KR101447123B1

KR101447123B1 - 헤파린의 추출 방법

Info

Publication number: KR101447123B1
Application number: KR1020140023106A
Authority: KR
Inventors: 박상협
Original assignee: 박상협
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2014-10-06

Abstract

본 발명은 돼지 내장 점막 조직으로부터 헤파린 나트륨을 회수하는 방법에 관한 것이다. 돼지 내장 점막 조직에 정제수와 정제염을 첨가하고 pH를 조정한 점막 조직 슬러리를 50~60℃로 가온 후 단백 분해효소를 첨가하고 3~5시간 동안 효소분해하여 효소분해액을 얻고 이 효소분해액을 75~95℃로 열처리하여 단백 분해효소와 점막 단백질을 변성시킨 다음 여과하여 불용성 물질을 제거된 청징 여액을 얻어 55~60℃로 급속 냉각시킨다. 상기 여액을 강염기성 음이온 교환수지에 접촉시켜 헤파린을 흡착시키고, 이온 교환수지를 분리하여 정제수로 수세 후 다시 3~5중량% 염화나트륨 용액에 투입하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거한 다음 15~30중량%의 염화나트륨 용액으로 처리하여 헤파린을 용리시켜 조 헤파린 나트륨 용리액을 얻고 이 용리액에 에탄올을 첨가하여 생성된 침전을 분리하고 건조하여 조 헤파린 나트륨 분말을 얻는다. 본 발명에 의한 헤파린 나트륨의 추출 방법은 추출 공정이 단순하면서도 헤파린의 추출 수율이 높고 추출된 헤파린의 순도가 높다.

Description

헤파린의 추출 방법{Extraction Method of Heparin}

본 발명은 돼지 내장 점막 조직으로부터 헤파린의 추출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 돼지 내장 점막 조직에 정제수와 정제염을 첨가하고 pH를 조정하여 점막 조직 슬러리를 얻는 단계; 상기 점막 조직 슬러리를 50~60℃로 가온 후 단백 분해효소를 첨가하고 3~5시간 동안 효소분해하여 효소분해액을 얻는 단계; 상기 효소분해액을 85~95℃로 열처리하여 단백 분해효소와 점막 단백질을 변성시키는 단계; 상기 처리액을 여과하여 불용성 물질을 제거하여 청징 여액을 얻고 55~60℃로 급속 냉각시키는 단계; 상기 여액을 강염기성 음이온 교환수지에 접촉시켜 헤파린을 흡착시키는 단계; 상기 헤파린을 흡착시킨 이온 교환수지를 분리하여 정제수로 수세 후 다시 음이온 교환수지 중량 대비 3배량의 3~5중량% 염화나트륨 용액에 투입하고 30분간 교반하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거하고 15~30중량%의 염화나트륨 용액으로 처리하여 헤파린을 용출시켜 조 헤파린 나트륨 용액을 얻는 단계로 구성된다. 본 발명에 의한 헤파린의 추출 방법은 추출공정이 단순하고 추출 수율이 높으며 추출된 헤파린의 순도가 높은 장점이 있다.

헤파린은 간, 소장, 폐, 피부 등에 존재하는 황산화된 D~글루코사민, D~글루쿠론산, L~이두론산 등을 포함하는 산성 뮤코다당류의 혼합물로 1922년 W. H. 하우얼에 의하여 발견되었다. 헤파린은 실험용으로 채취된 혈액이 응고되는 것을 방지하기 위해 사용되었으며, 1940년대에 정맥혈전 같이 이미 정맥 내에 혈괴가 형성된 환자를 치료하기 위해 도입되었다. 헤파린은 강한 혈액 항응고활성을 가지고 있으며(김성열 외. 2003. 미세혈관문합시 헤파린의 국소 및 전신 투여가 혈전 형성에 미치는 영향. 대한구강악안면외과학회지, 29, 232), 범발성 혈관 내 혈액응고 증후군의 치료, 정맥혈전증, 심근경색증, 폐색전증, 뇌색전증, 사지동맥혈전 색전증, 수술중ㆍ수술 후의 혈전 색전증 등 여러 혈전 색전증의 치료 및 예방 이외에, 혈액투석, 인공심폐 등의 체외순환장치 사용시나 혈관 카테터 삽입 시 또는 수혈 및 혈액검사 시 혈액응고의 방지에 사용되고 있다. 또, 헤파린은 혈액 항응고활성 이외에, 리포단백 리파아제 활성화 작용, 항혈소판 응집작용, 혈압 저하작용, 항보체작용, 암전이 억제작용, 비만세포로부터의 탈과립 저해작용, 국부염증 억제, 진통 및 근조직의 혈행촉진 작용 등의 많은 생리활성을 가지는 것도 알려져 있다.

