KR101451874B1

KR101451874B1 - 실시간 ｐｃｒ을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법

Info

Publication number: KR101451874B1
Application number: KR1020130021469A
Authority: KR
Inventors: 오세욱; 하수정; 임구상; 장혜진
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2014-10-16
Also published as: KR20140107013A

Abstract

본 발명은 실시간 PCR을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 먼저 특정 미생물의 실시간 PCR의 검출한계 값을 알아낸 후, WGA를 실시하여 시간별 DNA 농도의 그래프를 작성하여 WGA 시간(X)별 DNA 농도(Y) 함수로 나타낸 다음, 상기 검출한계 값을 상기 함수 Y에 대입하여 WGA의 최단시간을 구하고, 특정 미생물을 WGA의 최단시간 동안 실시하고 실시간 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 PCR을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법에 관한 것이다.

Description

실시간 ＰＣＲ을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법 {Methods for the fastest detection of microorganism using real-time PCR}

클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)는 그람양성, 편성혐기성, 열, 방사선, 화학적 소독제에 대한 저항성이 큰 내생포자 및 독소를 생성하는 간균으로서 항생제 관련 대장염(antibiotics-associated colitis) 환자에서 발생하는 설사와 위막성 대장염(pseudomembranous colitis), C. difficile에 의한 설사(Clostridium difficile associated diarrhea, CDAD)의 주요한 원인균이다 (Boer, E. et al., Int . J. Food Microbiol. 144: 561564 (2011)). 장내에 상재균으로 존재하며 건강한 성인의 경우 2% 정도이지만 노인과 1개월 이내 신생아의 경우 10-20%의 높은 비율로 존재하며 숙주의 면역이 약할 경우 발병이 되는 기회감염균으로 작용한다. C. difficile은 두 종류의 장독소(enterotoxin)인 톡신 A와 세포독소(cytotoxin)인 톡신 B를 생성하여 병원성을 나타낸다. 톡신 A는 주로 장관 내 상피세포를 손상시켜 출혈을 일으키고, 톡신 B는 뚜렷한 장독소의 활성을 보이지 않음에도 불구하고 톡신 A 보다 100배 이상의 강한 세포 독성을 나타낸다 (Lee, J.Y. et al., J. of Bacteriol . Virol. 35: 217-226 (2005)).

병원성 C. difficile는 분쇄육에서 분리됨에 따라 식중독의 잠재적인 원인으로 인정되고 있지만 식품관련 연구는 한정된 시료인 분쇄육에서의 모니터링 결과만 보고되고 있다. Rodriquez-Palacios 등은 소매점에서 구매한 60개의 분쇄육에서 12(20%)개의 C. difficile를 분리하였고 (Rodriguez-Palacios, et al., Emerg . Infect . Dis. 13: 485-487 (2007)), Bouttier 등의 연구에서는 C. difficile가 돼지고기 소시지 시료에서는 검출되지 않았지만, 분쇄 쇠고기 105개에서 2(1.9%)개를 분리하였다 (Bouttier, S. et al., Emerg . Infect . Dis. 16: 733-735 (2010)). 또한 Songer 등은 88개 시료에서 37(42%)개를 분리하여 높은 검출률을 보였다 (Songer, J.G. et al., Emerg . Infect . Dis. 5: 819821 (2007)). 그 외 돼지, 소, 닭 등 사람이 식육하는 고기에서도 분리된다고 보고되고 있다.

현재 식품공전법(식품의약품안전청 2012)에는 미생물 검출을 위한 표준방법인 전통적인 배지법이 등재되어 있으나, 배지법은 증균(enrichment)배양, 분리배양, 확인시험, 혈청시험 등의 과정으로 이루어져 있어 장시간이 요구된다. 또한 선택배지를 이용한 방법은 미생물을 분리하는 표준방법(golden standard)이지만 많은 시간과 노동력을 필요로 하고 민감도가 낮기 때문에 비효율적인 검출법으로 알려져 있다 (Hyeon, J.Y et al., Korean J. Food Sci . Ani . Resour. 29: 506-512 (2009)). 따라서 최근에는 이러한 단점을 최소화하기 위하여 래터럴플로시스템(lateral flow system) 등의 면역학적 방법, 전기전도도 이용방법, DNA를 이용하는 중합효소연쇄반응(PCR) 방법 등이 다양하게 개발되어 이용되고 있다 (Shearer, A.E et al., J. Food Protect. 64: 788-795 (2001)).

