2,2'-C), 130.4 (6,6'-C), 129.8 (4,4'-C), 127.8 (5,5 '-C), 125.6 (1,1'- C), 121.6 (3,3'-C), 29.6 (-CH 2 Br). Anal. Calcd for C 16 H 14 Br 2 N 2 O 2: C, 45.10; H, 3.31; N, 6.57. Found: C, 45.23; H, 3.30; N, 6.32.

제조예Manufacturing example 2-1. [2-아미노-2’-(N- 2-1. [2-Amino-2 ' - (N- 터트Rat -- 부톡시카보닐아미노Butoxycarbonylamino ]] 바이페닐Biphenyl ([2- ([2- aminoamino -2’-(N--2 ' - (N- terttert -- butoxycarbonylaminobutoxycarbonylamino )])] biphenylbiphenyl )의 합성) Synthesis of

2,2’-디아미노바이페닐에서 하나의 아미노기의 보호(monoprotection)는 다음과 같이 수행하였다. 구체적으로, 0℃에서 다이옥산과 물의 혼합물(100 mL, 3:4 in v/v)에 녹인 2,2’-디아미노바이페닐(0.6 g, 5.4 mmol)과 Na2CO3(0.4 g, 5.4 mmol)의 수용액에 다이옥산(20 ml)에 녹인 디-터트-부틸 디카보네이트(di-tert-butyl dicarbonate; 1.2 g, 5.4 mmol)의 용액을 1시간에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 6시간 동안 교반한 후, 다이옥산(10 ml)에 녹인 디-터트-부틸 디카보네이트(0.6 g, 2.7 mmol)를 첨가하고 교반하면서 밤새 반응시켰다. 상기 반응 혼합물을 톨루엔으로 추출하고 유기 추출물을 H2O(30 ml x 3 times)로 세척한 후 MgSO4로 건조하였다. 여과한 다음 진공 하에서 톨루엔을 제거하여 조생성물을 얻었으며 이를 크로마토그래피로 정제하여 백색 고형물을 얻었다. Yield: 0.5 g (55%). 1H NMR (CDCl3): δ = 8.12 (s, 1H, -NH), 7.38-7.36 (t, 1H, 4-H), 7.34-7.25 (d, 1H, 3-H), 7.24-7.22 (t, 1H, 5-H), 7.22-7.20 (d, 1H, 6-H), 7.18-7.12 (t, 1H, 5’-H), 6.86-6.84 (d, 1H, 6’-H), 6.81-6.79 (t, 1H, 4’-H), 6.63-6.62 (d, 1H, 3’-H), 3.59 (br, 2H, -NH2), 1.45 (s, 9H, -C(CH3)3). 13C NMR (CDCl3): δ = 153.12 (CO), 143.88 (2’-C), 136.25 (2-C), 131.00 (6’-C), 130.71 (4’-C), 129.28 (6-C), 128.66 (4-C), 128.15 (1-C), 123.31 (5-C), 123.26 (3-C), 120.15 (5’-C), 119.17 (1’-C), 115.35 (3’-C), 80.34 (-C(CH3)3), 28.46 (-C(CH3)3). Anal. Calcd for C17H20N2O2: C, 71.81; H, 7.09; N, 9.85. Found: C, 72.14; H, 7.16; N, 9.94.
The monoprotection of one amino group in 2,2'-diaminobiphenyl was carried out as follows. Specifically, 2,2'-diaminobiphenyl (0.6 g, 5.4 mmol) and Na 2 CO 3 (0.4 g, 5.4 mmol) dissolved in a mixture of dioxane and water (100 mL, 3: 4 in v / mmol) was dissolved in aqueous dioxane (20 ml) of di-tert-butyl dicarbonate (di- tert -butyl dicarbonate; a solution of 1.2 g, 5.4 mmol) was added slowly over 1 hour. The mixture was stirred for 6 hours and then di- tert -butyl dicarbonate (0.6 g, 2.7 mmol) dissolved in dioxane (10 ml) was added and reacted overnight with stirring. The reaction mixture was extracted with toluene and the organic extract was washed with H 2 O (30 ml x 3 times) and dried over MgSO 4 . Filtered and then toluene was removed under vacuum to give a crude product which was purified by chromatography to give a white solid. Yield: 0.5 g (55%). 1 H NMR (CDCl 3): δ = 8.12 (s, 1H, -NH), 7.38-7.36 (t, 1H, 4-H), 7.34-7.25 (d, 1H, 3-H), 7.24-7.22 ( 1H, 5'-H), 6.86-6.84 (d, 1H, 6'-H), 7.22-7.20 (d, 6.81-6.79 (t, 1H, 4'- H), 6.63-6.62 (d, 1H, 3'-H), 3.59 (br, 2H, -NH 2), 1.45 (s, 9H, -C (CH 3 ) 3 ). 13 C NMR (CDCl 3): δ = 153.12 (CO), 143.88 (2'-C), 136.25 (2-C), 131.00 (6'-C), 130.71 (4'-C), 129.28 (6- C), 128.66 (4-C), 128.15 (1-C), 123.31 (5-C), 123.26 (3-C), 120.15 '-C), 80.34 (-C ( CH 3) 3), 28.46 (-C (CH 3) 3). Anal. Calcd for C 17 H 20 N 2 O 2: C, 71.81; H, 7.09; N, 9.85. Found: C, 72.14; H, 7.16; N, 9.94.

제조예Manufacturing example 2-2. [2-(N- 2-2. [2- (N- 브로모메틸카보닐아미노Bromomethylcarbonylamino -2’-(N--2 ' - (N- 터트Rat -- 부톡시카보닐아미노Butoxycarbonylamino )])] 바이페닐Biphenyl ([2-(N-bromomethylcarbonylamino)-2’-(N- ([2- (N-bromomethylcarbonylamino) -2 '-( N- terttert -- butoxycarbonylaminobutoxycarbonylamino )])] biphenylbiphenyl )의 합성) Synthesis of

0℃에서 CHCl3(100 ml)에 녹인 [2-아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노]바이페닐 (1.0 g, 3.5 mmol)과 K2CO3 (3.9 g, 28.2 mmol)의 혼합물에 CHCl3(10 ml)에 녹인 브로모아세틸 브로마이드(2.1 g, 10.6 mmol)의 용액을 30분에 걸쳐 서서히 첨가하였다. 10시간 교반한 후, 무기염을 여과하여 제거하고 유기상은 감압 하에서 증발시켰다. 수득한 조생성물을 칼럼 크로마토그래피(silica, hexane/ethyl acetate, 80:20)를 통해 더 정제하여 백색 고형물을 얻었다. Yield: 1.1 g (80%). 1H NMR (CDCl3): δ = 8.35-8.32 (d, 1H, 3-H), 8.16-8.14 (d, 1H, 3’-H), 8.06 (br, 1H, -NHCO2), 7.49-7.46 (m, 2H, 6,6’-H), 7.45-7.43 (m, 2H, 4,4’-H), 7.26-7.16 (m, 2H, 5,5’-H), 6.17 (br, 1H, -NHCO), 3.83 (s, 2H, -CH2Br), 1.43 (s, 9H, -C(CH3)3). Anal. Calcd for C19H21N2O3: C, 56.31; H, 5.22; N, 6.91. Found: C, 56.61; H, 5.34; N, 6.77.
From 0 ℃ dissolved in CHCl 3 (100 ml) [2- amino -2 '- (N- tert-butoxycarbonyl-amino] biphenyl (1.0 g, 3.5 mmol) and K 2 CO 3 (3.9 g, 28.2 mmol) was added slowly a solution of bromoacetyl bromide (2.1 g, 10.6 mmol) in CHCl 3 (10 ml) over 30 minutes. After stirring for 10 hours, the inorganic salts were removed by filtration and the organic phase was evaporated under reduced pressure. The resulting crude product was further purified via column chromatography (silica, hexane / ethyl acetate, 80:20) to give a white solid. Yield: 1.1 g (80%). 1 H NMR (CDCl 3): δ = 8.35-8.32 (d, 1H, 3-H), 8.16-8.14 (d, 1H, 3'-H), 8.06 (br, 1H, -NHCO 2), 7.49- 2H), 7.45-7.43 (m, 2H, 4,4'-H), 7.26-7.16 (m, 2H, 1H, -NHCO), 3.83 (s , 2H, -CH 2 Br), 1.43 (s, 9H, -C (CH 3) 3). Anal. Calcd for C 19 H 21 N 2 O 3: C, 56.31; H, 5.22; N, 6.91. Found: C, 56.61; H, 5.34; N, 6.77.

