KR101458272B1 - 레티노이드 및 Ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－말단 억제제를 포함하는 암세포 성장 억제제 - Google Patents
레티노이드 및 Ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－말단 억제제를 포함하는 암세포 성장 억제제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 레티노이드와 p38 키나제 억제제 또는 C-Jun N-말단 억제제를 포함하는 암세포의 성장 억제제에 관한 것으로, 상기 암세포 성장 억제제 투여시 메트릭스 메탈로프로테이나제의 발현과 활성이 증가하고 암세포의 성장을 억제하는 효과가 뛰어나 암세포의 성장을 억제하는 의약품으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 레티노이드와 p38 키나제 억제제, C-Jun N-말단 억제제를 포함하는 암세포의 성장 억제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 암세포 성장 억제제 투여시 메트릭스 메탈로프로테이나제의 발현과 활성이 증가하는 암세포 성장 억제제에 관한 것이다.
레티노이드는 비타민 A의 구조적 유사체이고, 천연 화합물 및 합성 화합물 둘 다를 포함한다. 올-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid, 'ATRA'), 9-시스-레티노산, 트랜스-3,4-디데하이드로레티노산, 4-옥소 레티노산, 13-시스-레티노산 및 레티놀과 같은 레티노이드 화합물은 수많은 염증, 면역 및 구조 세포에 영향을 주는 다형질발현성 조절 화합물이다.
상기 레티노이드 중 레티노산은 연골과 골격 형성에 중요한 조절자로 알려져 있고 폐암, 유방암, 두경부암, 혈구암을 포함한 다양한 종류의 암치료에 있어 효과적인 화학 요법 물질의 파생물로 알려져 있다(Kakizuka A. et al., Cell, 1991, vol. 66, p663-671). 또한 레티노산은 폐암, 유방암, 백혈병, 횡문근육종을 포함한 여러 종류의 암에서 세포의 성장과 증식을 억제한다고 보고되었다(Sun SY et al., Cancer Res, 1997, vol. 57, p4931-4939). 하지만 항암제로서 레티노이드는 다른 항암제에 비해서 치료효율이 낮아 보다 높은 치료효율을 갖는 항암제가 필요하다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 기존의 암세포 성장 억제제보다 향상된 암세포 성장 억제제를 제공하는 것이다. 본 발명은 암세포에서 레티노이드와 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소 조절제의 동시 투여로 기존 레티노이드 단독 투여보다 높은 효과의 암세포 성장 억제제를 제공한다.
본 발명자는 레티노이드보다 높은 치료효율의 암세포 성장 억제제를 연구하던 중, 암세포에 레티노이드를 투여했을 때 메트릭스 메탈로프로테이나제의 조절제로서 작용하고, 또한 상기 레티노이드가 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소 신호전달 경로의 활성을 감소시키는 것을 발견했다. 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)는 세포의 성장, 분화, 사멸 등 거의 모든 생리현상에 핵심적인 역할을 하는 중요한 신호전달 단백질로서 암세포의 성장에 중요한 역할을 한다. 상기 결과를 통해 항암효과가 입증된 레티노이드와 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소 조절제로 p38 키나제 억제제와 C-Jun N-말단 키나제 억제제의 동시투여가 레티노이드 또는 상기 억제제 중 하나의 투여보다 높은 효율로 암세포 성장을 억제할 수 있을 것으로 판단하고 이에 대한 연구를 계속했다. 상기 연구의 결과, 기존 레티노이드 단독 투여보다 레티노이드와 상기 억제제의 동시 투여가 높은 효율의 암세포 성장 억제 효과를 갖는 것을 놀랍게도 발견했다.
본 발명의 암세포는 특별히 한정되지 않지만 섬유육종, 폐암, 유방암, 백혈병, 횡문근육종, 난소암, 간암, 췌장암, 전립선암 등의 암세포를 들 수 있다. 상기 섬유육종은 악성종양으로 신체의 어떤 부위에도 발생할 수 있으며, 상기 섬유육종의 예는 특별히 한정되지 않지만 HT1080을 포함한다.