미생물 검출법은 각각의 방법에 따라 검출에 필요한 최소한의 균 농도를 요구하고 있으며 이를 검출한계라고 한다. 식중독균은 식품에 매우 소량으로 존재하기 때문에 대부분이 검출한계 보다 낮은 값을 나타내며 따라서 미생물 균수를 증가시키는 증균 과정을 반드시 필요로 한다.

따라서 식중독균을 신속하게 검출하기 위해서는 낮은 검출한계를 가지는 방법이 유리하다. 이는 검출한계까지 미생물 수를 증가시키는 시간을 단축시킬 수 있기 때문이다. 현재까지 미생물 측정 방법 중 가장 낮은 검출한계를 가지는 것이 실시간 PCR(real-time PCR) 방법이라고 할 수 있으며 일반적으로 배지상태에서 10¹~10³ cfu/mL 수준을 검출한계를 가진다 (Arvind, A. et al., J. Food Microbiol. 84: 217224 (2003)). 낮은 검출한계 이외에도 또한 증폭 산물을 전기영동으로 확인할 필요가 없어, 간편하고 신속하게 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 오염 위험이 낮기 때문에 최근에는 기존의 PCR 법으로 검출하던 유전자 검사가 실시간 PCR로 대체되고 있다 (Lee, H.M. et al., Koeran J. Apiculture 20: 109-116 (2005)). 클로스트리듐 디피실리는 분쇄육에 미량 존재하는 것으로 알려져 있기 때문에 어떠한 키트를 사용하여도 바로 검출할 수 없으며 따라서 증균 과정이 필요하다. 이처럼 식품에 미량 존재하는 미생물의 신속 검출에는 검출한계 이상으로 배양하는 과정이 반드시 필요하며 일반적으로 약 8시간 이상 소요된다 (Catarame, T.M.G. et al., J. Food Safety 26: 1-15 (2006)).

WGA(whole genome amplification)는 랜덤 프라이머가 주형 DNA의 여러 곳에 어닐링(annealing)하여 동시다발적으로 DNA를 대량으로 증폭하게 되는 기작으로서, Phi29 DNA 중합효소를 이용하면 30℃에서 대량의 DNA 증폭이 가능하다 (Handyside, A.H. et al., Mol . Hum . Reprod. 10: 767772 (2004)). Phi29 DNA 중합효소를 이용한 증폭은 동일 온도조건에서 반응되기 때문에, 써멀 사이클러(thermal cycler)와 같은 장비가 필요 없다는 것이 큰 장점이다. 또한 다양한 시료(single cell, blood card, buccal swab, soil, plant, formaline-fixed paraffin-embedded tissue 등)의 극소량(nano gram) DNA를 증폭하여 10 μg 이상의 전체게놈 DNA를 얻을 수 있다 (Geigl, J.B. et al., Nucleic Acids Res. 37: 105 (2009)).

미생물의 신속 검출방법에서 가장 큰 시간이 소요되는 것이 증균 배양시간이며 따라서 이 시간을 단축시키는 것이 가장 효율적인 신속 검출법이라고 할 수 있다. 그러므로 식품에 극소량 존재하는 식중독균을 실시간 PCR로 검출하기 위하여, 미생물 증균 과정을 거쳐 검출한계까지 균수를 증가시켜 DNA를 분리하여 검출할 수 있다. 또는 미생물 증균 과정 없이 게놈 DNA를 검출한계까지 증가시키면 실시간 PCR에 의한 검출이 가능할 것으로 생각된다. 따라서 본 발명에서는 미생물 증균 과정을 대신하여 WGA를 이용하여 미량의 DNA를 신속하게 증폭시켜 실시간 PCR에 의한 검출 가능성을 타진하고자 하였으며 최종적으로 미생물 증균 과정을 신속한 DNA 증폭 과정으로 대체하여 검출시간이 대폭적으로 감소된 신속검출 기술을 개발하고자 하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 병원성 미생물이 극소량으로 존재하는 시료로부터 최단시간으로 식중독균을 검출할 수 있는 실시간 PCR을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 실시간 PCR을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법을 제공한다:

a) 10진 희석된 연속적인 미생물 농도에서 DNA를 추출한 후, 실시간 PCR을 실시하여 특정 미생물의 실시간 PCR의 검출한계 값을 알아내는 단계;