실시예Example 1. 2,2’- 1. 2,2'- 디아미노페닐Diaminophenyl DO3ADO3A 유도체의 제조 Preparation of derivatives

1-1. 2,2’-디아미노페닐 DO3A 유도체 1a의 합성1-1. Synthesis of 2,2'-diaminophenyl DO3A Derivative 1a

CH3CN(50 ml)에 녹인 2,2’-[비스(N-브로모메틸카보닐)아미노]바이페닐 (1.0 g, 2.4 mmol)과 K2CO3(1.0 g, 7.1 mmol)의 현탁액에 DO3A( t Bu)3 (2.9 g, 5.0 mmol)의 용액을 신중하게 떨어뜨려 첨가하였다. 첨가가 완료된 후, 상기 반응 혼합물을 50℃에서 18시간 교반한 후, 임의의 고형물들을 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 감압 하에서 증발시켜 노란색을 띠는 백색 고형물을 얻었다. 상기 조화합물(crude compound)을 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH, 90:10)를 통해 정제하여 용매를 제거한 후 백색 고형물을 얻었다. Yield: 1.9 g (63%). 1H NMR (CDCl3): δ = 9.83 (br, 2H, -NH), 7.30-7.11 (m, 8H, biphenyl), 3.45-3.40 (m, 16H, -CH2CO2), 2.84-1.76 (m, 36H, CH2 in the cyclen ring), 1.41-1.34 (m, 36H, -(CH3)3), 1.20-1.12 (m, 18H, -(CH3)3). Anal. Calcd for C68H112N10O14·3HBr: C, 53.16; H, 7.54; N, 9.12. Found: C, 53.30; H, 7.25; N, 9.11. HR-FABMS (m/z): calcd for C68H112N10O14Na: 1315.8252 ([MNa]+). Found: 1315.8257 ([MNa]+).
(1.0 g, 2.4 mmol) and K 2 CO 3 (1.0 g, 7.1 mmol) dissolved in CH 3 CN (50 ml) Was added dropwise a solution of DO3A ( t Bu) 3 (2.9 g, 5.0 mmol). After the addition was complete, the reaction mixture was stirred at 50 < 0 > C for 18 hours and any solids were removed by filtration. The filtrate was evaporated under reduced pressure to obtain a yellowish white solid. The crude compound was purified via flash chromatography (CH 2 Cl 2 / MeOH, 90:10) to remove the solvent to yield a white solid. Yield: 1.9 g (63%). 1 H NMR (CDCl 3): δ = 9.83 (br, 2H, -NH), 7.30-7.11 (m, 8H, biphenyl), 3.45-3.40 (m, 16H, -CH 2 CO 2), 2.84-1.76 ( m, 36H, CH2 in the cyclen ring), 1.41-1.34 (m, 36H, - (CH 3) 3), 1.20-1.12 (m, 18H, - (CH 3) 3). Anal. Calcd for C 68 H 112 N 10 O 14 · 3HBr: C, 53.16; H, 7.54; N, 9.12. Found: C, 53.30; H, 7.25; N, 9.11. HR-FABMS (m / z): calcd for C 68 H 112 N 10 O 14 Na: 1315.8252 ([MNa] + ). Found: 1315.8257 ([MNa] < + >).

1-2. 2,2’-디아미노페닐 DO3A 유도체 1b의 합성1-2. Synthesis of 2,2'-diaminophenyl DO3A derivative 1b

CH3CN (50 ml)에 녹인 [2-(N-브로모메틸카보닐아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노)]바이페닐 (0.3 g, 0.7 mmol)과 K2CO3 (0.5 g, 3.5 mmol)의 현탁액에 CH3CN (10 ml)에 녹인 DO3A( t Bu)3 (0.4 g, 0.7 mmol)의 용액을 신중하게 떨어뜨려 첨가하였다. 상기 혼합물을 50℃에서 18시간 교반한 후, 임의의 고형물들을 여과로 제거하였다. 상기 여과물을 감압 하에서 증발시켜 노란색을 띠는 백색 고형물을 얻었다. 상기 조화합물을 플래시 크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH, 90:10)로 정제하여 백색 고형물을 얻었다. Yield: 0.4 g (65%). 1H NMR (CDCl3): δ = 7.14-7.14 (m, 8H, biphenyl), 3.28-3.31 (m, 8H, -CH2CO2), 2.50-2.24(m, 16H, -CH2 in the cyclen ring), 1.51-1.36(m, 27H, -(CH3)3). Anal. Calcd for C45H70N6O9·2HBr: C, 54.00; H, 7.25; N, 8.40. Found: C, 54.33; H, 7.23; N, 8.44. HR-FABMS (m/z): calcd for C45H70N6O9Na: 861.5102 ([MNa]+). Found: 861.5102 ([MNa]+).
It was dissolved in CH 3 CN (50 ml) [2- (N- bromomethyl-carbonyl-amino -2 '- (N- tert-butoxycarbonylamino) biphenyl (0.3 g, 0.7 mmol) and K 2 CO 3 (0.5 g, 3.5 mmol) suspension in CH 3 dissolved in CN (10 ml) were disappointed carefully dropped a solution of DO3A (t Bu) 3 (0.4 g, 0.7 mmol) in. the mixture at 50 ℃ 18 The crude compound was purified by flash chromatography (CH 2 Cl 2 / MeOH, 90:10) to give the title compound as a white solid which was yellowed by evaporation under reduced pressure. 1 H NMR (CDCl 3 ):? = 7.14-7.14 (m, 8H, biphenyl), 3.28-3.31 (m, 8H, -CH 2 CO 2), 2.50-2.24 (m, 16H , -CH 2 in the cyclen ring), 1.51-1.36 (m, 27H, - (CH 3).. 3) Anal Calcd for C 45 H 70 N 6 O 9 · 2HBr : C, 54.00; H, 7.25 ; N, 8.40 Found:.. C, 54.33; H, 7.23; N, 8.44 HR-FABMS (m / z): calcd for C 45 H 70 N 6 O 9 Na: 861.5102 ( [MNa] + ). Found: 861.5102 ([MNa] < + >).