헤파린은 주로 소의 폐나 돼지의 장에서 추출하여 제조하였지만, 광우병 문제 이후, 의약품으로서의 헤파린의 기원은 거의 돼지 소장점막 유래하고 있다. 통상, 수용매에 돼지 소장점막을 현탁시켜 단백질을 소화시킨 다음 흡착제 등을 첨가하여 헤파린과 다른 뮤코폴리사카라이드(주로 콘드로이친황산 패밀리, 헤파란황산 등)을 복합체로서 추출해서 조원료로 한다.

한편, 헤파린의 추출에 관한 종래의 기술로는 한국 공개특허 제 10~2004~0071127호 (비만세포 배양물로 부터 헤파린의 제조방법), 한국 공개특허 제10~2013~0118307(고순도 헤파린 및 그 제조방법), 한국 등록특허 제10~0515706호(헤파린 제조방법), 한국 등록특허 특1982~0001739호(헤파린의 회수방법), 한국 등록특허 특1982~0000044호(헤파린의 추출방법) 등이 있으나, 본 발명과는 기술적 구성이 다르다.

본 발명의 목적은 돼지 내장 점막 조직으로부터 헤파린을 추출하는데 있어서 종래의 효소분해 과정 중 미생물 오염에 의한 헤파린의 회수율 저하를 방지하여 고수율로 헤파린을 추출하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 돼지 내장 점막 조직에 내장 점막 조직 중량 대비 4~6배의 정제수와 정제염 15~35중량%를 첨가하여 용해시킨 다음 pH를 8~12로 조정하고 효소분해 온도를 50~60℃로 유지함으로서 점막 조직 단백의 효소분해 시에 변질을 방지하여 헤파린의 추출 수율을 높일 수 있고, 효소분해 후 75~95℃로 5~15분간 열처리하여 단백 분해효소와 미분해 점막 단백질을 변성시킨 다음 여과하여 청징 효소분해액을 얻고, 55~60℃로 급속 냉각시켜 강염기성 음이온 교환수지에 헤파린을 용이하게 흡착시킬 수 있는 헤파린의 추출 방법을 제공한다.

본 발명은 돼지 내장 점막 조직에 정제수와 정제염을 첨가하고 pH를 조정한 슬러리에 단백 분해효소를 첨가하여 효소분해 후 열처리하여 단백질을 변성시킨 다음 여과하여 청징 효소분해액을 얻고 급속 냉각 후 강염기성 이온 교환수지에 헤파린을 흡착시켜 회수하는 방법으로서 공정을 단순화하고 미생물의 오염을 방지하여 헤파린의 회수율을 높일 수 있고 수세 공정을 통해 헤파린의 순도를 높일수 있는 효과가 있다.

본 발명은 돼지 내장 점막 조직에 정제수와 정제염을 첨가하고 pH를 조정하여 점막 조직 슬러리를 얻는 단계; 상기 점막 조직 슬러리에 단백 분해효소를 첨가하여 효소분해 후 열처리하여 단백 분해효소와 미분해 점막 단백질을 변성시킨 다음 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 급속 냉각시키고 청징 효소분해액을 얻는 단계; 상기 효소분해액을 강염기성 이온 교환수지에 접촉시켜 헤파린을 흡착시키는 단계; 상기 헤파린을 흡착시킨 이온 교환수지를 정제수로 수세하고 다시 묽은 염화나트륨 용액으로 처리하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거하고 고농도의 염화나트륨 용액으로 처리하여 헤파린을 용출시켜 헤파린나트륨 용액을 얻고 여기에 에탄올을 혼합하여 헤파린나트륨을 침전시키고 침천물을 분리하여 에탄올로 세척하여 건조하여 헤파린나트륨 분말을 얻는 단계로 구성된다.

1. 돼지 내장 점막 조직 슬러리의 제조

돼지 내장 점막 채취기로 채취한 점막 조직에 점막 조직 중량대비 4~6배의 정제수와 정제염 15~35중량%를 가하여 정제염을 용해시킨 다음 1N NaOH 용액으로 pH 8~12로 조정하여, 보다 바람직하게는 9~11로 조정하여 돼지 내장 점막 조직 슬러리를 제조한다.

