KR101450226B1 - Composition For Identifying Body-Fluid, Kit For Identifying Body-Fluid and Method for Identifying Body-Fluid by Using miRNA - Google Patents

Composition For Identifying Body-Fluid, Kit For Identifying Body-Fluid and Method for Identifying Body-Fluid by Using miRNA Download PDF

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KR101450226B1 KR1020140057011A KR20140057011A KR101450226B1 KR 101450226 B1 KR101450226 B1 KR 101450226B1 KR 1020140057011 A KR1020140057011 A KR 1020140057011A KR 20140057011 A KR20140057011 A KR 20140057011A KR 101450226 B1 KR101450226 B1 KR 101450226B1
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박종열
박성민
권오형
김선영
김용성
석현하
이우식
이한철
우광만
이승환
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대한민국
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Abstract

The present invention relates to a composition and a kit for identifying body fluid, comprising a primer set which can amplify body fluid-specific miRNA using the body fluid-specific miRNA as a biomarker and a method for identifying body fluid, including measurement of expression level of the body fluid-specific miRNA, using the same.

Description

miRNA를 이용한 체액 식별용 조성물, 키트 및 체액 식별 방법 {Composition For Identifying Body-Fluid, Kit For Identifying Body-Fluid and Method for Identifying Body-Fluid by Using miRNA}[Technical Field] The present invention relates to a composition for identifying a body fluid using miRNA, a kit for identifying the body fluid, and a kit for identifying the body fluid.

본 발명은 체액 식별용 조성물, 키트 및 이를 이용한 체액 식별 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 체액 특이적 miRNA를 바이오마커로 이용하여, 이를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 체액 식별용 조성물, 키트 및 이를 이용하여 체액 특이적 miRNA의 발현 레벨 측정을 포함하는 체액 식별 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for body fluid identification, a kit and a method for identifying a body fluid using the same, and more particularly to a body fluid identification composition comprising a primer set capable of amplifying a body fluid specific miRNA as a biomarker, And a method for identifying a body fluid including the expression level measurement of a body fluid-specific miRNA using the same.

법의학적 체액 식별은 범죄 현장 복원을 위해 중요하다. 전통적으로 면역학적 염색법이 주로 사용되었으나, 최근 유전학의 발달로 법의학적 체액 식별에 사용될 수 있는 분자의 레퍼토리(repertoire)가 mRNA, miRNA, 심지어 DNA까지 확장되었다. 많은 연구를 통해 많은 mRNA가 법의학적 체액에서 특이적으로 발현되고, 법의학적 체액 식별에 높은 민감도를 보임을 확립하였다. 몇몇 연구를 통해, 각 체액에서 DNA 메틸화와 같은 비유전적 변화가 특이적으로 일어남을 보이면서, DNA 메틸화는 법의학적 체액 식별 마커 개발을 위한 좋은 방안 중 하나가 되었다 (Frumkin, D., Wasserstrom, A., Budowle, B., Davidson, A., Forensic Sci Int Genet 2011, 5, 517-524. 등 참조).Forensic fluid identification is important for crime scene restoration. Traditionally, immunologic staining has been used predominantly, but recent advances in genetics have extended the repertoire of molecules that can be used for forensic fluid identification to mRNA, miRNA, and even DNA. Many studies have shown that many mRNAs are specifically expressed in forensic body fluids and are highly sensitive to forensic fluid identification. Several studies have shown that DNA methylation has become one of the best methods for the development of forensic body fluid identification markers (Frumkin, D., Wasserstrom, A., et al. , Budowle, B., Davidson, A., Forensic Sci Int. Genet. 2011, 5, 517-524.

MiRNA는 코딩하지 않는 작은 RNA 분자 분류에 속하고, 18-25개의 뉴클레오티드를 포함하며, 전사 후 메커니즘에 의해 다양한 생리학적 프로세스를 조절한다. miRNA는 크기가 작기 때문에, 세포가 없는 상태라 하더라도 법의학적 체액 중에서 매우 안정한 것으로 알려져 있고, 짧은 헤어핀 구조로 인해 마이크로베시클에 의한 캡슐화(encapsulation) 및 단백질 복합체와 결합하는 것으로 알려져 있다 (Cortez, M. A., Calin, G. A., Expert Opin Biol Ther 2009, 9, 703-711. 등 참조).MiRNAs belong to a small class of RNA molecules that do not encode, contain 18-25 nucleotides, and control various physiological processes by post-transcriptional mechanisms. Because miRNAs are small in size, they are known to be very stable in forensic fluids, even in the absence of cells, and are known to bind with microvesicle encapsulation and protein complexes due to short hairpin structures (Cortez, MA , Calin, GA, Expert Opin Biol Ther 2009, 9, 703-711.).

miRNA는 mRNA와 같이 조직 특이적 방식으로 발현한다 (Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C., BMC Genomics 2007, 8, 166 등 참조). 최근 여러 연구에서 법의학적 용도로 사용하기 위한 체액 특이적 miRNA의 확인 및 검증 결과를 발표하였다. 각 연구에서 수 개의 체액 특이적 miRNA를 보고하였으나, 단지 4개의 miRNA만이 2가지 또는 그 이상의 연구에서 지지되었다: 혈액에 대하여 miR-16 및 miR451 (Hanson, E. K., Lubenow, H., Ballantyne, J., Anal Biochem 2009, 387, 303-314. 및 Wang, Z., Zhang, J., Luo, H., Ye, Y., Yan, J., Hou, Y., Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 116-123. 참조), 타액에 대하여 miR-891a (Wang, Z., Zhang, J., Luo, H., Ye, Y., Yan, J., Hou, Y., Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 116-123. 등 참조) 및 정액에 대하여 miR-205 (Hanson, E. K., Lubenow, H., Ballantyne, J., Anal Biochem 2009, 387, 303-314.). 제안된 miRNA의 대부분은 다른 연구를 통해 독립적으로 검증되지 못하였으며, 법의학적 체액 식별을 위한 신뢰 가능한 miRNA 마커를 확립하기 전 더 많은 연구가 필요하다. 또한, 현재 1700개 이상이 인간 miRNA로 알려진 반면, 800개 미만의 miRNA만이 조사되었기 때문에, 이전의 연구는 제한적인 측면이 있다.miRNAs are expressed in a tissue-specific manner like mRNA (Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C., BMC Genomics 2007, 8, 166, etc.). Recent studies have identified and validated the identification of body fluid-specific miRNAs for use in forensic applications. Each study reported several body fluid-specific miRNAs, but only four miRNAs were supported in two or more studies: miR-16 and miR451 (Hanson, EK, Lubenow, H., Ballantyne, J. et al. , Anal Biochem 2009, 387, 303-314 and Wang, Z., Zhang, J., Luo, H., Ye, Y., Yan, J., Hou, Y., Forensic Sci Int. (See Wang, Z., Zhang, J., Luo, H., Ye, Y., Yan, J., Hou, Y., Forensic Sci Int Genet 2013, MiR-205 (Hanson, EK, Lubenow, H., Ballantyne, J. Anal Biochem 2009, 387, 303-314) for semen. Most of the proposed miRNAs have not been independently verified through other studies and more research is needed before establishing reliable miRNA markers for forensic fluid identification. Also, since more than 1,700 miRNAs are now known to be human miRNAs, only fewer than 800 miRNAs have been studied.