실시예Example 2. 가돌리늄  2. Gadolinium 착물의Complex 제조 Produce

2-1. 가돌리늄 2-1. gadolinium 착물Complex 1(화합물 2a)의 합성 1 (Compound 2a)

화합물 1a로부터 터트-부틸(tert-butyl)의 탈보호(deprotection)는 다음과 같이 수행하였다: TFA(Trifluoroacetic Acid)/CH2Cl2 (1:1, 30 ml)의 혼합물에 녹인 화합물 1a (3.0 g, 2.0 mmol)는 24시간 교반한 후, 그 용액을 디에틸에테르(diethyl ether; 100 ml)로 희석하여 백색 고형물을 침전시켰다. 이를 여과로 분리하고, 디에틸에테르로 여러 번 세척한 후, 진공 하에서 건조시켜 백색 고형물을 얻었다 (1.7 g, 90%). 이것을 탈이온수(15 ml)에 녹이고 가돌리늄(III) 클로라이드 헥사하이드레이트(gadolinium(III) chloride hexahydrate; 1.4 g, 3.7 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 18시간 교반하고 그 시간 동안 용액의 pH를 NaOH (1.0 M)를 이용하여 주기적으로 7.07.5로 조정하였다. 물은 증발시켜 제거하고, 남은 유성의 산물(target product)은 최소량의 MeOH(~5 ml)로 녹이고 침전을 위해 디에틸에테르를 신중하게 떨어뜨려 첨가하였다. 형성된 백색 침전물은 여과로 용매를 제거하고 디에틸에테르로 세척한 후 진공 하에서 건조하였다. 상기 침전물에서 자유 Gd3 + 이온이 없음을 자일레놀오렌지(xylenol orange) 시험으로 확인하였다. 생성물은 흡습성(hygroscopic) 백색 고형물을 얻었다. Yield: 2.1 g (92%). Anal. Calcd for C44H62GdN10O16·3H2O: C, 40.60; H, 4.80; N, 40.76. Found: C, 40.24; H, 4.82; N, 40.65. HR-FABMS (m/z): calcd C44H62GdN10O16H: 1303.2935 ([MH]+). Found: 1303.2933 ([MH]+). HPLC (analytical: 2.1 x 250 mm, flow rate: 1.4 min/L, retention time: 17.18 min).
 Tert from compounds 1a - deprotection of butyl (tert -butyl) (deprotection) was performed as follows: TFA (Trifluoroacetic Acid) / CH 2 Cl 2: the compound is dissolved in a mixture of (1 1, 30 ml) 1a (3.0 g, 2.0 mmol) was stirred for 24 hours, and the solution was diluted with diethyl ether (100 ml) to precipitate a white solid. This was separated by filtration, washed several times with diethyl ether and then dried under vacuum to give a white solid (1.7 g, 90%). This was dissolved in deionized water (15 ml) and gadolinium (III) chloride hexahydrate (1.4 g, 3.7 mmol) was added. The mixture was stirred for 18 hours during which time the pH of the solution was adjusted to 7.07.5 with NaOH (1.0 M) periodically. The water was evaporated off and the remaining oil product was dissolved in a minimal amount of MeOH (~ 5 ml) and diethyl ether was carefully added dropwise to precipitate. The white precipitate formed was filtered off to remove the solvent, washed with diethyl ether and dried under vacuum. The absence of free Gd 3 + ions in the precipitate was confirmed by the xylenol orange test. The product obtained a hygroscopic white solid. Yield: 2.1 g (92%). Anal. Calcd for C 44 H 62 GdN 10 O 16 · 3H 2 O: C, 40.60; H, 4.80; N, 40.76. Found: C, 40.24; H, 4.82; N, 40.65. HR-FABMS (m / z): calcd C 44 H 62 GdN 10 O 16 H: 1303.2935 ([MH] + ). Found: 1303.2933 ([MH] < + >). HPLC (analytical: 2.1 x 250 mm, flow rate: 1.4 min / L, retention time: 17.18 min).

2-2. 가돌리늄 2-2. gadolinium 착물Complex 2(화합물 2b)의 합성 2 (Compound 2b)

이 화합물의 제조는 화합물 1a를 화합물 1b로 단순히 대체함으로써 상기 화합물 2a의 제조에 대해 기술한 것과 본질적으로 동일하다. Yield: 90%. Anal. Calcd for C28H37GdN6O8·2H2O: C, 44.20; H, 5.17; N, 11.04. Found: C, 43.98; H, 5.07; N, 11.260. FABMS (m/z): calcd C28H37GdN6O8H: 743.19 ([MH]+). Found: 743.20 ([MH]+). HPLC (analytical: 2.1 x 250 mm, flow rate: 1.4 min/L, retention time: 20.97 min).
The preparation of this compound is essentially the same as that described for the preparation of compound 2a by simply substituting compound 1a for compound 1b. Yield: 90%. Anal. Calcd for C 28 H 37 GdN 6 O 8 · 2H 2 O: C, 44.20; H, 5.17; N, 11.04. Found: C, 43.98; H, 5.07; N, 11.260. FABMS (m / z): calcd C 28 H 37 GdN 6 O 8 H: 743.19 ([MH] + ). Found: 743.20 ([MH] < + >). HPLC (analytical: 2.1 x 250 mm, flow rate: 1.4 min / L, retention time: 20.97 min).

실험방법Experimental Method

1) 금속교환 동역학(1) Metal Exchange Dynamics ( TransmetallationTransmetallation kineticskinetics ))

이 시험은 문헌에 따라 수행되었으며, 여기서 같은 몰량의 화합물 2 (2.5 mM)와 ZnCl2 (2.5 mM)를 포함하는 버퍼 용액(phosphate buffer, pH 7.4)의 수중 양성자 이완율(water proton relaxation rates, R1 P)의 전개(evolution)를 측정하였다. 즉, 화합물 2의 버퍼 용액(1 ml)에 ZnCl2의 버퍼 용액(10 μl)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 강하게 교반하고 상기 용액 300 μl을 이완측정 시험(relaxometric study)에 사용하였다. 또한 비교 목적으로 Omniscan, Dotarem, Primovist 및 Multihance를 이용하여 비교 시험을 시행하였다. 상기 R1 P 이완율은 관찰된 이완율 R1 = (1/T1)에서 수중 양성자 이완의 반자성 기여(diamagnetic contribution)를 뺀 후 구했다. 측정은 실온에서 3 테슬라(T) 전신시스템(whole body system; Magnetom Tim Trio, siemens, Germany)으로 수행하였다.
This test was carried out according to the literature in which the water proton relaxation rates (R) of a buffer solution (pH 7.4) containing the same molar amounts of Compound 2 (2.5 mM) and ZnCl 2 1 P ) was measured. That is, a buffer solution (10 μl) of ZnCl 2 was added to a buffer solution (1 ml) of Compound 2. The mixture was stirred vigorously and 300 μl of the solution was used for a relaxometric study. For comparative purposes, comparative tests were performed using Omniscan, Dotarem, Primovist and Multihance. The R 1 P relaxation rate was obtained by subtracting the diamagnetic contribution of the underwater proton relaxation at the observed relaxation rate R 1 = (1 / T 1 ). Measurements were performed at room temperature with a 3-tesla (T) whole body system (Magnetom Tim Trio, Siemens, Germany).

