KR101466620B1 - Novel bacteriophage and its use for preventing proliferation of Aeromonas hydrophila - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새롭게 분리 및 동정된 신규 파지 및 이를 유효성분으로 포함하는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸용 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 아에로모나스 히드로필라 감염성 질병 예방 또는 치료용 조성물, 항생제, 소독제, 및 어류용 사료첨가제 등 다양하게 활용될 수 있다. The present invention relates to a novel phage that is newly isolated and identified, and a composition for inhibiting or proliferating Aeromonas hydrophila comprising the same as an active ingredient. The present invention relates to a composition for preventing or preventing Aeromonas hydropila infectious disease, Antibiotics, disinfectants, feed additives for fish, and the like.
Description
본 발명은 새롭게 분리 및 동정된 신규 파지, 이를 유효성분으로 포함하는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 아에로모나스 히드로필라 감염성 질병 예방 또는 치료용 조성물, 항생제, 소독제, 및 어류용 사료첨가제에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel phage which has been newly isolated and identified, Aeromonas hypha pylas containing it as an active ingredient hydrophila ) proliferation inhibiting or killing composition, a composition for preventing or treating an aeromonas hydropila infectious disease, an antibiotic, a disinfectant, and a feed additive for fish.
아에로모나다세애(Aeromonadaceae)에 속하는, 운동성 아에로모나드(motile aeromonas)인, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)는 광범위하게 다양한 어류에 감염되어 패혈증, 출혈, 궤양 등을 유발하고 이로 인한 집단 폐사는 심각한 경제적 피해를 일으킨다. 특히, 국내 양식장의 경우, 제한된 공간으로 인하여 사육의 밀집 정도가 심하므로, 아에로모나스 히드로필라 발병시 전염성이 강하게 나타난다. 일례로, 충북 진천 일대 양어 시장에서의 비단잉어와 금붕어는 아에로모나스 히드로필라에 의한 피해가 심각한 대표적인 관상 어류이다. Aeromexico on to, the movement ah belonging to monada seae (Aeromonadaceae) as a person, ah Monad (motile aeromonas) Monastir Heathrow Pilar (Aeromonas hydrophila) is susceptible to a wide variety of fish, causing sepsis, bleeding, ulcers, etc., and this Causing serious economic damage. Especially, in the case of domestic farms, the density of breeding is high due to limited space, so the occurrence of Aeromonas hydropila is highly contagious. For example, Nishikigoi and goldfish at the fish market in Jincheon, Chungcheongbuk-do are representative ornamental fish that are severely damaged by aeromonas hydropilas.
아에로모나스 히드로필라는 수중 상재균이기 때문에 이를 방제하기 위한 목적으로 항생제를 처리하는 경우가 많으며, 그 결과 대부분의 아에로모나스 히드로필라는 항생제에 대해 내성을 보이고 있고, 항생제 잔류로 인해 국민 건강을 위협할 뿐만 아니라 내성균 출현에 의한 피해가 가중되고 있다.
Because Aeromonas hydropila is an aquatic organism, it is often treated with antibiotics for the purpose of controlling it. As a result, most aeromonas hydropilas are resistant to antibiotics, It is not only a threat to health but also the damage caused by the emergence of resistant bacteria.
한편, 박테리오파지는 박테리아에 특이적으로 감염되는 바이러스로 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견하였다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 박테리아를 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 파지를 이용한 치료법은 항균제 개발 이후 동유럽과 구소련에서만 지속적으로 연구되어 왔으나, 최근 항생제의 오남용으로 인해 다재 내성(Multidrug-resistant)을 지닌 병원성 세균 및 슈퍼박테리아 출현 빈도가 높아지고 기존 항생제의 많은 문제점들이 부각되면서, 항균제의 대안으로서 각광받고 있다. 더욱이, 박테리오파지는 항균제 대비 개발시간이 짧고 개발비용이 적게 소요되며, 세균선택성, 지속성 및 부작용 등의 측면에서 우위가 인정된다. On the other hand, bacteriophage is a virus that is specifically infected with bacteria. In 1915, British bacteriologist Twort discovered in a study of the phenomenon of transparent melting of the micrococcus colonies by something. In 1917, a French bacteriologist d'Herelle discovered that there was an effect of dissolving Shigella disentriae in the filtrate of dysentery patients. Through the research, they discovered bacteriophages independently and eaten bacteria Called bacteriophage in the sense of. However, the use of antibiotics has led to the emergence of multidrug-resistant pathogens and superbacteria, and many problems with conventional antibiotics have emerged. , And has been attracting attention as an alternative to antibacterial agents. Moreover, bacteriophage has a short development time, low development cost, and superiority in terms of bacterial selectivity, persistence and side effects compared to antimicrobial agents.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 아에로모나스 히드로필라에 용균활성을 가지는 새로운 박테리오파지를 분리하고, 이를 포함하는 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 아에로모나스 히드로필라 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항생제, 소독제, 및 어류용 사료첨가제를 제공하는 것이다.
Accordingly, a problem to be solved by the present invention is to separate a new bacteriophage having a lytic activity in Aeromonas hydropila, to provide a composition for inhibiting or proliferating Aeromonas hydropila, a composition for preventing or treating aeromonas hydropila infection A pharmaceutical composition for preventing or treating disease, an antibiotic, a disinfectant, and a feed additive for fish.
일 양태로, 본 발명은 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지에 관한 것이다. In one aspect, the invention relates to bacteriophage having specific killing activity against Aeromonas hydrophila .
형태학상 마이오비리데(Myoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속하고, In the morphological Mai ohbiri to (Myoviridae) and (family) kawoodo Bilal less (Caudovirales) neck (order), and
수탁번호 KCTC 12128BP의 박테리오파지 또는 수탁번호 KCTC 12129BP의 박테리오파지인 것을 특징으로 한다.Bacteriophage of accession number KCTC 12128BP or bacteriophage of accession number KCTC 12129BP.
본 발명자들은 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 사멸능을 가지는 파지를 분리 및 동정하였으며, 이를 PAH1-C 및 PAH6-C로 명명하고 2012년 2월 3일에 생물자원센터에 각각 수탁번호 제KCTC 12128BP호 및 수탁번호 제KCTC 12129BP호로 기탁하였다.