이러한 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 체액 식별을 위한 신뢰할만한 체액 특이적 miRNA 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 특정 miRNA가 체액 식별을 위한, 효과적인 체액 특이적 바이오마커로 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Under these circumstances, the inventors of the present application have made extensive efforts to develop reliable body fluid-specific miRNA markers for body fluid identification, and as a result, have confirmed that certain miRNAs can be used as effective body fluid-specific biomarkers for body fluid identification, Thereby completing the present invention.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
The information described in the Background section is intended only to improve the understanding of the background of the present invention and thus does not include information forming a prior art already known to those skilled in the art .

본 발명의 주된 목적은 범죄 현장의 법의학적 체액 식별을 위해, 신뢰할 수 있으면서도 재현 가능성이 높고 용이하게 체액을 식별할 수 있는 신규 miRNA 마커의 검출을 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 체액 식별방법을 제공하는 데 있다.
The main object of the present invention is to provide a composition, a kit and a body fluid identification method for detecting new miRNA markers that are reliable and highly reproducible and easily identifiable for body fluid for identification of a forensic body fluid at a crime scene There is.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 혈액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 1 또는 2의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 9 또는 10의 프라이머, (I) a primer of SEQ ID NO: 9 or 10 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 that is specifically highly expressed in blood,

(ii) 타액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 3 또는 4의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 11 또는 12의 프라이머, (ii) a primer of SEQ ID NO: 11 or 12 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 that is specifically highly expressed in saliva,

(iii) 정액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 5 또는 6의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 13 또는 14의 프라이머, 및 (iii) a primer of SEQ ID NO: 13 or 14 for amplifying the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 which is specifically highly expressed in the semen, and

(iv) 질 분비액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 7 또는 8의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 15 또는 16의 프라이머 세트를 포함하는 체액 식별용 조성물을 제공한다.(iv) a primer set of SEQ ID NO: 15 or 16 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 that is specifically highly expressed in a vaginal secretion fluid.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 체액 식별용 키트를 제공한다.The present invention also provides a body fluid identification kit comprising the composition.

본 발명은 더욱이, 분석 대상 샘플을 상기 체액 식별용 조성물과 혼합하고, 샘플 중 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 레벨을 측정하는 단계; 및 The present invention further relates to a method for identifying a body fluid, comprising the steps of: mixing a sample to be analyzed with the body fluid identifying composition and measuring at least one miRNA expression level selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 8 in the sample; And

서열번호 1 또는 2의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 혈액, 서열번호 3 또는 4의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 타액, 서열번호 5 또는 6의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 정액, 또는 서열번호 7 또는 8의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 질 분비액으로 판별하는 단계를 포함하는 체액 식별 방법을 제공한다.
When the miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 is specifically highly expressed, if the miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 is specifically highly expressed in the saliva, the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 is specifically highly expressed, When the miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 is specifically and highly expressed, it is judged to be a vaginal secretion liquid.

본 출원의 발명자들은 잠재적 체액 특이적 miRNA 마커를 확인하기 위해, 2,216개의 작은 인간 RNA 뿐 아니라, 1,733 개의 알려진 성숙 miRNA를 포함하는 Affymetrix 3.0 miRNA 어레이를 사용하여, 20개의 체액 샘플에서 게놈 전체의 miRNA 발현 프로파일링을 수행하였다. 이를 통해, 203개의 체액 특이적 miRNA 마커를 처음 확인하였으며, 이후 qRT-PCR를 사용하여 8개의 신규 miRNA를 40개의 다른 샘플에서 검증하였다. 본 발명에 따른 신규의 miRNA 마커를 통해, 정확하고 빠르게 체액을 식별할 수 있으며, 범죄 현장의 손상된 RNA 샘플에서도 본 발명에 따른 신규의 miRNA 마커는 유의성 있게 발현되는 바, 범죄 현장 복원을 위한 체액 식별에 유용하다.
The inventors of the present application have used the Affymetrix 3.0 miRNA array containing 1,733 known mature miRNAs as well as 2,216 small human RNAs to identify potential body fluid specific miRNA markers for genome-wide miRNA expression in 20 body fluid samples Profiling was performed. Through this, 203 bodily fluid-specific miRNA markers were first identified, and then eight new miRNAs were tested in 40 different samples using qRT-PCR. The new miRNA markers according to the present invention can be identified accurately and rapidly through the novel miRNA markers according to the present invention and the novel miRNA markers according to the present invention are also significantly expressed in the damaged RNA samples at the crime scene, .