2) 동역학 상수의 결정(2) Determination of kinetic constants ( DeterminationDetermination ofof kinetickinetic constantsconstants ))

이러한 상수들은 하기 식 1 내지 4에 따라 계산하였다.
These constants were calculated according to the following equations (1) to (4).

[식 1][Formula 1]

Figure 112013033720272-pat00005
Figure 112013033720272-pat00005

여기서, Kf와 Kr은 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 금속교환 반응에 대한 속도상수(rate constant)이다. 금속교환의 속도는 하기 식 2로 표기될 수 있다. 여기서 [ZnL] = 가돌리늄 착물의 초기 농도가 되는 [GdL]0 로 [GdL]0 [GdL] 이다.
Where K f and K r are the rate constants for the forward and reverse metal exchange reactions, respectively. The rate of metal exchange can be expressed by Equation 2 below. Where [ZnL] = [GdL] 0 , which is the initial concentration of the gadolinium complex, [GdL] 0 [GdL].

[식 2][Formula 2]

Figure 112013033720272-pat00006
Figure 112013033720272-pat00006

시간 t에서 [GdL]의 농도는 하기 식 3으로 표기될 수 있다.
The concentration of [GdL] at time t can be expressed by the following equation (3).

[식 3][Formula 3]

Figure 112013033720272-pat00007
Figure 112013033720272-pat00007

k1 = k’f + k’r 및 [GdL]∞는 [GdL]의 평형농도(equilibrium concentration)이다. 따라서 Kf는 하기 식 4로 계산될 수 있다.
k 1 = k ' f + k' r and [GdL] ∞ are the equilibrium concentrations of [GdL]. Therefore, K f can be calculated by Equation 4 below.

[식 4][Formula 4]

Figure 112013033720272-pat00008
Figure 112013033720272-pat00008

상기 k’f 값은 식 4에 적용하기 위해 MATLAB R2008a를 이용하여 금속교환 데이터의 비-선형 곡선 피팅(non-linear curve fitting)에 의해 구할 수 있다.
The k ' f value can be determined by non-linear curve fitting of the metal exchange data using MATLAB R2008a for application to Equation 4.

3) 낮은 3) Low pHpH 영역에서 동역학적 안정성 Dynamic stability in the region

상기 안정성은 교반기에서 반응시간의 함수로서 서로 다른 pH 조건 (pH: 1, 3, 5 및 7)의 PBS에서 화합물 2 ([Gd] = 1.0 mM)에 대한 수중 양성자 이완율(R1)의 전개(evolution)로 인해 제공된다. 측정은 교반하면서 1.5 T 전신시스템(whole body system; GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)으로 수행하였다.
The stability was evaluated as the development of the underwater proton relaxation rate (R 1 ) to Compound 2 ([Gd] = 1.0 mM) in PBS at different pH conditions (pH: 1, 3, 5 and 7) as a function of reaction time in the agitator evolution. Measurements were performed with a 1.5 T whole body system (GE Healthcare, Milwaukee, Wis., USA) with agitation.

4) 이완성(4) Relaxation ( RelaxivityRelaxivity ))

T1 측정은 1.5 T (64 MHz, GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)에서 가변의 반전시간(variable inversion time, TI)으로 반전회복법(inversion recovery method)을 이용하여 수행하였다. 자기공명(MR) 이미지는 50 내지 1750 msec의 범위를 갖는 35개의 서로 다른 TI 값에서 요구되었다. T1 이완시간은 각 TI 값에서 측정된 신호 강도의 비-선형 최소제곱법(least square fit)으로부터 구하였다. T2 측정을 위해 CPMG (Carr-Purcell-Meiboon-Gill) 펄스 서열을 다중 스핀-에코(multiple spin-echo) 측정에 적용시켰다. 34개의 이미지는 10 내지 1900 msec 범위를 갖는 34개의 서로 다른 에코 시간(TE) 값과 함께 요구되었다. T2 이완시간은 각 에코 시간의 다중 스핀-에코 측정에 대한 평균 픽셀 값(mean pixel values)의 비-선형 최소제곱법으로부터 구하였다. 그런 다음, 이완성(R1 및 R2)은 mM 당 이완시간의 역으로 계산하였다. 계산된 이완시간(T1 및 T2) 및 이완성(R1 및 R2)으로 최종적으로 이미지-작업하여 각각 이완시간 지도 및 이완율 지도를 만들었다.
T 1 measurements were performed using the inversion recovery method with variable inversion time (TI) at 1.5 T (64 MHz, GE Healthcare, Milwaukee, Wis., USA). Magnetic resonance (MR) images were required at 35 different TI values ranging from 50 to 1750 milliseconds. T 1 relaxation time was determined from the non-linear least squares fit of the signal intensity measured at each TI value. The Carr-Purcell-Meiboon-Gill (CPMG) pulse sequence was applied to multiple spin-echo measurements for T 2 measurements. Thirty-four images were required with 34 different echo time (TE) values ranging from 10 to 1900 msec. T 2 relaxation time was determined from the non-linear least squares method of mean pixel values for multiple spin-echo measurements of each echo time. The relaxivity (R 1 and R 2 ) was then calculated inversely with the relaxation time per mM. The final relaxation time (T 1 and T 2 ) and the relaxation (R 1 and R 2 ) were finally image-worked to create relaxation time maps and relaxation rate maps, respectively.

5) 뇌종양 모델5) Brain Tumor Model

C6 신경교종 세포(glioma cells)는 우태아혈청(fetal calf serum, 10%), L-글루타민(2%), 페니실린/스트렙토마이신(0.2%)이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)으로 단층에서 성장시키고, 공기/CO2를 혼합(95%/5%)하여 37℃로 배양시켰다. 세포들은 주사 직전에 DMEM을 보충하여 제조된 아가 용액(1%)로 현탁한 후 (106 cell mL1) 상기 혼합물 10 μl을 주사하였다. 아가로즈는 세포가 주사 부위 밖으로 퍼져 나가는 것을 방지하는데 사용되었다. 래트(체중 40-60 g)를 산소에 포함된 1.5% 이소플루란(isoflurane)으로 마취시키고 정위 헤드홀더(stereotactic head holder)에 위치시킨 후 중앙부 두피 절개를 수행하였다. 상기 세포 현탁액(10 μl)을 해밀턴 실린지(직경 1.0 mm)를 이용하여 10분 동안 서서히 주사하였다. 세포 주사 후 2-5분간 실린지를 천천히 제거하고, 두피를 봉합하였다. MR 실험은 종양세포 이식 6 또는 7주 후 수행하였다 (Fonchy, E. et al., J. Magn . Reson. Imaging. 2001, 14(2), 97-105).
C6 glioma cells were cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) supplemented with fetal calf serum (10%), L-glutamine (2%) and penicillin / streptomycin , And air / CO 2 was mixed (95% / 5%) and cultured at 37 ° C. Cells were suspended in an agar solution (1%) prepared before supplementation with DMEM (10 6 cell mL1) and injected with 10 μl of the mixture. Agarose was used to prevent cells from spreading out of the injection site. The rats (body weight 40-60 g) were anesthetized with 1.5% isoflurane in oxygen and placed in a stereotactic head holder, followed by a central scalp incision. The cell suspension (10 μl) was slowly injected for 10 minutes using Hamilton syringe (diameter 1.0 mm). The syringes were slowly removed for 2-5 minutes after cell injection, and the scalp was closed. MR experiments were performed 6 or 7 weeks after tumor cell transplantation (Fonchy, E. et al., J. Magn . Reson. Imaging ., 2001, 14 (2), 97-105).