레티노이드는 4개의 이소프레노이드 단위가 헤드-투-테일(head-to-tail)식으로 연결된 골격을 가지는 화합물군 중 하나이다. 비타민A는 레티놀의 생물학적 활성을 정성적으로 가리키는 레티노이드의 일반적인 용어이다. 본 발명의 레티노이드는 암세포의 성장과정에서 메트릭스 메탈로프로테이나제의 발현과 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 레티노이드는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 레티놀(retinol), 레티날(retinal), 레티노산(retinoic acid), 레티놀과 지방산의 에스터, 지방족알코올과 레티노산의 에스터 등의 레티노이드 유도체, 및 비타민A 유사체(analog)를 이용할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "p38 키나제 억제제"는 p38 키나제를 표적으로 하거나, 저하시키거나 억제하는 화합물에 관련된다. p38 키나제는 사이토카인(cytokine)이나 자외선처리, 열충격, 삼투압충격 등 스트레스 자극에 반응하는 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소로 세포 분열과 사멸에 관여한다. p38 키나제 억제제의 예는 특별히 한정되지 않지만 하기 화학식 1로 표시되는 SB203580가 특히 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "C-Jun N-말단 키나제(JNK) 억제제"는 C-Jun N-말단 키나제를 표적으로 하거나, 저하시키거나 억제하는 화합물에 관련된다. 세린-지정 단백질 키나제인 JNK는 c-Jun 및 ATF2의 인산화 및 활성화에 관여하고, 대사, 성장, 세포 분화 및 아팝토시스에서 중요한 역할을 한다. JNK 키나제 억제제의 예는 특별히 한정되지 않지만 하기 화학식 2로 표시되는 피라졸안트론이 특히 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "메트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix Metalloproteinases)"는 아연 의존성의 효소군으로 특이적인 구조를 가지며, 촉매의 성질이 있어 종양의 침윤과 전이 과정에 중요한 역할을 한다. 메트릭스 메탈로프로테이나제 체계는 태아 발달, 장기 형성, 신생혈관 형성, 뼈 성장, 연골 개조 등 신체의 결합조직 재구성을 조절하는 다양한 과정에 참여한다. 그러나 종양과 같은 병적인 상태에서는 메트릭스 메탈로프로테이나제 체계의 조절 기능이 파괴되어 광범위한 세포외 기질의 분해, 재구성 등이 발생하게 된다. 메트릭스 메탈로프로테이나제는 분해하는 각각의 기질 종류에 따라서 메트릭스 메탈로프로테이나제-1/메트릭스 메탈로프로테이나제-8/메트릭스 메탈로프로테이나제-13/메트릭스 메탈로프로테이나제-18(interstitial collagenases), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2/메트릭스 메탈로프로테이나제-9(gelatinases), 메트릭스 메탈로프로테이나제-3/메트릭스 메탈로프로테이나제-10(stromelysins), 엘라스타아제(elastases), 막타입 메트릭스 메탈로프로테이나제(membrane-type MMP)로 분류할 수 있으며, 이들 중 젤라티나아제(gelatinases)인 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2가 종양의 침윤과 전이에 있어서 핵심적인 중요 조절자로 알려져 있다. 메트릭스 메탈로프로테이나제의 예는 특별히 한정되지 않지만 메트릭스 메탈로프로테이나제-2, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "암세포 성장 억제제"는 암의 성장에 관계되는 세포의 물리적, 화학적 및/또는 생리적인 작용 등을 직접 또는 간접적으로 억제하는 어떠한 약물일 수 있다. 상기 약물 중 항암제가 치료 효과 등의 측면에서 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 메트릭스 메탈로프로테이나제의 조절제로 레티노이드 및 유사분열물질-활성화 단백질 인산화효소 조절제로 p38 키나제 억제제 또는 C-Jun N-말단 키나제 억제제를 병용하여 기존 레티노이드 단독 투여시보다 높은 효율의 암세포 성장 억제 효과를 나타내었다.
도면 1은 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 레티노산의 농도를 0, 10, 20, 30, 50 μM로 다양하게 처리하여 위상차 현미경으로 관찰한 사진이다.
도면2는 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 레티노산의 농도를 0, 10, 20, 30, 50 μM로 다양하게 처리하여 세포증식 정도를 MTT 어세이를 통해 확인한 그래프이다.
도면 3은 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM를 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 것과 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 젤라틴 자이모그래프를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)와 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)의 활성 정도를 확인한 결과이다.