b) 상기 실시간 PCR에서 검출되지 못한 미생물 농도의 DNA를 이용하여 WGA(whole genome amplification)을 실시하여 WGA 시간별 DNA 농도의 그래프를 작성하는 단계;

c) 상기 그래프를 WGA 시간(X)별 DNA 농도(Y) 함수로 나타낸 후, 상기 검출한계 값을 상기 함수 Y에 대입하여 WGA의 최단시간을 구하는 단계; 및

d) 상기 미생물을 상기 WGA의 최단시간동안 WGA를 실시한 후 실시간 PCR을 수행하는 단계.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 a) 단계는 특정 미생물에 대하여 시료 내 포함된 미생물의 DNA 농도가 실시간 PCR 검출한계 보다 낮은 지를 결정하는 단계로서, 실시간 PCR로 검출되지 못하는 DNA 농도를 포함하는 시료가 본 발명의 분석대상이 될 수 있다.

상기 a) 단계에 따른 하나의 예로서, 실시예에서는 식중독 균의 하나인 클로스트리듐 디피실리를 대상으로 10진 희석된 미생물 농도에 대하여 실시간 PCR을 이용하여 검출 가능성을 타진한 결과, 표 4와 같이 1.16×10¹ cfu/ml 수준까지 타겟 유전자가 37.24 사이클(Ct, Threshold value) 만에 증폭이 되는 것으로 나타나 검출이 가능하였으며, 표 5에 표시한 바와 같이, 검출한계 값은 1.16×10¹ cfu/ml이다. 실시간 PCR에서 Ct 값을 Y축에 배열하였을 때 기울기는 -3.3665 이며 증폭효율은 98.17%로 나타난다. 따라서 클로스트리듐 디피실리는 분석 시료 중 ml 당 11.6개의 세포 이하인 경우 본 발명의 분석대상이 될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 b) 단계는 실시간 PCR 검출 한계값 이하의 미생물 DNA를 WGA를 이용하여 증폭하는 단계로서, WGA를 이용하여 DNA 농도를 높이면 실시간 PCR에 의해 검출이 가능하다.

상기 b) 단계에 따른 하나의 예로서, 실시예에서는 검출이 되지 않았던 DNA 농도인 1.16×10⁰ cfu/ml 수준의 미생물 농도에서 분리한 DNA를 WGA로 증폭시켜 검출이 가능한 미생물 농도인 1.16 x 10¹ cfu/ml에서 분리한 DNA 농도인 308 μg/ml로 증가시키는데 필요한 시간을 계산하고자 하였다. WGA를 수행하면서 증폭된 DNA 농도(Y) 함수로 나타낸다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 c) 단계는 WGA 수행 시간에 따른 DNA 농도 변화 함수로부터 실시간 PCR 검출 한계값에 이르는 WGA 최단시간을 구하기 위한 단계이다. 보통 시료를 처리할 때는 10배의 희석 조건에서 미생물을 분리하므로 예들 들어, 25 g 시료에 1개의 클로스트리듐 디피실리가 존재한다고 가정하면 희석액을 포함하여 250 g에 1개의 세포가 존재하게 되며 여기에서 DNA를 분리하여 농도를 계산하면 3×10^-8 μg/ml이 된다. 이 농도는 검출한계 이하이므로 WGA를 이용하여 검출한계인 3×10² μg/ml까지 DNA 증폭이 일어나야 검출이 가능하다 (도 7 참조). 이를 도 6인 WGA 증폭곡선에 대입하여 증폭이 필요한 시간을 계산하면 32초 이상으로 나타난다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 미생물은 종래 배양과정(enrichment) 후 실시간 PCR로 검출할 수 있었던 모든 미생물이 검출 대상이 될 수 있으므로 특별히 검출 대상 미생물에 있어서 제한은 없지만, 통상적인 식품미생물 시험법에 나오는 바와 같이, 25 g 시료에서 검출되지 않아야 할 정도로 식품에 낮은 농도 (즉, 25 g에 1개의 세포가 존재한다면 0.04 cfu/g의 농도)로 존재하고 신속한 검출을 필요로 하는 식중독균을 검출 대상으로 하는 것이 적절하다. 바람직하게는 식품에 10^-3 내지 10¹ cfu/g 농도로 존재하는 식중독균 중 대표적인 클로스트리듐 디피실리이다.