6) 6) 시험관내In vitro 세포 독성 Cytotoxicity

IMR-90 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection; Rockville, MD)로부터 구입하였다. 세포들은 10% FBS와 1% 항생제(Gibco에서 구입)가 보충된 DMEM (Welgene)에서 유지시켰다. 배지는 2일 마다 교체하였으며 IMR-90 세포들은 96웰 플레이트에 나누어 넣었다 (2×103 cells/well/50 μL). Dotarem, Gd 착물을 각 웰에 첨가하였다 (0.0005 mM ~ 500 mM/50 μl). 5% CO2 대기에서 37℃로 5일간 배양한 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, 분자내 염(inner salt; MTS, Promega, Madison, WI)을 각 웰에 첨가하였다 (20 μl/well). 추가 배양 1시간 후, 처리된 세포의 증식은 96웰 플레이트 리더(GENios, TECAN Co., Boston, MA)로 492 nm에서 배양 배지의 흡광도를 측정함으로써 정량한 다음, 세포독성을 비교하였다.
IMR-90 cell line was purchased from ATCC (American Type Culture Collection; Rockville, Md.). Cells were maintained in DMEM (Welgene) supplemented with 10% FBS and 1% antibiotic (purchased from Gibco). The medium was replaced every 2 days and IMR-90 cells were plated in 96-well plates (2 × 10 3 cells / well / 50 μL). Dotarem, Gd complex was added to each well (0.0005 mM to 500 mM / 50 μl). After incubation at 37 ° C in a 5% CO 2 atmosphere for 5 days, a solution of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- An inner salt (MTS, Promega, Madison, WI) was added to each well (20 μl / well). After 1 hour of further incubation, the proliferation of the treated cells was quantitated by measuring the absorbance of the culture medium at 492 nm in a 96-well plate reader (GENios, TECAN Co., Boston, Mass.) And then compared for cytotoxicity.

7) 7) 생체내In vivo MRMR 이미징Imaging

모든 동물 실험은 경북대학교 동물연구위원회의 규칙에 따라 수행하였다. 체중 29-31 g의 6주령 수컷 ICR 마우스는 MRI에 사용되었다. 체중 100-120 g의 8주령 수컷 SD(Sprague-Dawley) 래트는 뇌종양 MR 이미징에 사용되었다. 상기 마우스(n=4)와 래트(n=4)를 산소에 포함된 1.5% 이소플루란으로 마취시켰다. 측정은 꼬리 정맥을 통한 화합물 2의 주사 전후로 수행하였다. 각 주사 당 CA의 양은 MR 이미지에 대해 0.1 mmol [Gd]/kg이다. 각 측정 후 상기 마우스를 마취에서 회복시키고, 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있는 케이지에 놓았다. 이러한 측정 동안, 동물들은 따뜻한 워터 블라켓을 이용하여 대략 37℃에서 유지시켰다. 전신 MR 이미지는 홈-메이드 소동물용 RF 코일을 갖춘 1.5 T MR 유닛(GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)으로 얻었다. 상기 코일은 내경 50 mm의 리시버타입(receiver type)이다. SE(Spin Echo)에 대한 이미징 파라미터는 다음과 같다: 반복시간(repetition time, TR) 300 ms; 에코시간(echo time, TE) = 13 ms; 8 mm 시야각(field of view, FOV); 192×128 매트릭스 크기; 1.0 mm 슬라이스 두께; 구입수량(number of acquisition, NEX) = 8. 이미지는 주사 후 140분간 얻었다. 뇌종양 MR 이미지는 홈-메이드 소동물용 RF coil을 갖춘 1.5 T MR 유닛(GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA)으로 얻었다. SE(Spin Echo)에 대한 이미징 파라미터는 다음과 같다: 반복시간(repetition time, TR) 300 ms; 에코시간(echo time, TE) = 12 ms; 7 mm 시야각(field of view, FOV); 192×128 매트릭스 크기; 1.2 mm 슬라이스 두께; 구입수량(number of acquisition, NEX) = 6.
All animal experiments were conducted according to the rules of the Animal Research Council of Kyungpook National University. Six-week-old male ICR mice weighing 29-31 g were used for MRI. 8-week-old male SD (Sprague-Dawley) rats weighing 100-120 g were used for brain tumor MR imaging. The mice (n = 4) and rats (n = 4) were anesthetized with 1.5% isoflurane contained in oxygen. Measurements were performed before and after injection of compound 2 through the tail vein. The amount of CA per injection is 0.1 mmol [Gd] / kg for the MR image. After each measurement, the mice were restored in anesthesia and placed in a cage in which food and water could be taken freely. During this measurement, the animals were maintained at approximately 37 [deg.] C using a warm water bath. Whole body MR images were obtained with a 1.5 T MR unit (GE Healthcare, Milwaukee, Wis., USA) equipped with a home-made small animal RF coil. The coil is a receiver type having an inner diameter of 50 mm. Imaging parameters for SE (Spin Echo) are as follows: repetition time (TR) 300 ms; Echo time (TE) = 13 ms; 8 mm field of view (FOV); 192 x 128 matrix size; 1.0 mm slice thickness; Number of acquisition (NEX) = 8. The image was taken for 140 minutes after injection. Brain tumor MR images were obtained with a 1.5 T MR unit (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) equipped with a home-made small animal RF coil. Imaging parameters for SE (Spin Echo) are as follows: repetition time (TR) 300 ms; Echo time (TE) = 12 ms; 7 mm field of view (FOV); 192 x 128 matrix size; 1.2 mm slice thickness; Number of acquisition (NEX) = 6.

8) 이미지 분석8) Image analysis

증강된 대비 효과를 나타내는 해부학적 위치는 조영 후 MR 이미지 상에서 심장, 신장 및 간에 대해 확인되었다. 정량 측정을 위해, 특이적인 관심영역(regions of interest, ROI)의 신호강도를 소프트웨어(Advantage Window software; GE Medical, USA)를 이용하여 측정하였다. CNR(Contrast to Noise Ratio)는 하기 식 5를 이용하여 계산하였다. 이 때 SNR은 노이즈에 대한 신호 비율이다.
The anatomical location showing the enhanced contrast effect was confirmed for the heart, kidney and liver on the MR image after contrast. For quantitative measurement, signal intensities of specific regions of interest (ROI) were measured using software (Advantage Window software; GE Medical, USA). Contrast to Noise Ratio (CNR) was calculated using Equation 5 below. Where SNR is the signal to noise ratio.

[식 5][Formula 5]

Figure 112013033720272-pat00009

Figure 112013033720272-pat00009

실험결과.Experiment result.