The present inventors have isolated and identified phage having the ability to kill Aeromonas hydrophila , named PAH1-C and PAH6-C, and on Feb. 3, 2012, No. KCTC 12128BP and Accession No. KCTC 12129BP.
본 발명자들은 하성 서암천에서 샘플을 채취하여 이 샘플에서 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) JUNAH를 숙주로 이를 용균하는 파지(이하, PAH1-C라 칭함)를 분리하였고 난지 물 재생 센터에서 채취한 샘플에서 아에로모나스 히드로필라 JUNAH를 용균하는 파지(이하, PAH6-C라 칭함)을 분리하였으며, 이들 PAH1-C 및 PAH6-C가 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 플라크를 형성하여 용균 활성(bacteriolytic activity)을 가짐을 확인하였다. The present inventors collected samples from Haesung Seocheon and analyzed the aeromonas hydropilas ( Aeromonas hydrophila) La phage lysis them the JUNAH as a host (hereinafter, PAH1-C hereinafter) the separation was phage lysis of Trichomonas dihydro pillar JUNAH to remain on from a sample collected from Nanji water reclamation center (hereinafter, PAH6-C hereinafter ). These PAH1-C and PAH6-C were found to form plaques on Aeromonas hydrophila to have bacteriolytic activity.
또한, 이들 PAH1-C 및 PAH6-C을 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 마이오비리데(Myoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order)에 속하는 것으로 판명되었다. Further, it was found to belong to these PAH1-C and C-PAH6 a result of observation of the morphology by electron microscopy, to my ohbiri (Myoviridae) and (family) kawoodo Bilal less (Caudovirales) neck (order).
또한, PAH1-C 및 PAH6-C의 게놈을 분석한 결과, 이중-나선 DNA(dsDNA)로 구성되고 게놈 크기는 약 50 kb 이며, PAH1-C 및 PAH6-C1 전체 게놈은 다른 파지와 명백한 상동성을 보이지 않아서, PAH1-C 및 PAH6-C의 게놈 크기는 지금까지 보고된 아에로모나스 히드로필라에 감염능을 가지는 것으로 공지된 박테리오파지와는 큰 차이를 보이는바, 신규한 박테리오파지인 것으로 판명되었다.
In addition, the genomes of PAH1-C and PAH6-C were analyzed and found to be composed of double-stranded DNA (dsDNA) with a genome size of about 50 kb. The entire genome of PAH1-C and PAH6- , The genomic size of PAH1-C and PAH6-C was found to be a novel bacteriophage showing a great difference from the bacteriophage known to have the ability to infect a previously reported aeromonas hydropila.
본 발명의 명세서에 있어서, 상기 'PAH1-C 또는 PAH6-C'에는 파지 자체 뿐만 아니라 파지 배양물도 포함된다. In the specification of the present invention, 'PAH1-C or PAH6-C' includes phage cultures as well as phage itself.
본 발명에 따른 파지 PAH1-C 또는 PAH6-C 파지는 통상적인 파지 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, NB(nutrient broth), TSB(tryptic soy broth) 액체 배지, 또는 TSA(tryptic soy agar) 고체배지 등을 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양조건으로 수행할 수 있다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
The phage PAH1-C or PAH6-C phage according to the present invention can be cultured in a large amount by a conventional phage culturing method. As the culture medium, a medium composed of carbon source, nitrogen source, vitamins and minerals can be used. For example, NB (nutrient broth), TSB (tryptic soy broth) liquid medium, or TSA (tryptic soy agar) solid medium can be used. The culture can be carried out under ordinary culture conditions. The culture medium in the culture medium may be removed and centrifuged or filtered to collect only the concentrated cells, which step may be carried out according to the needs of those skilled in the art. The concentrated microbial cells can be preserved by freezing or freeze-drying according to a conventional method so as not to lose their activity.
PAH1-C 및 PAH6-C는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 감수성을 나타낸다. PAH1-C and PAH6-C show susceptibility to Aeromonas hydrophila .
보다 구체적으로, 상기 PAH1-C는 아에로모나스 히드로필라 AH1, AH6, AH9, AH16, AK1 및 AK9에 감수성을 보이며, 상기 PAH6-C는 아에로모나스 히드로필라 AH7, AH16, AK1 및 AK9에 감수성을 보인다. More specifically, PAH1-C shows susceptibility to Aeromonas hydropilas AH1, AH6, AH9, AH16, AK1 and AK9, and PAH6-C is sensitive to Aeromonas hydropilas AH7, AH16, AK1 and AK9 It shows sensitivity.
또한, 바람직하게, 상기 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)는 항생제 내성 균주 또는 다제 내성 균주이다.
Further, preferably, the Aeromonas hydrophila is an antibiotic-resistant strain or a multidrug-resistant strain.
따라서, 다른 양태로, 본 발명은 PAH1-C 또는 PAH6-C를 유효성분으로 포함하는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸용 조성물 또는 이를 이용하여 아에로모나스 히드로필라의 증식을 억제시키거나 또는 사멸시키는 방법에 관한 것이다.
Accordingly, in another aspect, the present invention as the O-containing PAH1 PAH6 C or C-pillar, as an active ingredient, Pseudomonas hydrochloride (Aeromonas hydrophila ) proliferation inhibiting or killing composition or a method for inhibiting or killing the growth of aeromonas hydropilla using the same.
또 다른 양태로, 본 발명은 PAH1-C 또는 PAH6-C, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 항생제, 소독제 및 어류용 사료첨가제에 관한 것이다. 바람직하게, 파지 PAH1-C 또는 PAH6-C, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸용 항생제, 소독제 및 어류용 사료첨가제에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to PAH1-C or PAH6-C, or antibiotics, disinfectants and feed additives for fishes comprising the same as an active ingredient. Preferably, phage PAH1-C or PAH6-C, or Aeromonas hydropilas containing it as an active ingredient hydrophila ) proliferation inhibiting or killing antibiotics, disinfectants and feed additives for fish.
본 발명의 명세서에 있어서, 상기 '항생제'는 방부제, 살균제, 및 항균제를 포함하는 의미이다. In the specification of the present invention, the term 'antibiotic' means a preservative, a bactericide, and an antibacterial agent.