종래 알려져 있는 미생물 검출은 그 방법에 따라 검출에 필요한 최소한의 균 농도인 ‘검출한계’ 이상으로 높이는 과정에서 상당한 시간이 소요되는 단점이 있다. 특히 식중독균의 경우 식품에 극히 소량으로 존재하기 때문에 대부분이 검출한계 보다 낮은 균 농도를 나타내기 때문에 미생물 균수를 증가시키는 과정으로 배양과정(enrichment)에서 많은 시간이 소요되고 있다. 현재까지 미생물 검출 방법 중 가장 낮은 검출한계를 갖는 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하더라도, 일반적으로 식품에 미량으로 존재하는 미생물의 검출은 검출한계 이상으로 배양하는 과정을 포함해 대략 8시간 이상 소요되는 것으로 알려져 있다 (Catarame, T.M.G. et al., J. Food Safety 26 :1-15 (2006)).

본 발명의 미생물의 최단시간 검출방법은, 상술한 종래 검출방법들에서 긴 시간이 소요되었던 미생물 배양과정을 WGA로 대체하고 그에 따라 특정 미생물에 대한 WGA의 최단시간을 구함으로써 미생물 검출에 소요되는 시간을 획기적으로 줄일 수 있다.

본 발명에서, 상기 WGA의 최단시간은 하기 식 1로 표시되는 함수를 통해 구할 수 있다.

[식 1]

여기서, X는 WGA 시간이고 Y는 DNA 농도이다.

본 발명에서, 상기 식 1은 도 6에 나타난 WGA를 이용한 실시간 PCR에 의해 DNA 농도가 증폭되는 그래프로부터 산출된 것이다. 즉, WGA와 미생물 성장에 의한 증폭 간의 속도를 비교하기 위하여 WGA도 변형곰펄츠 모델을 사용하여 상기 식 1을 모델링 하였다. 이렇게 함으로서 유도기와 증식속도를 구할 수 있다.

상술한 바와 같이, 실시간 PCR과 같은 분자생물학적 방법을 활용하여 클로스트리듐 디피실리를 환자의 검체에서 분리하는 연구는 보고되고 있으나 식품에서 분리하는 방법에 대해서는 아직까지 연구가 보고되지 않고 있다. 또한 종래 배지를 이용한 검출방법은 식품에 자연적으로 존재하는 상재균이 높은 수준으로 존재할 경우 고기, 야채에 존재하는 미량의 식중독균의 검출이 어려운 것으로 알려져 있다 (Shin, B.M. et al., Korean J. Lab Med. 26: 27-31 (2006)). 따라서 DNA의 특이성을 이용한 분자생물학적 검출 방법인 실시간 PCR과 분자 증폭방법인 WGA 방법은 식품에 존재하는 식중독균에 대한 고유의 선택성을 가지고 있어 미량으로 존재하는 클로스트리듐 디피실리 균을 정확하고도 빠르게 검출할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 특정 미생물의 실시간 PCR 검출한계치를 WGA 시간별 DNA 농도로 표시되는 그래프 또는 그 대응식에 대입시킴으로써 WGA의 최단시간을 산출할 수 있고, 이렇게 산출된 WGA 최단시간 동안 WGA를 실시한 후 실시간 PCR을 수행하여 특정 미생물을 최단시간에 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 식중독균이 극미량으로 존재하는 식품에서 특정 미생물을 최단시간에 검출할 수 있기 때문에, 식품 생산, 유통, 관리 분야에서 매우 유용하게 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 실시간 PCR 방법의 요약도이다.
도 2는 WGA(whole genome amplification) 방법의 요약도이다.
도 3은 BHI 배지에서 미생물의 성장곡선 및 실시간 PCR 검출에 필요한 시간을 나타낸다.
도 4는 BHI에서 실시간 PCR을 이용하여 측정된 미생물의 검출한계를 나타낸다.
도 5는 미생물 타겟 유전자의 실시간 PCR 증폭 효율(efficiency)을 나타낸 것이다.
도 6은 WGA를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 DNA의 농도를 나타낸 것이다.
도 7은 WGA를 이용한 실시간 PCR에 대한 증폭 플롯(amplification plot)을 나타낸 것이다 (30초, 1분, 5분 및 10분).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 균주 배양 및 분리

클로스트리듐 디피실리(KCTC 5009)를 BHI 배지(brain heart infusion broth; Oxoid, Hampshire, England)를 이용하여 챔버(Whitley A35 anaerobic chamber; Don Whitley Scientific Ltd., Shipley, UK)에서 혐기적으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 선택배지(selective agar; BD BBL, Sparks, USA)에 도말하여 장파 자외선(long-wave ultraviolet light)에서 녹색/노랑(green/yellow) 형광을 나타내는 단일 콜로니를 분리하여 실험에 사용하였다.