하기 도 1에 설명된 바와 같이, 화합물 1과 2의 합성은 간단하다. 화합물 2의 합성은 두 단계로 진행된다: 즉, DO3A-디아미노바이페닐 콘쥬게이트(DO3A-diaminobiphenyl conjugate) (화합물 1)를 먼저 형성시킨 뒤 GdCl3 과 복합체(착물)를 형성시킨다. 모노-Gd 유사체(화합물 2b)의 제조를 위해서는, 초기에 2,2’-bis(amino)biphenyl에서 하나의 아미노기를 di-tert-butyl dicarbonate로 보호할 필요가 있다. 화합물 1과 2의 형성은 마이크로수준의 분석, 스펙트럼분석(NMR과 MS), 및 HPLC 방법(cf. ESI)으로 확인하였다.As shown in FIG. 1, the synthesis of compounds 1 and 2 is simple. The synthesis of compound 2 proceeds in two steps: first, the DO3A-diaminobiphenyl conjugate (compound 1) is first formed and then the complex (complex) with GdCl 3 is formed. For the preparation of the mono-Gd analog (compound 2b), it is necessary initially to protect one amino group from 2,2'-bis (amino) biphenyl with di- tert- butyl dicarbonate. Formation of compounds 1 and 2 was confirmed by micro-level analysis, spectral analysis (NMR and MS), and HPLC method (cf. ESI).

하기 표 1은 비교목적의 Gd-DOTA (Dotarem) 및 MS-325와 함께, 본 발명의 화합물 2a와 2b의 양성자 이완성 R1과 R2를 나타낸다.
Table 1, together with Gd-DOTA (Dotarem) and MS-325 for comparative purposes, shows the proton relaxation R 1 and R 2 of Compounds 2a and 2b of the present invention.

Figure 112013033720272-pat00010
Figure 112013033720272-pat00010

측정은 3가지 다른 매질(media)에서 수행하였다: 물, PBS(ph 7.4) 및 HSA의 PBS 용액. 수중에서 화합물 2a와 2b의 R1 이완성은 구조적으로 유사한 Dotarem에 비해 거의 2배 높다. 그러나 PBS에서는, 그 이완성이 원래 수치의 거의 절반으로 떨어졌다. 이와 같은 결과는 PBS의 인산 음이온(phosphate anion)에 의한 화합물 2에서 이너스피어(inner-sphere) 물 분자의 가능한 치환을 야기한 경우에 예상할 수 있다. HSA의 PBS 용액에서 R1 급감(drop)과 같은 관련 결과는 단백질의 카복실레이트 또는 PBS의 인산 음이온에서 공여원자(donor atom)에 의해 치환된 이너스피어 물 분자에 의하여 이미 확인되고 이론으로 설명되어 있다 (Anim, S. et al., J. Biol . Inorg . Chem. 2000, 5, 488497). 화합물 2a와 2b의 R1 이완성은 HSA의 PBS 용액에서 거의 두 배인데, HSA와의 상호작용이 MS-325로 관찰된 것에 비해 강하진 않지만, HSA와 상호작용의 존재를 설명한다.Measurements were performed on three different media: water, PBS (pH 7.4) and PBS solution of HSA. The R 1 relaxation of compounds 2a and 2b in water is almost two times higher than that of structurally similar Dotarem. In PBS, however, its relaxation dropped to almost half of its original value. This result can be expected when the possible substitution of inner-sphere water molecules in compound 2 by the phosphate anion of PBS is expected. Related results such as R 1 drop in PBS solutions of HSA have already been identified and described theoretically by inner sphere water molecules displaced by donor atoms in the carboxylate or phosphate anion of the protein (Anim, S. et al., J. Biol . Inorg . Chem . 2000, 5, 488497). The R 1 relaxation of compounds 2a and 2b is almost double in the PBS solution of HSA, although the interaction with HSA is not stronger than that observed with MS-325, but explains the presence of interaction with HSA.

양성자 이완 증강(proton relaxation enhancement, PRE)은 단백질과의 이러한 상호작용에 관한 더 상세한 정보를 얻기 위해 측정되었다. 이완 증강의 크기(ε* titration)는 이완율 증가가 HSA의 존재 시 매우 커진다는 것에서 예상된 바와 같고, 이완율은 농도에 따라 선형으로 증가하지 않으며, 이는 단백질 결합의 존재를 의미한다 (도 2 참조). HSA와 화합물 2a 및 2b 사이의 상호작용을 설명하는 결합계수(Ka)는 각각 2.11×102 및 1.07×102 M1 이다. 이들 값은 HSA의 고정 농도에서 상자성 기질(paramagnetic substrate) 농도의 함수로서 양성자 종축이완율(proton longitudinal relaxation rate)인, 소위 M-역가(titration)로부터 나올 수 있다 (도 3 참조). 데이터의 피팅(fitting)은 문헌에 따라 수행하였다 (Caravan, P. et al., J. Am . Chem . Soc. 2002, 124, 31523162). 여기서, BPCA로 잘 알려진 MS-325가 화합물 2a와 2b 보다 거의 1 크기(magnitude)만큼 더 큰, 6.1×103 M1 의 Ka 값을 나타낸다는 것은 아무런 의미가 없다(J. Am . Chem . Soc. 2002, 124, 31523162). MS-325에서는 흔히 있는 경우지만, 친유성 결합을 통한 2개의 방향족 유닛의 역할은, 이완성의 증가가 그다지 극적이진 않지만, PBS 용액에서 이완성의 증가를 이론으로 설명할 수 있게 한다. 바이페닐 모이어티와 관련하여 이와 같은 결과는 DTPA-바이페닐-2,2’-비스(아미이드) 유사체 (화합물 3)에 대한 본 발명자들의 이전 연구에서 이미 언급한 적이 있다 (Jung, K.-H. et al., J. Med . Chem. 2011, 54, 53855394). 요컨대, 화합물 2a는 마크로사이클릭(macrocyclic) DOTA 유닛을 전달하는데 있어서 새로운 BPCA의 역할을 할 수 있고, acyclic DTPA 유사체들 보다 더 열역학 및 동역학적 안정성을 제공한다. 본 발명의 화합물 2a는 킬레이트로서 DOTA를 가진 첫번째 BPCA이다.Proton relaxation enhancement (PRE) was measured to obtain more detailed information about this interaction with proteins. The magnitude of the relaxation enhancement (ε * titration) is as expected from the fact that the increase in relaxation rate is greatly increased in the presence of HSA, and the relaxation rate does not increase linearly with concentration, indicating the presence of protein binding Reference). The coupling coefficients (Ka), which account for the interaction between HSA and compounds 2a and 2b, are 2.11 × 10 2 and 1.0 7 × 10 2 M 1, respectively. These values can come from so-called M-titration, which is a proton longitudinal relaxation rate as a function of the paramagnetic substrate concentration at a fixed concentration of HSA (see FIG. 3). Fitting of the data was performed according to literature (Caravan, P. et al., J. Am . Chem . Soc . 2002, 124, 31523162). Here, it is meaningless that MS-325, well known as BPCA, exhibits a Ka value of 6.1 × 10 3 M 1 , which is almost 1 magnitude larger than the compounds 2a and 2b ( J. Am . Chem . Soc 2002, 124, 31523162). The role of two aromatic units through lipophilic linkage, which is common in MS-325, allows theoretically to explain the increase in relaxation in PBS solutions, although the increase in relaxation is not very dramatic. This result with regard to the biphenyl moiety has already been mentioned in our previous work on the DTPA-biphenyl-2, 2 ' -bis (amide) analog (compound 3 ) (Jung, H. et al., J. Med . Chem . 2011, 54, 53855394). In short, compound 2a can act as a new BPCA in delivering macrocyclic DOTA units and provide more thermodynamic and kinetic stability than acyclic DTPA analogs. Compound 2a of the present invention is the first BPCA with DOTA as a chelate.