상기 사료첨가제는 어류용 사료에 첨가될 수 있다. The feed additive may be added to feed for fish.
또는, 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키지 않고, 사료 제조시 직접 PAH1-C 또는 PAH6-C를 첨가하여 제조할 수도 있다. Alternatively, PAH1-C or PAH6-C may be added directly to the feed without preparing it as a feed additive and mixing with the feed.
상기 어류에는 잉어, 시클리드, 농어, 대구, 붕어, 연어, 우럭, 미꾸라지. 메기 또는 망둑어가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The fish include carp, cichlid, perch, cod, crucian carp, salmon, beetle, loach. But are not limited to, catfish or rodents.
본 발명에 따른 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제, 및 사료첨가제는 기존의 것에 비해 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 특이성이 매우 높으므로 익균은 죽이지않고 특정 병원균만 사멸시킬 수 있어 부작용이 없고, 다제 내성 병원균도 사멸시킬 수 있어 그 효과가 탁월할 뿐만 아니라, 병원균의 내성 내지 저항성을 유도하지 않으므로 기존의 것에 비하여 제품수명이 길다.
Aeromonas hydropilas according to the present invention hydrophilia ) Antimicrobial agents, antibiotics, disinfectants, and feed additives for proliferation inhibition or killing are highly specific to Aeromonas hydrophila as compared with conventional ones, and thus it is possible to kill only specific pathogens without killing them It is possible to kill multidrug-resistant pathogens, which not only exerts excellent effects but also does not induce tolerance or resistance of pathogens, and thus has a longer product life than conventional ones.
상기 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제 및 사료첨가제는 용액, 현탁액, 유화액과 같은 액상으로 제조될 수 있으나, 파지 건조체에 기반하여 분말제, 과립제, 정제, 또는 캅셀제와 같은 고상으로도 제조될 수 있다. The compositions, antibiotics, disinfectants and feed additives for inhibiting or killing aeromonas hy- drophila may be prepared in liquid form such as solutions, suspensions and emulsions, but may be formulated as powders, granules, tablets or capsules It can be produced in the same solid phase.
상기 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제 및 사료첨가제에는 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 상기 허용가능한 담체란 생물체를 자극하지 않고 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체를 말한다. 실제 포장에 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다. 상기 계면활성제의 일예로 알킬(C8~C12)아릴설포네이트, 디알킬(C3~C6)아릴설포네이트, 디알킬(C8~C12)설포숙시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포네이트축합물, 나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 알킬(C8~C12)나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설포네이트와 같은 설포네이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬(C8~C12)설페이트, 알킬(C8~C12)아릴설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐설페이트와 같은 설페이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 나트륨 벤조에이트, 알킬카르복실레이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬(C12~C18)에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8~C12)페닐폴리머, 에틸렌옥사이드 프로필렌옥사이드 코폴리머와 같은 비이온성 계면활성제, 폴리카복실레이트, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 계면활성제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 증량제로는 벤토나이트(bentonite), 활석, 클레이, 카올린, 탄산칼슘, 규사, 경석, 규조토, 산성 백토, 제올라이트, 펄라이트, 화이트 카본, 암모늄 설페이트, 요소, 포도당, 덱스트린(dextrin), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 포도당 및 전분, 물 등이 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 증량제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. The compositions, antibiotics, disinfectants and feed additives for inhibiting or killing the aerosol hydropilase may further comprise an acceptable carrier and may be formulated together with the carrier. The acceptable carrier refers to a carrier that does not irritate the organism and does not interfere with its biological activity and properties. For the purpose of stable formulation suitable for actual packaging, it may be prepared in the form of a wetting agent, a granular wetting agent, a liquid wettable powder, a liquid agent, a water-soluble agent, a water-soluble granule or an encapsulating agent using a surfactant or an extender. Examples of the surfactant include alkyl (C 8 -C 12 ) aryl sulfonate, dialkyl (C 3 -C 6 ) aryl sulfonate, dialkyl (C 8 -C 12 ) sulfosuccinate, lignin sulfonate, naphthalene Sulfonate condensates, naphthalene sulfonate formalin condensates, alkyl (C 8 -C 12 ) naphthalene sulfonate formalin condensates, sodium salts of sulfonate compounds such as polyoxyethylene alkyl (C 8 -C 12 ) phenylsulfonate, or calcium salts, alkyl (C 8 ~ C 12) sulfates, alkyl (C 8 ~ C 12) aryl sulfates, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12) sulfates, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12) phenyl sulphate , Sodium salts or calcium salts of succinate compounds such as polyoxyalkylene succinates, sodium benzoates, anionic surfactants such as alkylcarboxylates, polyoxyethylene alkyl (C 12 ~ C 18) ethers, polyoxyethylene al (C 8 ~ C 12) phenyl ether, polyoxyethylene alkyl (C 8 ~ C 12) phenyl polymer and ethylene oxide propylene oxide from the non-ionic surfactants, polycarboxylate, a group consisting of Triton 100 and Tween 80, such as a copolymer It will be readily understood by those skilled in the art that one or more selected surfactants may be used in combination, and surfactants other than these surfactants may also be used. Examples of the extender include bentonite, talc, clay, kaolin, calcium carbonate, silica, pumice, diatomaceous earth, acidic clay, zeolite, pearlite, white carbon, ammonium sulfate, urea, glucose, dextrin, , Yellow loess, glucose and starch, water, etc. may be used singly or in combination of two or more, and other extender may be used, as will be readily understood by those skilled in the art will be.
상기 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제 및 사료첨가제에서의 파지 농도 내지 파지 건조체의 함량은 사용 목적에 맞게 임의로 조정될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다. It will be apparent to those skilled in the art that the composition of the composition for inhibiting or killing aeromonas hy- drophila, the antibiotic, the disinfectant, and the feed additive can be arbitrarily adjusted to suit the purpose of use, It will be easily understood.