도면 4는 도3의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 5는 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM를 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 것과 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 웨스턴블럿 분석를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)와 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 액틴(Actin)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 6은 도5의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 7은 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM을 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 후 웨스턴블럿 분석을 통해 p38 키나제와 pp38 키나제, pJNK, C-Jun N-말단 키나제(JNK)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 8은 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 웨스턴블럿 분석을 통해 p38 키나제와 pp38 키나제, pJNK, C-Jun N-말단 키나제(JNK)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 9는 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 레티노산만 50μM 처리한 것, 레티노산 50μM과 p38 키나제 억제제인 SB203580(SB)을 처리한 것, 레티노산 50μM와 C-Jun N-말단 키나제 억제제인 SP600125(SP)를 처리한 것을 젤라틴 자이모그래프를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 활성 정도를 확인한 결과이다.
도면 10은 도9의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 11은 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 레티노산만 50μM 처리한 것, 레티노산 50μM과 p38 키나제 억제제인 SB203580을 처리한 것, 레티노산 50μM와 C-Jun N-말단 키나제 억제제인 SP600125를 처리한 것을 웨스턴블럿 분석을 통해 pp38 키나제, pJNK, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), 액틴(Actin)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 12는 도10의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면2는 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 레티노산의 농도를 0, 10, 20, 30, 50 μM로 다양하게 처리하여 세포증식 정도를 MTT 어세이를 통해 확인한 그래프이다.
도면 3은 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM를 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 것과 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 젤라틴 자이모그래프를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)와 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9)의 활성 정도를 확인한 결과이다.
도면 4는 도3의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 5는 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM를 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 것과 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 웨스턴블럿 분석를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)와 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 액틴(Actin)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 6은 도5의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 7은 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM을 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간 동안 처리한 후 웨스턴블럿 분석을 통해 p38 키나제와 pp38 키나제, pJNK, C-Jun N-말단 키나제(JNK)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 8은 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 0, 10, 20, 30, 50μM를 처리한 한 후 웨스턴블럿 분석을 통해 p38 키나제와 pp38 키나제, pJNK, C-Jun N-말단 키나제(JNK)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 9는 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 레티노산만 50μM 처리한 것, 레티노산 50μM과 p38 키나제 억제제인 SB203580(SB)을 처리한 것, 레티노산 50μM와 C-Jun N-말단 키나제 억제제인 SP600125(SP)를 처리한 것을 젤라틴 자이모그래프를 통해 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2)의 활성 정도를 확인한 결과이다.
도면 10은 도9의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
도면 11은 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 레티노산만 50μM 처리한 것, 레티노산 50μM과 p38 키나제 억제제인 SB203580을 처리한 것, 레티노산 50μM와 C-Jun N-말단 키나제 억제제인 SP600125를 처리한 것을 웨스턴블럿 분석을 통해 pp38 키나제, pJNK, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2), 액틴(Actin)의 발현량을 확인한 결과이다.
도면 12는 도10의 처리 결과를 image J 프로그램을 통해 정량화한 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
실시예 1-1
본 실시예에서 사용된 인간 섬유육종 HT1080은 아메리칸 타입 컬처 콜렉션( American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스 소재)에서 구매하였다. 상기 인간 섬유육종 HT1080은 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, 인비트로젠(invitrogen, 캐나다 벌링턴 소재)에서 구매)과 50㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 50units/㎖의 페니실린(penicillin)이 포함된 RPMI-1640(인비트로젠(incitrogen, 캐나다 벌링턴 소재)에서 구매) 배지에 37℃가 유지되는 5% 이산화탄소(CO2) 인큐베이터에서 배양했으며 밀도는 1.2×105 cell/dish의 밀도로 배양했다.
실시예 1-2
실시예 1-1에서 배양된 인간 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 레티노산의 농도를 다르게 처리하여 세포의 모양 변화를 위상차 현미경으로 관찰하였으며 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-닐)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 어세이(assay)를 통해 세포증식 정도를 확인하였다(도 1, 도 2). 상기 MTT 어세이는 하기의 방식으로 진행했다.
실시예 1-1에서 배양된 섬유육종 HT1080을 96웰-플레이트(well-plate)에 웰당 1.2×105셀의 밀도로 분주하여 37℃가 유지되는 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 70~80% 자랐을 때 레티노산을 처리하여 24시간 동안 배양하였으며, 배양 후 MTT 시약 Ⅰ(10㎎/㎖)를 웰당 10㎕씩 처리하여 4시간 배양하였다. 그 후 다시 MTT 시약 Ⅱ를 웰당 100㎕씩 처리하여 12시간 배양한 후 ELISA reader를 이용하여 550~600nm의 흡광도값을 측정하였다. 상기 MMT 시약 Ⅱ는 10% SDS(도데실 황산 나트륨, Sodium dodecyl sulfate)와 0.01 N 염화수소(HCl), 디메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)를 혼합한 용액이다.