도 1은 총 RNA의 퀄리티를 나타내는 결과이며, miRNA를 포함하는 추출된 총 RNA를 ExperionTM RNA StdSens로 분석하였다. (A) 혈액 (Blood), (B) 타액 (saliva), (C) 정액 (semen) 및 (D) 질 분비액 (vaginal secretion).
도 2는 RMA 정규화 전후에 따른 Affymetrix 마이크로어레이 실험의 강도 분포를 나타낸 결과이며, Affymetrix expression console 1.3를 통해 RNA 정규화를 실시하였다.
도 3은 20개의 체액 샘플 중 miRNA 발현 패턴을 나타낸 결과이며, 체액 샘플 중 개인의 상관관계 분석은 1,733개의 miRNA를 이용하여 수행되었다.
도 4는 203개의 선별된 체액 특이적 miRNA를 사용하여, 20개의 체액 샘플을 관리되지 않은 계층적 클러스터링 (unsupervised hierarchical clustering)한 결과를 나타낸다. Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array를 사용하여, 20개의 체액 샘플 (4가지 종류의 체액 각각에 대하여 5개의 샘플)에 대해 MiRNA 발현 프로파일링을 실시하였다. 203개의 miRNA를 Q값 (Q < 3.3)에 기반하여 체액 특이적인 것으로 선별하였다.
도 5는 출원인의 마이크로어레이 데이터세트에서 확인한 선별된 8개 miRNA 마커의 발현 패턴을 나타낸 결과로, Y축은 log2 스케일의 miRNA 발현값을 의미한다.
도 6은 선별된 체액 특이적 8개 miRNA 마커에 대하여 qRT-PCR을 통해 검증한 결과로, 총 40개의 샘플 (4가지 종류의 체액 각각에 대하여 10개)을 qRT-PCR 어세이에 사용하였다. (A) 혈액 (Blood), (B) 타액 (saliva), (C) 정액 (semen) 및 (D) 질 분비액 (vaginal secretion).
도 7은 선별된 8개의 miRNA 마커에 대한 분석 결과로, R software를 사용하여 ROC 곡선 및 AUC 값을 측정하였다. (A) 혈액 (Blood), (B) 타액 (saliva), (C) 정액 (semen) 및 (D) 질 분비액 (vaginal secretion).
도 8은 이전에 보고된 miRNA의 발현 패턴 결과로, 출원인의 마이크로어레이 데이터세트에 의한 결과와는 맞지 않는다. Y축은 log2 스케일의 miRNA 발현값을 의미한다.
도 9는 이전에 보고된 miRNA의 발현 패턴 결과로, 출원인의 마이크로어레이 데이터세트에 의한 결과와는 맞지 않는다. Y축은 log2 스케일의 miRNA 발현값을 의미한다.Figure 1 shows the results of the total RNA quality, and the extracted total RNA containing miRNA was analyzed with Experion ™ RNA StdSens. (A) Blood, (B) saliva, (C) semen and (D) vaginal secretion.
Figure 2 shows the intensity distributions of the Affymetrix microarray experiments before and after RMA normalization and RNA normalization was performed using Affymetrix expression console 1.3.
Figure 3 shows the results of miRNA expression patterns in 20 body fluid samples and an individual correlation analysis in body fluid samples was performed using 1,733 miRNAs.
Figure 4 shows the results of unsupervised hierarchical clustering of 20 body fluid samples using 203 selected body fluid-specific miRNAs. Using the Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array, MiRNA expression profiling was performed on 20 body fluid samples (5 samples for each of the 4 body fluids). 203 miRNAs were selected for body fluid specificity based on the Q value (Q <3.3).
Figure 5 shows the expression patterns of the selected 8 miRNA markers identified in the microarray data set of the applicant, wherein the Y axis represents the miRNA expression level of the log 2 scale.
Figure 6 shows a total of 40 samples (10 for each of 4 different body fluids) used in the qRT-PCR assay as a result of qRT-PCR for selected eight body fluid-specific miRNA markers. (A) Blood, (B) saliva, (C) semen and (D) vaginal secretion.
FIG. 7 shows the ROC curve and AUC value of the selected 8 miRNA markers using R software. (A) Blood, (B) saliva, (C) semen and (D) vaginal secretion.
Figure 8 is a result of an expression pattern of previously reported miRNAs, which is inconsistent with the results of the applicant's microarray data set. And the Y axis represents the miRNA expression value of the log 2 scale.
Figure 9 is a result of an expression pattern of previously reported miRNAs, which is inconsistent with results from the applicant's microarray data set. And the Y axis represents the miRNA expression value of the log 2 scale.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.

본 발명은 (i) 혈액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 1 또는 2의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 9 또는 10의 프라이머, (I) a primer of SEQ ID NO: 9 or 10 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 that is specifically highly expressed in blood,

(ii) 타액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 3 또는 4의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 11 또는 12의 프라이머, (ii) a primer of SEQ ID NO: 11 or 12 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 that is specifically highly expressed in saliva,

(iii) 정액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 5 또는 6의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 13 또는 14의 프라이머, 및 (iii) a primer of SEQ ID NO: 13 or 14 for amplifying the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 which is specifically highly expressed in the semen, and

(iv) 질 분비액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 7 또는 8의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 15 또는 16의 프라이머 세트를 포함하는 체액 식별용 조성물에 관한 것이다.(iv) a primer set of SEQ ID NO: 15 or 16 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 that is specifically highly expressed in a vaginal secretion fluid.

RNA는 통상 UV, 빛, 열, 습기 및 도처에 존재하는 리보핵산가수분해효소 (ubiquitous ribonuclease)와 같은 열악한 조건에 노출되어 있기 때문에, RNA를 법의학적 체액 식별에 사용함에 있어서 RNA의 비특이적 손상은 거대한 도전이다. 이와 관련하여, miRNA는 크기가 작기 때문에 손상에 덜 민감하여 mRNA 보다 낫고, 마이크로베시클(microvesicle)에 의한 캡슐화 및 단백질 복합체와 연관이 있어, 내인성 RNase 활성으로부터 더 잘 보호된다. 체액으로부터의 RNA 샘플이 심각하게 손상되고 퀄리티가 나쁘더라도, 모든 miRNA 마이크로어레이 실험이 QC 테스트를 통과하였고 체액 특이적 miRNA 발현 패턴을 성공적으로 제조하였다. 따라서, miRNA는 범죄 현장의 손상된 RNA 샘플에서 우수한 마커가 될 수 있다.Since RNA is exposed to harsh conditions such as UV, light, heat, moisture and ubiquitous ribonuclease present everywhere, the non-specific damage of RNA in the use of RNA for forensic body fluid identification is enormous It is a challenge. In this regard, miRNAs are less susceptible to damage because of their smaller size, which are better than mRNAs, and are associated with encapsulation and protein complexes by microvesicles, thus being better protected from endogenous RNase activity. Although RNA samples from body fluids were severely impaired and poor in quality, all miRNA microarray experiments passed QC testing and successfully produced a fluid-specific miRNA expression pattern. Thus, miRNAs can be excellent markers in damaged RNA samples at crime scenes.

본 발명의 조성물에 따르면, 배출된 체액을 포함하는 분석대상샘플로부터 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA가 특이적으로 고발현되는지 여부를 확인하여, 체액을 식별할 수 있다. According to the composition of the present invention, body fluids can be identified by checking whether the one or more miRNAs selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 8 are specifically and highly expressed from a sample to be analyzed containing discharged body fluids.

이 때, 상기 '체액'은 혈액 (blood), 타액 (saliva), 정액 (semen) 및/또는 질분비액 (vaginal secretion) 일 수 있으며, 상기 서열번호 1 ((miRBase) miR-484) 또는 서열번호 2의 miRNA (miR-182)는 혈액, 서열번호 3 (miR-223) 또는 서열번호 4 (miR-145)의 miRNA는 타액, 서열번호 5 (miR-2392) 또는 서열번호 6 (miR-3197)의 miRNA는 정액 및 서열번호 7 (miR-1260b) 또는 서열번호 8 (miR-654)의 miRNA는 질 분비액에서 특이적으로 고발현된다. Herein, the 'body fluid' may be blood, saliva, semen and / or vaginal secretion, and may be any one of SEQ ID NO: 1 ((miRBase) miR-484) (MiR-2392) or SEQ ID NO: 6 (miR-3197) of the blood, the miRNA of SEQ ID NO: 3 (miR-223) or SEQ ID NO: Of the miRNA is semen and the miRNA of SEQ ID NO: 7 (miR-1260b) or SEQ ID NO: 8 (miR-654) is specifically highly expressed in the vaginal secretion.