상기 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제 및 사료첨가제에는 PAH1-C 또는 PAH6-C, 즉 한가지 파지만 포함될 수도 있고, 상기 두가지 파지가 모두 포함될 수도 있다. 또한, 상기 파지 외에 유효 박테리오파지가 추가로 포함될 수 있으며, 상기 유효 박테리오파지는 바람직하게는 아에로모나스 히드로필라에 대한 용균 활성을 가진 것이나 이에 한하지 않고 그 외 박테리아에 대한 용균 활성을 가진 파지도 포함될 수 있다. The compositions, antibiotics, disinfectants and feed additives for inhibiting or killing aeromonas hy- drophilas may include PAH1-C or PAH6-C, i.e., only one phage, and both of the two phages may be included. In addition, the effective bacteriophage may further include an effective bacteriophage, which preferably has a lytic activity against Aeromonas hydropilas, but also includes a phage having a lytic activity against other bacteria .
또한, 상기 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸용 조성물, 항생제, 소독제 및 사료첨가제를 처리하는 경우, 아에로모나스 히드로필라를 포함한 박테리아 증식 억제 또는 사멸을 위해 종래 통용되던 방법과 병용할 수 있고, 바람직하게는 아에로모나스 히드로필라 증식 억제 또는 사멸을 위해 종래 통용되던 방법과 병용할 수 있다.
In addition, when the composition for inhibiting or proliferating aeromonas hydropilas is treated, an antibiotic, a disinfectant, and a feed additive can be used in combination with a conventional method for inhibiting or killing bacterial growth including aeromonas hydropilas And preferably used in combination with a method conventionally used for inhibiting or killing aeromonas hydropilas.
또 다른 양태로, 본 발명은 파지 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 감염성 질병 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 이를 이용하여 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 감염성 질병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition comprising Aeromonas hypha pylas containing phage or a culture thereof as an active ingredient hydrophila ) pharmaceutical composition for preventing or treating an infectious disease, or a pharmaceutical composition for preventing or treating an infectious disease by using Aeromonas hydropilla hydrophila ) infectious diseases.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 파지는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 특이적 사멸능을 가지므로, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 감염에 의해 유발되는 다양한 질병의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다. As it described above, the grip according to the present invention, so as to have the O-specific killing capability for Pseudomonas dihydro pillar (Aeromonas hydrophila), O to Pseudomonas dihydro pillar (the Aeromonas hydrophila ) infections. < / RTI >
바람직하게, 상기 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 감염성 질병은 패혈증, 아레로모나스병 또는 궤양이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 감염성 질병에는 이러한 질병으로부터 발현되는 증상도 포함되며, 예를 들어 설사 또는 출혈이 있으나, 이에 제한되지 않는다. Preferably, the aeromonas hydropilas ( Aeromonas hydrophila) infectious diseases, sepsis, but are not limited to Monastir disease or ulcers, or in Arezzo, this. In addition, the Vibrio parahaemolyticus infectious diseases also include symptoms expressed from such diseases, including, but not limited to, diarrhea or hemorrhage.
본 발명의 명세서에 있어서, 상기 '예방 또는 치료'에는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 감염성 질병의 예방, 억제, 및 경감이 포함된다. In the specification of the present invention, the term 'prevention or treatment' includes Aeromonas hydropilas hydrophila) includes the prevention, inhibition, and reduction of the infectious disease.
본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있다. The composition of the present invention may be administered to an animal in the form of a pharmaceutical preparation, or mixed with feed or water and fed to the animal.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. The administration route of the composition of the present invention may be administered through various routes of oral or parenteral administration as long as it can reach the target tissues. Specifically, oral administration, rectal administration, topical administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, Transdermal, non-intranasal, inhalation, and the like.
본 발명의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 일이다. 특정 대상에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
A prophylactic or therapeutic method of the present invention includes administering a composition of the present invention in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that the appropriate total daily dose may be determined by the practitioner within the scope of sound medical judgment. The specific therapeutically effective amount for a particular subject will depend upon the type and extent of response to be achieved, the age, body weight, general health, sex and diet of the subject, the time of administration, the route of administration and the fraction of the route of administration, It is preferable to apply differently depending on various factors including drugs used or co-used and similar factors well known in the medical field.
본 발명에 따른 새롭게 분리한 파지는 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 증식 억제 또는 사멸 효과가 있고, 특히 항생제 내성 아에로모나스 히드로필라에 대해서도 증식 억제 또는 사멸능을 가지므로, 패혈증, 아에로모나스병 또는 궤양과 같은 아에로모나스 히드로필라 감염성 질병 예방 또는 치료에 효과적이며, 사료로 활용할 수 있을 뿐만 아니라 항생제 또는 소독제로 사용할 수 있다. 따라서, 양식 산업의 경쟁력 및 국민보건 향상에 이바지할 것으로 기대된다. The newly separated phage according to the present invention has Aeromonas hydrophila proliferation inhibition or killing effect, and particularly has a proliferation inhibiting or killing activity against antibiotic resistant Aeromonas hydropilas, Aeromonas disease or ulcers such as Aeromonas It is effective for the prevention or treatment of infectious diseases of hydropila, and it can be used as an antibiotic or disinfectant as well as being utilized as feed. Therefore, it is expected to contribute to the competitiveness of the aquaculture industry and the improvement of public health.
도 1은 PAH1-C gDNA (좌측) 및 PAH6-C gDNA (우측)과 12가지 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonucleases)에 의한 분해물의 펄스-필드 젤 전기영동한 결과(Pulsed-field gel electrophoretogram)를 나타낸 것이다. M 라인은 낮은 범위 PFG 마커를 나타낸 것이다 (새로운 잉글랜드 바이오랩). 1 라인은 분해되지 않은 파지 gDNA를 나타낸 것이다. 2-13 라인은 각각 SacII, Sau3AI, MspI, XbaI, NotI, HindIII, SmaI, SphI, NcoI, HpaII, SpeI 및 EcoRI 에 의해 생성된 파지 PAH1-C 및 PAH6-C 분해 패턴을 나타낸 것이다(새로운 잉글란드 바이오랩). 두 파지 gDNA의 게놈 크기는 약 50 kb로 예측되었다.
도 2는 음성 염색된 PAH1-C (좌측) 또는 PAH6-C (우측)을 전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 3은 아에로모나스 히드로필라 AH16에 대한 PAH1-C 및 PAH6-C의 용균 활성을 나타낸 것이다. MOI(muliplicity of infection) 0.01, 1, 및 100 으로 PAH1-C 또는 PAH6-C과 공배양하였다. 그 결과는 세번의 시험을 통해 평균±표준편차 값으로 기재하였다.