실시예 2. BHI에서의 성장 곡선 모델

실시예 1에서 분리된 클로스트리듐 디피실리를 0.5% 효모추출물, DL-시스테인(DL-cysteine; Sigma-Aldrich), 0.1% 소듐 타우로콜레이트(sodium taurocholate; Sigma-Aldrich)를 넣은 BHI에 1~10 CFU/mL 수준으로 접종하고 37℃에서 배양하면서 매 시간마다 1 mL을 취하여 10진 희석하고 CCFA 배지(cefoxitin-cycloserine fructose agar; Oxoid, Hampshire, England)에 도말하였으며 이를 37℃에서 24시간 배양한 후 균수를 측정하였다.

실시예 3. 곰퍼츠 모델 적용

실시예 2를 통해 얻어진 데이터는 변형된 곰퍼츠(modified Gompertz)에 적용할 수 있는 소프트웨어(GraphPad Prism 4.0 Software; Graphad Software, San Diego, CA, USA) 프로그램을 이용하여 각 증균 배지에 따른 유도기(lag time; LT)와 증식속도(growth rate log; GR)를 구하였다. WGA에 의한 DNA 증폭식도 변형된 곰퍼츠에 적용하여 식을 구하였다.

Equation: Gompertz*

Y = N₀ + C·exp [-exp {(2.718·mue/C)·(lag - X) + 1}]

여기서, N₀: log initial number of cells, C: difference between initial and final cell numbers, lag: delay before growth, same units as X, mue: maximum specific growth rate, X is time, Y is log cell #이다.

실시예 4. 게놈 DNA의 추출

게놈 DNA는 BHI에 배양한 클로스트리듐 디피실리 배양액을 AccuPrep게놈 DNA 추출키트(Bioneer Co., Daejeon, Korea)를 사용하여 제조사에서 제공하는 방법에 따라 추출하였다. 분리된 DNA 량을 측정하기 위하여 분광광도계(spectrophotometer; Gehealtcare, Ultrospec 2100 pro, San Francisco, USA)로 260 nm와 280 nm에서 농도를 측정하여 정량하였다.

실시예 5. 실시간 PCR 조건

하기 표 1에 개시된 PCR 프라이머 세트를 이용하여 각 시료의 PCR 산물을 얻었다. 실시간 PCR을 위한 반응물 조성은 TaqManuniversal Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, USA) 10 μL, DNA 용액 3 μL, 1000 nM 정방향 및 역방향 프라이머 2 μL 씩, 프로브 1 μL (250 nM)로 구성하였다. 96-웰의 마이크로플레이터를 이용하여 StepOne Plus real-time PCR system (Applied Biosystems)에서 실시간 PCR을 수행하였다. 반응 조건은 50℃에서 2분, 95℃에서 10분간 반응시킨 후 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 1 사이클로 하여 총 40 사이클을 반응시켰다 (표 2 참조). Ct(threshold cycle) 값은 StepOne™ software (Applied Biosystems)로 분석하였다.

Target gene	Primer /probe	sequence (5'→3')
tcdB	Forward	GAAAGTCCAAGTTTACGCTCAAT
	Reverse	GCTGCACCTAAACTTACACCA
	Probe	FAM¹ ⁾-ACAGATGCAGCCAAAGTTGTTGAATT-TAMRA² ⁾

¹⁾ FAM, 6-carboxyfluorescein (the reporter dye)

²⁾ TAMRA, 6-carboxytetramethylrhodamine (the quencher dye)

System	UNG incubation	Polymerase activation	PCR
	Hold	Hold	cycle (40 cycles)
	Hold	Hold	Denature	Anneal/extend
Temperature (℃)	50	95	95	60
Time (sec)	120	600	15	60
Reaction volume (μL)	20