본 출원의 발명자들은 4가지 종류의 법의학적 체액인 혈액, 타액, 정액 또는 질분비액과 관련하여, 20개 샘플 중 게놈 전체에 대한 miRNA 발현 분석을 통해, 203개의 체액 특이적 miRNA를 확인하였으며, 이후 qRT-PCR을 사용하여 다른 40개의 샘플에서 8개의 miRNA를 검증하였다.The inventors of the present application identified 203 body fluid-specific miRNAs through analysis of miRNA expression in the genome as a whole among 20 samples with respect to blood, saliva, semen or vaginal secretion fluid of four kinds of forensic body fluids, Eight miRNAs were tested in another 40 samples using qRT-PCR.

본 발명에 따른 프라이머(primer)는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만, 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다.A primer according to the present invention is a single strand capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable conditions (i.e., four different nucleoside triphosphates and polymerase enzymes) in a suitable buffer at a suitable temperature Lt; / RTI &gt; oligonucleotide. The suitable length of the primer is typically 15 to 30 nucleotides, although it varies depending on various factors such as temperature and use of the primer.

상기 서열번호 1 또는 2의 miRNA는 서열번호 9 또는 10의 프라이머에 의해 증폭되고, 분석대상샘플 중 서열번호 9 또는 10의 프라이머에 의해 서열번호 1 또는 2의 miRNA가 특이적으로 고발현됨을 확인하면, 샘플을 혈액으로 판별할 수 있다. The miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 is amplified by the primer of SEQ ID NO: 9 or 10 and that the miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 is specifically highly expressed by the primer of SEQ ID NO: 9 or 10 among the samples to be analyzed , The sample can be identified as blood.

상기 서열번호 3 또는 4의 miRNA는 서열번호 11 또는 12의 프라이머에 의해 증폭되고, 분석대상샘플 중 서열번호 11 또는 12의 프라이머에 의해 서열번호 3 또는 4의 miRNA가 특이적으로 고발현됨을 확인하면, 샘플을 타액으로 판별할 수 있다. The miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 is amplified by the primer of SEQ ID NO: 11 or 12 and the miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 is specifically highly expressed by the primer of SEQ ID NO: 11 or 12 among the samples to be analyzed , The sample can be identified as saliva.

상기 서열번호 5 또는 6의 miRNA는 서열번호 13 또는 14의 프라이머에 의해 증폭될 수 있고, 분석대상샘플 중 서열번호 13 또는 14의 프라이머에 의해 서열번호 5 또는 6의 miRNA가 특이적으로 고발현됨을 확인하면, 샘플을 정액으로 판별할 수 있다. The miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 can be amplified by the primer of SEQ ID NO: 13 or 14 and the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 is specifically highly expressed by the primer of SEQ ID NO: 13 or 14 among the samples to be analyzed Once confirmed, the sample can be determined by semen.

상기 서열번호 7 또는 8의 miRNA는 서열번호 15 또는 16의 프라이머에 의해 증폭되고, 분석대상샘플 중 서열번호 15 또는 16의 프라이머에 의해 서열번호 7 또는 8의 miRNA가 특이적으로 고발현됨을 확인하면, 샘플을 질 분비액으로 판별할 수 있다. The miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 is amplified by the primer of SEQ ID NO: 15 or 16 and the miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 is specifically highly expressed by the primer of SEQ ID NO: 15 or 16 among the samples to be analyzed , And the sample can be determined as the vaginal secretion liquid.

상기 특이적 고발현은 예를 들어, 타겟 체액과 나머지 체액의 마이크로어레이 유래 miRNA 발현량에 대한 log2 값 차이가 2 이상임을 의미할 수 있으며, 본 출원에서는 Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array에서 도출된 miRNA 발현량에 대한 log2 값을 통해 타겟 체액을 식별하였다. For example, the specific high expression may mean that the difference in log 2 value between microarray-derived miRNA expression amounts of the target body fluid and the remaining body fluids is 2 or more. In this application, miRNA derived from Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array Target body fluids were identified by log 2 values for expression levels.

구체적으로, 분석대상샘플 중 서열번호 1 또는 2의 miRNA 발현량에 대한 log2 값이 다른 서열번호의 miRNA 발현량에 대한 log2 값과 2 이상의 차이가 나는 경우, 이를 혈액으로 식별할 수 있다. 또한, 서열번호 3 또는 4의 miRNA 발현량에 대한 log2 값이 다른 서열번호의 miRNA 발현량에 대한 log2 값과 2 이상의 차이가 나는 경우, 이를 타액으로 식별할 수 있고, 서열번호 5 또는 6의 miRNA 발현량에 대한 log2 값이 다른 서열번호의 miRNA 발현량에 대한 log2 값과 2 이상의 차이가 나는 경우, 이를 정액으로 식별할 수 있으며, 서열번호 7 또는 8의 miRNA 발현량에 대한 log2 값이 다른 서열번호의 miRNA 발현량에 대한 log2 값과 2 이상의 차이가 나는 경우, 이를 질 분비액으로 식별할 수 있다.Specifically, when a difference of at least log 2 value and the second of the miRNA expression of different sequence number log 2 value for miRNA expression levels of SEQ ID NO: 1 or 2 of the analyte sample I, it is possible to identify them to the blood. Further, when log 2 value for miRNA expression levels of SEQ ID NO: 3 or 4 is the difference of at least log 2 value and the second of the miRNA expression of different sequence numbers I, it is possible to identify them as saliva, SEQ ID NO: 5 or 6 When the log 2 value of the miRNA expression level of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 is different from the log 2 value of the miRNA expression amount of the other sequence numbers by 2 or more, If the value I 2 is log 2 value and two or more differences in miRNA expression of different sequence numbers, it is possible to identify them as quality juice.

종래 4개의 그룹에서, 법의학적 식별을 위해 수 개의 체액 특이적 miRNA를 동정하였음을 보고한 바 있다. 그러나, 단지 4개의 miRNA (혈액 특이적 miR-16 및 miR-451, 정액 특이적 miR-891a 및 타액 특이적 miR-658) 만이 존재하였을 뿐이다. 이전 연구와 본 발명의 차이를 설명하기 위해, 이전에 보고된 체액 특이적 16개의 miRNA를 출원인의 miRNA 마이크로어레이 데이터 세트에서 평가하였다. In the past four groups, we have identified several body fluid-specific miRNAs for forensic identification. However, only four miRNAs (blood-specific miR-16 and miR-451, semen-specific miR-891a and saliva-specific miR-658) were present. To illustrate the difference between the previous study and the present invention, the previously reported body fluid-specific 16 miRNAs were evaluated in the applicant's miRNA microarray data set.