상기 섬유육종 HT1080에 24시간 동안 레티노산의 농도를 0, 10, 20, 30, 50 μM로 다양하게 처리하여 확인한 결과 레티노산 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되는 것이 위상차 현미경으로 관찰되었다(도 1). 이에 세포증식 정도를 상기 MTT 어세이를 통해 확인한 결과 레티노산 처리 농도 의존적으로 세포의 증식이 억제되었으며, 특히 레티노산 50μM에서의 세포의 증식이 50%정도 억제됨을 확인하였다(도 2).
실시예 1-3
실시예 1-1에서 배양된 섬유육종 HT1080에 레티노산을 시간과 농도를 다양하게 처리한 후 메트릭스 메탈로프로테이나제의 활성 정도를 젤라틴 자이모그래프(Gelatin zymography)를 통해 확인하였다. 상기 젤라틴 자이모그래프는 하기의 방식으로 진행된다.
상기 젤라틴 자이모그래프는 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum, 인비트로젠(invitrogen, 캐나다 벌링턴 소재)에서 구매)이 포함된 RPMI-1640(인비트로젠(incitrogen, 캐나다 벌링턴 소재)에서 구매)를 이용하여 섬유육종 HT1080을 부착시킨 후 2% 소태아혈청이 포함된 RPIM-1640으로 교환하여 12시간 배양하였다. 세포가 70~80% 자랐을 때 2% 소태아혈청이 포함된 RPMI-1640을 이용하여 레티노산을 처리하였다. 24시간 후 상등액만을 따로 모아 0.1%의 젤라틴(gelatin)이 함유된 SDS-폴리아크릴아미드 겔(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동하여 단백질들을 크기별로 분리하였다. 그 후 2.5% 트리톤(triton) X-100에 30분씩 3번 씻은 후 증류수로 씻어주어 SDS를 제거하였으며 5mM 염화칼슘(CaCl2), 0.2M 염화나트륨(NaCl), 50mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris-(hydroxymethyl)-aminomethane)가 함유된 젤라틴 인큐베이션 버퍼(pH7.5)에 담가 20~24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 70rpm으로 쉐이킹하여 반응시켰다. 반응 후 겔을 쿠마시블루 용액으로 염색하였다.
또한 상기 섬유육종 HT1080에 메트릭스 메탈로프로테이나제의 발현량을 웨스턴블럿 분석(Western blot analysis)를 수행하였다. 먼저 단백질의 정량분석을 위해 50mM 트리스-염화수소(Tris-HCl) pH 7.4, 150mM 염화나트륨, 1% SDS가 함유된 세포 라이시스 버퍼(세포용해제)(cell lysis buffer)에 단백질 분해효소 억제제(10㎍/㎖ 아프로티닌, 10㎍/㎖ 류펩틴, 10㎍/㎖ 펩스타틴, 1mM 4-(2-아미노에틸) 벤젠셀포닐 플루오라이드)와 인산 분해효소 억제제(1mM 소듐 오르토 바나데이트(sodium orthovanadate), 1mM 플루오르나트륨)를 첨가하여 세포 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 SDS-폴리아크릴 아미드 겔에 전기영동하여 크기별로 분리하였으며, 이를 니트로 셀룰로오즈 막으로 이동시켰다. 그 후 각 단백질 발현의 분석을 위하여 각 단백질에 특이적인 항체인 메트릭스 메탈로프로테이나제-9(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매), 메트릭스 메탈로프로테이나제-2(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매), pp38 키나제(미국 매사추세츠주 댄버스 소재 셀 시그널링 테크놀로지에서 구매), p38 키나제(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매), pJNK 키나제(미국 매사추세츠주 댄버스 소재 셀 시그널링 테크놀로지에서 구매), C-Jun N-말단 키나제(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매), 액틴(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재 산타 크루즈 바이오 테크놀로지에서 구매)을 사용하였다.