실시예 6. WGA 조건

WGA 키트 (SEQ-TempliGen™ WGA kit; SolGent co., Daejeon, Korea)를 사용하여 수행하였으며, 총 반응 용액은 반응 튜브 당 샘플 DNA 1 μL 및 변성버퍼(denaturation buffer) 1 μL을 첨가하여 상온에서 5분간 변성시켰다. 중화버퍼(neutralization buffer) 2 μL, 샘플버퍼(sample buffer) 6 μL, 반응버퍼(reaction buffer) 9 μL, 그리고 효소(enzyme mixture) 1 μL을 첨가하여 최종 볼륨이 20 μL이 되도록 하였으며 증폭 반응은 30℃에서 시간별로, 70℃에서 5분으로 써멀 사이클러(C1000™ Thermal Cycler; Bio-rad Laboratories Inc, CA, USA)에서 수행하였다.

실험결과 1. 배지에서의 성장곡선

클로스트리듐 디피실리는 식품에 낮은 농도로 존재하기 때문에 신속하게 검출하기 위해서는 우선적으로 증균 배지를 이용한 증식이 이루어져야 한다. BHI에 클로스트리듐 디피실리를 인위적으로 접종한 후, 20-30 시간까지 배양하면서 시간에 따라 배양액을 취하여 균수를 측정하여 성장곡선을 작성하였다. 또한 성장예측 모델로 변형 곰퍼츠 식(modified Gompertz equation)을 이용하여 계산하였다 (도 3 참조).

도 3은 BHI 배지에서 클로스트리듐 디피실리의 성장곡선 및 실시간 PCR 검출에 필요한 시간을 나타낸다. 샘플 25 g 당 1 세포에서 검출시간까지 세포 수를 1.16×10¹ CFU/mL로 증가시키는 데에는 시간이 필요하고, 성장곡선에서 추론하여 6시간 30분으로 계산되었다.

계산식:

¹⁾ X: time

²⁾ Y: log cell

균의 증식을 예측하기 위하여, 하기 표 3과 같이, 균의 증식을 대표하는 생육 지표인 유도기(LT)와 성장속도(GR)를 구하였다. 균의 성장을 표현하는 식으로는 여러 가지의 형태로 연구되고 있으나, 그 중에서 특히 곰퍼츠 모델(Gompertz model)에 관한 연구가 가장 많이 보고되고 있으며 미국과 영국에서 각각 개발된 병원체 모델링 프로그램(Pathogen Modeling program, PMP)과 식품 마이크로모델(food micromodel, FMM)에서도 곰퍼스 모델을 사용하고 있다 (Moon, S.Y. et al., Korean J. Food Sci . Techno. 36: 349-354 (2004)). 클로스트리듐 디피실리는 BHI에서 LT는 3.775이고, GR는 0.863으로 나타났다.예측된 생육지표의 통계적 적합성을 나타내는 R² 값은 0.9894로 나타나 1에 근접하였다.

	Parameters of modified Gompertz equation¹ ⁾
	GR ²⁾	LT ³⁾	R² ⁴⁾
Clostridium difficile	0.863	3.775	0.9894

¹⁾ Modified Gompertx equation was

Y = N₀ + C · exp {-exp [2.718·μ/C)·(lag - X) + 1]}.

²⁾ GR: maximum growth rate (per hour).

³⁾ LT: the lag time before growth (hours).

⁴⁾ R²: coefficient of determination.

실험결과 2. 배지에서의 실시간 PCR 검출한계치

일반적으로 식품에서 클로스트리듐 디피실리 검출은 BHI, cooked meat media와 같은 비선택적인 배지로 증균을 시키고 이를 선택배지인 CCFA를 이용하여 48-72시간 배양하여 검출한다. 기존 방법은 생화학적 특성을 이용한 선택배지를 사용하기 때문에 분리 균주 중에 있는 독소 생성 여부를 알지 못하는 단점이 있다. 클로스트리듐 디피실리를 신속하게 검출하기 위해서 여러 가지 검출기술 중 검출한계가 낮은 것으로 보고되고 있는 실시간 PCR을 이용하여 신속검출 가능성을 타진하였다. 우선적으로 신속 검출기술에서 가장 중요한 검출 한계값을 측정하였다. 10진 희석된 연속적인 균 농도에서 DNA를 추출한 후 실시간 PCR을 이용하여 검출 실험을 한 결과, 하기 표 4와 같이, 검출 한계값이 1.16×10¹ cfu/ml로 측정되어 10¹ 수준의 검출한계값을 가지는 것으로 측정되었다 (도 4 참조). 또한 하기 표 5에서 나타난 바와 같이, 형광 염료(fluorescence dye)가 나타내는 형광의 한계치(threshold value), 즉 목적으로 하는 DNA가 검출되었다는 한계치 값인 Ct는 38 사이클을 1 세포로 추정하였으며, 35 사이클을 10 세포로, 그리고 32 사이클을 100 세포로 추정하여 산정하였다. 클로스트리듐 디피실리에 대한 증폭곡선 기울기로부터 PCR 증폭 효율을 산출하였다. 실험에서 기울기(slope)는 -3.3665로 측정되었으며 증폭효율은 98.17%로 측정되었다 (도 5 참조). PCR 증폭 효율(Efficiency)은 (10^-1/ ^slope)-1로 계산되었는데 80-120% 범위가 바람직하다고 알려져 있다.