2. 돼지 내장 점막 조직 단백의 효소분해

상기 돼지 내장 점막 조직 슬러리를 가온하여 온도를 50~60℃, 보다 바람직하게는 55℃로 승온 후 세균 유래의 알칼리 프로테아제를 점막 조직 중량 대비 500~2,000단위, 보다 바람직하게는 1,000~1,500단위가 되도록 첨가하고 50~60℃, 보다 바람직하게는 55℃에서 3~5시간 동안 효소분해시킨다. 효소분해 후 75~95℃에서 5~15분간 열처리하여 첨가한 단백 분해효소와 미분해 점막 단백질을 변성시키고 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 청징한 효소분해액을 얻고, 55~60℃로 급속 냉각시킨다.

3. 헤파린의 분말의 제조

상기에서 얻은 효소분해액에 돼지 내장 점막 조직 중량대비 2~5중량%의 Cl형 강염기성 음이온 교환수지를 첨가하고 55~60℃에서 10~15시간 교반하여 헤파린을 흡착시킨 다음 음이온 교환수지를 필터로 분리하여 정제수로 수세 후 다시 음이온 교환수지 중량 대비 40~60℃로 조정한 3배량의 3~5중량% 염화나트륨 용액에 투입하고 15~30분간 교반하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거한다. 다음 음이온 교환수지를 분리하여 음이온 교환수지 중량 대비 2~4배의 15~30중량% 염화나트륨 용액에 넣고 50~70℃에서 2~5시간 교반하여 헤파린 나트륨을 용출시킨다. 헤파린이 용리된 음이온 교환수지를 분리한 용출액에 용출액 용량 대비 2~3배량의 에탄올을 혼합하여 상온에서 16~24시간 방치하여 헤파린 나트륨을 침전시키고 이 침전물을 수집하여 에탄올로 세척 후 건조하여 헤파린 나트륨 분말을 얻는다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

* 헤파린 나트륨의 정량분석 방법

헤파린 나트륨의 정량분석은 대한약전 제 10개정 중 헤파린 나트륨의 분석방법에 따라 분석하였다. 즉, 37℃로 미리 가온한 시험관에 미리 37℃로 가온한 공시험액, 각 농도 검액 및 표준액 각 100

씩을 넣고 미리 37℃로 가온한 안티트롬빈 용액 200

를 혼합하여 2분간 방치한 다음 미리 37℃로 가온한 사람유래 트롬빈용액 50

를 넣고 2분간 방치하고 미리 37℃로 가온한 기질액 100

를 혼합하여 2분간 방치하고 반응 정지액 100

를 혼합하여 2분간 방치한 후 405nm에서 흡광도를 측정하고 표준곡선을 작성하여 표준곡선으로부터 헤파린 나트륨의 단위를 구하였다.

<실시예>

돼지 내장 점막 채취기(모델명 : 280B, Hefei Lidong machinery equipment Co., China)로 채취한 점막 조직 100kg에 500kg의 정제수와 21kg의 정제염을 가하여 정제염을 용해시킨 다음 1N NaOH 용액으로 pH 9.0으로 조정하고 온도를 55℃로 상승시킨 후 세균 유래의 알칼리 프로테아제(2709 Alkali Protease, 200,000u/g, Shijiazhuang XINDA Enzyme Ltd., China) 120,000,000단위를 첨가하고 55℃에서 4시간 동안 효소분해시켰다. 효소분해 후 90℃에서 10분간 열처리 후, 80메쉬의 필터로 여과하여 청징한 효소 분해액을 얻은 다음 58℃로 냉각하였다. 여기에 강염기성 Cl형 음이온교환수지(AMBERLITE FPA 98, ROHM AND HAAS, USA) 3kg을 첨가하고 58℃에서 12시간 교반하여 헤파린을 흡착시킨 다음 음이온 교환수지를 분리하여 정제수 6L로 수세 후 다시 7.5kg의 4중량% 염화나트륨 용액에 투입하고 55℃에서 20분간 교반하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거하였다. 다음 음이온 교환수지를 분리하여 24중량% 염화나트륨 용액 7.5kg를 넣고 60℃에서 3시간 교반하여 헤파린 나트륨을 용리시켰다. 헤파린이 용리된 음이온 교환수지를 분리한 용리액에 95용량% 에탄올 18L를 혼합하여 상온에서 24시간 방치하여 헤파린 나트륨을 침전시키고 이 침전을 분리하여 에탄올로 세척 후 건조하여 헤파린 나트륨 분말 53.2g을 얻었다. 이때 헤파린의 농도는 92u/mg이었고, 헤파린의 회수율은 97.1%이었다.