도 4는 미꾸라지의 아에로모나스 히드로필라(A. hydrophila ) 감염에 대한 PAH1-C 및 PAH6-C 파지의 치료 효과를 나타낸 것이다.
Figure 1 shows the results of pulsed-field gel electrophoretograms of the degradation products by PAH1-C gDNA (left) and PAH6-C gDNA (right) and 12 restriction endonucleases . The M line represents the low range PFG marker (New England BioLab).
FIG. 2 is an electron microscopic observation of negative stained PAH1-C (left) or PAH6-C (right).
FIG. 3 is a graph And PAH1-C and PAH6-C against AH16. Co-cultured with PAH1-C or PAH6-C with MOI (muliplicity of infection) 0.01, 1, and 100. The results are expressed as mean + standard deviation values through three tests.
Figure 4 illustrates the therapeutic effect of the in the loach Oh Pseudomonas dihydro pillar (A. hydrophila) PAH1-C and C-PAH6 gripping of the infection.
<재료 및 방법>≪ Materials and methods >
대상 박테리아 및 파지의 샘플링Sampling of target bacteria and phage
하수처리장, 강, 어류 양식장 주변의 하천 등에서 샘플링하였으며, 샘플링한 장소, 날짜를 표기한 후 500ml 이상을 채취하여 100ml을 박테리오파지 분리에 사용하였다. 구체적으로, 하성 서암천 및 난지 물 재생센터에서 박테리오파지를 분리하였다. 또한, 동시에 양식장 또는 하천에서 박테리아를 분리하였다. 분리된 박테리아는 PCR과 Vitek II를 이용해 동정하였다.
Samples were taken from sewage treatment plants, rivers, and rivers around fish farms. After sampling the place and date, more than 500 ml was sampled and 100 ml was used for bacteriophage separation. Specifically, the bacteriophage was isolated from the Seosam Stone and the Nanji Water Reclamation Center. At the same time, bacteria were isolated from farms or rivers. Isolated bacteria were identified using PCR and Vitek II.
파지 분리 및 숙주역 조사Separation of phage and host station investigation
파지 분리 및 그것의 플라크-형성 유니트(plaque-formingunits(PFUs))의 수 계산을 위해 통상적으로 사용되는 이중-층 아가법(double-layered method)(AdamsM (1959) Bacteriophages. Interscience Publishers, NewYork)을 이용하였다. 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) JUNAH를 파지 분리용 숙주 박테리아로 사용하였다. 플라크 형태는 인큐베이션 18-24 시간 경과 후에 관찰하였다. 분리재료를 20℃ 에서 36 시간 동안 인큐베이션하고, 10,000×g 에서 20분 동안 원심분리한 후, 0.45μm 크기의 필터을 통해 여과하여 90ml에 10×TSB 10ml을 첨가하고, 숙주 박테리아 106~107 CFU를 접종하여 12시간 이상 배양하였다. 5,000rpm 20 분간 원심분리를 하여 상층액을 채취하고, 숙주 박테리아 108 CFU를 TSA 한천배지 표면에 도포한 후 상층액 5~10ul를 떨어뜨린 후 25℃에서 18시간 배양하였다. 용균이 일어나는 경우 10진 희석하여 역가 특정하고 플라크 모양을 관찰하였다. 순수한 파지 균주를 세번의 일련의 단일-플라크 분리를 통해 수득하였고 이를 PAH1-C 및 PAH6-C로 명명하였다. 여과된 파지 용해물을 12 시간 동안 4℃의 1M의 NaCl 내에서 10% (wt/vol) 폴리에틸렌 글리콜 8000을 이용해 침전시켰고, 4℃에서 10분 동안 10,000×g로 원심분리하여 회수하였다. 정제된 파지는 CsCl 단계 구배 울트라원심분리 (밀도 구배:1.15, 1.45, 1.50 및 1.70g/ml; 250,000×g;22h; 4℃)하고, SM 버퍼(10-mM NaCl, 50-mMTris[pH7.5] 및 10-mM MgSO4)에서 투석하고 사용 전까지 4℃ 암소에 보관하였다.(Adams M (1959) Bacteriophages. Interscience Publishers, New York), which is commonly used for phage separation and the numbering of plaque-forming units (PFUs) thereof. Respectively. Aeromonas hydropilas ( Aeromonas hydrophila JUNAH was used as a host bacterium for phage separation. The plaque morphology was observed after 18-24 hours of incubation. The separating material is incubated at 20 DEG C for 36 hours, centrifuged at 10,000 x g for 20 minutes, filtered through a 0.45 mu m filter to add 10 mL of 10 x TSB to 90 mL and incubated with
PAH1-C 및 PAH6-C의 숙주역은 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 및 아에로모나스 소르비아(Aeromonas sorbia)를 접종한 이중-층 아가 플레이트에 10μl의 희석된 파지 부유액(3.3×107PFU/ml)을 떨어뜨려 결정하였다. 그리고 나서, 상기 박테리아를 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션시켰고, 플라크가 형성되는지 여부를 체크하였다.
The host strains of PAH1-C and PAH6-C were prepared by adding 10 [mu] l of diluted phage suspension (3.3 [mu] l) to a double-layer agar plate inoculated with Aeromonas hydrophila and Aeromonas sorbia 10 < 7 > PFU / ml). The bacteria were then incubated at 37 [deg.] C for 20 hours and checked for plaque formation.