Target	Threshold cycle (Ct)
Target	1.16×10⁸¹⁾	1.16×10⁷	1.16×10⁶	1.16×10⁵	1.16×10⁴	1.16×10³	1.16×10²	1.16×10¹	1.16×10⁰
tcdB	16.37	19.14	22.98	26.72	30.62	34.20	37.36	37.24	-

¹⁾ CFU/mL

Detection limit	R²	Slope	Efficiency (%)¹⁾
1.16×10¹	0.9821	-3.3665	98.17

¹⁾ Efficiency = (10^-1/ ^slope)-1

실험결과 3. 성장곡선을 이용한 최단검출시간 산정

실시간 PCR 방법으로 클로스트리듐 디피실리를 검출할 수 있는 최단 검출 시간을 산출하고자 하였다. 시료 25 g에 1 세포의 클로스트리듐 디피실리가 존재한다고 가정하였을 때의 초기 농도(0.04 CFU/mL)에서 9배량의 증균 배지를 가한 후에 미생물 농도인 0.004 CFU/mL에서 실시간 PCR 검출 한계값인 11.6 CFU/mL까지의 미생물 성장이 일어나야 검출이 가능할 것으로 생각되었다. 이를 로그(log)로 전환하면 -2.398에서 1.064 만큼의 증가가 필요하며 이를 하기 계산식에 대입하면 약 6시간 30분이 필요함을 알 수 있었다.
[계산식]

따라서 시료 25 g에 1 세포가 존재할 경우 tcdB 유전자(톡신 B의 유전자)를 target으로 하여 BHI 배지를 이용하여 증균 배양할 경우, DNA 추출시간 30분과 실시간 PCR 수행시간 1시간 반을 모두 합하여 약 8시간 30분 이내에 검출이 가능할 것으로 판단하였다.

실험결과 4. 배지에서의 WGA 검출한계치

일반적으로 제조사에서 제공하는 방법에 따르면 WGA의 시간은 2시간 이내로 권고하고 있다. 따라서 미생물 신속 검출에서는 시간 단축이 중요하므로 조금 더 빠른 시간을 찾고자 하여 WGA 과정 중 실시간 PCR로 검출이 가능한 농도가 증폭되는 시점을 찾기 위해 검출 한계값을 측정하였다. 실시간 PCR에서 검출되지 못한 1.16×10⁰ CFU/ml의 DNA를 이용하여 WGA를 실시하였다. 도 6은 WGA를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 DNA의 농도를 나타낸 것이다. 샘플 25 g에 1 세포가 존재할 경우에 분리한 DNA 농도에서 검출이 가능한 DNA 양인 308 μg/ml로 증가시키는 데 시간이 필요하고, WGA에 의한 모델식(식 1)에서 추론하여 32초로 계산되었다.

계산식:

¹⁾ X: time

²⁾ Y: Concentration of DNA

검출 실험 결과, 하기 표 6과 같이, WGA를 30초 동안 실시한 DNA에서 36.32의 Ct(threshold cycle)가 측정되었다. 이는 미생물 수가 1.16×10¹~10² CFU/ml와 비슷한 검출 한계값을 가지는 것으로 측정되었다.