그 결과, 절반은 체액 특이적 발현 패턴을 보인 반면 (도 8 참조), 나머지는 좋지 못한 체액 특이적 발현 패턴을 보였다 (도 9 참조). 예를 들어, 이전 보고된 miR-135a 및 miR-135b와 같은 정액 특이적 miRNA는 질 분비액에서도 현저하게 발현되었다 (도 9A 참조). 이전에 보고된 miR-200c, miR-203 및 miR-205와 같은 타액 특이적 miRNA는 질 분배액에서도 높게 발현됨을 확인하였다 (도 9B 참조).As a result, half showed a body fluid-specific expression pattern (see FIG. 8), while the rest showed a poor body fluid-specific expression pattern (see FIG. 9). For example, semen-specific miRNAs, such as miR-135a and miR-135b, previously reported, were also significantly expressed in vaginal secretion (see Fig. 9A). The previously reported saliva-specific miRNAs such as miR-200c, miR-203 and miR-205 were also highly expressed in vaginal aliquots (see FIG. 9B).

Courts, C., Madea, B., J Forensic Sci 2011, 56, 1464-1470.의 선행문헌에서는 정맥혈 및 타액 샘플에서만 마이크로어레이 실험을 진행하였을 뿐, 스크리닝을 위한 정액 및 질 분비액 샘플에서는 진행하지 않았다. 4개의 주요한 종류의 체액을 게놈 전체의 miRNA 프로파일링에 포함하는 것이 이전 연구와의 차이에 대한 한가지 원인이다. 이전에 식별된 4개의 정액 특이적 miRNA (miR-135a, miR-135b, miR-10a, 및 miR-10b)는 출원인의 마이크로어레이 데이터 세트에서 낮은 레벨(log2-expression < 2)로 발현되었다(도 9A 참조). In the prior art of Courts, C., Madea, B., J Forensic Sci 2011, 56, 1464-1470., Microarray experiments were only performed on venous blood and saliva samples, but not on semen and vaginal fluid samples for screening . Including the four major classes of body fluids in the genome profiling of miRNAs is one cause for differences from previous studies. The four previously identified semen-specific miRNAs miR-135a, miR-135b, miR-10a and miR-lOb were expressed at low levels (log2-expression < 2) in the applicant's microarray data set 9A).

반면에, Wang, Z., Zhang, J., Luo, H., Ye, Y., Yan, J., Hou, Y., Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 116-123.에 개시된 정액 특이적 miRNA miR891a는 높은 레벨 (log2-expression > 10)로 발현되었고, 출원인의 데이터 세트에서도 정액 특이적이었다 (도 8B 참조). 따라서, 절대적 발현 레벨은 체액 특이적 miRNA 선별시 고려하여야 할 중요한 기준임을 알 수 있다.On the other hand, the cumulus-specific &lt; RTI ID = 0.0 &gt; miRNA miR891a was expressed at high levels (log2-expression &gt; 10) and was also semi- specific in the applicant's dataset (see FIG. 8B). Thus, the absolute expression level is an important criterion to be considered in the selection of body fluid-specific miRNAs.

또한, 인간 게놈에서 식별된 miRNA의 수는 최근 빠르게 증가하고 있고, 현재 1700개가 넘는 성숙 miRNA가 존재(miRBase V18)한다. 이와 관련하여, 이전 연구에서는 800개 미만의 miRNA를 포함하는 miRNA 마이크로어레이 플랫폼을 사용하였기 때문에 제한적이다. 1,700개가 넘은 miRNA 포함 Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 array를 사용하여, 법의학적 체액 식별을 위한 많은 신규 miRNA를 식별할 수 있었고, qRT-PCR을 통해 이들 중 몇몇을 성공적으로 검증하였다.In addition, the number of miRNAs identified in the human genome has increased rapidly in recent years, and there are currently more than 1700 mature miRNAs present (miRBase V18). In this regard, previous studies have limited the use of miRNA microarray platforms containing less than 800 miRNAs. Using more than 1,700 miRNA-containing Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 arrays, we were able to identify many new miRNAs for forensic fluid identification and successfully validated some of them through qRT-PCR.

이를 바탕으로, 본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 체액 식별용 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 예를 들어, 분석대상샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 서열번호 9 또는 10, 서열번호 11 또는 12, 서열번호 13 또는 14, 및 서열번호 15 또는 16의 프라이머 세트를 포함하는 용기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 키트의 구동에 필요한 추가 구성을 포함할 수 있다.On the basis thereof, the present invention also relates to a body fluid identification kit comprising the composition. The kit includes, for example, a compartmented carrier means containing a sample to be analyzed, a container comprising a set of primers of SEQ ID NO: 9 or 10, SEQ ID NO: 11 or 12, SEQ ID NO: 13 or 14, and SEQ ID NO: But is not limited to, and may include additional configurations necessary for driving the kit.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용한 체액 식별 방법에 관한 것으로, 분석 대상 샘플을 상기 체액 식별용 조성물과 혼합하고, 샘플 중 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 레벨을 측정하는 단계; 및 서열번호 1 또는 2의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 혈액, 서열번호 3 또는 4의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 타액, 서열번호 5 또는 6의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 정액, 또는 서열번호 7 또는 8의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 질 분비액으로 판별하는 단계를 포함한다.The present invention also relates to a method for identifying a body fluid using the composition, comprising: mixing a sample to be analyzed with the body fluid identifying composition and measuring one or more miRNA expression levels selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 8 in the sample ; When the miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 is specifically highly expressed, the saliva when the miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 is specifically highly expressed when the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 is specifically high- When the miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 is specifically and highly expressed, it is judged to be a vaginal secretion liquid.

하나의 실시예에서, 상기 miRNA 발현 레벨은 miRNA 발현을 프로파일링하는데 사용될 수 있는 통상적 기술을 통해 측정될 수 있으며, 예를 들어 마이크로어레이, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 또는 qRT-PCR(quantitative real time PCR) 등의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
In one embodiment, the miRNA expression level can be measured through routine techniques that can be used to profile miRNA expression, including, for example, microarray, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) or quantitative real time PCR), but the present invention is not limited thereto.

실시예Example

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

I. 실험 방법I. Experimental Method

1. 샘플 수집 및 RNA 준비1. Sample Collection and RNA Preparation

참가자들로부터 사전 동의를 받은 후, 건강한 한국인 지원자로부터 각 체액 샘플 (혈액, 타액, 정액 및 질 분비액)을 수집하였다. 이번 연구는 차의과대학교의 연구윤리심의위원회를 통해 승인 받았다. miRNeasy Mini kit (Qiagen, Carlsbad, CA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라, miRNA를 포함하는 총 RNA를 분리하였다. ExperionTM RNA StdSens (Bio-Rad, Hercules, CA)을 통해 추출된 총 RNA를 정량 및 정성 분석하였다.
After receiving prior consent from the participants, each body fluid sample (blood, saliva, semen and vaginal fluid) was collected from healthy Korean volunteers. The study was approved by the Research Ethics Review Committee of the Medical School of Medicine. Total RNA containing miRNA was isolated using the miRNeasy Mini kit (Qiagen, Carlsbad, Calif.) according to the manufacturer's protocol. Total RNA extracted from Experion ™ RNA StdSens (Bio-Rad, Hercules, CA) was quantitatively and qualitatively analyzed.