분리된 파지의 Discrete phage 유전체적Genetic 분석 analysis
정제된 파지 게놈 DNA(gDNA)를 Son JS et al,. (2010) Complete genome sequence of a newly isolated lytic bacteriophage, EFAP-1 of Enterococcus faecalis, and antibacterial activity of its endoly sin EFAL-1.J Appl Microbiol 108:1769-1779에 기재된 바와 같이 준비하였고, 그리고 파지의 유전체적 분석을 위하여 우선적으로 지침서에 기재된 바에 따라 DNase I (20U/μl)(Takara), RNase A (5U/μl)(intron) 및 Mung bean nuclease (20U/μl)(Takara)에 대한 파지 게놈의 반응 여부를 조사하였다. 먼저 109 PFU/ml 이상의 파지 stock을 Proteinase K로 캡시드(capsid)를 제거한 후 PCI (phenol-chloform-isoamyl alcohol)로 처리된 상층액을 이소프로판올(isopropanol)로 처리하고 70% 에탄올(ethanol)로 세척하는 과정을 거쳐 TE 버퍼(buffer)에 최종적으로 게놈을 농축하였다. 이렇게 농축된 파지의 게놈은 0.7% 아가로스 젤(1X TAE 버퍼)에 전기영동되어 대조군(control)으로 사용되었으며, 각각의 파지군은 DNase I와 RNase A, Mung bean nuclease에 의해 처리된 후 양성밴드의 유무를 통하여 결과가 판단되었다.Purified phage genomic DNA (gDNA) was obtained from Son JS et al. (2010) Complete genome sequence of a newly isolated lytic bacteriophage, EFAP-1 of Enterococcus faecalis, and antibacterial activity of its endoly sin EFAL-1.J Appl Microbiol 108: 1769-1779, For analysis, the phage genome response to DNase I (20 U / μl) (Takara), RNase A (5 U / μl) (intron) and Mung bean nuclease (20 U / μl) (Takara) . First, 10 9 PFU / ml or more of phage stock was removed with Proteinase K, and the supernatant treated with PCI (phenol-chloform-isoamyl alcohol) was treated with isopropanol and washed with 70% ethanol And the genome was finally concentrated in a TE buffer. The enriched phage genome was electrophoresed in 0.7% agarose gel (1X TAE buffer) and used as a control. Each phage group was treated with DNase I, RNase A, and Mung bean nuclease, The results were determined by the presence or absence of.
추가로, 파지 gDNA의 유전체 크기 및 제한효소 절단 패턴을 정확히 관찰하기 위해 Uchiyama J et al., (2008) Iso-lation and characterization of a novel Enterococcus faecalis bacteriophage EF24C as a therapeutic candidate. FEMS Microbiol Lett 278:200-206에 기재된 바에서 약간 변형한 방법에 따라 펄스-필드 젤 전기영동(PFGE; pulsed-feild gel electrophoresis)을 수행하였다. 간략히 말해, 500μl의 파지 부유액을 2% (wt/vol) NuSieve GTG agarose(FMC BioProducts)와 혼합하고, 플럭 몰드(plug mold)에 붓고, 고체화하였다. 상기 플럭은 소량의 분해 버퍼(500 mM EDTA, 10 mM Tris [pH 8.0], 1% SDS [wt/vol] 및 1 mg/ml 의 proteinase K) 안으로 몰드를 통해 펀치되었고 밤새 50°C 에서 인큐베이션시켰다. 분해 버퍼를 따라내고, 상기 샘플을 TE 버퍼를 사용해 3회 세척하고, 그리고나서 10 U 의 SacII, Sau3AI, MspI, XbaI, NotI, HindIII, SmaI, SphI, NcoI, HpaII, SpeI 및 EcoRI (New England Biolabs)으로 각각 1시간 동안 37°C에서 분해시켰다. 상기 플럭은 TE 버퍼를 사용해 3회 세척하고, 0.5X TBE 내 1.2% Pulsed Field Certified agarose (Bio-Rad)의 웰(wells) 내 넣고, molten 0.5% NuSieve GTG agarose를 이용해 덮어씌웠다. 상기 샘플은 0.5X TBE 버퍼 내에서 14°C 에서 16시간 동안 5 내지 15초간 펄스 램프와 함께 6 V/cm 로 CHEF-DR III System (Bio-Rad)를 이용해 전기영동하였다.
In addition, Uchiyama J et al., (2008) Iso-lation and characterization of a novel Enterococcus faecalis bacteriophage EF24C as a therapeutic candidate for precisely observing the genome size and restriction enzyme cleavage pattern of phage gDNA. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) was performed according to a slightly modified method as described in FEMS Microbiol Lett 278: 200-206. Briefly, 500 μl of phage suspension was mixed with 2% (wt / vol) NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), poured into a plug mold and solidified. The flock was punched through a mold into a small volume of digestion buffer (500 mM EDTA, 10 mM Tris [pH 8.0], 1% SDS [wt / vol] and 1 mg / ml proteinase K) and incubated overnight at 50 ° C . The digestion buffer was removed and the sample was washed 3 times with TE buffer and then 10 U of SacII, Sau3AI, MspI, XbaI, NotI, HindIII, SmaI, SphI, NcoI, HpaII, SpeI and EcoRI (New England Biolabs ) At 37 ° C for 1 hour, respectively. The flasks were washed three times with TE buffer and placed in wells of 1.2% Pulsed Field Certified agarose (Bio-Rad) in 0.5X TBE and covered with molten 0.5% NuSieve GTG agarose. The samples were electrophoresed with CHEF-DR III System (Bio-Rad) at 6 V / cm with a pulse lamp for 15-15 seconds at 14 ° C in 0.5X TBE buffer.
분리된 파지의 전자현미경 분석Electron microscopic analysis of isolated phage
분리된 파지의 형태학적 분류를 위해 투과전자현미경(TEM) 관찰을 수행하였다. 파지 스톡을 구리 그리드에 로드(load) 한 후에, 1% 우라닐 아세테이트로 음성 염색하고 건조하였다. 전자현미경 촬영은 서울대학교 관악캠퍼스 농업생명과학대학교 부속 NICEM에서 이뤄졌다. 상기 파지의 형태는 Zeiss TEM EM902 (Zeiss)를 이용해 80 kV의 전압으로 관찰하였다. 파지 크기는 10번 이상의 측정으로 계산하였다.
Transmission electron microscopy (TEM) was performed for morphological classification of isolated phage. The phage stock was loaded onto a copper grid, followed by negative staining with 1% uranyl acetate and drying. Electron microscopy took place at NICEM, the College of Agriculture and Life Sciences, Gwanak Campus, Seoul National University. The morphology of the phage was observed using a Zeiss TEM EM902 (Zeiss) at a voltage of 80 kV. The phage size was calculated by measuring over 10 times.