<비교예 1>

실시예에서 사용한 동일한 점막 조직 100kg을 500kg의 정제수에 현탁시키고 온도를 55℃로 상승시킨 후 실시예와 동일한 세균 유래의 알칼리 프로테아제 120,000,000단위를 첨가하고 55℃에서 10시간 동안 효소분해시켰다. 효소분해 후 75℃에서 30분간 열처리한 다음 80메쉬의 필터로 여과하여 청징한 효소 분해액을 얻은 다음 방치하여 상온으로 냉각하였다. 이하 실시예와 같은 방법으로 처리하여 헤파린 나트륨 분말 55.9g을 얻었다. 이때 헤파린의 농도는 78u/mg이었고, 헤파린의 회수율은 86.5%이었다.

<비교예 2>

점막조직 슬러리의 pH를 7.0으로 조정한 것을 제외하고는 실시예와 같은 방법으로 처리하여 헤파린 나트륨 분말 51.7g을 얻었다. 이때 헤파린의 농도는 83u/mg이었고, 헤파린의 회수율은 85.1%이었다.

<비교예 3>

음이온 교환수지를 3~5중량% 정제염 용액으로 수세하는 공정을 생략한 것을 제외하고는 실시예와 같은 방법으로 처리하여 헤파린 나트륨 분말 63.5g을 얻었다.

이때 헤파린의 농도는 74u/mg이었고, 헤파린의 회수율은 93.2%이었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 돼지 내장 점막 조직으로부터 헤파린을 추출하는 방법은 제조공정이 비교적 단순하고 회수율이 높을 뿐 아니라 추출된 헤파린 나트륨의 순도가 높아 산업상 이용 가능성이 있다.

Claims

돼지 내장 점막 조직에 정제수와 정제염을 첨가하고 pH를 조정하여 점막 조직 슬러리를 얻는 단계; 상기 점막 조직 슬러리에 온도를 50~60℃로 상승 시킨 후 단백 분해효소를 첨가하고 50~60℃에서 3~5시간 동안 효소분해하여 효소분해액을 얻는 단계; 상기 효소분해액을 75~95℃로 열처리하여 단백 분해효소와 점막 단백질을 변성시키는 단계; 상기 처리액을 여과하여 불용성 물질을 제거한 후 청징 여액을 얻고 55~60℃로 급속 냉각시키는 단계; 상기 여액을 강염기성 음이온 교환수지에 접촉시켜 헤파린을 흡착시키는 단계; 상기 헤파린을 흡착시킨 이온 교환수지를 분리하여 정제수로 수세 후, 다시 3~5 중량%의 염화나트륨 용액에 투입하고 교반하여 음이온 교환수지에 흡착된 불순물을 제거하고, 15~30 중량%의 염화나트륨 용액으로 헤파린을 용리시켜 조 헤파린 나트륨 용리액을 얻는 단계; 및 상기 조 헤파린 나트륨 용리액에 에탄올을 혼합하고 상온에서 방치하여 헤파린 나트륨을 침전시킨 후 이 침전물을 수집하여 에탄올로 세척하고 건조하여 조 헤파린 분말을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 정제염의 첨가량은 점막 조직 중량 대비 15~35중량%인 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 점막 조직 슬러리의 pH를 8~12로 조정하는 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 단백 분해효소는 세균 유래의 알칼리성 프로테아제인 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 단백 분해효소의 첨가량은 점막 조직 중량 대비 500~2000단위인 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 이온교환수지에 흡착된 불순물의 제거는 음이온 교환수지의 중량대비 3배량의 3~5중량%의 염화나트륨 용액으로 40~60℃에서 15~30분간 수세하는 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 음이온교환수지로부터 헤파린의 용리는 음이온 교환수지 중량대비 3배량의 15~30중량% 염화나트륨 용액으로 50~70℃에서 2~5시간 처리하여 조 헤파린 나트륨 용액을 얻는 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.
제 1항에 있어서, 조 헤파린 나트륨 분말은 용리액 용량 대비 2~3배량의 95용량% 에탄올을 혼합하여 상온에서 16~24시간 방치하여 헤파린 나트륨을 침전시키고 이 침전물을 수집하는 것을 특징으로 하는 헤파린의 추출 방법.