2. MiRNA 마이크로어레이 실험 및 데이터 분석2. MiRNA Microarray Experiment and Data Analysis

체액 특이적 miRNA 마커를 확인하기 위해, 1,733개의 인간 성숙 miRNA, miRBase v. 17에 기초한 1,658 개의 인간 pre-miRNA및 snoRNAs와 scaRNAs 같은 인간의 작은 RNA 2,216개를 포함하여 총 19,724 개의 miRNA 프로브 세트를 제공하는 Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array를 사용하였다. 간략하게, 500 ng 총 RNA이 poly-A tail을 포함하도록 하고, 라이게이션 한 다음 제조자의 지시에 따라 miRNA 3.0 array와 혼성화하였다. 혼성화 후, miRNA 3.0 array를 Affymetrix GeneChip Scanner 3000로 스캔하였다.To identify body fluid-specific miRNA markers, 1,733 human mature miRNAs, miRBase v. 17-based human pre-miRNA and Affymetrix Gene Chip miRNA 3.0 Array, which provides a total of 19,724 miRNA probe sets, including 2,216 human small RNAs such as snoRNAs and scaRNAs. Briefly, 500 ng total RNA was included in the poly-A tail, ligated and hybridized with the miRNA 3.0 array according to the manufacturer's instructions. After hybridization, miRNA 3.0 arrays were scanned with an Affymetrix GeneChip Scanner 3000.

스캐닝한 이미지를 AffymetrixTM Expression Console 1.3 program을 사용하여 강도값으로 변환하였다. 데이터 정규화에 RMA(Robust Multi-array Average)법을 사용하였다 (Eschrich, S. A., Hoerter, A. M., Bloom, G. C., Fenstermacher, D. A., Conference proceedings : ... Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. Conference 2008, 2008, 2419-2422. 참조). 모든 1차 miRNA 마이크로어레이 데이터를 GSE49630의 accession number로 GEO (Gene Expression Omnibus)에 등록하였다.
The scanned images were converted to intensity values using the Affymetrix TM Expression Console 1.3 program. We used the RMA (Robust Multi-Array Average) method for data normalization (Eschrich, SA, Hoerter, AM, Bloom, GC, Fenstermacher, DA, Conference proceedings: IEEE Engineering in Medicine and Biology Society Conference 2008, 2008, 2419-2422). All primary miRNA microarray data were registered with GEO (Gene Expression Omnibus) with accession number of GSE49630.

3. qRT-PCR3. qRT-PCR

8개의 체액 특이적 miRNA 후보를 검증하기 위해, miRNA 특이적 qRT-PCR을 실시하였다. 간략하게, 500 ng의 총 RNA를 사용하여 NCode VILO miRNA cDNA Synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 통해 cDNA를 합성하였고, 프라이머 세트 및 2X SYBR Premix (Bio-Rad) 를 포함하는 qRT-PCR 반응에 합성된 cDNA를 사용하였고, CFX96 Real-Time PCR (Bio-Rad) 기계를 다음의 조건에서 사용하였다: 3분 동안 95℃, 10초 동안 95℃에서 40 사이클, 20초 동안 60℃ 및 20초 동안 72℃. 각 miRNA 발현 레벨은 U6 표현식으로 정규화되었다 (Khajuria, C., Williams, C. E., El Bouhssini, M., Whitworth, R. J., Richards, S., Stuart, J. J., Chen, M. S., BMC Genomics 2013, 14, 187. 참조). 발현 레벨은 델타Ct (ΔCt)법을 사용하여 정량화되었고, 각 정방향 프라이머 및 조건에 대한 정보를 표 1에 기재하였다.
MiRNA-specific qRT-PCR was performed to validate eight body fluid-specific miRNA candidates. Briefly, cDNA was synthesized using the NCode VILO miRNA cDNA synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Using 500 ng of total RNA and subjected to qRT-PCR with primer set and 2X SYBR Premix (Bio-Rad) The synthesized cDNA was used and a CFX96 Real-Time PCR (Bio-Rad) machine was used under the following conditions: 95 ° C for 3 minutes, 40 cycles at 95 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 20 seconds and 20 seconds 72 ° C. Each miRNA expression level was normalized to U6 expression (Khajuria, C., Williams, CE, El Bouhssini, M., Whitworth, RJ, Richards, S., Stuart, JJ, Chen, MS, BMC Genomics 2013, 14, 187 . Reference). Expression levels were quantified using the delta Ct ([Delta] Ct ) method, and the information for each forward primer and condition is set forth in Table 1.

miRNAmiRNA SequenceSequence TmTm 서열번호 1: Hsa-miR-484SEQ ID NO: 1: Hsa-miR-484 서열번호 9: CCTCAGTCCCCTCCCGATSEQ ID NO: 9: CCTCAGTCCCCTCCCGAT 60℃60 ° C 서열번호 2: Hsa-miR-182SEQ ID NO: 2: Hsa-miR-182 서열번호 10: TGGCAATGGTAGAACTCACACTSEQ ID NO: 10: TGGCAATGGTAGAACTCACACT 60℃60 ° C 서열번호 3: Hsa-miR-223SEQ ID NO: 3: Hsa-miR-223 서열번호 11: TGTCAGTTTGTCAAATACCCCASEQ ID NO: 11: TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA 60℃60 ° C 서열번호 4: Hsa-miR-145SEQ ID NO: 4: Hsa-miR-145 서열번호 12: GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCTSEQ ID NO: 12: GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT 60℃60 ° C 서열번호 5: Hsa-miR-2392SEQ ID NO: 5: Hsa-miR-2392 서열번호 13: TAGGATGGGGGTGAGAGGTGSEQ ID NO: 13: TAGGATGGGGGTGAGAGGTG 60℃60 ° C 서열번호 6: Hsa-miR-3197SEQ ID NO: 6: Hsa-miR-3197 서열번호 14: GCAGGCTCGGAAAGGCGSEQ ID NO: 14: GCAGGCTCGGAAAGGCG 60℃60 ° C 서열번호 7: Hsa-miR-1260bSEQ ID NO: 7: Hsa-miR-1260b 서열번호 15: ATCCCACCACTGCCACCATSEQ ID NO: 15: ATCCCACCACTGCCACCAT 60℃60 ° C 서열번호 8: Hsa-miR-654-5qSEQ ID NO: 8: Hsa-miR-654-5q 서열번호 16: GCCGCAGAACATGTGCSEQ ID NO: 16: GCCGCAGAACATGTGC 60℃60 ° C