BrothBroth -- cultureculture 상태의 숙주 박테리아에 대한 파지 감수성 검사 Detection of phage susceptibility to host bacteria
아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)에 대한 PAH1-C 및 PAH6-C의 용균 활성을 평가하였다. PAH1-C(1.1x1010PFU/ml) 및 PAH6-C(1.1x1010PFU/ml)과 아에로모나스 히드로필라 AH16(8.8x106CFU/ml) 균주를 이용하여 진행되었으며, 정제된 파지 및 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) AH16을 10 ml의 깨끗한 TSB 내에서 MOI(multiplicity of infection, 박테리아와 박테리오파지의 정량적 비율) 0.01, 1, 100의 3군으로 나누어 실험을 진행하였다. 상기 제조물을 20°C 에서 250 rpm 으로 흔들면서 공배양하였다. 파지가 없는 TSB 내에 접종된 박테리아는 대조군으로 사용하였다. 흡광도(OD600)는 접종 후, 24 h 경과할 때까지 측정하였다.
The lytic activity of PAH1-C and PAH6-C against Aeromonas hydrophila was evaluated. The cells were treated with PAH1-C (1.1x10 10 PFU / ml) and PAH6-C (1.1x10 10 PFU / ml) and Aeromonas hydropila AH16 (8.8x10 6 CFU / ml) Aeromonas hydropilas ( Aeromonas hydrophila AH16 was divided into three groups: MOI (multiplicity of infection, quantitative ratio of bacteria and bacteriophage) 0.01, 1, 100 in 10 ml of clean TSB. The product was co-cultured at 20 ° C with shaking at 250 rpm. Bacteria inoculated into TSB without phage were used as controls. Absorbance (OD 600 ) was measured until 24 h after inoculation.
실험어의Experimental 아에로모나스Aeromonas 히드로필라에Hydropila 인공 감염을 통한 파지의 효능효과 검정 Effectiveness of phage treatment by artificial infection
아에로모나스 히드로필라에 감수성이 가장 높은 것으로 알려진 미꾸라지(Loach, Cobitis biwae, 평균 체장: 14.56Cm, 평균 체중: 14.98g)를 사용하였다. 인공 감염에 사용된 아에로모나스 히드로필라는 미꾸라지에서 대량폐사를 유발하였던 아에로모나스 히드로필라 AH16 균주를 사용하였으며, 파지는 PAH1-C와 PAH6-C를 사용하였다. 감염은 근육 주사법(IM, intra-muscular injection)이 사용되었으며, 치료용 파지 역시 동일한 방법으로 투여되었다. 실험군은 총 4군으로 박테리아 감염 후 파지 치료하지 않은 군(20미), 박테리아 감염 후 PAH1-C 파지 치료한 군(20미), 박테리아 감염 후 PAH6-C 파지 치료한 군(20미), 박테리아 감염 후 PAH1-C와 PAH6-C 파지를 같이 치료한 군(20미)으로 구성되었다. 또한 각 실험은 3번 반복 시험을 하여 보다 정확한 결과를 도출하였다. 박테리아 감염 시 사용된 AH16 균주의 경우 3.3x107CFU/fish의 농도로 PBS에 희석된 후 인공 감염되었으며, 파지 치료시 사용된 PAH1-C는 1.1x109PFU/fish, PAH6-C는 1.0x109PFU/fish의 농도로 접종하였다. 각 실험군들은 25℃ 수온의 수조에서 7일 동안 그 예후가 관찰되었다.
Loach (Cobitis biwae, average length: 14.56 cm, average weight: 14.98 g), which is known to have the highest sensitivity to Aeromonas hydropila, was used. AEROMONAS HYDROPILLA used for artificial infection was AEROMONAS HYDROPHILA strain AH16 which caused mass mortality in loach, PAH1-C and PAH6-C were used for phage. Intramuscular injection (IM, intra-muscular injection) was used and the therapeutic phage were administered in the same way. The experimental groups were divided into four groups: those not treated with phage after bacterial infection (20 percent), those treated with PAH1-C phage (20 percent) after bacterial infection, those treated with PAH6-C phage (20 percent) And PAH1-C and PAH6-C phages (20 controls). Each experiment was repeated three times to obtain more accurate results. In the case of the AH16 strain used for bacterial infection, it was diluted with PBS to a concentration of 3.3 × 10 7 CFU / fish and artificially infected. The PAH1-C used in the phage treatment was 1.1 × 10 9 PFU / fish and the PAH 6 -C was 1.0 × 10 9 PFU / fish. Each experimental group had prognosis for 7 days at 25 ℃ water temperature.
<결과><Result>
파지 분리 및 Separate phage and 숙주역Host station
총 11번의 분리 시도로 2종의 파지를 분리하였다. 파지는 3회의 클로닝 과정을 통하여 순수 분리되었다. PAH1-C라고 명명된 파지는 하성 서암천에서 분리되었고, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) JUNAH에서 플라크를 형성하였다. 또한, PAH6-C라고 명명된 파지는 난지 물 재생센터에서 분리되었고, 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) JUNAH에서 플라크를 형성하였다. A total of 11 isolations were used to isolate the two phages. The phage were separated pure through three cloning steps. The phage named PAH1-C was isolated from Haesung Seocheon, and Aeromonas hydropilas hydrophila) to form a plaque in JUNAH. In addition, the phage named PAH6-C was isolated from the Nanji Water Recovery Center and formed plaques in Aeromonas hydrophila JUNAH .
분리된 총 8주의 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) 뿐만 아니라 10주의 아에로모나스 소르비아(Aeromonas Sorbia)를 대상으로 하여 2종 파지의 각각에 대한 감수성 및 숙주역을 조사하여 최종적으로 확정지었다. PAH1-C는 7주의 아에로모나스 히드로필라 중 6주의 아에로모나스 히드로필라 및 10주의 아에로모나스 소르비아 중 1주의 아에로모나스 소르비아에서 플라크를 형성하였다. 아울러, PAH6-C는 7주의 아에로모나스 히드로필라 중 4주의 아에로모나스 히드로필라 및 10주의 아에로모나스 소르비아 중 1주의 아에로모나스 소르비아에서 플라크를 형성하였다. A total of 8 separate aeromonas hydropilas ( Aeromonas hydrophila , and aeromonas sorbia ( 10 ) were investigated for susceptibility and host status of each of two kinds of phage. PAH1-C formed plaques in six of the seven Aeromonas hydropilas of Aeromonas hydropila and one of ten Aeromonas sorbia of Aeromonas sorbia. In addition, PAH6-C formed plaques in four weeks of Aeromonas hydropila in seven weeks of Aeromonas hydropila and one in Aeromonas sorbia of ten weeks of Aeromonas sorbia.