도 4는 화합물 2a로 꼬리정맥 주사하여 얻은 마우스의 생체 내 관상면(coronal) 이미지를 보여준다. 도 4는 심장과 복부대동맥에서 분명하게 혈액풀 증강을 나타내며, 이미지는 최후에는 신장을 통해 배출되는 1시간까지 길게 유지된다. 이러한 결과로 알 수 있는 것은 도 5와 도 6에서 각각 제공되는 화합물 2a의 생체 내 분포(biodistribution) 데이터와 그 CNR 프로파일이다. 높은 안정성과 함께 이러한 느린 신장청소율(renal clearance)(열역학과 동역학 모두)은 신성 전신 섬유증(nephrogenic systemic fibrosis)의 잠재적인 위험을 보완할 수 있는데, 이는 Omniscan과 같은 acyclic DTPA 계열에서 종종 보고된 바 있다. 하기 표 2는 도 5의 보충 자료로서 각 기관(organ)에서 Gd의 농도가 몇 ppm을 포함되어 있는지를 보여주는 biodistribution 결과이다.
Figure 4 shows in vivo coronal images of mice obtained by tail vein injection with compound 2a. Figure 4 clearly shows blood pool enhancement in the heart and abdominal aorta, and the image lasts for up to one hour, which is finally excreted through the kidneys. These results are the biodistribution data and the CNR profile of the compound 2a provided in FIGS. 5 and 6, respectively. This slow renal clearance (both thermodynamic and kinetic) with high stability can complement the potential risk of nephrogenic systemic fibrosis, which has been frequently reported in acyclic DTPA sequences such as Omniscan . Table 2 below is a supplementary data of FIG. 5 showing the biodistribution results showing how many ppm of Gd is contained in each organ.

OrganOrgan 0.5 h0.5 h 1 h1 h 6 h6 h 12 h12 h 24 h24 h 48 h48 h 72 h72 h LiverLiver 22.122.1 21.821.8 13.613.6 13.713.7 5.65.6 4.64.6 3.63.6 KidneyKidney 48.248.2 23.123.1 28.428.4 13.613.6 22.922.9 13.513.5 BDBD BladderBladder 683.6683.6 1970.41970.4 BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BloodBlood 0.10.1 0.10.1 BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD IntestineIntestine BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD 0.50.5 0.50.5 LungLung BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD SpleenSpleen BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BrainBrain BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD BDBD

Assuming that the blood volume represents 5.4%(v/w) of the body weight. BD = below detection.
Assuming that the blood volume represents 5.4% (v / w) of the body weight. BD = below detection.

화합물 2a의 다른 특징은 1시간 정도 길게 뇌종양을 증강시킬 수 있다는 것인데, 이는 Dotarem과 같은 통상의 ECF 약제로는 잘 관찰되지 않는 것이다 (도 7 참조).Another characteristic of compound 2a is that it can augment brain tumors for as long as 1 hour, which is not well observed with conventional ECF drugs such as Dotarem (see FIG. 7).

화합물 2a의 다른 이점은, 기존의 MS-325와 비교하여, DTPA 보다 나은 킬레이트 백본으로서 그 형태가 DOTA를 도입한다는 것에 있다. 따라서 혈액풀 효과의 현저한 손실 없이 그들의 DTPA-기반 카운터파트 보다 화합물 2의 동역학적 안정성에서의 큰 향상이 예상된다. 실제로, 이러한 예상은 도 8에서 설명되며, 다양한 MRI CAs에 대하여 시간의 함수로서 R1 p(t)/R1 p(0)의 플롯을 보여준다. 따라서 임의의 시간 t에서 R1 P의 상대적인 값, R1 P(t)/R1 P(0)는 아연(zinc)에 의한 금속교환 정도의 좋은 평가지표(estimator)이다. 내인성 이온들 중에서, Zn2 + 만 상당한 양의 Gd를 대체할 수 있는데 이는 혈액에서 그 형성물(former)의 농도가 상대적으로 높기 때문이다 (Laurent, S. et al., Invest . Radiol. 2001, 36, 115122). 시간에 따른 그것의 전개양상(evolution)은 반응의 동역학에 대한 상대적인 정보를 제공한다. 정량적인 금속교환 동역학 데이터는 도 9와 하기 표 3에서 제공된다.
Another advantage of compound 2a is that it introduces DOTA as a chelate backbone, which is superior to DTPA in comparison to conventional MS-325. Thus, a significant improvement in the kinetic stability of Compound 2 is expected over their DTPA-based counterpart without significant loss of blood pool effect. Indeed, this prediction is illustrated in FIG. 8 and shows a plot of R 1 p (t) / R 1 p (0) as a function of time for various MRI CAs. Thus, the relative value of R 1 P at any time t, R 1 P (t) / R 1 P (0), is a good estimator of the degree of metal exchange by zinc. Of the endogenous ions, Zn 2 + can replace a considerable amount of Gd, because the concentration of the former in the blood is relatively high (Laurent, S. et al., Invest . Radiol . 2001, 36, 115122). Its evolution over time provides relative information on the dynamics of the reaction. Quantitative metal exchange dynamics data is provided in Figure 9 and Table 3 below.

착물Complex K 1 (min-1) K 1 (min -1 ) [Lig Gd]∞(mol/L)[Lig Gd] ∞ (mol / L) K' f (min-1) K ' f (min -1 ) 화합물 2aCompound 2a 4.19 x 10-3 4.19 x 10 -3 2.66 x 10-3 2.66 x 10 -3 2.73 x 10-4 2.73 x 10 -4 화합물 2bCompound 2b 3.80 x 10-3 3.80 x 10 -3 2.58 x 10-3 2.58 x 10 -3 1.15 x 10-4 1.15 x 10 -4 DotaremDotarem 1.48 x 10-3 1.48 x 10 -3 2.73 x 10-3 2.73 x 10 -3 1.37 x 10-4 1.37 x 10 -4 화합물 3Compound 3 1.04 x 10-3 1.04 x 10 -3 1.26 x 10-3 1.26 x 10 -3 5.15 x 10-4 5.15 x 10 -4 PrimovistPrimovist 1.36 x 10-3 1.36 x 10 -3 1.47 x 10-3 1.47 x 10 -3 5.61 x 10-4 5.61 x 10 -4 MultihanceMultihance 2.08 x 10-3 2.08 x 10 -3 1.44 x 10-3 1.44 x 10 -3 8.83 x 10-4 8.83 x 10 -4 OmniscanOmniscan 1.77 x 10-3 1.77 x 10 -3 1.12 x 10-3 1.12 x 10 -3 9.79 x 10-4 9.79 x 10 -4

동역학적 안정성의 극적인 증가는 최근 본 발명자들이 개발한 BPCA의 새로운 형태인, 화합물 3을 포함한 DTPA-기반 CAs에 의해 나타나는 플롯과 비교해 볼 때 화합물 2에서 관찰된다 (Jung, K.-H. et al., J. Med . Chem. 2011, 54, 53855394). 또한 화합물 2의 동역학적 안정성은 Dotarem과 비교해서 그에 못지않다. pH 범위 1-7에서 관찰된 R1의 변화가 거의 없다는 것은 화합물 2가 높은 산성 조건에서도 안정하다는 것이다 (도 10).A dramatic increase in kinetic stability is observed in Compound 2 compared to the plots exhibited by DTPA-based CAs containing Compound 3, a new form of BPCA developed by the present inventors (Jung, K.-H. et al , J. Med . Chem ., 2011, 54, 53855394). The kinetic stability of compound 2 is also comparable to that of Dotarem. Little change in R 1 observed in the pH range 1-7 indicates that compound 2 is stable under high acid conditions (FIG. 10).