4. 통계 분석4. Statistical Analysis

Shannon Entropy (H) 및 Q-statistics (Q)을 사용하여 체액 특이적 마커를 선별하였다 (Park, S. M., Park, S. Y., Kim, J. H., Kang, T. W., Park, J. L., Woo, K. M., Kim, J. S., Lee, H. C., Kim, S. Y., Lee, S. H., Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 143-150. 참조). Student? t-test를 사용하여 한 유형의 체액과 나머지 유형의 체액 사이의 miRNA 발현 차이에 대한 유의성을 추론하였다. ROC (receiver operating characteristic) 및 R software (version 2.6.1)의 ROCR 패키지를 사용하여 각 miRNA 마커에 대한 ROC 커브 아래 개별 면적을 계산하였다. < 0.05의 P-value 결과는 유의한 것으로 판단된다.
We used the Shannon Entropy (H) and Q-statistics (Q) to select body fluid specific markers (Park, SM, Park, SY, Kim, JH, Kang, TW, Park, JL, Woo, KM, , Lee, HC, Kim, SY, Lee, SH, Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 143-150. Student? The t-test was used to infer the significance of miRNA expression differences between one type of body fluids and the rest of the body fluids. The individual area under the ROC curve for each miRNA marker was calculated using the ROC (receiver operating characteristic) and R software (version 2.6.1) package. A P-value of <0.05 was considered significant.

II. 실험 결과II. Experiment result

1. MiRNA 발현 프로필 및 체액 특이적 miRNA 선별1. MiRNA expression profiles and body fluid-specific miRNA screening

법의학적 체액을 식별하기 위해 RNA를 사용하는 것과 관련된 어려움 중 하나는 체액 중 대부분의 RNA가 매우 손상되었다는 것이다. 당연하게도, 혈액을 제외한 체액 중 총 RNA가 심하게 손상되었음을 확인하였다 (도 1 참조). 그러나, miRNA 마이크로어레이 실험을 수행하였을 때, 모든 샘플이 QC 테스트를 통과하여, 좋은 결과를 보였음을 확인하였다. 미가공 강도 데이터를 RMA법으로 정규화하고, 후속의 분석에 사용하였다 (도 2 참조). 각 체액 샘플은 그룹 상관관계 내에서 좋은 상태를 나타내었다 (도 3 참조). One of the difficulties associated with using RNA to identify forensic fluids is that most RNA in body fluids is very damaged. As a matter of course, it was confirmed that the total RNA in the body fluids except the blood was severely damaged (see FIG. 1). However, when miRNA microarray experiments were performed, all samples passed the QC test and were found to have good results. The raw strength data was normalized by the RMA method and used for subsequent analysis (see Figure 2). Each body fluid sample showed a good state within the group correlation (see FIG. 3).

체액 특이적 miRNA를 선별하기 위해, 각 miRNA 에 대하여 Shannon Entropy (E) 및 Q-statistics (Q)을 측정(본 출원의 발명자에 의해 공개된 Park, S. M., Park, S. Y., Kim, J. H., Kang, T. W., Park, J. L., Woo, K. M., Kim, J. S., Lee, H. C., Kim, S. Y., Lee, S. H., Forensic Sci Int Genet 2013, 7, 143-150.에 따라 수행)하였으며, 4개의 체액 중에서의 발현 차이 또한 고려하였다. 이에 따라, 다음 2가지 조건 (1) 각 체액에 대한 Q값 < 3.3, (2) 타겟 체액과 나머지 체액 사이의 miRNA 발현 차이> 2 (log2-scale)을 적용하였으며, 그 결과 203개의 체액 특이적 miRNA를 선별하였다. 이들은 97개의 혈액 특이적 miRNA, 13개의 타액 특이적 miRNA, 76개의 정액 특이적 miRNA 및 17개의 질 분비액 특이적 miRNA를 포함하였다 (도 4 참조).
In order to screen for body fluid-specific miRNAs, Shannon Entropy (E) and Q-statistics (Q) were measured for each miRNA (Park, SM, Park, SY, Kim, JH, Kang, The experiments were performed according to Forensic Sci Int Genet 2013, 7 , 143-150.), And expression in 4 body fluids Differences were also considered. Therefore, the following two conditions (1) Q value for each body fluid was <3.3, (2) miRNA expression difference between the target body fluid and the remaining body fluid was> 2 (log 2 -scale) Red mRNA was selected. These included 97 blood-specific miRNAs, 13 saliva-specific miRNAs, 76 semen-specific miRNAs, and 17 vaginal fluid-specific miRNAs (see FIG. 4).

2. qRT-PCR에 의한 체액 특이적 miRNA의 검증2. Verification of body fluid-specific miRNA by qRT-PCR

203개의 체액 특이적 miRNA 중에서, qRT-PCR에 의한 독립적 검증을 위해 8개의 miRNA를 선별하였다. 추가적으로 필터링 하기 위해 다음 4가지 기준을 사용하였다: (1) 각 체액에서의 Q값 순위, (2) 체액에서 특이적으로 발현될 것, (3) 고발현 레벨 보일 것 및 (4) 이전에 보고된 miRNA가 아닐 것. 각 체액에 대하여 2개의 miRNA를 선별하였다 (표 2). 선택된 8개의 miRNA는 예상하였던 바 대로 마이크로어레이 데이터에서 체액 특이적 발현 패턴을 보였다 (도 5 참조).
Of the 203 body fluid-specific miRNAs, 8 miRNAs were selected for independent verification by qRT-PCR. To further filter, the following four criteria were used: (1) Q value rankings in each body fluid, (2) specific expression in body fluids, (3) high expression levels, and (4) It should not be miRNA. Two miRNAs were selected for each fluids (Table 2). The eight selected miRNAs showed body fluid-specific expression patterns in microarray data as expected (see FIG. 5).