그러므로, PAH1-C 및 PAH6-C 모두가 아에로모나스 히드로필라에 감수성을 나타내는 것으로 판단된다(표 1). 하기 표 1의 모든 아에로모나스 히드로필라는 항생제 내성 균주이며, 특히 숙주 세균으로 사용된 아에로모나스 히드로필라 중(Aeromonas hydrophila) 아에로모나스 히드로필라 JUNAH는 다제 내성 균주이다.Therefore, it was judged that both PAH1-C and PAH6-C showed susceptibility to Aeromonas hydropila (Table 1). To a Table 1 corresponding to all of the Pseudomonas dihydro pillar is an antibiotic-resistant strain, especially of the O to Pseudomonas dihydro pillars for use as a host bacterium (Aeromonas hydrophila ) Aeromonas hydropila JUNAH is a multidrug-resistant strain.
Strain name
Serial Number
Separation place
sensibility
분리된 파지는 4℃ 암소에 보관하였다.
The separated phages were stored at 4 ° C in a dark place.
PAH1PAH1 -C 및 -C PAH6PAH6 -C의 분류 및 성상Classification and Characteristics of -C
1) 유전체 성상에 따른 파지의 분류 1) Classification of phage according to dielectric properties
일반적으로, 미오비리데 파지는 이중 나선(ds) DNA 게놈을 가지는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, PAH1-C 및 PAH6-C 의 gDNA는 DNase I 에 의해서는 완벽히 분해되지만, RNase A 또는 Mung bean nuclease 에 의해서는 완전히 분해되지 않았다. 그러므로, 그것은 ds(double strand) DNA 로 추정되었다. 아울러, gDNA 는 SacII, Sau3AI, MspI, SmaI, NcoI, HpaII 및 EcoRI 에 의해 절단되었고, 그리고 그것의 크기는 대략 50 kb 으로 추정되었다(도 1). In general, mio viride de phage is known to have a double helix (ds) DNA genome. Similarly, the gDNAs of PAH1-C and PAH6-C are completely degraded by DNase I, but not completely degraded by RNase A or Mung bean nuclease. Therefore, it was estimated to be ds (double strand) DNA. In addition, the gDNA SacII, Sau3AI, MspI, SmaI, NcoI, was truncated by the HpaII and EcoRI, and its size was estimated to be approximately 50 kb (Figure 1).
2) 분리된 파지의 형태학적 분류2) Morphological classification of isolated phage
PAH1-C 및 PAH6-C는 Ackermann 분류법에 따르면, 형태면에서 미리오비데(myoviridae) 과(family) 카우도비랄레스(Caudovirales) 목(order) 으로 분류되었다(도 2). 꼬리 길이 및 폭은 각각 113 ± 6 / 124 ± 6 nm (mean ± SD) (n = 10) 및 14 ± 3 / 18 ± 1 nm (n = 10)이고, 머리 직경은 41 ± 3 / 63 ± 3 nm (n = 10)이였다.
According to PAH1-C and C-PAH6 is Ackermann classification, in the form of cotton were pre-classified into five bidet (myoviridae) and (family) kawoodo Bilal less (Caudovirales) neck (order) (Fig. 2). The tail length and width were 113 ± 6/124 ± 6 nm (mean ± SD) (n = 10) and 14 ± 3/18 ± 1 nm (n = 10) respectively and the head diameter was 41 ± 3/63 ± 3 nm (n = 10).
아에로모나스Aeromonas 히드로필라에Hydropila 대한 About PAH1PAH1 -C 및 -C PAH6PAH6 -- C 의Of C 효능효과 검정 Effectiveness test
1) 숙주 세포 용균 테스트1) Host cell lysate test
PAH1-C 및 PAH6-C 의 박테리아 용균 활성도를 아에로모나스 히드로필라 AH16배양물을 대상으로 테스트하였다(도 3). 아에로모나스 히드로필라 AH16 배양물이 PAH1-C 및 PAH6-C 으로 감염되지 않았을 때(control), OD600 값은 인큐베이션 동안 계속해서 증가하였다. 그러나, PAH1-C 및 PAH6-C 감염 후 24시간 경과하는 동안, MOI 0.01, 1 및 100 에서는 아에로모나스 히드로필라 AH16의 생존이 현저히 억제되었다. Bacterial lysing activity of PAH1-C and PAH6-C was tested on cultures of Aeromonas hydropila AH16 (Fig. 3). Time to remain on Pseudomonas dihydro pillar AH16 cultures are not infected with PAH1-C and PAH6-C (control), OD 600 value was increased continuously during the incubation. However, during the 24 hours after infection with PAH1-C and PAH6-C, the viability of Aeromonas hydropila AH16 was significantly inhibited at MOIs of 0.01, 1, and 100.
2) 2) 아에로모나스Aeromonas 히드로필라에Hydropila 감염된 Infected 실험어를Experimental words 통한 파지의 치료 효과 검정 Therapeutic effect of phage through
아에로모나스 히드로필라 AH16만 접종한 군은 3일 이내에 전량 폐사하였으며, PAH1-C 및 PAH6-C로 치료를 시도한 군에서는 폐사의 지연 내지 폐사율 감소가 관찰되었다. 아울러, PAH6-C 가 PAH1-C 보다 아에로모나스 히드로필라 감염성 질병 억제 효과가 우수한 것을 알 수 있었다(도 4).
The group inoculated with Aeromonas hydropila AH16 died within 3 days, and in the group treated with PAH1-C and PAH6-C, there was a delay or a decrease in mortality. In addition, it was found that PAH6-C was superior to PAH1-C in inhibiting aeromonas hydropila infectious disease (Fig. 4).
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