	Reaction time (min)
	0	0.5	1	5	10	30	120
Threshold cycle (Ct)	ND¹ ⁾	36.32	37.83	36.80	36.93	35.73	36.67

¹⁾ND: not detection

실험결과 5. WGA 을 이용한 최단 검출시간 산정

WGA 방법으로 적은 양의 DNA의 농도를 증폭시킨 후, 실시간 PCR을 이용하여 클로스트리듐 디피실리를 검출할 수 있는 최단 검출시간을 산출하고자 하였다. 하기 표 7과 같이, 시료 25 g에 1 세포의 클로스트리듐 디피실리가 존재한다고 가정하였을 때의 초기 DNA 농도는 3×10^-7 μg/mL에서 9배량의 증균 배지를 가한 후에 농도인 3×10^-8 μg/mL에서 실시간 PCR 검출 한계값인 3×10² μg/mL까지의 DNA 증폭이 일어나야 검출이 가능할 것으로 생각되었다. 도 7은 WGA를 3×10^-8 μg/mL의 DNA 농도에서 0.5(30초), 1분, 5분, 10분, 30분, 120분 실시한 경우 모든 처리구에서 목표로 하는 클로스트리듐 디피실리의 유전자가 검출되었음을 보여준다. 즉, 클로스트리듐 디피실리가 검출되었다. WGA 시간이 짧게 나타났으므로 이를 보다 정확히 알기 위하여 도 6에 나타낸 식에 대입하면 약 32초가 필요함을 알 수 있었다. 따라서 시료 25 g에 1 세포가 존재한다고 가정할 경우, 미생물 증균 과정 없이 WGA을 32초 이상 수행하여 검출할 수 있으며, 따라서 DNA 증폭시간, DNA 추출시간 30분과 실시간 PCR 수행시간 1시간 반을 모두 합하여 약 1시간 30분 정도면 검출이 가능할 것으로 판단하였다.

WGA time	0¹⁾	0.5	1	5	10	30	120
DNA conc. (ug/ml)	3×10^-7,2)	308	393	411	442	547	583

¹⁾ Time (minutes)

²⁾ 1.16 x 100 cfu/mL에서 분리한 DNA 농도는 3 x 10^-7 ug/ml임

이상의 결과를 정리하면, 본 발명은 식품에 존재하여 식중독의 잠재적인 원인으로 인정받는 클로스트리듐 디피실리가 극소량 존재 시 실시간 PCR과 WGA 방법을 이용하여 최단시간으로 검출할 수 있는 방법을 고안하였다. 증균 과정에 대한 성장예측모델로 변형된 곰퍼츠 식(modified Gompertz equation)을 이용하여 계산하였을 때, LT는 3.775이고, GR는 0.863로 나타났다. 실시간 PCR에서는 타겟 유전자를 이용하여 수행하였으며 검출한계는 1.16×10¹cfu/ml로 측정되어 10¹ 수준의 검출 한계값을 가지는 것으로 측정되었다. 시료 25 g에 1 세포가 존재한다고 가정한 경우, 실시간 PCR로 검출하기 위해서는 BHI 배지에서 약 6시간 30분으로 증균 배양함으로 검출이 가능하였지만, 미생물 증균 과정을 DNA 증폭 과정으로 대체한 WGA를 활용하였을 경우, 약 32초 후 검출이 가능한 DNA 양으로 증폭되었다. 따라서 WGA를 활용하면 증균 과정에 소요되는 시간을 대폭적으로 줄여 식중독균의 신속검출이 가능할 것으로 판단된다.

Claims

하기 단계들을 포함하는 실시간 PCR을 이용한 미생물의 최단시간 검출방법:
a) 10진 희석된 연속적인 미생물 농도에서 DNA를 추출한 후, 실시간 PCR을 실시하여 특정 미생물의 실시간 PCR의 검출한계 값을 알아내는 단계;
b) 상기 실시간 PCR의 검출한계 값 이하의 미생물 농도의 DNA를 이용하여 WGA(whole genome amplification)을 실시하여 WGA 시간별 DNA 농도의 그래프를 작성하는 단계;
c) 상기 그래프를 WGA 시간(X)별 DNA 농도(Y) 함수로 나타낸 후, 상기 검출한계 값을 상기 함수 Y에 대입하여 WGA의 최단시간을 구하는 단계; 및
d) 상기 미생물을 상기 WGA의 최단시간동안 WGA를 실시한 후 실시간 PCR을 수행하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 식품에 10^-3 내지 10¹ cfu/g 농도로 존재하는 클로스트리듐 디피실리인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 c) 단계의 함수는 하기 식 1인 것을 특징으로 하는 방법.
[식 1]