microRNAmicroRNA 유형type 혈액blood 타액saliva 정액 semen 질분비액Vaginal secretion 엔트로피Entropy 혈액_QBlood_Q 타액_QSaliva_Q 정액_QQi_Q 질분비액_QVaginal secretion fluid Q hsa-miR-484hsa-miR-484 혈액blood 5.55 5.55 1.91 1.91 1.54 1.54 1.61 1.61 1.75 1.75 2.69 2.69 4.23 4.23 4.53 4.53 4.47 4.47 hsa-miR-182hsa-miR-182 혈액blood 10.42 10.42 3.73 3.73 2.80 2.80 2.94 2.94 1.75 1.75 2.68 2.68 4.16 4.16 4.58 4.58 4.50 4.50 hsa-miR-223hsa-miR-223 타액saliva 3.46 3.46 9.75 9.75 0.96 0.96 4.13 4.13 1.65 1.65 4.05 4.05 2.55 2.55 5.89 5.89 3.79 3.79 hsa-miR-145hsa-miR-145 타액saliva 3.23 3.23 9.60 9.60 0.64 0.64 4.80 4.80 1.61 1.61 4.11 4.11 2.53 2.53 6.43 6.43 3.54 3.54 hsa-miR-2392hsa-miR-2392 정액semen 4.60 4.60 3.44 3.44 10.45 10.45 4.40 4.40 1.85 1.85 4.17 4.17 4.58 4.58 2.98 2.98 4.23 4.23 hsa-miR-3197hsa-miR-3197 정액semen 4.65 4.65 4.30 4.30 10.72 10.72 7.90 7.90 1.90 1.90 4.47 4.47 4.58 4.58 3.26 3.26 3.70 3.70 hsa-miR-1260bhsa-miR-1260b 질분비액Vaginal secretion 2.99 2.99 3.24 3.24 2.43 2.43 6.95 6.95 1.86 1.86 4.25 4.25 4.13 4.13 4.55 4.55 3.03 3.03 hsa-miR-654-5phsa-miR-654-5p 질분비액Vaginal secretion 1.08 1.08 1.08 1.08 1.84 1.84 3.90 3.90 1.78 1.78 4.65 4.65 4.65 4.65 3.88 3.88 2.79 2.79

이후, 선택된 8개의 miRNA를 SYBR 기반 qRT-PCR 어세이를 사용하여 다른 40개의 샘플(각 체액 당 10개의 샘플)에서 검증하였다 (도 6 참조). 각 miRNA의 상대적 존재수(relative abundance)를 U6로 정규화하고, 발현레벨을 델타 Ct (ΔCt)법을 사용하여 정량화하였다. 선별된 8개의 miRNA는 타겟 체액 중에서 높게 과발현되었다: hsa-miR-484 및 182는 혈액, has-miR-223 및 145는 타액, has-miR-2392 및 3197는 정액 및 has-miR-654 및 1260b는 질 분비액에서 높게 과발현되었다.
The selected eight miRNAs were then verified in another 40 samples (10 samples per fluid) using a SYBR-based qRT-PCR assay (see FIG. 6). The relative abundance of each miRNA was normalized to U6 and expression levels were quantified using the delta Ct (? Ct ) method. Hs-miR-484 and 182 are highly expressed in blood, has-miR-223 and 145 are saliva, has-miR-2392 and 3197 are seminal and has-miR-654 and 1260b Was overexpressed in the vaginal secretion fluid.

3. 체액 식별의 정확성3. Accuracy of body fluid identification

체액 식별을 위한 체액 특이적 miRNA 각각의 성능을 확인하였다. ROC (receiver operating characteristic) 분석을 통해, 대부분의 miRNA가 우수한 민감도 및 특이성을 나타내었다 (도 7 참조). 예를 들어, 2개의 혈액 특이적 miRNA (miR-484 및 miR-182)는 대부분 혈액을 다른 체액과 거의 완벽하게 구분하였다. 2개의 타액 특이적 miRNA (miR-2392 및 miR-3197) 또한 타액을 다른 체액과 효율적으로 구분하였다. 이러한 결과를 통해, 8개의 miRNA가 법의학적 체액 식별을 위한 우수한 분자 마커임을 제시한다.
The performance of each of the body fluid-specific miRNAs for body fluid identification was verified. Through receiver operating characteristic (ROC) analysis, most miRNAs exhibited excellent sensitivity and specificity (see FIG. 7). For example, two blood-specific miRNAs (miR-484 and miR-182) almost completely differentiated blood from other body fluids. Two salivary-specific miRNAs (miR-2392 and miR-3197) also efficiently differentiated saliva from other body fluids. These results suggest that eight miRNAs are good molecular markers for forensic fluid identification.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the invention is not limited thereby. It will be obvious. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

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Claims (5)

(i) 혈액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 1 또는 2의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 9 또는 10의 프라이머,
(ii) 타액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 3 또는 4의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 11 또는 12의 프라이머,
(iii) 정액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 5 또는 6의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 13 또는 14의 프라이머, 및
(iv) 질 분비액에서 특이적으로 고발현되는 서열번호 7 또는 8의 miRNA를 증폭하기 위한 서열번호 15 또는 16의 프라이머 세트를 포함하는 체액 식별용 조성물.(i) a primer of SEQ ID NO: 9 or 10 for amplifying the miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 that is specifically highly expressed in blood,
(ii) a primer of SEQ ID NO: 11 or 12 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 that is specifically highly expressed in saliva,
(iii) a primer of SEQ ID NO: 13 or 14 for amplifying the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 which is specifically highly expressed in the semen, and
(iv) a primer set of SEQ ID NO: 15 or 16 for amplifying a miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 that is specifically highly expressed in vaginal secretion fluid. 제1항에 있어서,
상기 특이적 고발현은 타겟 체액과 나머지 체액의 마이크로어레이 유래 miRNA 발현량에 대한 log2 값 차이가 2 이상인 것을 특징으로 하는 체액 식별용 조성물.
The method according to claim 1,
Wherein the specific high expression is a difference in log 2 value between the microarray-derived miRNA expression amount of the target body fluid and the remaining body fluid of 2 or more.
제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는 체액 식별용 키트.
7. A body fluid identification kit comprising the composition according to any one of claims 1 to 6.
분석 대상 샘플을 제1항 또는 제2항의 체액 식별용 조성물과 혼합하고, 샘플 중 서열번호 1 내지 8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 miRNA 발현 레벨을 측정하는 단계; 및
서열번호 1 또는 2의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 혈액, 서열번호 3 또는 4의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 타액, 서열번호 5 또는 6의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 정액, 또는 서열번호 7 또는 8의 miRNA가 특이적으로 고발현되면 질 분비액으로 판별하는 단계를 포함하는 체액 식별 방법.
Mixing the sample to be analyzed with the composition for identifying a body fluid of claim 1 or 2 and measuring at least one miRNA expression level selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 1 to 8 in the sample; And
When the miRNA of SEQ ID NO: 1 or 2 is specifically highly expressed, if the miRNA of SEQ ID NO: 3 or 4 is specifically highly expressed in the saliva, the miRNA of SEQ ID NO: 5 or 6 is specifically highly expressed, Wherein the microorganism is identified as a vaginal secretion fluid when the miRNA of SEQ ID NO: 7 or 8 is specifically and highly expressed.
제4항에 있어서,
상기 miRNA 발현 레벨은 마이크로어레이, SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 또는 qRT-PCR(quantitative real time PCR) 방법으로 측정되는 것을 특징으로 하는 체액 식별 방법.
5. The method of claim 4,
Wherein the miRNA expression level is measured by a microarray, Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) or qRT-PCR (quantitative real time PCR) method.
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