본 발명의 화합물들의 세포독성은 Dotarem과 비교해서 그에 못지않다 (도 11). 상기 비교는 비독성 시험에 일반적으로 사용되는 정상 세포주인, IMR-90 섬유아세포(human embryonic lung fibroblast)를 이용하여 수행되었다. 결론적으로, 본 발명은 신규한 MRI BPCAs로서 새로운 Gd 착물(화합물 2a와 2b)을 제안한다. 화합물 2a의 가장 특징적인 특성 중 하나는 수중에서 R1 이완성의 상당한 신호 증강을 나타낼 뿐만 아니라 동역학적 안정성의 극적인 증가를 갖는 HSA 용액과의 상호작용도 어느 정도 나타낸다는 것이다. 화합물 2의 구조적인 특이성은 전하가 중성이고 그에 따라 정전기적 상호작용이 없어서 아마도 혈액풀 효과에 필수적인 요소의 하나라는 것에 있다.
The cytotoxicity of the compounds of the present invention is comparable to that of Dotarem (FIG. 11). The comparison was carried out using IMR-90 human embryonic lung fibroblast, a normal cell line commonly used in non-toxic tests. In conclusion, the present invention proposes new Gd complexes (compounds 2a and 2b) as novel MRI BPCAs. One of the most characteristic properties of compound 2a is that it exhibits significant signal enhancement of R 1 relaxation in water as well as some interaction with HSA solution with dramatic increase in kinetic stability. The structural specificity of compound 2 is that it is one of the essential elements for the blood pool effect, probably because the charge is neutral and thus has no electrostatic interaction.

또한 도 13은 도 7에서 측정된 MR 이미지의 CNR(Contrast to Noise Ratio)을 측정한 결과로 화합물 2a의 inhancement가 상용화된 조영제인 dotarem보다 높은 것을 알 수 있다. 그리고 도 14는 합성된 화합물 2a와 2b의 HPLC 결과로 2a의 경우 17.18분에서, 2b의 경우 20.97분에서 하나의 peak만 나타남으로써 불순물 없이 가돌리늄 킬레이트만 순수하게 합성되었음을 확인할 수 있다. 13 also shows that the inhancement of compound 2a is higher than that of dotarem, which is a commercial contrast agent, as a result of measuring the CNR (Contrast to Noise Ratio) of the MR image measured in FIG. FIG. 14 shows that only one peak appears at 17.18 minutes in 2a and 20.97 minutes in 2b by the HPLC of synthesized compounds 2a and 2b, showing that pure gadolinium chelate was synthesized without impurities.

Claims (8)

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 DO3A-디아미노바이페닐 화합물.
[화학식 1]
Figure 112013033720272-pat00011


[화학식 2]
Figure 112013033720272-pat00012

A DO3A-diaminobiphenyl compound represented by the following formula (1) or (2).
[Chemical Formula 1]
Figure 112013033720272-pat00011


(2)
Figure 112013033720272-pat00012

 하기 단계들을 포함하는 제 1항에 따른 DO3A-디아미노바이페닐 화합물의 제조방법:
a) 2,2’-[비스(N-브로모메틸카보닐)아미노]바이페닐 또는 [2-(N-브로모메틸카보닐아미노-2’-(N-터트-부톡시카보닐아미노)]바이페닐에 DO3A( t Bu)3 을 첨가하고 교반하여 혼합물을 얻는 단계;
b) 상기 혼합물을 여과한 후 감압 하에서 증발시켜 조화합물(crude compound)을 얻는 단계; 및
c) 상기 조화합물을 플래시 크로마토그래피를 통해 정제하여 용매를 제거한 후 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 얻는 단계.
A process for preparing the DO3A-diaminobiphenyl compound according to claim 1, comprising the steps of:
a) 2,2 '- [bis (N- bromomethyl-carbonyl) amino] biphenyl, or [2- (N- bromomethyl-carbonyl-amino -2' - (N- tert-butoxycarbonylamino) ] Biphenyl with DO3A ( t Bu) 3 and stirring to obtain a mixture;
b) filtering the mixture and evaporating under reduced pressure to obtain a crude compound; And
c) purifying the crude compound through flash chromatography to remove the solvent and then obtaining the DO3A-diaminobiphenyl compound.
제 1항에 따른 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 포함하는 가돌리늄 착물 리간드(L)용 조성물.
A composition for a gadolinium complex ligand (L) comprising a DO3A-diaminobiphenyl compound according to claim 1.
제 1항에 따른 DO3A-디아미노바이페닐 화합물을 리간드(L)로 포함하고, 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 가돌리늄(Gd) 착물.
[화학식 3]
Figure 112013033720272-pat00013


[화학식 4]
Figure 112013033720272-pat00014

A gadolinium (Gd) complex comprising the DO3A-diaminobiphenyl compound according to claim 1 as a ligand (L) and represented by the following formula (3) or (4)
(3)
Figure 112013033720272-pat00013


[Chemical Formula 4]
Figure 112013033720272-pat00014

 하기 단계들을 포함하는 제 4항에 따른 가돌리늄(Gd) 착물의 제조방법:
a) TFA와 CH2Cl2의 혼합물에 제 1항의 화학식 1 또는 2로 표시되는 화합물을 녹인 후 교반하여 터트-부틸(tert-butyl) 기를 탈보호(deprotection)시키는 단계;
b) 상기 a) 단계의 결과물에 가돌리늄(III) 클로라이드 헥사하이드레이트를 첨가하고 교반하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 결과물에서 물과 불순물을 제거하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계의 결과물을 디에틸에테르로 침전시켜 고형물을 얻는 단계.
A process for preparing a gadolinium (Gd) complex according to claim 4, comprising the steps of:
a) dissolving the compound of formula (1) or (2) of claim 1 in a mixture of TFA and CH 2 Cl 2 and stirring to deprotect the tert-butyl group;
b) adding gadolinium (III) chloride hexahydrate to the result of step a) and stirring;
c) removing water and impurities from the result of step b); And
d) precipitating the product of step c) with diethyl ether to obtain a solid.
제 4항에 따른 가돌리늄(Gd) 착물을 포함하는 자기공명영상(MRI) 조영제.
A magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent comprising a gadolinium (Gd) complex according to claim 4.
제 6항에 있어서, 혈액풀 조영제(blood-pool contrast agent, BPCA)로 사용되는 것을 특징으로 하는 자기공명영상(MRI) 조영제.
The MRI contrast agent according to claim 6, which is used as a blood-pool contrast agent (BPCA).
제 6항에 있어서, 상기 조영제는 뇌종양 영상을 1시간까지 증강시키는 것을 특징으로 하는 자기공명영상(MRI) 조영제.The MRI contrast agent according to claim 6, wherein the contrast agent enhances a brain tumor image by 1 hour.
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