실시예 1-1에서 배양된 섬유육종 HT1080에 레티노산 50μM을 0분, 10분, 30분, 1시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간별로 처리하여 메트릭스 메탈로프로테이나제 활성을 확인한 결과 시간 의존적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 활성이 증가하였으며, 레티노산을 0, 10, 20, 30, 50μM농도로 24시간 처리하여 확인한 결과 농도 의존적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 발현량이 증가함을 확인하였다(도3). 도면 3을 image J 프로그램을 이용하여 그래프로 정량화하였다(도4). 메트릭스 메탈로프로테이나제-2, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9의 발현 정도를 상기 웨스턴블럿 분석을 통해 확인한 결과 레티노산 50μM에서 시간 의존적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제-2, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9의 발현량이 증가하였으며, 농도 의존적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제-2, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다(도5). 상기 웨스턴블럿 분석을 수행하여 얻은 결과값은 image J 프로그램을 통해 수치화하였다(도6). 결과적으로, 레티노산은 섬유육종 HT1080에서 시간과 농도 의존적으로 메트릭스 메탈로프로테이나제-2, 메트릭스 메탈로프로테이나제-9의 활성과 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.
실시예 2-1
실시예 1-1에서 배양된 섬유육종 HT1080에서 레티노산 50μM을 다양한 시간별로 처리하여 실시예 1-3에서 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과 시간 의존적으로 p38 키나제와 C-Jun N-말단 키나제의 활성이 감소함을 확인할 수 있었다(도7). 레티노산의 농도를 0, 10, 20, 30, 50μM로 점차 증가시켜 24시간 동안 처리한 결과, 농도 의존적으로 p38 키나제와 C-Jun N-말단 키나제의 활성이 감소함을 확인할 수 있었다(도8). 반면, ERK의 활성과 농도에 비의존적인 활성을 보였다.
상기 실험의 결과, 레티노산과 p38 키나제, C-Jun N-말단 키나제 억제제를 함께 사용시 메트릭스 메탈로프로테이나제의 활성이 더 증가할 것이라는 가설을 가지고 다음을 진행하였다.
레티노산과 p38 키나제의 활성 억제제인 SB203580(SB)과 C-Jun N-말단 키나제의 활성 억제제인 SP600125(SP)를 처리하여 메트릭스 메탈로프로테이나제-2와 메트릭스 메탈로프로테이나제-9의 활성과 발현 정도를 실시예 1-3에서 사용한 젤라틴 자이모그래프와 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다. 젤라틴 자이모그래프를 수행한 결과 섬유육종 HT1080에 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 레티노산 50μM 단독 처리시 메트릭스 메탈로프로테이나제-9, 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 활성이 2배 이상 증가하였고, SP600125와 SB203580을 함께 처리하여 p38 키나제와 C-Jun N-말단 키나제를 억제시켰을 때 레티노산 단독처리보다 약 1.6배 많이 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 활성이 증가함을 확인할 수 있었다(도9). 웨스턴블럿 분석을 수행한 결과 또한 섬유육종 HT1080에 어떤 시약도 처리하지 않은 대조군과 비교하여 레티노산 50μM 단독 처리시 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 발현량이 2배 이상 증가하였고, SB203580과 SP600125를 함께 처리하여 p38 키나제와 C-Jun N-말단 키나제의 활성을 저해시켰을 때 레티노산 단독 처리보다 약 1.6배 많이 메트릭스 메탈로프로테이나제-9와 메트릭스 메탈로프로테이나제-2의 발현량이 증가함을 알 수 있었다(도 11). 상기 젤라틴 자이모그래프와 상기 웨스턴블럿 분석의 결과를 image J 프로그램을 이용하여 그래프로 나타냈다(도10, 도12).
이와 같이 암세포에 레티노산, 및 SB 또는 SP를 투여했을 때 레티노산 단독 처리보다 높은 효율의 항암 작용을 나타냄을 알 수 있다.
Claims (8)
- 레티노산 및 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하는 섬유육종 암세포 성장 억제제:
화학식 2.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 암세포 성장 억제제 투여시 메트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix Metalloproteinases)의 발현 또는 활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 섬유육종 암세포 성장 억제제.
- 제5항에 있어서, 상기 메트릭스 메탈로프로테이나제가 메트릭스 메탈로프로테이나제-2 또는 메트릭스 메탈로프로테이나제-9인 섬유육종 암세포 성장 억제제.
- 삭제
- 삭제
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| JP2006507327A (ja) * | 2002-07-16 | 2006-03-02 | ユニバーシティ オブ メディスン アンド デンティストリー オブ ニュー ジャージー | α５β１およびその細胞生存経路を調節する能力 |
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2012
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